Summary
Denne analysen er en enkel metode for å kvantifisere hematopoietiske celler i utviklingen av embryonal sebrafisk. Blodceller fra dissosiert sebrafisk blir utsatt for strømningscytometrianalyse. Dette gjør det mulig å oppdage blodfeil hos mutante dyr og etter genetisk modifikasjon.
Abstract
Mangfoldet av celleavstamninger som består av modent blod i virveldyrdyr oppstår fra differensiering av hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Dette er en kritisk prosess som oppstår gjennom hele levetiden til organismer, og forstyrrelse av molekylære veier involvert under embryogenese kan ha katastrofale langsiktige konsekvenser. Av mange grunner har sebrafisk (Danio rerio) blitt en modellorganisme for å studere hematopoiesis. Zebrafish embryoer utvikler seg eksternt, og med 7 dager postfertilisering (dpf) har produsert de fleste av undertypene av definitive blodlegemer som vil vedvare for livet. Analyser for å vurdere antall hematopoietiske celler er utviklet, hovedsakelig ved hjelp av spesifikke histologiske flekker, in situ hybridiseringsteknikker og mikroskopi av transgene dyr som bruker blodcellespesifikke promotorer som driver uttrykket av fluorescerende proteiner. Imidlertid kvanterer de fleste fargeanalyser og in situ hybridiseringsteknikker ikke nøyaktig antall blodceller som er tilstede; Bare store forskjeller i celletall visualiseres enkelt. Bruk av transgene dyr og analyse av individer med fluorescerende eller konfektmikroskopi kan utføres, men mengden av disse analysene er avhengig av enten å telle manuelt eller bruke dyr bildebehandlingsprogramvare, som begge kan gjøre feil. Utvikling av ytterligere metoder for å vurdere blodcelletall ville være økonomisk, raskere og til og med kunne automatiseres for raskt å vurdere effekten av CRISPR-mediert genetisk modifikasjon, morpholino-mediert transkripsjonsreduksjon og effekten av legemiddelforbindelser som påvirker hematopoiesis i stor skala. Denne nye analysen for å kvantisere blodceller utføres ved å dissosiere hele sebrafiskembryoer og analysere mengden fluorescerende merkede blodlegemer tilstede. Disse analysene bør tillate belysning av molekylære veier som er ansvarlige for blodcellegenerering, ekspansjon og regulering under embryogenese, noe som gjør det mulig for forskere å oppdage nye faktorer som er endret under blodsykdommer, samt veier som er essensielle under utviklingen av virveldyr hematopoiesis.
Introduction
Blodproduksjon (hematopoiesis) er en viktig utviklingsprosess som først starter i det tidlige embryoet. Denne prosessen begynner med å generere primitive røde blodlegemer og makrofager direkte fra mesoderm, og skifter senere mot produksjon av hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer). Disse stamcellene, som er multipotente, genererer alle varianter av modne blodlegemer i organismen. Systemet er i stand til selvfornyelse, og etterfylles kontinuerlig gjennom disse HSPCene. Mens denne prosessen starter tidlig i utviklingen, fortsetter hematopoiesis for dyrets liv, og gir evnen til å transportere oksygen til fjerne steder i kroppen, for å stoppe blødning etter skade og for å beskytte kroppen mot infeksjon. Utviklingen av dette komplekse systemet kontrolleres timelig og romlig under utvikling, og eventuelle perturbasjoner i blodcelleproduksjon kan være katastrofale for organismen, noe som resulterer i anemi, trombocytopeni, leukopeni og leukemi.
En populær dyremodell som brukes til hematopoietisk forskning er sebrafisken (Danio rerio) fordi de har lignende blodutvikling sammenlignet med mennesker. Faktisk er mange av genene og molekylære veier som brukes under hematopoiesis bevart gjennom virveldyrutvikling, slik at vi kan lære om menneskelige gener ved å studere sebrafisk. Det er viktig at sebrafiskembryoer utvikler seg utenfor kroppen, og innen 7 dager har generert de mest modne blodcelletypene, noe som gir direkte visualisering av det hematopoietiske systemet på kort tid. Sebrafisk er også ekstremt fecund, noe som gjør det mulig for forskere å observere et større antall prøver på kort tid, noe som også er viktig for å generere reproduserbare data. Sebrafiskens korte generasjonstid og eksterne utvikling gir enklere manipulering og observasjon under mutagenesestudier1,2,3,4,5 og legemiddelscreening6,7,8,9,10. Dette gjør at et panel med lovende terapeutiske forbindelser for menneskelige blodsykdommer raskt og effektivt kan testes.
Det er viktig at sebrafisk også er genetisk mottagelig, og genomet er sekvensert og kommentert. Denne luftbarheten gjør det mulig å utføre omvendte genetikkteknikker som morpholino- (MO-) mediert knockdown og CRISPR-mediert genetisk ablasjon. Sebrafisk har også bevist deres nytte som modell for å utføre fremover genetiske skjermer; mange essensielle gener og veier involvert i virveldyr bloddannelse har blitt oppdaget på denne måten. Tallrike metoder for å observere blodceller har også blitt utviklet i sebrafisk. Mens tradisjonelle histologiske fargingsteknikker eksisterer, er det også mulig å utføre in situ hybridisering for blodspesifikke transkripsjoner. Det er viktig at det også finnes mange transgene linjer med fisk der fluorescerende proteiner uttrykkes av avledningsspesifikke promotorer, slik at merking av spesifikke blodlegemer med fluorescerende proteiner11. Dette gjør det mulig for forskere å utføre opp-til-minutt observasjon av blodcelle genesis, ekspansjon og regulering i en levende organisme over tid.
Totalt sett har bevaring av det hematopoietiske systemet, tilstedeværelsen og enkel utvikling av transgene linjer, enkel visualisering og kort generasjonstid gjort sebrafisken til en økonomisk, rask og tilpasningsdyktig modell av hematopoiesis. For å forbedre verktøykassen for teknikker som er tilgjengelige for sebrafiskforskere, utviklet vi denne analysen for å kvantifisere antall blodceller i embryoer på en robust måte. Metoden innebærer å fordøye transgene dyr og utføre strømningscytometri for fluorescerende blodlegemer. På denne måten kan blodceller fra mutante dyr, effekten av MO og CRISPR modifikasjon, og effekten av små molekyler analyseres kvantitativt på en rask og reproduserbar måte. Disse analysene er brukervennlige og økonomiske måter å liste opp blodceller på, slik at undersøkelse av deres generasjon, spredning og vedlikehold over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) rådgivende styre ved California State University, Chico, godkjente alle metoder beskrevet nedenfor.
MERK: Det anbefales å behandle embryoer med 1-fenyl 2-tiourea (PTU; Tabell 1) på 24 timer postfertilisering (hpf) for å forhindre pigmentering som påvirker fluorescensdiskriminering negativt ved strømningscytometri. Alle prosedyrer som er oppført nedenfor er akseptable for strømningscytometri og fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Men hvis ens mål er å dyrke hematopoietiske celler etter FACS, så hold deg til steril praksis ved behandling av prøver. Protokollen for bleking og tilberedning av embryoprøver på en steril måte er beskrevet tidligere12.
1. Dechorionation av 48 hpf sebrafisk embryoer
- Med embryoer (minst 5, men ikke mer enn 200 embryoer) i en 10 cm plast Petri-tallerken, vipp parabolen slik at embryoene synker til bunnkanten.
MERK: Det er lett å vippe parabolen ved å ta av lokket og plassere lokket under den ene kanten av Petri-parabolen. - Fjern og kast så mye E3 medium (Tabell 1) som mulig og tilsett 500 μL dechorionation protease (10 mg/ml). Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Etter 5 min, plukk opp Petri-parabolen (hold alle embryoene i bunnkanten av platen), og trykk forsiktig på siden av Petri-parabolen, slik at embryoer forsiktig gni mot bunnen av platen for å fjerne chorions helt.
- Med en klemmeflaske, tilsett ~ 20 ml E3 medium for å fortynne protease. La embryoer bosette seg og fjerne E3-mediet ved å dekantere.
- Gjenta trinn 1.4 3x for å fjerne alle spor av dechorionation protease.
MERK: For hver enkelt prøve å analysere, er det nødvendig med minst 5 embryoer. Denne dechorionation prosedyren kan romme opptil 200 embryoer per Petri parabolen. Prøver kan grupperes på dette stadiet og separeres senere hvis ønskelig. Alternativt kan manuell dechorionation utføres ved å forsiktig rive korionene med urmakerens tang. Dette er fordelaktig når det er lite antall embryoer. Vanligvis vil sebrafisk klekkes fra sine korioner med 72 hkf. Alvorlig misformede embryoer kan imidlertid ikke, og vil kreve dechorionation (enten manuell eller kjemisk) etter den tiden.
2. Utarbeidelse av embryoprøver for dissosiasjon
- Bruk en P1000 pipette og plasser 5-10 embryoer i et enkelt mikrocentrifugerør på 1,5 ml.
- Fjern E3-mediet med en pipette og kast den.
FORSIKTIG: Pipette med forsiktighet da embryoer lett kan kastes under følgende trinn. - Tilsett 1 ml 10 mM dithiothreitol (DTT) i E3 medium for å fjerne slimbelegget rundt den embryonale sebrafisken11,12,13,14. Legg mikrocentrifugerøret horisontalt, og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
3. Embryo dissosiasjon
- Vask embryoene 3x med 1 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) med Ca2+ og Mg2+ for å fjerne spor av DTT. Etter siste vask tilsettes 500 μL DPBS med Ca2+ og Mg2+ og 5 μL 5 mg/ml (26 U/ml) dissosiasjonsprotease.
MERK: Andre isotoniske bufrede løsninger kan brukes, men de må inneholde Ca2+ og Mg2+ for at dissosiasjonsenzymet skal fungere ordentlig. - Inkuber prøver ved 37 °C på en horisontal orbital shaker ved 185 o/min i 60 minutter. Triturat embryoer med en P1000 pipette til prøvene er fullstendig dissosiert.
FORSIKTIG: Pass på at du ikke overfordrer embryoene; noe fast vev skal være til stede, og det bør ikke være helt homogent. Det er mulig å overdigest, noe som vil ødelegge målblodcellene som skal observeres på strømningscytometeret (Supplerende figur 1).
MERK: Denne prosedyren fungerer best for 48-72 hpf embryoer. Senere stadier kan kreve lengre inkubasjon med dissosiasjonsprotease. Tidspunkt for ulike stadier må bestemmes empirisk. Det finnes raskere alternative metoder for å dissosiere embryonalt vev, men det er empirisk at denne metoden, selv om den tar 60 min, er mild og grundig nok til å tillate effektiv isolasjon av levende hematopoietiske celler.
4. Fremstilling av dissosierte embryoer for strømningscytometri
- Pipette de 5 dissosierte embryoene på toppreservoaret til et 5 ml polystyren rundt bunnrør med en 35 μmM cellesilhette.
- Skyll cellene ved å tilsette 4 ml fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca2+ eller Mg2+ til silhetten på 5 ml polystyrenrøret som inneholder de filtrerte cellene.
MERK: Andre isotoniske bufrede løsninger kan også brukes, men de bør mangle Ca2+ eller Mg2+ for å fortynne og gjøre dissosiasjonsenzymet ineffektivt. - Sentrifugerør ved 4 °C og 300 x g i 5 minutter for å pellet cellene. Med en pipette, fjern og kast supernatant. Resuspend cellene i 500 μL AV PBS (uten Ca2 + eller Mg2 +).
5. Flowcytometri
- Virvel celleopphenget forsiktig og tilsett 1:1000 rød død celleflekk (Materialfortegnelse).
MERK: Den røde døde celleflekken er et cellegjennomtrengelig fargestoff som tillater utelukkelse av døde celler og rusk fra målceller og er et utmerket valg av fargestoff for dødcellediskriminering, fordi den er begeistret av 633 nm laser, som er forskjellig fra 488 nm laser som brukes til å begeistre vanlige fluoroforer som grønt fluorescerende protein (GFP) og DsRed. På denne måten er det ingen spektral overlapping fra døde celler og transgene blodlegemer. Propidiumjodid (PI) ved 1 mg/ml er et billig alternativ til den røde døde celleflekken, men sørg for å reservere noen prøver som bare er farget med PI, samt prøver bare med fluorofor av interesse for å sette instrumentkompensasjonen. Ellers vil signalene fra PI og fluoroforer som GFP overlappe, noe som resulterer i falske positive resultater. Hvis strømningscytometeret også har en 405 nm laser, er andre fargestoffer som blå pappacelleflekk også et utmerket valg.
FORSIKTIG: Når du analyserer blodceller, vær oppmerksom på at etter 30 min vil visse celletyper begynne å fagocytose den røde døde celleflekken. Hold cellene beskyttet mot lys og på is til de analyserer og utfører strømningscytometri innen 30 minutter etter tilsetning av fargestoffet. - Analyse av strømningscytometri
MERK: Hvert strømningscytometer er litt annerledes, men følgende trinn vil hjelpe deg med å forberede prøver for analyse på de fleste maskiner. For brukere som ikke har brukt cytometri før, kan du søke råd fra noen som er ekspert på det aktuelle utstyret. Følgende instruksjoner gjelder BD FACSAria Fusion flow cytometer.- Slå på cytometeret og la lasere varme opp i 20 minutter. Tom avfallstank, fyll hylsetank med passende løsning (varierer basert på strømningscytometer) og start fluidikksystemet.
MERK: Det er vanligvis en bestemt oppstart prosedyre for hver type strømning cytometer; følg denne oppstartsprosedyren nøye. - I analyseprogramvaren tegner du fem plott (Figur 1A).
- Få den første prikkplottet til å måle fremover punkt (FSC) på x-aksen og sidespredningen (SSC) på y-aksen. Angi FSC som lineær og SSC som logg.
MERK: FSC er et mål på cellestørrelse, og SSC er et mål på granularitet; Dette vil tillate diskriminering av celler fra rusk. Embryonale sebrafisk blodcellepopulasjoner skiller ikke etter størrelse og granularitet på samme måte som voksne sebrafiskblodceller beskrevet tidligere15. I stedet vil de vises i samme befolkning med alle de andre fordøyde embryonale cellene. - Angi at det andre plottet skal undersøke FSC-høyden (H) kontra FSC-bredden (W). Angi at det tredje plottet skal måle SSC (H) versus SSC (W).
MERK: Dette trinnet brukes til å utelukke dobler (celler som sitter fast sammen når de passerer gjennom laseren). - Angi den fjerde prikkplottet for å måle den røde døde celleflekken på x-aksen (avhengig av cytometeret tilsvarer dette vanligvis filteret som brukes for allophycocyanin [APC]) og SSC på y-aksen. Dette vil tillate diskriminering av levende celler fra døde celler.
MERK: Filtersettene til hvert cytometer kan være forskjellige. Sørg for å bruke riktig deteksjonsfilter for dødcellediskrimineringsfargen. - Den femte tomten måler den valgte fluoroforen. Visualiser dette som et histogram av fluoroforen (figur 1) eller bruk en prikkplott (Supplerende figur 2).
MERK: Når du undersøker mer enn en fluorofor i samme dyr, anbefales det å bruke en prikkplott for å se begge parametrene samtidig. Hvis det er noen sjanse for at fluoroforene har spektral overlapping med hverandre (Supplerende figur 2), anbefales også en prikkplott. Bruk innstillingene for Areal (A) til å beregne området under kurven som genereres av laserpulsen til cytometeret for alle parametere, fordi de er mer nøyaktige.
- Få den første prikkplottet til å måle fremover punkt (FSC) på x-aksen og sidespredningen (SSC) på y-aksen. Angi FSC som lineær og SSC som logg.
- Last inn prøven og reduser strømningshastigheten slik at prøven ikke går ut raskt. Juster FSC- og SSC-innstillingene slik at hoveddelen av cellepopulasjonen tydelig kan ses (Figur 1A).
- Tegn en port rundt cellepopulasjonen, og merk den med celler. Kontroller at det andre prikkplottet er inngjerdet på celler, utelat dobler ved først å stirre på FSC og deretter på SSC-singleter.
- På den fjerde tomten justerer du innstillingene for rød dødcelleflekk slik at det tydeligvis er en negativ befolkning. Tegn en port rundt disse cellene, og merk dem levende celler. På den femte tomten, gate på levende celler og undersøke fluorofor negative og positive celler. Tegn en port rundt de positive cellene.
MERK: Denne hierarkiske gating strategien undersøker enkelt fluorofor+ celler som ligger i live celle gate, som også ligger i celleporten. Pass på å stille inn portene riktig. Disse portene kan tilpasses avhengig av eksperimentet. - Kjør hvert eksempel og samle inn minst 25 000 live cellehendelser.
- Følg avslutningsprosedyren for å slå av flytene. Fyll på hylsetanken og tøm avfallstanken.
MERK: Det er ofte vanskelig å visualisere fluorofor+ celler når proteinuttrykket er lavt, eller cellepopulasjonen er sjelden. For å sikre at parametrene er riktig innstilt, bør fluorofor- søskenembryoer tilberedes ved siden av for å tegne porter riktig og justere laserspenninger (Supplerende figur 2). Hvis populasjonen i målcellen er sjelden, samler du inn mer enn 25 000 hendelser. Med 5-10 fordøyde dyr skal man kunne samle millioner av hendelser. Totalt antall fluorofor+ celler kan også oppnås med disse dataene. Bare tell det totale antall celler i prøven med et hemocytometer og multipliser prosentandelen fluorofor+ celler for å oppnå det absolutte antall fluorofor+ celler per fisk.
- Slå på cytometeret og la lasere varme opp i 20 minutter. Tom avfallstank, fyll hylsetank med passende løsning (varierer basert på strømningscytometer) og start fluidikksystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å liste opp røde blodlegemer i embryonal sebrafisk ble lcr:GFP16 embryoer injisert i encellet stadium med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO eller 7,0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Ved 48 hkf ble de fordøyd og utsatt for strømningscytometrianalyse. Etter å ha analysert prosentandelen av GFP+ røde blodlegemer fra hver prøve (hver prøve er 5 tilfeldig utvalgte embryoer; Figur 1A), ble gjennomsnittet av hele kontrollgruppen beregnet. Dette gjennomsnittet ble satt til 1, og alle prosentene ble beregnet fra dette referansepunktet. Disse dataene indikerer at reduksjon av ism1 transkripsjon med en bestemt MO reduserte antall GFP+ røde blodlegemer tilstede i 48 HPF embryo. I tillegg, redde denne reduksjonen i ism1 nivåer med eksogen mRNA returnerte antall røde blodlegemer til normal.
Figur 1: ism1 MO reduserer antall røde blodlegemer produsert under embryogenese. (A) lcr:GFP16 embryoer ble injisert med PBS og utsatt for strømningscytometrianalyse. Først ble størrelse og granularitet bestemt, og en port ble tegnet rundt cellepopulasjonen av interesse (celler, venstre panel). Deretter ble FSC H og FSC W evaluert for å eliminere celler som sitter fast sammen (singler FSC). SSC H og W ble også evaluert for å redusere muligheten for å evaluere celler som sitter fast sammen (singles SSC). Rød fluorescens ble deretter undersøkt for å bestemme levende celler (levende celler). Til slutt ble levende celler undersøkt for GFP-fluorescens (høyre panel). (B) lcr:GFP12 embryoer ble injisert med PBS (kontroll, sirkler), ism1 MO (ism1 MO, firkanter), eller ism1 MO + ism1 mRNA12 (redning, trekanter) på encellet stadium av utviklingen. Etter 48 timer ble de samlet inn, fordøyd og utsatt for strømningscytometri som vist i panel A. Hvert punkt representerer fem tilfeldig valgte individuelle embryoer. Bretteendring beregnes ved å ta den gjennomsnittlige prosentandelen av GFP+ celler i kontrollprøven og angi den som 1. Alle andre prøver sammenlignes med det gjennomsnittet. *p < 0,005 og N.S. = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Ingredienser | Notater |
| E3-medium (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4·7H2O, 1,83 g CaCl2·2H2O | Til en 2 L gradert sylinder, legg til ingrediensene og nok destillert vann til å bringe det totale volumet til 1 L. |
| E3-medium (1x) | 40 ml 50x E3 | Til en 2 L gradert sylinder, legg til nok destillert vann til å bringe det totale volumet til 2 L. |
| 1-Fenyl-2-thiourea (PTU) i E3 medium | 40 ml 50x E3 i en 2 L flaske, 40 mg PTU | Til en 2 L gradert sylinder, legg til nok destillert vann til å bringe det totale volumet til 2 L. Rør i minst 2 dager for å fullstendig oppløse PTU. |
Tabell 1: Oppskrifter på løsninger.
Supplerende figur 1: Fordøyelse av embryoer med dissosiasjonsprotease. Bilder av 10 embryoer ikke riktig fordøyd (venstre; ufordøyd), etter tilstrekkelig fordøyelse (midten, fordøyd), og etter overflødig fordøyelse (høyre; overfordøyd). Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Evaluering av to fluoroforer i 5 dpf embryoer. Porter ble tegnet for å evaluereFSC og SSC for å bestemme cellepopulasjonen av interesse (celler, venstre kolonne), for å evaluere singlets (ikke vist), for å bestemme levende celler (levende, midtre kolonne) og fluoroforeuttrykk (mpx:GFP17 og gata1:D sRed15). Først ble porter satt på et dyr som ikke har fluoroforer (øverste rad). Deretter ble mpx:GFP+ (uten gata1:D sRed) dyr evaluert for å sette portene og kompensasjonen for GFP (andre rad). gata1:D sRed+ (uten mpx:GFP) dyr ble evaluert for å sette portene og kompensasjonen for DsRed (tredje rad). Til slutt kan de to fargene evalueres i doble positive dyr som er mpx:GFP+ og gata1:D sRed+. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk er et utmerket modellsystem for å studere primitive og definitive virveldyr hematopoiesis. I løpet av de siste tiårene har flere analyser blitt utviklet og raffinert, slik at sebrafisk kan bli en rask og økonomisk modell for testing av narkotika, generering og testing av genetiske mutanter, og generelt slik at forskere kan analysere molekylære veier som er avgjørende for hematopoiesis. Denne protokollen benytter embryonal sebrafisk som muliggjør rask datainnsamling, bruk av mindre fysisk plass enn voksne dyr, og bruk av mindre stoffer til store kjemiske skjermer. Det tillater også kvantgering etter overekspressering av mRNA, generering av CRISPR-mutanter og MO-indusert transkripsjonsreduksjon for å endre spesifikke genetiske veier som oppstår under tidlig embryonal utvikling. Det er viktig at det tillater sensitiv, robust mengde blodceller, noe som er vanskelig å gjøre med in situ hybridisering eller histologiske fargingsteknikker.
Denne analysen er fleksibel og kan endres for å svare på mange forskningsspørsmål. En modifikasjon av denne protokollen kan utføres der dyrets utviklingsstadium manipuleres for å kvantisere forskjellige blodcelletyper. For eksempel oppstår røde blodlegemer tidlig i sebrafiskutviklingen, og med transgene dyr som lcr:GFP16 kan transgen linje oppdages så tidlig som 16-somite stadium. Hvis man er interessert i å studere trombocytter, men itga2b:GFP18 (også kjent som cd41:GFP) transgene linje begynner å uttrykke GFP på 48 HPF, med modne sirkulerende trombocytter observert ved 72 HPF. Hvis man ønsker å kvantisere B-celler med denne analysen, kan den utføres med ighm:EGFP19 transgene dyr nærmere 20 dpf. Viktigst, denne analysen kan også brukes til å følge blodceller over tid. For eksempel, ved å analysere antall lcr:GFP+ celler ved 24 HPF, 48 HPF, 72 HPF, kan man avgjøre om en genetisk modifikasjon (eller stoff) regulerer vedlikehold av røde blodlegemer kontra bare deres generasjon.
Disse analysene gjør det mulig for forskere å redusere genuttrykket med CRISPR eller MOs eller overekspress genuttrykk ved å injisere mRNA på encellet utviklingsstadium og nøyaktig sammenligne antall blodceller produsert i disse modifiserte embryoene. Det bør alltid tas hensyn til å utføre riktige kontroller for disse eksperimentene samtidig ved å injisere søskendyr med ikke-spesifikke guide RNAer eller uoverensstemmende MOer og undersøke blodet deres sammen med eksperimentelle grupper. Utviklingsstadiet er kritisk; endringer på bare noen få timer under utviklingen kan vise svært forskjellige antall blodceller tilstede i et embryo. Med andre ord, sørg for å nøye overvåke timene med utvikling når du sammenligner embryoer. For å sikre at embryoer er alderstilpassede, bør morfologiske signaler brukes. I tidlige embryoer, vurder å telle somitter til alderskamp. Senere i utviklingen kan andre markører som begynnelsen av hjertet slå, størrelsen på otic vesicle, eller lengden på kroppen brukes til å matche stadier av modifisert fisk for å kontrollere fisk. Videre kan antall totale celler listes opp fra fordøyde embryoer for å sikre at samme antall celler er til stede i eksperimentelle og kontrollere dyr. I tillegg til å bruke disse analysene til å undersøke genetisk modifikasjon, kan disse analysene også endres for å utføre store narkotikaskjermer. Embryoer kan bli utsatt for forskjellige konsentrasjoner av forbindelser temporally under utvikling for å se om de aktuelle kjemikaliene har noen effekt på hematopoiesis. Hvis eksperimentet er designet for å teste effekten av et bestemt stoff, bør dyr som behandles med kjøretøy bare inkluderes som en kontroll. På disse måtene kan forskere avgjøre om gevinst- eller funksjonstap av spesifikke gener eller signalveier spiller en viktig rolle i hematopoiesis.
Det er viktig at når du undersøker forskjellige transgenes at antall dyr fordøyd per prøve er optimalisert; for få dyr kan generere liten eller ingen fluorescens. Dette gjelder spesielt når du undersøker HSPCer som ikke er rikelig på et bestemt tidspunkt. Det er også kritisk når man undersøker transgener som har svake promotører som driver fluorescens. For å motvirke disse problemene kreves flere dyr (og dermed flere celler) for nøyaktige tellinger. Når du endrer utviklingsstadier, er det også viktig å optimalisere fordøyelsestiden. Denne protokollen er optimalisert for 5 individuelle 48 hkf embryoer per rør. Fordøye mer modne embryoer vil sannsynligvis kreve lengre tid.
Noen potensielle problemer kan oppstå under prosedyren. Hvis det ikke observeres fluorescens, kan det være et teknisk problem med cytometeret som må løses. Av denne grunn er det viktig å verifisere at embryoene er fluorescerende før du begynner prosedyren ved raskt å sjekke dem under et mikroskop. Et annet vanlig problem er å fordøye embryoene, noe som ødelegger cellene. Ta vare på fordøyelsestrinnet og endre timingen hvis for mange døde celler blir observert.
Disse analysene har noen begrensninger. Det største problemet er at disse analysene er avhengige av uttrykket av en transgen markør. Potensielt kan endringen av den transgene markørens uttrykk ikke gjenspeile biologien til det som skjer i embryoet. I tillegg kan strømningscytometri ikke være den beste metoden for å kvantisere celler hvis målcellepopulasjonen er ekstremt lav. For å håndtere disse mulighetene kan andre analyser som in situ eller histologiske fargingsteknikker benyttes. Hvis det finnes spesifikke antistoffer for celletypen av interesse, kan immunhiistokjemi også utføres. Embryoer kan også bli utsatt for qRT-PCR for å måle avledningsspesifikke gener, og hvis disse analysene utføres på en FACS-maskin, kan cellene isoleres og studeres individuelt med enda mer følsomme metoder. Ekskludert disse problemene kan denne kvantitative strømningscytometrianalysen generere mye nyttig informasjon for forskere.
Med disse analysene kan forskere lett observere hematopoietiske defekter hos virveldyrdyr. Modifisere genetiske veier med MOs eller CRISPR og deretter utføre strømningscytometri for å belyse om genet spiller en rolle i hematopoiesis kan gjøres raskt og er kvantitativt. I tillegg kan fremovergenetiske skjermer (så lenge dyrene har en fluorescerende tag) utføres og feil vurderes. Sebrafisk har også blitt en utmerket modell for store legemiddelskjermer6,7,8,9,10, slik at effektive legemiddelscreeningsanalyser på levende organismer kan observere om stoffene er effektive og om de har negative effekter på utvikling / overlevelse. Å koble denne analysen med automatisert strømningscytometriteknologi forbedret av robotikk ville gjøre den enda mer effektiv20,21,22, slik at virkelig storskala analyse og screening av veier som er viktige i blodcelle genesis, vekst og regulering som forblir uklare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. er vitenskapelig konsulent og har mottatt kompensasjon fra Finless Foods, Inc. og Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Støtten ble gitt av National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 til D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MR 1626406 til D.L.S.), og fra Honor's Program ved California State University Chico (til K.F.R.). Forfatterne takker Betsey Tamietti for laboratorieledelse og Kathy Johns for administrativ bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
