Summary
هذا المقايسة هي طريقة بسيطة لكمية الخلايا الدموية في تطوير حمار وحشي الجنينية. تخضع خلايا الدم من سمك الحمار الوحشي المفكك لتحليل تدفق قياس الخلايا. وهذا يسمح للكشف عن عيوب الدم في الحيوانات المتحولة وبعد التعديل الوراثي.
Abstract
ينشأ تنوع أنساب الخلايا التي تضم دما ناضجا في الحيوانات الفقارية من تمايز الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). وهذه عملية حاسمة تحدث طوال عمر الكائنات الحية، ويمكن أن يكون لاضطراب المسارات الجزيئية التي ينطوي عليها تكوين الأجنة عواقب كارثية على المدى الطويل. لعدة أسباب، أصبح حمار وحشي(دانيو rerio)كائن حي نموذجي لدراسة الدم. تتطور أجنة سمك الحمار الوحشي خارجيا ، وبحلول 7 أيام أنتجت بعد الولادة (dpf) معظم الأنواع الفرعية لخلايا الدم النهائية التي ستستمر طوال حياتها. وقد تم تطوير المقايسات لتقييم عدد الخلايا الدموية، وذلك أساسا باستخدام بقع النسيجية محددة، وتقنيات التهجين في الموقع، ومجهر الحيوانات المعدلة وراثيا التي تستخدم المروجين خلايا الدم محددة يقود التعبير عن البروتينات الفلورية. ومع ذلك، فإن معظم المقايسات تلطيخ وتقنيات التهجين في الموقع لا كمية بدقة عدد خلايا الدم الموجودة؛ يتم تصور الاختلافات الكبيرة فقط في أرقام الخلايا بسهولة. يمكن إجراء استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا وتحليل الأفراد الذين يعانون من المجهر الفلوري أو الكونفوجال ، ولكن كمية هذه المقايسات تعتمد إما على العد يدويا أو استخدام برامج التصوير باهظة الثمن ، وكلاهما يمكن أن يخطئ. إن تطوير طرق إضافية لتقييم أعداد خلايا الدم سيكون اقتصاديا وأسرع، بل ويمكن أن يكون آليا لتقييم تأثير التعديل الوراثي بوساطة CRISPR بسرعة، والحد من النسخ بوساطة مورفولينو، وتأثير مركبات الأدوية التي تؤثر على حالات الهيماتوبويز على نطاق واسع. يتم إجراء هذا الفحص الجديد لكمية خلايا الدم عن طريق فصل أجنة حمار وحشي كاملة وتحليل كمية خلايا الدم الموسومة بالفلورسنت الموجودة. وينبغي أن تسمح هذه المقايسات بتجلي المسارات الجزيئية المسؤولة عن توليد خلايا الدم، والتوسع، والتنظيم أثناء تكوين الأجنة، مما سيسمح للباحثين باكتشاف المزيد من العوامل الجديدة التي تم تغييرها أثناء أمراض الدم، وكذلك المسارات الضرورية أثناء تطور الهيماتوبويز الفقارية.
Introduction
إنتاج الدم (الهيماتوبويز) هو عملية تنموية أساسية تبدأ لأول مرة في الجنين المبكر. تبدأ هذه العملية بتوليد خلايا الدم الحمراء البدائية وال الضامة مباشرة من mesoderm ، وتتحول في وقت لاحق نحو إنتاج الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). هذه الخلايا الجذعية، التي هي متعددة القدرات، وتوليد جميع أنواع خلايا الدم الناضجة في الكائن الحي. ويمكن تجديد النظام ذاتيا، ويتم تجديده باستمرار من خلال هذه المركبات الهيدروفلورية. في حين أن هذه العملية تبدأ في وقت مبكر من التنمية ، يستمر التهاب الدم لحياة الحيوان ، مما يوفر القدرة على نقل الأكسجين إلى مواقع بعيدة من الجسم ، ووقف النزيف بعد الإصابة ، وحماية الجسم من العدوى. يتم التحكم في تطوير هذا النظام المعقد زمنيا ومكانيا أثناء التطور وأي اضطراب في إنتاج خلايا الدم يمكن أن يكون كارثيا على الكائن الحي ، مما يؤدي إلى فقر الدم والجلطات الدموية واللوكوبينيا وسرطان الدم.
وهناك نموذج شعبية تستخدم للبحوث الدم هو حمار وحشي(دانيو rerio)لأن لديهم نمو الدم مماثلة بالمقارنة مع البشر. في الواقع، يتم الحفاظ على العديد من الجينات والمسارات الجزيئية المستخدمة أثناء الهيماتوبويز طوال تطور الفقاريات، مما يسمح لنا بالتعرف على الجينات البشرية من خلال دراسة سمك الحمار الوحشي. الأهم من ذلك ، تتطور أجنة حمار وحشي خارج الجسم وخلال 7 أيام ولدت أنواع خلايا الدم الأكثر نضجا ، مما يسمح بالتصور المباشر للنظام الدموي في فترة قصيرة من الزمن. كما أن سمك الحمار الوحشي براز للغاية، مما يسمح للباحثين بمراقبة عدد أكبر من العينات في إطار زمني قصير، وهو أمر مهم أيضا لتوليد بيانات قابلة للاستنساخ. يوفر زمن الجيل القصير من سمك الحمار الوحشي والتطور الخارجي سهولة التلاعب والمراقبة أثناء دراسات تكوين الطفرات1و2و3و4و5 وفحص المخدرات6و7و8و9و10. وهذا يسمح للوحة من المركبات العلاجية الواعدة لاضطرابات الدم البشري ليتم اختبارها بسرعة وكفاءة.
الأهم من ذلك، حمار وحشي هي أيضا قابلة وراثيا، ويتم تسلسل الجينوم والشروح. تسمح قابلية التجريب هذه بإجراء تقنيات علم الوراثة العكسية مثل المورفولينو -(MO-) بوساطة الضربة القاضية والاجتثاث الوراثي بوساطة CRISPR. وقد أثبتت حمار وحشي أيضا فائدتها كنموذج لأداء الشاشات الوراثية إلى الأمام; وقد تم اكتشاف العديد من الجينات الأساسية والمسارات المشاركة في تكوين الدم الفقاري بهذه الطريقة. كما تم تطوير العديد من الطرق لمراقبة خلايا الدم في حمار وحشي. في حين أن تقنيات تلطيخ الهسولوجية التقليدية موجودة ، فمن الممكن أيضا إجراء التهجين في الموقع للنصوص الخاصة بالدم. الأهم من ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا من الأسماك موجودة أيضا حيث يتم التعبير عن البروتينات الفلورية من قبل المروجين النسب محددة، مما يسمح لوضع العلامات على خلايا الدم محددة مع البروتينات الفلورية11. وهذا يسمح للباحثين بإجراء مراقبة دقيقة لنشأة خلايا الدم وتوسعها وتنظيمها في كائن حي بمرور الوقت.
وعموما، فإن الحفاظ على نظام الهيماتوبويات، ووجود خطوط معدلة وراثيا وتطويرها بسهولة، وسهولة التصور، ووقت الجيل القصير جعل من سمك الحمار الوحشي نموذجا اقتصاديا وسريعا وقابلا للتكيف لنظم الدم. لتحسين مجموعة أدوات التقنيات المتاحة للباحثين حمار وحشي، وضعنا هذا المقايسة لكمية قوية من خلايا الدم في الأجنة. تتضمن الطريقة هضم الحيوانات المعدلة وراثيا وإجراء قياس التدفق الخلوي لخلايا الدم الفلورية. وبهذه الطريقة ، يمكن تحليل خلايا الدم من الحيوانات المتحولة ، وتأثير تعديل MO و CRISPR ، وتأثير الجزيئات الصغيرة كميا بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. هذه المقايسات هي طرق سهلة الاستخدام واقتصادية لتعداد خلايا الدم ، مما يسمح بفحص جيلها وانتشارها وصيانتها بمرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق المجلس الاستشاري للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة ولاية كاليفورنيا، شيكو، على جميع الأساليب المذكورة أدناه.
ملاحظة: ينصح بمعالجة الأجنة مع 1-فينيل 2-ثيورينا (PTU; الجدول 1) في 24 ساعة postfertilization (hpf) لمنع التصبغ الذي يؤثر سلبا على التمييز الفلوري عن طريق قياس التدفق الخلوي. جميع الإجراءات المذكورة أدناه مقبولة لقياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS). ومع ذلك ، إذا كان هدف المرء هو زراعة الخلايا الدموية بعد FACS ، ثم الالتزام بالممارسات العقيمة عند معالجة العينات. وقد وصف بروتوكول لتبييض وإعداد عينات الأجنة بطريقة معقمة سابقا12.
1. dechorionation من 48 أجنة حمار وحشي hpf
- مع الأجنة (على الأقل 5، ولكن لا أكثر من 200 جنين) في طبق بيتري البلاستيك 10 سم، إمالة الطبق بحيث تغرق الأجنة إلى الحافة السفلية.
ملاحظة: من السهل إمالة الطبق عن طريق إزالة غطاءه ووضع الغطاء تحت حافة واحدة من طبق بيتري. - إزالة وتجاهل أكبر قدر E3 المتوسطة (الجدول 1) ممكن وإضافة 500 ميكرولتر من protease dechorionation (10 ملغ / مل). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بعد 5 دقائق، التقط طبق بيتري (مع الحفاظ على جميع الأجنة في الحافة السفلية من الطبق)، واضغط بلطف على جانب طبق بيتري، مما يسمح للأجنة بفرك الجزء السفلي من الطبق بلطف لإزالة الكورونات تماما.
- مع زجاجة ضغط، إضافة ~ 20 مل من E3 المتوسطة لتخفيف protease. السماح للأجنة لتسوية وإزالة المتوسطة E3 عن طريق إزالة.
- كرر الخطوة 1.4 3x لإزالة جميع آثار protease dechorionation.
ملاحظة: لكل عينة على حدة لتحليل، مطلوب ما لا يقل عن 5 أجنة. هذا الإجراء dechorionation يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 200 جنين لكل طبق بيتري. يمكن تجميع العينات في هذه المرحلة وفصلها لاحقا إذا رغبت في ذلك. بدلا من ذلك، يمكن إجراء dechorionation اليدوي عن طريق تمزيق بلطف chorions مع ملقط صانع الساعات. وهذا مفيد عندما تكون هناك أعداد صغيرة من الأجنة. عادة حمار وحشي سوف يفقس من المشيمات من قبل 72 حصان. ومع ذلك، قد لا تحتاج الأجنة المشوهة بشدة إلى إزالة المشيمة (إما يدوية أو كيميائية) بعد ذلك الوقت.
2. إعداد عينات الأجنة للتفكك
- باستخدام ماصة P1000، ضع 5−10 أجنة في أنبوب طرد دقيق واحد سعة 1.5 مل.
- إزالة E3 المتوسطة مع ماصة وتجاهل.
تنبيه: يمكن بسهولة التخلص من ماصة مع الرعاية والأجنة خلال الخطوات التالية. - إضافة 1 مل من 10 م dithiothreitol (DTT) في E3 المتوسطة لإزالة طلاء المخاط المحيطة حمار وحشي الجنينية11،12،13،14. وضع أنبوب الطرد الدقيق أفقيا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. فصاع الأجنة
- غسل الأجنة 3x مع 1 مل من الفوسفات Dulbecco المالحة المخزنة (DPBS) مع Ca2 + و Mg2 + لإزالة آثار DTT. بعد غسل الماضي إضافة 500 μL من DPBS مع Ca2 + و Mg2 + و 5 ميكرولتر من 5 ملغ / مل (26 U / مل) protease التفكك.
ملاحظة: قد يتم استخدام حلول المخزن المؤقت isotonic أخرى، ولكن يجب أن تحتوي على Ca2+ و Mg2+ لأنزيم الانفصال لتعمل بشكل صحيح. - احتضان العينات عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري أفقي عند 185 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. الأجنة تريتورات مع ماصة P1000 حتى يتم فصل العينات تماما.
تنبيه: الحرص على عدم الإفراط في عسر الهضم الأجنة; بعض الأنسجة الصلبة يجب أن تكون موجودة، وأنه لا ينبغي أن تكون متجانسة تماما. فمن الممكن أن الإفراط في عسر الهضم، والتي سوف تدمر خلايا الدم المستهدفة التي يتعين ملاحظتها على مقياس التدفق الخلوي(الشكل التكميلي 1).
ملاحظة: يعمل هذا الإجراء بشكل أفضل ل 48−72 جنين hpf. قد تتطلب المراحل اللاحقة حضانة أطول مع بروتياز التفكك. ويجب تحديد توقيت المراحل المختلفة تجريبيا. هناك طرق بديلة أسرع للأنسجة الجنينية الفصامية ، ولكن تم العثور عليها تجريبيا أن هذه الطريقة ، على الرغم من أنها تستغرق 60 دقيقة ، لطيفة وشاملة بما يكفي للسماح بالعزل الفعال للخلايا الدموية الحية.
4. إعداد الأجنة المفككة لقياس التدفق الخلوي
- ماصة الأجنة 5 فصلت على الخزان العلوي من 5 مل البوليسترين جولة أنبوب أسفل مع غطاء مصفاة الخلية 35 ميكرومتر.
- شطف الخلايا بإضافة 4 مل من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) مع عدم وجود Ca2 + أو Mg2 + إلى غطاء مصفاة من أنبوب البوليسترين 5 مل التي تحتوي على الخلايا المصفاة.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام حلول عازلة متساوية التوتر الأخرى ، ولكن يجب أن تفتقر إلى Ca2 + أو Mg2 + لتخفيف إنزيم الانفصال وجعله غير فعال. - أنابيب الطرد المركزي في 4 درجة مئوية و 300 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا. مع ماصة، وإزالة وتجاهل supernatant. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (مع عدم وجود Ca2 + أو ملغ2 +).
5. تدفق قياس الخلايا
- دوامة بلطف تعليق الخلية وإضافة 1:1،000 بقعة الخلية الميتة الحمراء (جدول المواد).
ملاحظة: وصمة عار الخلايا الميتة الحمراء هي صبغة نفاذية للخلايا تسمح باستبعاد الخلايا الميتة والحطام من الخلايا المستهدفة وهي خيار ممتاز للصبغة للتمييز في الخلايا الميتة ، لأنها متحمسة بالليزر 633 نانومتر ، والذي يختلف عن ليزر 488 نانومتر المستخدم لإثارة الفلوروفورات الشائعة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) و DsRed. وبهذه الطريقة، لا يوجد تداخل طيفي من الخلايا الميتة وخلايا الدم المعدلة وراثيا. البروبيديوم يوديد (PI) في 1 ملغ / مل هو بديل غير مكلفة لوصمة عار الخلية الميتة الحمراء، ولكن تأكد من حجز بعض العينات الملطخة فقط مع PI فضلا عن عينات فقط مع الفلوروفور من الفائدة لتعيين التعويض الصك. وإلا فإن إشارات PI والفلوروفوريس مثل GFP سوف تتداخل، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. إذا كان تدفق cytometer أيضا ليزر 405 نانومتر، والأصباغ الأخرى مثل بقعة خلية الأب الأزرق هي أيضا خيار ممتاز.
تنبيه: عند تحليل خلايا الدم، لاحظ أنه بعد 30 دقيقة ستبدأ أنواع معينة من الخلايا في فاغوسيتوز بقعة الخلايا الميتة الحمراء. الحفاظ على الخلايا المحمية من الضوء وعلى الجليد حتى التحليل وإجراء قياس التدفق الخلوي في غضون 30 دقيقة من إضافة الصبغة. - تحليل قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: يختلف كل مقياس تدفق للخلايا قليلا، ولكن الخطوات التالية ستساعد في إعداد العينات للتحليل على معظم الأجهزة. للمستخدمين الجدد لتدفق قياس الخلايا، وطلب المشورة من شخص ما هو خبير في قطعة معينة من المعدات. التعليمات التالية تتعلق بمقياس تدفق تدفق BD FACSAria Fusion.- تشغيل مقياس الخلايا والسماح لأشعة الليزر للاحماء لمدة 20 دقيقة. خزان النفايات الفارغة، وملء خزان غمد مع الحل المناسب (يختلف على أساس تدفق السيتومتر) وبدء نظام fluidics.
ملاحظة: عادة ما يكون هناك إجراء بدء تشغيل معين لكل نوع من تدفق الخلايا; اتبع إجراء بدء التشغيل هذا بعناية. - في برنامج التحليل ، رسم خمس مؤامرات(الشكل 1A).
- يكون مقياس رسم النقطة الأول مبعثر للأمام (FSC) على محور س والتبعثر الجانبي (SSC) على محور ص. تعيين FSC كخطي و SSC كسجل.
ملاحظة: FSC هو قياس لحجم الخلية، وSSC هو قياس التفاصيل. وهذا سيسمح بالتمييز بين الخلايا من الحطام. مجموعات خلايا الدم حمار وحشي الجنينية لا تفصل حسب الحجم والحبيبة بنفس الطريقة التي خلايا الدم حمار وحشي الكبار وصفها سابقا15. بدلا من ذلك سوف تظهر في نفس السكان مع جميع الخلايا الجنينية الأخرى المهضومة. - تعيين المخطط الثاني لفحص ارتفاع FSC (H) مقابل عرض FSC (W). تعيين المؤامرة الثالثة لقياس SSC (H) مقابل SSC (W).
ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة لاستبعاد doublets (الخلايا التي يتم عالقة معا عند مرورها من خلال الليزر). - تعيين مؤامرة نقطة الرابعة لقياس وصمة عار الخلية الميتة الحمراء على محور س (اعتمادا على السيتومتر هذا هو عادة ما يعادل مرشح المستخدمة ل allophycocyanin [APC]) وSSC على محور ص. وسيسمح ذلك بالتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة.
ملاحظة: يمكن أن تكون مجموعات التصفية لكل مقياس للخلايا مختلفة. تأكد من استخدام مرشح الكشف الصحيح لصبغة التمييز الخلية الميتة. - تقيس المؤامرة الخامسة الفلوروفور المفضل. تصور هذا كمخطط للفلوروفور (الشكل 1) أو استخدام مؤامرة نقطة (الشكل التكميلي 2).
ملاحظة: عند فحص أكثر من فلوروفور واحد في نفس الحيوان، فمن المستحسن استخدام مؤامرة نقطة لعرض المعلمات على حد سواء في نفس الوقت. إذا كان هناك أي فرصة أن الفلوروفورات لها تداخل طيفي مع بعضها البعض (الشكل التكميلي 2)، يوصى أيضا برسم نقطة. استخدم إعدادات المنطقة (A) لحساب المساحة تحت المنحنى الناتجة عن نبض الليزر للمقياس الخلوي لجميع المعلمات، لأنها أكثر دقة.
- يكون مقياس رسم النقطة الأول مبعثر للأمام (FSC) على محور س والتبعثر الجانبي (SSC) على محور ص. تعيين FSC كخطي و SSC كسجل.
- قم بتحميل العينة وتقليل معدل التدفق بحيث لا تنفد العينة بسرعة. ضبط إعدادات FSC و SSC بحيث يمكن رؤية الجزء الأكبر من مجموعة الخلايا بوضوح(الشكل 1A).
- رسم بوابة حول السكان الخلية وتسمية الخلايا. التأكد من أن يتم مسور مؤامرة نقطة الثاني على الخلايا، استبعاد doublets عن طريق gating أولا على FSC ومن ثم على singlets SSC.
- على المؤامرة الرابعة ضبط إعدادات بقعة الخلية الميتة الحمراء بحيث يكون هناك بوضوح السكان السلبية. رسم بوابة حول هذه الخلايا، وتسميتها الخلايا الحية. على المؤامرة الخامسة، بوابة على الخلايا الحية وفحص الخلايا السلبية والإيجابية الفلوروفور. رسم بوابة حول الخلايا الإيجابية.
ملاحظة: هذه الاستراتيجية الهرمية gating يفحص الفلوروفور واحد+ الخلايا الموجودة في بوابة الخلايا الحية، والتي توجد أيضا في بوابة الخلية. الحرص على تعيين البوابات بشكل صحيح. يمكن تخصيص هذه البوابات اعتمادا على التجربة. - تشغيل كل عينة، وجمع ما لا يقل عن 25،000 أحداث الخلايا الحية.
- اتبع إجراء إيقاف التشغيل لإيقاف تشغيل fluidics. إعادة تعبئة خزان غمد وتفريغ خزان النفايات.
ملاحظة: غالبا ما يكون من الصعب تصور الفلوروفور+ الخلايا عندما يكون تعبير البروتين منخفضا، أو يكون عدد الخلايا نادرا. لضمان تعيين المعلمات بشكل صحيح ، يجب إعداد الفلوروفور- الأجنة الشقيقة جنبا إلى جنب لرسم البوابات بشكل صحيح وضبط الفولتية بالليزر(الشكل التكميلي 2). إذا كان عدد الخلايا المستهدفة نادرا، فاجمع أكثر من 25,000 حدث. مع 5-10 الحيوانات المهضومة، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على جمع الملايين من الأحداث. ويمكن أيضا الحصول على العدد الإجمالي للفلوروفور+ الخلايا مع هذه البيانات. ببساطة عد العدد الإجمالي للخلايا في العينة مع مقياس الدم وضرب النسبة المئوية للفلوروفور+ الخلايا للحصول على العدد المطلق من الفلوروفور+ الخلايا لكل سمكة.
- تشغيل مقياس الخلايا والسماح لأشعة الليزر للاحماء لمدة 20 دقيقة. خزان النفايات الفارغة، وملء خزان غمد مع الحل المناسب (يختلف على أساس تدفق السيتومتر) وبدء نظام fluidics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتعداد خلايا الدم الحمراء في حمار وحشي الجنينية, lcr:تم حقن GFP16 الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع برنامج تلفزيوني, 7.0 نانوغرام / nL ism1 MO, أو 7.0 نانوغرام / nL ism1 MO مع 7.0 نانوغرام ism1 مرنا12. في 48 حصان تم هضمها وتخضع لتحليل تدفق قياس الخلايا. بعد تحليل النسبة المئوية لخلايا الدم الحمراء+ GFP من كل عينة (كل عينة هي 5 أجنة مختارة عشوائيا؛ الشكل 1A)، تم حساب متوسط مجموعة التحكم كافة. تم تعيين هذا المتوسط على أنه 1، وتم حساب كافة النسب المئوية من تلك النقطة المرجعية. وتشير هذه البيانات إلى أن الحد من نص ism1 مع MO محددة خفضت عدد GFP+ خلايا الدم الحمراء الموجودة في الجنين 48 حصان. بالإضافة إلى ذلك، إنقاذ هذا الانخفاض في مستويات ism1 مع الحمض النووي الريبي الخارجية عاد عدد خلايا الدم الحمراء إلى وضعها الطبيعي.
الشكل 1: يقلل ism1 MO من عدد خلايا الدم الحمراء المنتجة أثناء تكوين الأجنة. (A) lcr: تم حقن أجنة GFP16 مع PBS وخضعت لتحليل قياس التدفق الخلوي. أولا ، تم تحديد الحجم والحبيبة ، ورسمت بوابة حول مجموعة الخلية ذات الاهتمام(الخلايا، اللوحة اليسرى). ثم تم تقييم FSC H و FSC W للقضاء على الخلايا العالقة معا (singlets FSC). كما تم تقييم SSC H و W للحد من إمكانية تقييم الخلايا العالقة معا (singlets SSC). ثم تم فحص الفلورسينس الأحمر لتحديد الخلايا الحية(الخلايا الحية). وأخيرا، تم فحص الخلايا الحية لفلورة GFP (اللوحة اليمنى). (ب) lcr:تم حقن أجنة GFP12 مع PBS (التحكم، الدوائر)، ism1 MO(ism1 MO، المربعات)، أو ism1 MO + ism1 مرنا12 (الإنقاذ، المثلثات) في مرحلة الخلية الواحدة من التنمية. بعد 48 ساعة، تم جمعها وهضمها وإخضاعها لقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في اللوحة A. تمثل كل نقطة خمسة أجنة فردية تم اختيارها عشوائيا. يتم حساب التغيير أضعاف عن طريق اتخاذ متوسط النسبة المئوية للGFP+ خلايا عينة التحكم ووضع ذلك على النحو 1. تتم مقارنة جميع العينات الأخرى بهذا المتوسط. *p < 0.005، وN.S. = غير مهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | المكونات | تلاحظ |
| متوسط E3 (50x) | 14.61 غرام من NaCl، 0.63 غرام من KCI، 1.99 غرام من MgSO4· 7H2O، 1.83 غرام من CaCl2· 2H2O | إلى اسطوانة 2 L تخرج، إضافة المكونات والمياه المقطرة بما فيه الكفاية ليصل إجمالي حجم إلى 1 L. |
| متوسط E3 (1x) | 40 مل من 50x E3 | إلى اسطوانة تخرج 2 لتر، إضافة ما يكفي من الماء المقطر ليصل إجمالي حجم إلى 2 L. |
| 1-فينيل-2-ثيورينا (PTU) في E3 المتوسطة | 40 مل من 50x E3 في زجاجة 2 لتر، 40 ملغ من وحدة الإرسال الكبرى | إلى اسطوانة تخرج 2 لتر، إضافة ما يكفي من الماء المقطر ليصل إجمالي حجم إلى 2 L. يحرك لمدة يومين على الأقل ليذوب تماما وحدة الإرسال الكبرى. |
الجدول 1: وصفات للحلول.
الشكل التكميلي 1:هضم الأجنة مع بروتياز الفصام. صور 10 أجنة لم يتم هضمها بشكل صحيح (يسار؛ غير مهضوم)، بعد الهضم الكافي (الوسط؛ هضمها)، وبعد الهضم الزائد (يمين؛ عسر الهضم). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2:تقييم اثنين من الفلوروفوريس في 5 أجنة dpf. تم رسم غيتس لتقييمFSC و SSC لتحديد مجموعة الخلايا ذات الاهتمام(الخلايا، العمود الأيسر) ، لتقييم المفردات (غير مبين) ، لتحديد الخلايا الحية(الحية، العمود الأوسط) ، والتعبير الفلوري(mpx:GFP17 و gata1:D SRed15). أولا، تم تعيين البوابات على ليس لديه فلوروفوريس (الصف العلوي). ثم mpx:GFP+ (مع عدم وجود gata1:D sRed) تم تقييم الحيوانات لتعيين البوابات والتعويض عن GFP (الصف الثاني). تم تقييم gata1:D SRed+ (مع عدم وجود mpx:GFP) الحيوانات لتعيين البوابات والتعويض عن DsRed (الصف الثالث). وأخيرا، يمكن تقييم لونين في الحيوانات الإيجابية المزدوجة التي هي mpx:GFP+ و gata1:D sRed+. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حمار وحشي هي نظام نموذج ممتاز لدراسة الهيماتوبويز الفقارية البدائية والنهائية. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطوير العديد من المقايسات وصقلها، مما يسمح لسمك الحمار الوحشي بأن يصبح نموذجا سريعا واقتصاديا لاختبار الأدوية، وتوليد واختبار المسوخ الوراثية، والسماح بشكل عام للباحثين بتحليل المسارات الجزيئية الضرورية لخلايا الدم. يستخدم هذا البروتوكول سمك الحمار الوحشي الجنيني الذي يسمح بجمع البيانات بسرعة ، واستخدام مساحة مادية أقل من الحيوانات البالغة ، واستخدام أدوية أقل للشاشات الكيميائية واسعة النطاق. كما أنه يسمح بالكمية بعد الإفراط في التعبير عن الحمض النووي الريبي ، وتوليد المسوخ CRISPR ، والحد من النسخ الناجمة عن MO لتغيير مسارات وراثية محددة تحدث أثناء التطور الجنيني المبكر. والأهم من ذلك، أنه يسمح بالكمية الحساسة والقوية لخلايا الدم، وهو أمر يصعب القيام به مع تقنيات التهجين في الموقع أو تلطيخ النسيج.
هذا المقايسة مرنة ويمكن تعديلها للإجابة على العديد من الأسئلة البحثية. يمكن إجراء تعديل واحد لهذا البروتوكول حيث يتم التلاعب بمرحلة نمو الحيوان لكمية أنواع خلايا الدم المختلفة. على سبيل المثال ، تنشأ خلايا الدم الحمراء في وقت مبكر من تطور سمك الحمار الوحشي ، ومع الحيوانات المعدلة وراثيا مثل lcr: يمكن اكتشاف خط GFP16 المعدل وراثيا في وقت مبكر من مرحلة 16-somite. إذا كان أحد المهتمين في دراسة thrombocytes، ومع ذلك، فإن itga2b:GFP18 (المعروف أيضا باسم cd41:GFP) خط المعدلة وراثيا يبدأ التعبير عن GFP في 48 حصان، مع thrombocytes تعميم ناضجة لوحظ في 72 حصان. إذا كان أحد يرغب في كمية الخلايا B مع هذا المقايسة ثم يمكن أن يؤديها مع ighm: EGFP19 الحيوانات المعدلة وراثيا أقرب إلى 20 dpf. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا المقايسة لمتابعة خلايا الدم مع مرور الوقت. على سبيل المثال ، من خلال تحليل أعداد lcr: GFP+ الخلايا في 24 hpf ، 48 hpf ، 72 hpf ، يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كان التعديل الوراثي (أو الدواء) ينظم الحفاظ على خلايا الدم الحمراء مقابل جيلها فقط.
تسمح هذه المقايسات للباحثين بالحد من التعبير الجيني مع CRISPR أو MOs أو التعبير الجيني المفرط عن طريق حقن الحمض النووي الريبي في مرحلة الخلية الواحدة من التطور ومقارنة عدد خلايا الدم المنتجة في هذه الأجنة المعدلة بدقة. وينبغي دائما توخي الحذر لإجراء الضوابط المناسبة لهذه التجارب في نفس الوقت عن طريق حقن الحيوانات الشقيقة مع RNAs دليل غير محدد أو MOs غير متطابقة وفحص دمائهم جنبا إلى جنب مع المجموعات التجريبية. إن المرحلة التنموية حاسمة؛ التعديلات من بضع ساعات فقط أثناء التنمية يمكن أن تظهر أعدادا مختلفة إلى حد كبير من خلايا الدم الموجودة في الجنين. وبعبارة أخرى، تأكد من مراقبة ساعات النمو بعناية عند مقارنة الأجنة. ولضمان مطابقة الأجنة للعمر، ينبغي استخدام الإشارات المورفولوجية. في الأجنة المبكرة، فكر في عد السخامات لمطابقة العمر. في وقت لاحق في التنمية، وعلامات أخرى مثل بداية ضربات القلب، وحجم الحويذة otic، أو طول الجسم يمكن استخدامها لتتناسب مع مراحل الأسماك المعدلة للسيطرة على الأسماك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعداد أعداد الخلايا الكلية من الأجنة المهضومة لضمان وجود نفس العدد من الخلايا في الحيوانات التجريبية والسيطرة عليها. بالإضافة إلى استخدام هذه المقايسات لفحص التعديل الوراثي، يمكن أيضا تعديل هذه المقايسات لإجراء شاشات الأدوية على نطاق واسع. يمكن أن تتعرض الأجنة لتركيزات مختلفة من المركبات مؤقتا أثناء التطور لمعرفة ما إذا كانت المواد الكيميائية المعنية لها أي تأثير على الهيماتوبويز. إذا تم تصميم التجربة لاختبار تأثير دواء معين ، فيجب أيضا تضمين الحيوانات المعالجة بالمركبة فقط كعنصر تحكم. وبهذه الطرق، يمكن للباحثين تحديد ما إذا كان اكتساب أو فقدان وظيفة جينات محددة أو مسارات الإشارات تلعب دورا أساسيا في الهيماتوبويز.
ومن الضروري عند فحص مختلف المتحولين أن يتم تحسين عدد الحيوانات المهضومة لكل عينة؛ عدد قليل جدا من الحيوانات قد تولد القليل أو لا تضان. وينطبق هذا بشكل خاص عند فحص HSPCs التي ليست وفيرة في نقطة زمنية معينة. ومن الأهمية بمكان أيضا عند فحص المعدلات وراثيا التي لديها ضعف المروجين القيادة الفلورية. لمواجهة هذه القضايا هناك حاجة إلى المزيد من الحيوانات (وبالتالي المزيد من الخلايا) لأعداد دقيقة. عند تغيير مراحل النمو ، من المهم أيضا تحسين وقت الهضم. تم تحسين هذا البروتوكول ل 5 أجنة فردية 48 حصان لكل أنبوب. من المرجح أن يتطلب هضم أجنة أكثر نضجا وقتا أطول.
يمكن أن تنشأ بعض المشاكل المحتملة أثناء الإجراء. إذا لم يكن هناك مضان لوحظ، يمكن أن يكون هناك مشكلة فنية مع السيتومتر التي تحتاج إلى حل. ولهذا السبب، من الضروري التحقق من أن الأجنة فلورية قبل بدء العملية عن طريق فحصها بسرعة تحت المجهر. وثمة مسألة شائعة أخرى هي الإفراط في هضم الأجنة، مما يدمر الخلايا. الحرص في خطوة الهضم وتغيير توقيت إذا لوحظ عدد كبير جدا من الخلايا الميتة.
هذه المقايسات لها بعض القيود. والمسألة الأكبر هي أن هذه المقايسات تعتمد على التعبير عن علامة معدلة وراثيا. قد لا يعكس تغيير تعبير العلامة المعدلة وراثيا بيولوجيا ما يحدث في الجنين. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يكون قياس التدفق الخلوي أفضل طريقة لكمية الخلايا إذا كان عدد الخلايا المستهدفة منخفضا للغاية. للتعامل مع هذه الاحتمالات، يمكن استخدام المقايسات الأخرى مثل تقنيات التلطيخ في الموقع أو النسيجية. إذا كانت هناك أجسام مضادة محددة لنوع الخلية من الكيمياء المناعية الفائدة يمكن أيضا أن يؤديها. ويمكن أيضا أن تخضع الأجنة لqRT-PCR لقياس النسب جينات محددة، وإذا تم إجراء هذه المقايسات على جهاز FACS، يمكن عزل الخلايا ودرسها بشكل فردي مع أساليب أكثر حساسية. وباستثناء هذه القضايا، يمكن أن يولد هذا المقايسة الكمية لقياس التدفق الخلوي الكثير من المعلومات المفيدة للباحثين.
مع هذه المقايسات ، يمكن للباحثين بسهولة مراقبة عيوب الدم في الحيوانات الفقارية. تعديل المسارات الوراثية مع MOs أو CRISPR ومن ثم إجراء قياس التدفق الخلوي لتوضيح ما إذا كان الجين يلعب دورا في الهيماتوبويز يمكن القيام به بسرعة وكميا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الشاشات الوراثية الأمامية (طالما أن الحيوانات لديها علامة فلورية) وتقييم العيوب. كما أصبحت Zebrafish نموذجا ممتازا لشاشات المخدرات على نطاق واسع6،7،8،9،10، مما يسمح بكفاءة فحص الأدوية على الكائنات الحية لمراقبة ما إذا كانت الأدوية فعالة وإذا كان لها آثار سلبية على التنمية / البقاء على قيد الحياة. اقتران هذا المقايسة مع تكنولوجيا قياس التدفق الآلي التي تعززها الروبوتات من شأنه أن يجعلها أكثر كفاءة20،21،22، مما يسمح حقا تحليل واسع النطاق وفحص المسارات الهامة في تكوين خلايا الدم ، والنمو ، والتنظيم التي لا تزال غامضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. هو مستشار علمي وحصل على تعويض من شركة فينليس للأغذية وشركة Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. تعلن عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد القومية للصحة: R15 DK114732-01 إلى D.L.S.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF: MRI 1626406 إلى D.L.S.) ، ومن برنامج الشرف في جامعة ولاية كاليفورنيا شيكو (إلى K.F.R. ). يشكر المؤلفان بيتسي تاميتي على إدارة المختبر وكاثي جونز على المساعدة الإدارية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
