Summary
Bu tahlil, embriyonik zebra balığı geliştirmede hematopoetik hücreleri miktarlandırmak için basit bir yöntemdir. Ayrışmış zebra balıklarından alınan kan hücreleri akış sitometrisi analizine tabi tutulur. Bu, mutant hayvanlarda ve genetik modifikasyondan sonra kan kusurlarının tespit edilmesine izin verir.
Abstract
Omurgalı hayvanlarda olgun kanı oluşturan hücre soylarının çeşitliliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC' ler) farklılaşmasından kaynaklanmaktadır. Bu, organizmaların ömrü boyunca meydana gelen kritik bir süreçtir ve embriyogenez sırasında söz konusu moleküler yolların bozulması uzun vadeli felaket sonuçlar doğurabilir. Çok sayıda nedenden dolayı, zebra balığı (Danio rerio) hematopoez çalışmak için örnek bir organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyoları dışarıdan gelişir ve 7 gün postfertilizasyon (dpf) ile yaşamları boyunca devam edecek kesin kan hücrelerinin alt tiplerinin çoğunu üretmiş olurlar. Hematopoetik hücrelerin sayısını değerlendirmek için, esas olarak spesifik histolojik lekeler, in situ hibridizasyon teknikleri ve floresan proteinlerin ekspresyonunu yönlendiren kan hücresine özgü promotörleri kullanan transgenik hayvanların mikroskopisi kullanılarak tahliller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çoğu boyama tahlilleri ve yerinde hibridizasyon teknikleri mevcut kan hücrelerinin sayısını doğru bir şekilde miktarlandırmaz; yalnızca hücre sayılarındaki büyük farklılıklar kolayca görselleştirilir. Transgenik hayvanların kullanılması ve floresan veya konfokal mikroskopisi olan bireylerin analiz edilmesi yapılabilir, ancak bu tahlillerin niceliği manuel olarak saymaya veya her ikisi de hata yapabilen pahalı görüntüleme yazılımı kullanmaya dayanır. Kan hücresi sayılarını değerlendirmek için ek yöntemlerin geliştirilmesi ekonomik, daha hızlı olacaktır ve hatta CRISPR aracılı genetik modifikasyonun, morfoino aracılı transkript azaltmanın ve hematopoezleri büyük ölçekte etkileyen ilaç bileşiklerinin etkisini hızlı bir şekilde değerlendirmek için otomatikleştirilebilir. Kan hücrelerini nicelleştirmek için yapılan bu yeni test, tüm zebra balığı embriyolarının ayrıştırularak ve floresan etiketli kan hücrelerinin miktarının analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu tahliller, embriyogenez sırasında kan hücresi üretimi, genişlemesi ve düzenlenmesinden sorumlu moleküler yolların aydınlatılmasına izin vermelidir, bu da araştırmacıların kan hastalıkları sırasında değiştirilen yeni faktörleri ve omurgalı hematopoezlerin evrimi sırasında gerekli yolları daha fazla keşfetmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Kan üretimi (hematopoez) ilk olarak erken embriyoda başlayan önemli bir gelişim sürecidir. Bu süreç doğrudan mezodermden ilkel kırmızı kan hücreleri ve makrofajlar üreterek başlar ve daha sonra hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC) üretimine doğru kayar. Çok güçlü olan bu kök hücreler, organizmadaki olgun kan hücrelerinin tüm çeşitlerini oluşturur. Kendini yenileyebilen sistem, bu HSPC'ler aracılığıyla sürekli olarak yenileniyor. Bu süreç gelişimin erken dönemlerinde başlarken, hematopoez hayvanın yaşamı için devam eder, vücudun uzak bölgelerine oksijen taşıma, yaralanma sonrası kanamayı durdurma ve vücudu enfeksiyondan koruma yeteneği sağlar. Bu karmaşık sistemin gelişimi, gelişim sırasında zamansal ve mekansal olarak kontrol edilir ve kan hücresi üretimindeki herhangi bir pertürbasyon organizma için felaket olabilir, bu da anemi, trombositopeni, lökopeni ve lösemi ile sonuçlanır.
Hematopoetik araştırmalar için kullanılan popüler bir hayvan modeli zebra balığıdır (Danio rerio) çünkü insanlara kıyasla benzer kan gelişimine sahiptirler. Aslında, hematopoez sırasında kullanılan genlerin ve moleküler yolların çoğu omurgalı evrim boyunca korunur ve zebra balıklarını inceleyerek insan genleri hakkında bilgi edinmemizi sağlar. Daha da önemlisi, zebra balığı embriyoları vücut dışında gelişir ve 7 gün içinde hematopoetik sistemin kısa sürede doğrudan görselleştirilmesini sağlayan en olgun kan hücresi tiplerini üretmiştir. Zebra balıkları ayrıca, araştırmacıların kısa bir zaman diliminde daha fazla sayıda numune gözlemlemelerini sağlayan ve tekrarlanabilir veriler üretmek için de önemli olan son derece fecund'dur. Zebra balığının kısa nesil süresi ve dış gelişimi, mutajensis çalışmaları1, 2 , 3,4, 5ve ilaç taraması 6,7,8,9,10sırasında daha kolay manipülasyon ve gözlem sağlar. Bu, insan kan bozuklukları için umut verici terapötik bileşiklerden oluşan bir panelin hızlı ve verimli bir şekilde test edilmesine izin verir.
Daha da önemlisi, zebra balıkları da genetik olarak uygundur ve genom sıralanır ve açıklamalır. Bu çekiş kabiliyeti morfotino- (MO-) aracılı nakavt ve CRISPR aracılı genetik ablasyon gibi ters genetik tekniklerin gerçekleştirilebilmesini sağlar. Zebra balıkları ayrıca ileri genetik ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak yararlarını kanıtlamıştır; omurgalı kan oluşumunda rol oynayan birçok temel gen ve yol bu şekilde keşfedilmiştir. Zebra balıklarında kan hücrelerini gözlemlemek için çok sayıda yöntem de geliştirilmiştir. Geleneksel histolojik boyama teknikleri mevcut olmakla birlikte, kana özgü transkriptler için yerinde hibridizasyon yapmak da mümkündür. Daha da önemlisi, floresan proteinlerin soyuna özgü promotörler tarafından ifade edildiği ve belirli kan hücrelerinin floresan proteinlerle etiketlenmesine izin verdiği çok sayıda transgenik balık hattı da mevcuttur11. Bu, araştırmacıların zaman içinde canlı bir organizmada kan hücresi kökeni, genişlemesi ve regülasyonunun güncel gözlemini gerçekleştirmelerini sağlar.
Genel olarak, hematopoetik sistemin korunması, transgenik çizgilerin varlığı ve kolay gelişimi, kolay görselleştirme ve kısa nesil süre zebra balığını ekonomik, hızlı ve uyarlanabilir bir hematopoez modeli haline getirmiştir. Zebra balığı araştırmacıları için mevcut tekniklerin araç kutusunu geliştirmek için, embriyolardaki kan hücrelerinin sayısını sağlam bir şekilde kalibre etmek için bu tahlilini geliştirdik. Yöntem, transgenik hayvanların sindirilmesini ve floresan kan hücreleri için akış sitometrisinin gerçekleştirilmesidir. Bu şekilde, mutant hayvanlardan kan hücreleri, MO ve CRISPR modifikasyonunun etkisi ve küçük moleküllerin etkisi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde nicel olarak analiz edilebilir. Bu tahliller, kan hücrelerini numaralandırmanın kullanıcı dostu ve ekonomik yollarıdır ve zaman içinde nesillerinin, çoğalmalarının ve bakımlarının incelenmesine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kaliforniya Eyalet Üniversitesi, Chico'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) danışma kurulu, aşağıda açıklanan tüm yöntemleri onayladı.
NOT: Embriyoların 1-fenil 2-tiyoea (PTU; Tablo 1) akış sitometrisi ile floresan ayrımını olumsuz etkileyen pigmentasyonu önlemek için 24 saat postfertilizasyon (hpf). Aşağıda listelenen tüm prosedürler akış sitometrisi ve floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) için kabul edilebilir. Bununla birlikte, kişinin amacı FACS'den sonra hematopoetik hücreleri kültüre etmekse, numuneleri işlerken steril uygulamalara uyun. Embriyo örneklerinin steril bir şekilde ağartma ve hazırlanması protokolü daha öncetanımlanmıştır 12.
1. 48 hpf zebra balığı embriyosunun kaynatılması
- 10 cm'lik plastik Petri kabındaki embriyolarla (en az 5, ancak en fazla 200 embriyo) embriyoların alt kenara batması için kabı eğin.
NOT: Kapağını çıkararak ve kapağı Petri kabının bir kenarının altına yerleştirerek kabı eğmek kolaydır. - Mümkün olduğunca çok E3 ortamını(Tablo 1)çıkarın ve atın ve 500 μL dezomyon proteaz (10 mg/mL) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
- 5 dakika sonra Petri kabını alın (tüm embriyoları plakanın alt kenarında tutarak) ve Petri kabının yanına hafifçe dokunun, embriyoların korozyonları tamamen çıkarmak için plakanın altına hafifçe sürtünmesine izin verin.
- Bir sıkma şişesi ile, proteaz seyreltmek için ~ 20 mL E3 ortamı ekleyin. Embriyoların yerleşmesine izin verin ve dekantasyonu ile E3 ortamını çıkarın.
- Dezoionasyon proteazının tüm izlerini kaldırmak için 1.4 3x adımını yineleyin.
NOT: Analiz etmek için her bir örnek için en az 5 embriyo gereklidir. Bu dekonsiyon prosedürü Petri kabı başına 200 embriyoya kadar barındırabilir. Örnekler bu aşamada gruplandırılabilir ve istenirse daha sonra ayrılabilir. Alternatif olarak, saatçinin tokmaklarıyla angaryaların hafifçe yırtılmasıyla manuel dekonsiyon yapılabilir. Bu, az sayıda embriyo olduğunda avantajlıdır. Genellikle zebra balıkları korolarından 72 hpf yumurtadan çıkar. Bununla birlikte, ciddi şekilde hatalı biçimlendirilmiş embriyolar olmayabilir ve bu süreden sonra dehorionasyon (manuel veya kimyasal) gerektirecektir.
2. Embriyo örneklerinin ayrışma için hazırlanması
- Bir P1000 pipet kullanarak, 5−10 embriyoyu tek bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- E3 ortamını pipetle çıkarın ve atın.
DİkKAT: Embriyolar olarak dikkatli pipet aşağıdaki adımlar sırasında kolayca atılabilir. - Embriyonik zebra balığını çevreleyen mukus kaplamasını çıkarmak için E3 ortamına 10 mM dithiothreitol (DTT) 1 mL ekleyin11,12,13,14. Mikrosantrifüj tüpünü yatay olarak döşeyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Embriyo ayrışması
- DTT izlerini gidermek için embriyoları 1 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile Ca2+ ve Mg2+ ile yıkayın. Son yıkamadan sonra Ca 2+ ve Mg2+ ile 500μL DPBS ve 5 mg/mL (26 U/mL) ayrışma proteaz ekleyin.
NOT: Diğer izotonik tamponlu çözeltiler kullanılabilir, ancak ayrışma enziminin düzgün çalışması içinCa 2+ ve Mg2+ içermelidir. - Örnekleri 37 °C'de 185 rpm'de yatay bir yörünge çalkalayıcıda 60 dakika boyunca kuluçkaya yatır. Numuneler tamamen dağılana kadar embriyoları P1000 pipetle tritüre edin.
DİkKAT: Embriyoları aşırıya ezmemeye dikkat edin; bazı katı dokular bulunmalı ve tamamen homojen olmamalıdır. Akış sitometresinde gözlemlenecek hedef kan hücrelerini yok edecek aşırıya kaçmak mümkündür (Ek Şekil 1).
NOT: Bu prosedür en iyi 48−72 hpf embriyo için geçerlidir. Daha sonraki aşamalar dissosasyon proteaz ile daha uzun inkübasyon gerektirebilir. Farklı aşamaların zamanlaması ampirik olarak belirlenmelidir. Embriyonik dokuyu ayrıştırmak için daha hızlı alternatif yöntemler vardır, ancak ampirik olarak, bu yöntemin, 60 dakika sürmesine rağmen, canlı hematopoetik hücrelerin verimli bir şekilde izole edilmesini sağlayacak kadar nazik ve kapsamlı olduğu bulunmuştur.
4. Ayrışmış embriyoların akış sitometrisi için hazırlanması
- Pipet 5 ayrışmış embriyo 35 μmM hücre süzgeç kapağı ile 5 mL polistiren yuvarlak alt tüp üst rezervuar üzerine.
- Filtrelenmiş hücreleri içeren 5 mL polistiren tüpün süzgeç kapağına Ca2+ veya Mg2+ içermeyen 4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek hücreleri durulayın.
NOT: Diğer izotonik tamponlu çözeltiler de kullanılabilir, ancak ayrışma enzimini seyreltmek ve etkisiz hale getirmek için Ca2+ veya Mg2+ olmamalıdır. - Hücreleri peletmek için 5 dakika boyunca 4 °C ve 300 x g'da santrifüj tüpleri. Bir pipetle, süpernatant çıkarın ve atın. Hücreleri 500 μL PBS'de yeniden biriktirin (Ca2+ veya Mg2+olmadan).
5. Akış sitometrisi
- Hücre süspansiyonu hafifçe girdap ve ekleyin 1:1,000 kırmızı ölü hücrelekesi( Malzeme Tablosu ).
NOT: Kırmızı ölü hücre lekesi, ölü hücrelerin ve kalıntıların hedef hücrelerden dışlanmasına izin veren hücre geçirgen bir boyadır ve ölü hücre ayrımcılığı için mükemmel bir boya seçimidir, çünkü yeşil floresan protein (GFP) ve DSRed gibi yaygın floroforları heyecanlandırmak için kullanılan 488 nm lazerden farklı olan 633 nm lazer tarafından heyecanlanır. Bu şekilde ölü hücrelerden ve transgenik kan hücrelerinden spektral örtüçlenme olmaz. 1 mg/mL'deki propidium iyodür (PI), kırmızı ölü hücre lekesine ucuz bir alternatiftir, ancak sadece PI ile lekelenmiş bazı örnekleri ve sadece cihaz tazminatını ayarlamak için ilgi floroforu ile örnekleri ayırdığından emin olun. Aksi takdirde, PI ve GFP gibi floroforların sinyalleri çakışacak ve yanlış-pozitif sonuçlara neden olacaktır. Akış sitometresi de 405 nm lazere sahipse, mavi baba hücre lekesi gibi diğer boyalar da mükemmel bir seçimdir.
DİkKAT: Kan hücrelerini analiz ederken, 30 dk sonra bazı hücre tiplerinin kırmızı ölü hücre lekesini fagositoz etmeye başlayacağını unutmayın. Hücreleri analiz edene kadar ışıktan ve buzda koruyun ve boyayı eklediden sonraki 30 dakika içinde akış sitometrisi yapın. - Akış sitometrisi analizi
NOT: Her akış sitometresi biraz farklıdır, ancak aşağıdaki adımlar numunelerin çoğu makinede analiz için hazırlanmasına yardımcı olacaktır. Sitometri akışında yeni olan kullanıcılar için, belirli bir ekipman parçası konusunda uzman olan birinden tavsiye alın. Aşağıdaki yönergeler BD FACSAria Fusion akış sitometresi ile ilgilidir.- Sitometreyi açın ve lazerlerin 20 dakika ısınmasına izin verin. Boş atık tankı, kılıf tankını uygun çözelti ile doldurun (akış sitometreye göre değişir) ve akışkanlar sistemini başlatın.
NOT: Her akış sitometresi türü için genellikle belirli bir başlangıç prosedürü vardır; bu başlangıç yordamı dikkatle izleyin. - Analiz yazılımında, beş arsa çizin (Şekil 1A).
- İlk nokta çiziminin x ekseninde ileri dağılımını (FSC) ve y ekseninde yan dağılımını (SSC) ölçmesini sağlar. FSC'yi doğrusal, SSC'yi günlük olarak ayarlayın.
NOT: FSC hücre boyutunun bir ölçümüdür ve SSC parçalı yapının bir ölçümüdür; bu, hücrelerin enkazdan ayrımcılığa izin verecektir. Embriyonik zebra balığı kan hücresi popülasyonları, daha önce açıklanan yetişkin zebra balığı kan hücreleri ile aynı şekilde boyut ve taneciklere göre bölünmez15. Bunun yerine, diğer tüm sindirilmiş embriyonik hücrelerle aynı popülasyonda görünecektir. - FSC yüksekliği (H) ile FSC genişliğini (W) incelemek için ikinci çizimi ayarlayın. Üçüncü çizimi SSC (H) ile SSC (W) arasında ölçülecek şekilde ayarlayın.
NOT: Bu adım, çiftleri (lazerden geçtiklerinde birbirine yapışan hücreler) dışlamak için kullanılır. - X eksenindeki kırmızı ölü hücre lekesini ölçmek için dördüncü nokta grafiğini ayarlayın (sitometreye bağlı olarak bu genellikle allophycocyanin [APC] için kullanılan filtreye eşdeğerdir) ve y eksenindeki SSC' ye eşdeğerdir. Bu, ölü hücrelerden canlı hücrelerin ayrımcılığına izin verecektir.
NOT: Her bir sitometrenin filtre kümeleri farklı olabilir. Ölü hücre ayrımcılığı boyası için doğru algılama filtresini kullandığınızdan emin olun. - Beşinci arsa seçim flororophore ölçen. Bunu floroforun histogramı olarak görselleştirin (Şekil 1) veya bir nokta çizimi kullanın (Ek Şekil 2).
NOT: Aynı hayvanda birden fazla florofor incelerken, her iki parametreyi aynı anda görüntülemek için bir nokta çizimi kullanılması önerilir. Floroforların spektral olarak birbirleriyle çakışma olasılığı varsa (Ek Şekil 2), bir nokta grafiği de önerilir. Tüm parametreler için sitometrenin lazer darbesi tarafından oluşturulan eğrinin altındaki alanı hesaplamak için Alan (A) ayarlarını kullanın, çünkü bunlar daha doğrudur.
- İlk nokta çiziminin x ekseninde ileri dağılımını (FSC) ve y ekseninde yan dağılımını (SSC) ölçmesini sağlar. FSC'yi doğrusal, SSC'yi günlük olarak ayarlayın.
- Numuneyi yükleyin ve numunenin hızla tükenmemesi için akış hızını azaltın. Hücre popülasyonunun büyük kısmının net bir şekilde görülebilmesi için FSC ve SSC ayarlarını yapın (Şekil 1A).
- Hücre popülasyonunun etrafına bir kapı çizin ve hücreleri etiketleyin. İkinci nokta çiziminin hücreler üzerinde kapılı olduğundan emin olun, önce FSC'de ve ardından SSC singlet'larında gating yaparak çiftleri hariç tutun.
- Dördüncü çizimde kırmızı ölü hücre lekesi ayarlarını yapın, böylece açıkça negatif bir popülasyon vardır. Bu hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve onları canlı hücreler olarak etiketleyin. Beşinci arsada, canlı hücrelere kapı verin ve florofor negatif ve pozitif hücreleri inceleyin. Pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin.
NOT: Bu hiyerarşik gating stratejisi, hücre kapısında da bulunan canlı hücreler kapısında bulunan tek florofor+ hücreleri inceler. Kapıları düzgün bir şekilde ayarlamaya özen edin. Bu kapılar deneye bağlı olarak özelleştirilebilir. - En az 25.000 canlı hücre olayı toplayarak her örneği çalıştırın.
- Akışkanları kapatmak için kapatma prosedürünü izleyin. Kılıf deposunu doldurun ve atık tankını boşaltın.
NOT: Protein ekspresyolü düşük olduğunda veya hücre popülasyonu nadir olduğunda florofor+ hücreleri görselleştirmek genellikle zordur. Parametrelerin düzgün ayarlandığından emin olmak için, florofor- kardeş embriyolar kapıları düzgün bir şekilde çizmek ve lazer voltajlarını ayarlamak için birlikte hazırlanmalıdır (Ek Şekil 2). Hedef hücre popülasyonu nadirse, 25.000'den fazla olay toplayın. 5−10 sindirilmiş hayvanla milyonlarca olay toplanabilmelidir. Bu verilerle toplam florofor+ hücre sayısı da elde edilebilir. Sadece bir hemositometre ile numunedeki toplam hücre sayısını sayın ve balık başına mutlak florofor+ hücre sayısını elde etmek için florofor+ hücrelerin yüzdesini çarpın.
- Sitometreyi açın ve lazerlerin 20 dakika ısınmasına izin verin. Boş atık tankı, kılıf tankını uygun çözelti ile doldurun (akış sitometreye göre değişir) ve akışkanlar sistemini başlatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embriyonik zebra balıklarında kırmızı kan hücrelerini numaralandırmak için, lcr:GFP16 embriyoları pbs, 7.0 ng/nL ism1 MO veya 7.0 ng/nL ism1 MO ile tek hücreli aşamada enjekte edildi 7.0 ng ism1 mRNA12. 48 hpf'de sindirildiler ve akış sitometrisi analizine tabi tutuldular. Her örnekten GFP+ kırmızı kan hücrelerinin yüzdesini analiz ettikten sonra (her örnek rastgele seçilen 5 embriyodur; Şekil 1A), tüm kontrol grubunun ortalaması hesaplanmıştır. Bu ortalama 1olarak ayarlandı ve tüm yüzdeler bu referans noktasından hesaplandı. Bu veriler, ism1 transkriptinin belirli bir MO ile azaltılmasının 48 hpf embriyoda bulunan GFP+ kırmızı kan hücrelerinin sayısını azalttığını göstermektedir. Ek olarak, ism1 seviyelerindeki bu azalmanın eksojen mRNA ile kurtarılması kırmızı kan hücrelerinin sayısını normale döndürmektedir.
Şekil 1: ism1 MO embriyogenez sırasında üretilen kırmızı kan hücrelerinin sayısını azaltır. (A) lcr:GFP16 embriyolarına PBS enjekte edildi ve akış sitometrisi analizine tabi tutuldu. İlk olarak, boyut ve parçalı yapı belirlendi ve ilgi çekici hücre popülasyonunun etrafına bir kapı çizildi (hücreler, sol panel). Daha sonra, FSC H ve FSC W birbirine yapışmış hücreleri ortadan kaldırmak için değerlendirildi (singlets FSC). SSC H ve W da birbirine sıkışmış hücreleri değerlendirme olasılığını azaltmak için değerlendirildi(singlets SSC). Kırmızı floresan daha sonra canlı hücreleri(canlıhücreler) belirlemek için incelendi. Son olarak, canlı hücreler GFP floresan (sağ panel) için incelendi. (B) lcr:GFP12 embriyolarına pbs (kontrol, daireler), ism1 MO (ism1 MO, kareler) veya ism1 MO + ism1 mRNA12 (kurtarma, üçgenler) tek hücreli gelişim aşamasında enjekte edildi. 48 saat sonra toplandılar, sindirildiler ve A panelinde gösterildiği gibi akış sitometrisine maruz bırakıldılar. Her nokta rastgele seçilmiş beş bireysel embriyoyı temsil eder. Kat değişimi, kontrol örneğinin GFP+ hücrelerinin ortalama yüzdesi alınarak ve 1olarak ayarlanarak hesaplanır. Diğer tüm örnekler bu ortalama ile karşılaştırılır. *p < 0.005 ve N.S. = önemli değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Malzemeler | Notlar |
| E3 orta (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4·7H2O, 1,83 g CaCl2·2H2O | 2 L mezunu bir silindire, toplam hacmi 1 L'ye çıkarmak için malzemeleri ve yeterli damıtılmış suyu ekleyin. |
| E3 orta (1x) | 40 mL 50x E3 | 2 L mezunu bir silindire, toplam hacmi 2 L'ye çıkarmak için yeterli damıtılmış su ekleyin. |
| 1-Fenil-2-tiyotirea (PTU) E3 ortamında | 2 L şişede 40 mL 50x E3, 40 mg PTU | 2 L mezunu bir silindire, toplam hacmi 2 L'ye çıkarmak için yeterli damıtılmış su ekleyin. PTU'yu tamamen çözmek için en az 2 gün karıştırın. |
Tablo 1: Çözümler için tarifler.
Ek Şekil 1: Embriyoların ayrışma proteaz ile sindirimi. Düzgün sindirilmemiş (sol; sindirilmemiş), yeterli sindirimden sonra (orta; sindirilmiş) ve aşırı sindirimden sonra (sağ; aşırı sindirilmiş) 10 embriyonun görüntüleri. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: 5 dpf embriyoda iki floroforun değerlendirilmesi. Kapılar,FSC ve SSC'yi değerlendirmek için hücre popülasyonunu belirlemek için çizildi (hücreler, sol sütun), singlet'ları değerlendirmek (gösterilmedi), canlı hücreleri belirlemek için(canlı, orta sütun) ve florofor ifadesi (mpx:GFP17 ve gata1:D sRed15). İlk olarak, kapılar floroforları olmayan bir hayvana (üst sıra) ayarlandı. Daha sonra mpx:GFP+ (gata1:D sRed olmadan) hayvanlar GFP (ikinci sıra) için kapıları ve telafiyi ayarlamak için değerlendirildi. gata1:D sRed+ (mpx:GFP olmadan) hayvanlar DsRed (üçüncü sıra) için kapıları ve telafiyi ayarlamak için değerlendirildi. Son olarak, iki renk mpx:GFP+ ve gata1:D sRed+olan çift pozitif hayvanlarda değerlendirilebilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı, ilkel ve kesin omurgalı hematopoezleri incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Son birkaç on yılda, zebra balıklarının ilaçları test etmek, genetik mutantları üretmek ve test etmek için hızlı ve ekonomik bir model haline gelmesine ve genel olarak araştırmacıların hematopoez için gerekli moleküler yolları analiz etmelerine izin sağlayan birden fazla test geliştirilmiş ve rafine edilmiştir. Bu protokol, hızlı veri toplanmasına, yetişkin hayvanlara göre daha az fiziksel alan kullanılmasına ve büyük ölçekli kimyasal ekranlar için daha az ilaç kullanılmasına izin veren embriyonik zebra balıklarını kullanır. Ayrıca, erken embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan spesifik genetik yolları değiştirmek için mRNA'nın aşırı ifade edilmesi, CRISPR mutantlarının üretimi ve MO kaynaklı transkript redüksiyonu sonrasında nicelasyona izin verir. Daha da önemlisi, in situ hibridizasyon veya histolojik boyama teknikleri ile yapılması zor olan hassas, sağlam miktarda kan hücresi sağlar.
Bu test esnektir ve birçok araştırma sorusunu yanıtlamak için değiştirilebilir. Bu protokolün bir modifikasyonu, hayvanın gelişim aşamasının farklı kan hücresi tiplerini nicel olarak kalibre etmek için manipüle edildiği durumlarda gerçekleştirilebilir. Örneğin, kırmızı kan hücreleri zebra balığı gelişiminde erken ortaya çıkar ve lcr: GFP16 transgenik hattı gibi transgenik hayvanlarla 16 somit evresi kadar erken tespit edilebilir. Bununla birlikte, trombositleri incelemekle ilgileniyorsanız, itga2b:GFP18 (cd41:GFP olarak da bilinir) transgenik hat GFP'yi 48 hpf'de ifade etmeye başlar ve olgun dolaşımdaki trombositler 72 hpf'de gözlenir. B hücrelerini bu testle nicelleştirmek istiyorsa, 20 dpf'ye yakın ighm:EGFP19 transgenik hayvan ile gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, bu test zamanla kan hücrelerini takip etmek için de kullanılabilir. Örneğin, 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf'deki lcr:GFP+ hücrelerinin sayılarını analiz ederek, bir genetik modifikasyonun (veya ilacın) kırmızı kan hücrelerinin bakımını sadece nesillerine göre düzenleyip düzenlemediğini belirleyebilir.
Bu tahliller, araştırmacıların gelişimin tek hücreli aşamasında mRNA enjekte ederek CRISPR veya MO'larla gen ekspresyonını azaltmalarını veya gen ekspresyonlarını aşırı ifade etmelerini ve bu değiştirilmiş embriyolarda üretilen kan hücrelerinin sayısını doğru bir şekilde karşılaştırmalarını sağlar. Kardeş hayvanlara spesifik olmayan rehber RNA'lar veya eşleşmeyen MO'lar enjekte edilerek ve deneysel grupların yanında kanları incelenerek bu deneyler için her zaman uygun kontrollerin yapılmasına özen gösterilmelidir. Gelişim aşaması kritiktir; Gelişim sırasında sadece birkaç saatlik değişiklikler, bir embriyoda bulunan kan hücrelerinin çok farklı sayılarını gösterebilir. Başka bir deyişle, embriyoları karşılaştırırken gelişim saatlerini dikkatlice izlediğinden emin olun. Embriyoların yaşla eşleştiklerinden emin olmak için morfolojik ipuçları kullanılmalıdır. Erken embriyolarda, yaş eşleşmesi için somitleri saymayı düşünün. Geliştirmenin ilerleyen aşamalarında, kalbin atışının başlangıcı, otik veziklinin büyüklüğü veya vücudun uzunluğu gibi diğer belirteçler, balıkları kontrol etmek için değiştirilmiş balıkların aşamalarını eşleştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, deney ve kontrol hayvanlarında aynı sayıda hücrenin bulunmasını sağlamak için toplam hücre sayısı sindirilmiş embriyolardan numaralandırılabilir. Genetik modifikasyonu incelemek için bu tahlilleri kullanmanın yanı sıra, bu tahliller büyük ölçekli ilaç ekranları yapmak için de değiştirilebilir. Embriyolar, söz konusu kimyasalların hematopoez üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını görmek için gelişim sırasında zamansal olarak farklı bileşik konsantrasyonlarına maruz kalabilir. Deney belirli bir ilacın etkisini test etmek için tasarlanmışsa, sadece araçla tedavi edilen hayvanlar da kontrol olarak dahil edilmelidir. Bu şekilde, araştırmacılar belirli genlerin veya sinyal yollarının kazanıp kazanmadığını veya işlev kaybının hematopoezde önemli bir rol oynayıp oynamadığını belirleyebilirler.
Farklı transgenleri incelerken, numune başına sindirilen hayvan sayısının optimize edilmiş olması önemlidir; çok az hayvan çok az floresan üretebilir veya hiç üretmeyebilir. Bu, özellikle belirli bir zaman noktasında bol olmayan HSPC'leri incelerken geçerlidir. Floresan kullanan zayıf promotörlere sahip transgenikleri incelerken de kritik öneme sahiptir. Bu sorunlara karşı koymak için doğru sayımlar için daha fazla hayvan (ve dolayısıyla daha fazla hücre) gereklidir. Gelişim aşamalarını değiştirirken, sindirim süresini optimize etmek de önemlidir. Bu protokol tüp başına 5 bireysel 48 hpf embriyo için optimize edilmiştir. Daha olgun embriyoları sindirmek muhtemelen daha uzun zaman gerektirecektir.
İşlem sırasında bazı potansiyel sorunlar ortaya çıkabilir. Floresan gözlenmezse, sitometre ile ilgili çözülmesi gereken teknik bir sorun olabilir. Bu nedenle embriyoları mikroskop altında hızlı bir şekilde kontrol ingerek prosedüre başlamadan önce floresan olduklarını doğrulamak esastır. Bir diğer yaygın konu, hücreleri yok eden embriyoları aşırı sindirmektir. Sindirim adımına dikkat edin ve çok fazla ölü hücre gözlenirse zamanlamayı değiştirin.
Bu tahlillerin birkaç sınırlaması vardır. En büyük sorun, bu tahlillerin transgenik bir belirteç ifadesine dayandırıyor olmasıdır. Potansiyel olarak transgenik belirtecin ifadesinin değişmesi embriyoda meydana gelenlerin biyolojisini yansıtmayabilir. Ayrıca, hedef hücre popülasyonu son derece düşükse, akış sitometrisi hücreleri nicel hale getirmek için en iyi yöntem olmayabilir. Bu olasılıklarla başa çıkmak için in situ veya histolojik boyama teknikleri gibi diğer tahlillerden yararlanılabilir. Faiz immünhistokimyasının hücre tipi için spesifik antikorlar varsa da yapılabilir. Embriyolar ayrıca soyuna özgü genleri ölçmek için qRT-PCR'ye tabi tutulabilir ve bu tahliller bir FACS makinesinde yapılırsa, hücreler daha da hassas yöntemlerle izole edilebilir ve ayrı ayrı incelenebilir. Bu konular hariç, bu nicel akış sitometrisi tahlili araştırmacılar için birçok yararlı bilgi üretebilir.
Bu tahlillerle araştırmacılar omurgalı hayvanlarda hematopoetik kusurları kolayca gözlemleyebilirler. Genetik yollarıN MO'lar veya CRISPR ile değiştirilmesi ve daha sonra genin hematopoezde rol oynaması durumunda aglotiz yapmak için akış sitometrisi yapmak hızlı bir şekilde yapılabilir ve niceldir. Ek olarak, ileri genetik ekranlar (hayvanlar floresan etikete sahip olduğu sürece) yapılabilir ve kusurlar değerlendirilebilir. Zebra balığı ayrıca büyük ölçekli ilaç ekranları6, 7,8,9,10için mükemmel bir model haline gelmiştir , canlı organizmalar üzerinde etkili ilaç tarama testlerinin ilaçların etkiliolupolmadığını ve gelişim / sağkalım üzerinde olumsuz etkileri olup olmadığını gözlemlemelerini sağlar. Bu tahlilin robotik tarafından geliştirilmiş otomatik akış sitometri teknolojisi ilebirlenmesi,onu daha da verimlihale getirecektir 20,21,22, kan hücresi oluşumunda, büyümesinde ve düzenlenmesinde önemli olan yolların gerçekten büyük ölçekli analizine ve taranmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. bilimsel bir danışmandır ve Finless Foods, Inc. ve Xytogen Biotech, Inc.'den tazminat almıştır.
Acknowledgments
Fon, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH: R15 DK114732-01'den D.L.S.'e), Ulusal Bilim Vakfı (NSF: MRI 1626406'dan D.L.S.'e) ve California State University Chico'daki Onur Programı'ndan (K.F.R.'a) sağlandı. Yazarlar laboratuvar yönetimi için Betsey Tamietti'ye ve idari yardım için Kathy Johns'a teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
