Summary
Este ensayo es un método simple para cuantificar las células hematopoyéticas en el desarrollo de peces cebra embrionarios. Los glóbulos del pez cebra disociado se someten a análisis de citometría de flujo. Esto permite la detección de defectos sanguíneos en animales mutantes y después de la modificación genética.
Abstract
La diversidad de linajes celulares que comprenden sangre madura en animales vertebrados surge de la diferenciación de células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSPCs). Este es un proceso crítico que ocurre a lo largo de la vida útil de los organismos, y la interrupción de las vías moleculares implicadas durante la embriogénesis puede tener consecuencias catastróficas a largo plazo. Por multitud de razones, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un organismo modelo para estudiar la hematopoyesis. Los embriones de pez cebra se desarrollan externamente, y para 7 días la posfertilización (dpf) han producido la mayoría de los subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirán durante su vida útil. Se han desarrollado ensayos para evaluar el número de células hematopoyéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridación in situ y microscopía de animales transgénicos que utilizan promotores específicos de células sanguíneas que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de tinción y las técnicas de hibridación in situ no cuantifican con precisión el número de células sanguíneas presentes; sólo las grandes diferencias en el número de celdas se visualizan fácilmente. La utilización de animales transgénicos y el análisis de individuos con microscopía fluorescente o confocal se pueden realizar, pero la cuantificación de estos ensayos se basa en contar manualmente o utilizar software de imágenes costoso, ambos de los cuales pueden cometer errores. El desarrollo de métodos adicionales para evaluar el número de células sanguíneas sería económico, más rápido e incluso podría automatizarse para evaluar rápidamente el efecto de la modificación genética mediada por CRISPR, la reducción de transcripción mediada por morpholino y el efecto de los compuestos farmacológicos que afectan a la hematopoyesis a gran escala. Este nuevo ensayo para cuantificar las células sanguíneas se realiza desvinculando embriones enteros de pez cebra y analizando la cantidad de células sanguíneas etiquetadas fluorescentemente presentes. Estos ensayos deben permitir la aclaración de las vías moleculares responsables de la generación, expansión y regulación de células sanguíneas durante la embriogénesis, lo que permitirá a los investigadores descubrir aún más nuevos factores alterados durante las enfermedades de la sangre, así como vías esenciales durante la evolución de la hematopoyesis vertebrada.
Introduction
La producción de sangre (hematopoyesis) es un proceso de desarrollo esencial que comienza por primera vez en el embrión temprano. Este proceso comienza generando glóbulos rojos primitivos y macrófagos directamente a partir del mesodermo, y más tarde se desplaza hacia la producción de células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPCs). Estas células madre, que son multipotentes, generan todas las variedades de células sanguíneas maduras en el organismo. Capaz de auto-renovación, el sistema se repone continuamente a través de estos HSPCs. Mientras que este proceso comienza temprano en el desarrollo, hematopoyesis continúa durante la vida del animal, proporcionando la capacidad de transportar oxígeno a sitios distantes del cuerpo, para detener el sangrado después de la lesión, y para proteger el cuerpo de la infección. El desarrollo de este complejo sistema se controla temporal y espacialmente durante el desarrollo y cualquier perturbación en la producción de células sanguíneas puede ser catastrófico para el organismo, lo que resulta en anemia, trombocitopenia, leucopenia y leucemia.
Un modelo animal popular utilizado para la investigación hematopoyética es el pez cebra(Danio rerio)porque tienen un desarrollo sanguíneo similar en comparación con los seres humanos. De hecho, muchos de los genes y vías moleculares utilizados durante la hematopoyesis se conservan a lo largo de la evolución de los vertebrados, lo que nos permite aprender sobre los genes humanos estudiando el pez cebra. Es importante destacar que los embriones de pez cebra se desarrollan fuera del cuerpo y en 7 días han generado la mayoría de los tipos de células sanguíneas maduras, lo que permite la visualización directa del sistema hematopoyético en un corto período de tiempo. El pez cebra también es extremadamente fecunda, lo que permite a los investigadores observar un mayor número de muestras en un corto período de tiempo, lo que también es importante para generar datos reproducibles. El tiempo de corta generación y desarrollo externo del pez cebra prevé una manipulación y observación más sencillas durante los estudios de mutagénesis1,2,3,4,5 y cribado de drogas6,7,8,9,10. Esto permite que un panel de compuestos terapéuticos prometedores para los trastornos sanguíneos humanos se pruebe rápida y eficientemente.
Es importante destacar que los peces cebra también son genéticamente aptos, y el genoma se secuencia y anota. Esta tractabilidad permite realizar técnicas genéticas inversas como el derribo mediado por morpholino(MO)y la ablación genética mediada por CRISPR. Los peces cebra también han demostrado su utilidad como modelo para realizar pantallas genéticas delanteras; muchos genes esenciales y vías involucradas en la formación de sangre de vertebrados se han descubierto de esta manera. También se han desarrollado numerosos métodos de observación de células sanguíneas en peces cebra. Si bien existen técnicas tradicionales de tinción histológica, también es posible realizar la hibridación in situ para transcripciones específicas de la sangre. Es importante destacar que también existen numerosas líneas transgénicas de peces mediante las cuales las proteínas fluorescentes son expresadas por promotores específicos del linaje, permitiendo el etiquetado de células sanguíneas específicas con proteínas fluorescentes11. Esto permite a los investigadores realizar observaciones de hasta el minuto de génesis, expansión y regulación de células sanguíneas en un organismo vivo con el tiempo.
En general, la conservación del sistema hematopoyético, la presencia y el fácil desarrollo de líneas transgénicas, la fácil visualización y el corto tiempo de generación han hecho del pez cebra un modelo económico, rápido y adaptable de hematopoyesis. Para mejorar la caja de herramientas de técnicas disponibles para los investigadores de peces cebra, desarrollamos este ensayo para cuantificar sólidamente el número de células sanguíneas en embriones. El método consiste en digerir animales transgénicos y realizar citometría de flujo para glóbulos fluorescentes. De esta manera, las células sanguíneas de animales mutantes, el efecto de la modificación del MO y crispr, y el efecto de las moléculas pequeñas se pueden analizar cuantitativamente de una manera rápida y reproducible. Estos ensayos son formas fáciles de usar y económicas de enumerar las células sanguíneas, permitiendo el examen de su generación, proliferación y mantenimiento a lo largo del tiempo.
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Protocol
El consejo asesor del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de California, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.
NOTA: Se recomienda tratar embriones con 1-fenilo 2-tiourea (PTU; Tabla 1) a las 24 horas de postfertilización (HPF) para prevenir la pigmentación que afecta negativamente a la discriminación por fluorescencia por citometría de flujo. Todos los procedimientos enumerados a continuación son aceptables para la citometría de flujo y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Sin embargo, si el objetivo de uno es cultivo de las células hematopoyéticas después de FACS, a continuación, adherirse a prácticas estériles al procesar muestras. El protocolo de blanqueo y preparación de muestras de embriones de manera estéril se ha descrito anteriormente12.
1. Desconorionación de embriones de pez cebra de 48 CV
- Con embriones (al menos 5, pero no más de 200 embriones) en una placa de Petri de plástico de 10 cm, incline la placa para que los embriones se hundan hasta el borde inferior.
NOTA: Es fácil inclinar el plato quitando la tapa y colocando la tapa debajo de un borde de la placa Petri. - Retire y deseche tanto medio E3(Tabla 1)como sea posible y agregue 500 μL de proteasa de deschorionación (10 mg/ml). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Después de 5 minutos, recoge la placa De Petri (manteniendo todos los embriones en el borde inferior de la placa), y toca suavemente el lado de la placa De Petri, permitiendo que los embriones se froten suavemente contra la parte inferior de la placa para eliminar completamente las corales.
- Con una botella de compresión, añadir ~ 20 ml de medio E3 para diluir la proteasa. Permita que los embriones se asienten y retiren el medio E3 decantando.
- Repita el paso 1.4 3x para eliminar todos los rastros de la proteasa de deschorionation.
NOTA: Para que cada muestra individual analice, se requieren al menos 5 embriones. Este procedimiento de desconocupación puede acomodar hasta 200 embriones por placa de Petri. Las muestras se pueden agrupar en esta etapa y separarse más tarde si lo desea. Alternativamente, la deschorionación manual se puede realizar desgarrando suavemente los carros con fórceps del relojero. Esto es ventajoso cuando hay un pequeño número de embriones. Por lo general, el pez cebra eclosionará de sus corales por 72 CVf. Sin embargo, es posible que los embriones gravemente malformados no requieran desconorionación (ya sea manual o química) después de ese tiempo.
2. Preparación de muestras de embriones para la disociación
- Con una pipeta P1000, coloque 5-10 embriones en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Retire el medio E3 con una pipeta y deseche.
PRECAUCIÓN: Pipeta con cuidado, ya que los embriones se pueden descartar fácilmente durante los siguientes pasos. - Añadir 1 ml de 10 mM de ditiotiothreitol (TDT) en medio E3 para eliminar el recubrimiento de moco que rodea el pez cebra embrionario11,12,13,14. Poner el tubo de microcentrífuga horizontalmente, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Disociación embrionaria
- Lave los embriones 3x con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) con Ca2+ y Mg2+ para eliminar rastros de TDT. Después del último lavado añadir 500 μL de DPBS con Ca2+ y Mg2+ y 5 μL de 5 mg/ml (26 U/mL) proteasa de disociación.
NOTA: Se pueden utilizar otras soluciones almacenadas en búfer isotónicas, pero deben contener Ca2+ y Mg2+ para que la enzima de disociación funcione correctamente. - Incuba muestras a 37 °C en una coctelera orbital horizontal a 185 rpm durante 60 min. Triturar embriones con una pipeta P1000 hasta que las muestras estén completamente disociadas.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no sobredigestar los embriones; algún tejido sólido debe estar presente, y no debe ser completamente homogéneo. Es posible sobredigestar, lo que destruirá los glóbulos objetivo que se observarán en el citómetro de flujo(Figura suplementaria 1).
NOTA: Este procedimiento funciona mejor para embriones de 48-72 HPf. Las etapas posteriores pueden requerir una incubación más larga con proteasa de disociación. El tiempo para diferentes etapas debe determinarse empíricamente. Hay métodos alternativos más rápidos para disociar el tejido embrionario, pero se encuentra empíricamente que este método, aunque toma 60 min, es lo suficientemente suave y exhaustivo como para permitir un aislamiento eficiente de las células hematopoyéticas vivas.
4. Preparación de embriones disociados para la citometría de flujo
- Pipetear los 5 embriones disociados en el depósito superior de un tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml con una tapa de colador celular de 35 μmM.
- Enjuague las células añadiendo 4 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin Ca2+ o Mg2+ a la tapa del colador del tubo de poliestireno de 5 ml que contiene las células filtradas.
NOTA: También se pueden utilizar otras soluciones amortiguadas isotónicas, pero deben carecer de Ca2+ o Mg2+ para diluir y hacer que la enzima de disociación sea ineficaz. - Tubos centrífugas a 4 °C y 300 x g durante 5 minutos para peletizar las células. Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 500 μL de PBS (sin Ca2+ o Mg2+).
5. Cytometría de flujo
- Vórtice suave la suspensión celular y añadir 1:1,000 manchas de células muertas rojas (Tabla de Materiales).
NOTA: La mancha roja de células muertas es un tinte permeable a las células que permite la exclusión de células muertas y desechos de las células objetivo y es una excelente opción de tinte para la discriminación celular muerta, ya que está excitado por el láser de 633 nm, que es diferente del láser de 488 nm utilizado para excitar fluoróforos comunes como la proteína fluorescente verde (GFP) y DsRed. De esta manera, no hay superposición espectral de células muertas y células sanguíneas transgénicas. El yoduro de propidio (PI) a 1 mg/ml es una alternativa barata a la mancha roja de células muertas, pero asegúrese de reservar algunas muestras manchadas sólo con PI, así como muestras sólo con el fluoróforo de interés para establecer la compensación del instrumento. De lo contrario, las señales de PI y fluoróforos como GFP se superponen, lo que resulta en resultados falsos positivos. Si el citómetro de flujo también tiene un láser de 405 nm, otros tintes como la mancha de la célula de papá azul también son una excelente opción.
PRECAUCIÓN: Al analizar los glóbulos, tenga en cuenta que después de 30 minutos ciertos tipos de células comenzarán a fagocitos de la mancha roja de células muertas. Mantenga las células protegidas de la luz y del hielo hasta su análisis y realice la citometría de flujo en un plazo de 30 minutos a partir de la adición del tinte. - Análisis de citometría de flujo
NOTA: Cada cytómetro de flujo es un poco diferente, pero los siguientes pasos ayudarán a preparar muestras para su análisis en la mayoría de las máquinas. Para los usuarios nuevos para fluir citometría, busque el consejo de alguien que es un experto en la pieza de equipo en particular. Las siguientes instrucciones pertenecen al cytómetro de flujo BD FACSAria Fusion.- Encienda el citómetro y permita que los láseres se calienten durante 20 minutos. Depósito de residuos vacío, llenar el depósito de vaina con la solución adecuada (varía en función del citómetro de flujo) e iniciar el sistema de fluidos.
NOTA: Por lo general, hay un procedimiento de inicio determinado para cada tipo de cytómetro de flujo; seguir ese procedimiento de inicio cuidadosamente. - En el software de análisis, dibuje cinco gráficas (Figura 1A).
- Tenga la primera gráfica de puntos medir dispersión hacia adelante (FSC) en el eje x y dispersión lateral (SSC) en el eje y. Establezca fsc como lineal y SSC como registro.
NOTA: EL FSC es una medida del tamaño de la célula, y SSC es una medida de granularidad; esto permitirá la discriminación de las células de los desechos. Las poblaciones embrionarias de células sanguíneas de pez cebra no se separan por tamaño y granularidad de la misma manera que las células sanguíneas adultas de pez cebra descritas anteriormente15. En su lugar, aparecerán en la misma población con todas las demás células embrionarias digeridas. - Establezca el segundo trazado para examinar la altura FSC (H) frente a la anchura FSC (W). Establezca el tercer trazado para medir SSC (H) frente a SSC (W).
NOTA: Este paso se utiliza para excluir los dobletes (celdas que están pegadas juntas cuando pasan a través del láser). - Establezca el trazado del cuarto punto para medir la mancha roja de la célula muerta en el eje x (dependiendo del citómetro esto suele ser equivalente al filtro utilizado para la aloficocianina [APC]) y SSC en el eje y. Esto permitirá la discriminación de las células vivas de las células muertas.
NOTA: Los conjuntos de filtros de cada cytometer pueden ser diferentes. Asegúrese de utilizar el filtro de detección correcto para el tinte de discriminación de células muertas. - La quinta parcela mide el flúor de elección. Visualice esto como un histograma del flúor (Figura 1) o utilice una gráfica de puntos (Figura suplementaria 2).
NOTA: Al examinar más de un flúor en el mismo animal, se recomienda utilizar una gráfica de puntos para ver ambos parámetros al mismo tiempo. Si existe alguna posibilidad de que los fluoróforos tengan superposición espectral entre sí(Figura suplementaria 2),también se recomienda una gráfica de puntos. Utilice los ajustes de Área (A) para calcular el área bajo la curva generada por el pulso láser del cytómetro para todos los parámetros, ya que son más precisos.
- Tenga la primera gráfica de puntos medir dispersión hacia adelante (FSC) en el eje x y dispersión lateral (SSC) en el eje y. Establezca fsc como lineal y SSC como registro.
- Cargue la muestra y reduzca el caudal para que la muestra no se agote rápidamente. Ajuste la configuración fsc y SSC para que la mayor parte de la población celular se pueda ver claramente (Figura 1A).
- Dibuje una puerta alrededor de la población celular y etiquete las celdas. Asegurándose de que la segunda gráfica de puntos esté cerrada en las celdas, excluya los dobletes primero gating en fsc y luego en singletes SSC.
- En la cuarta gráfica ajustar la configuración de manchas de celda muerta roja para que haya claramente una población negativa. Dibuje una puerta alrededor de estas celdas y etiquete las celdas vivas. En la quinta parcela, puerta en las células vivas y examinar las células negativas y positivas del fósforo. Dibuje una puerta alrededor de las celdas positivas.
NOTA: Esta estrategia jerárquica de gating examina un solo fósforo+ células que residen en la puerta de las células vivas, que también residen en la puerta de la celda. Se encargue de establecer las puertas correctamente. Estas puertas se pueden personalizar dependiendo del experimento. - Ejecute cada ejemplo, recopilando al menos 25.000 eventos de células en vivo.
- Siga el procedimiento de apagado para apagar los fluidos. Rellene el tanque de vaciar y vacíe el tanque de residuos.
NOTA: A menudo es difícil visualizar flúor+ células cuando la expresión proteica es baja, o la población celular es rara. Para garantizar que los parámetros se establecen correctamente, el fluoróforo- embriones hermanos deben prepararse junto con para dibujar correctamente las puertas y ajustar las tensiones láser (Figura suplementaria 2). Si la población celular objetivo es rara, recopile más de 25.000 eventos. Con 5-10 animales digeridos, uno debe ser capaz de recoger millones de eventos. El número total de fluoróforos+ células también se puede obtener con estos datos. Basta con contar el número total de células de la muestra con un hemociclo y multiplicar el porcentaje de fluoróforo+ células para obtener el número absoluto de fluoroforo+ células por pez.
- Encienda el citómetro y permita que los láseres se calienten durante 20 minutos. Depósito de residuos vacío, llenar el depósito de vaina con la solución adecuada (varía en función del citómetro de flujo) e iniciar el sistema de fluidos.
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Representative Results
Para enumerar los glóbulos rojos en el pez cebra embrionario, se inyectaron16 embriones lcr:GFP 16 en una etapa celular con PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, o 7.0 ng/nL ism1 MO con 7.0 ng ism1 mRNA12. A 48 CV fueron digeridos y sometidos a análisis de citometría de flujo. Después de analizar el porcentaje de GFP+ glóbulos rojos de cada muestra (cada muestra es 5 embriones seleccionados aleatoriamente; Figura 1A), se calculó el promedio de todo el grupo de control. Este promedio se estableció en 1y todos los porcentajes se calcularon a partir de ese punto de referencia. Estos datos indican que la reducción de la transcripción ism1 con un MO específico redujo el número de GFP+ glóbulos rojos presentes en el embrión de 48 HPF. Además, el rescate de esta reducción en los niveles de ism1 con ARNm exógeno devolvió el número de glóbulos rojos a la normalidad.
Figura 1: ism1 MO reduce el número de glóbulos rojos producidos durante la embriogénesis. (A) lcr:GFP16 embriones fueron inyectados con PBS y sometidos a análisis de citometría de flujo. En primer lugar, se determinaron el tamaño y la granularidad, y se dibujó una puerta alrededor de la población celular de interés(celdas,panel izquierdo). Luego, FSC H y FSC W fueron evaluados para eliminar las células pegadas juntas(singlets FSC). SSC H y W también se evaluaron para reducir la posibilidad de evaluar las células pegadas juntas(singlets SSC). Luego se examinó la fluorescencia roja para determinar las células vivas(células vivas). Finalmente, se examinaron células vivas para detectar fluorescencia GFP (panel derecho). (B) lcr:GFP12 embriones fueron inyectados con PBS (control, círculos), ism1 MO(ism1 MO, cuadrados), o ism1 MO + ism1 mRNA12 (rescate, triángulos) en la etapa de desarrollo de una célula. Después de 48 h, fueron recogidos, digeridos y sometidos a citometría de flujo como se muestra en el panel A. Cada punto representa cinco embriones individuales elegidos al azar. El cambio de pliegue se calcula tomando el porcentaje medio de GFP+ celdas de la muestra de control y estableciendo que como 1. Todas las demás muestras se comparan con ese promedio. *p < 0.005, y N.S. = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| solución | ingredientes | Notas |
| Medio E3 (50x) | 14,61 g de NaCl, 0,63 g de KCI, 1,99 g de MgSO4·7H2O, 1,83 g de CaCl2·2H2O | A un cilindro graduado de 2 L, agregue los ingredientes y suficiente agua destilada para llevar el volumen total a 1 L. |
| Medio E3 (1x) | 40 ml de 50x E3 | A un cilindro graduado de 2 L, agregue suficiente agua destilada para llevar el volumen total a 2 L. |
| 1-Fenil-2-tiourea (PTU) en medio E3 | 40 ml de 50x E3 en una botella de 2 L, 40 mg de PTU | A un cilindro graduado de 2 L, agregue suficiente agua destilada para llevar el volumen total a 2 L. Revuelva durante al menos 2 días para disolver completamente la PTU. |
Tabla 1: Recetas para soluciones.
Figura suplementaria 1: Digestión de embriones con proteasa de disociación. Imágenes de 10 embriones no digeridas adecuadamente (izquierda; indigno), después de una digestión adecuada (media; digerida) y después del exceso de digestión (derecha; sobredisecha). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Evaluación de dos fluoróforos en embriones de 5 dpf. Se dibujaron puertas para evaluarel FSC y el SSC para determinar la población celular de interés (células,columna izquierda), para evaluar singletes (no se muestran), para determinar las células vivas(vivas,columna media) y la expresión de fluoróforo(mpx:GFP17 y gata1:D sRed15). Primero, se instalaron puertas en un animal que no tiene fluoróforos (fila superior). A continuación, seevaluó a los animales mpx :GFP+ (sin gata1:D sRed) para establecer las puertas y la compensación por GFP (segunda fila). gata1:D sRed+ (sin animales mpx:GFP) fueron evaluados para establecer las puertas y la compensación por DsRed (tercera fila). Por último, los dos colores se pueden evaluar en animales doblemente positivos que son mpx:GFP+ y gata1:D sRed+. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudiar la hematopoyesis de vertebrados primitiva y definitiva. En las últimas décadas, se han desarrollado y refinado múltiples ensayos, permitiendo que el pez cebra se convierta en un modelo rápido y económico para probar fármacos, generar y probar mutantes genéticos, y en general permitiendo a los investigadores analizar vías moleculares esenciales para la hematopoyesis. Este protocolo utiliza peces cebra embrionarios que permiten una recopilación rápida de datos, el uso de menos espacio físico que los animales adultos y el uso de menos fármacos para pantallas químicas a gran escala. También permite la cuantificación después de la sobreexpresión del ARNM, la generación de mutantes CRISPR y la reducción de transcripción inducida por MO para alterar las vías genéticas específicas que ocurren durante el desarrollo embrionario temprano. Es importante destacar que permite una cuantificación sensible y robusta de las células sanguíneas, lo que es difícil de hacer con técnicas de hibridación in situ o tinción histológica.
Este ensayo es flexible y se puede modificar para responder a muchas preguntas de investigación. Se puede realizar una modificación de este protocolo mediante la cual se manipula la etapa de desarrollo del animal para cuantificar diferentes tipos de células sanguíneas. Por ejemplo, los glóbulos rojos surgen temprano en el desarrollo de peces cebra, y con animales transgénicos como el lcr:GFP16 línea transgénica se puede detectar tan pronto como la etapa de 16 somite. Sin embargo, si uno está interesado en estudiar trombocitos, la línea transgénica itga2b:GFP18 (también conocida como cd41:GFP) comienza a expresar GFP a 48 CVf, con trombocitos circulantes maduros observados a 72 CVf. Si uno desea cuantificar las células B con este ensayo, entonces se puede realizar con ighm:EGFP19 animales transgénicos más cercanos a 20 dpf. Es importante destacar que este ensayo también se puede utilizar para seguir las células sanguíneas con el tiempo. Por ejemplo, mediante el análisis del número de lcr:GFP+ células a 24 HPf, 48 HPf, 72 HPf, se podría determinar si una modificación genética (o fármaco) está regulando el mantenimiento de los glóbulos rojos en comparación con sólo su generación.
Estos ensayos permiten a los investigadores reducir la expresión génica con CRISPR o MOs o sobreexprimir la expresión génica inyectando ARNM en la etapa de desarrollo de una sola célula y comparar con precisión el número de células sanguíneas producidas en estos embriones modificados. Siempre se debe tener cuidado de realizar los controles adecuados para estos experimentos al mismo tiempo inyectando animales hermanos con RNAs guía no específicos o MOs no coincidentes y examinando su sangre junto con los grupos experimentales. La etapa de desarrollo es crítica; alteraciones de sólo unas pocas horas durante el desarrollo podrían mostrar un número muy diferente de células sanguíneas presentes en un embrión. En otras palabras, asegúrese de monitorear cuidadosamente las horas de desarrollo al comparar embriones. Para garantizar que los embriones coincidan con la edad, se deben utilizar señales morfológicas. En embriones tempranos, considere contar somites para que coincidan con la edad. Más adelante en el desarrollo, otros marcadores como el comienzo del latido del corazón, el tamaño de la vesícula ótica, o la longitud del cuerpo se pueden utilizar para que coincida con las etapas de los peces modificados para controlar los peces. Además, el número total de células se puede enumerar a partir de embriones digeridos para garantizar que el mismo número de células estén presentes en animales experimentales y de control. Además de utilizar estos ensayos para examinar la modificación genética, estos ensayos también se pueden modificar para realizar pantallas de fármacos a gran escala. Los embriones pueden estar expuestos a diferentes concentraciones de compuestos temporalmente durante el desarrollo para ver si los productos químicos en cuestión tienen algún efecto sobre la hematopoyesis. Si el experimento está diseñado para probar el efecto de un medicamento en particular, entonces los animales tratados con vehículo sólo deben incluirse como control. De esta manera, los investigadores pueden determinar si la ganancia o pérdida de la función de genes específicos o vías de señalización desempeñan un papel esencial en la hematopoyesis.
Es esencial que al examinar diferentes transgenes se optimice el número de animales digeridos por muestra; muy pocos animales pueden generar poca o ninguna fluorescencia. Esto es especialmente cierto cuando se examinan HSPCs que no son abundantes en un momento determinado. También es crítico al examinar transgénicos que tienen promotores débiles que impulsan la fluorescencia. Para contrarrestar estos problemas se requieren más animales (y por lo tanto, más células) para recuentos precisos. Al alterar las etapas de desarrollo, también es fundamental optimizar el tiempo de digestión. Este protocolo está optimizado para 5 embriones individuales de 48 CV por tubo. Digerir embriones más maduros probablemente requerirá más tiempo.
Algunos problemas potenciales pueden surgir durante el procedimiento. Si no se observa fluorescencia, podría haber un problema técnico con el citómetro que debe resolverse. Por esta razón, es esencial verificar que los embriones son fluorescentes antes de comenzar el procedimiento comprobándolos rápidamente bajo un microscopio. Otro problema común es digerir en exceso los embriones, lo que destruye las células. Ten cuidado en el paso de digestión y altera el tiempo si se observan demasiadas células muertas.
Estos ensayos tienen algunas limitaciones. El mayor problema es que estos ensayos se basan en la expresión de un marcador transgénico. Potencialmente, el cambio de la expresión del marcador transgénico puede no reflejar la biología de lo que está ocurriendo en el embrión. Además, la citometría de flujo puede no ser el mejor método para cuantificar las células si la población celular objetivo es extremadamente baja. Para hacer frente a estas posibilidades, se podrían utilizar otros ensayos como técnicas in situ o de tinción histológica. Si existen anticuerpos específicos para el tipo celular de inmunohistoquímica de interés también se puede realizar. Los embriones también podrían ser sometidos a qRT-PCR para medir genes específicos del linaje, y si estos ensayos se realizan en una máquina FACS, las células podrían ser aisladas y estudiadas individualmente con métodos aún más sensibles. Excluyendo estas cuestiones, este ensayo cuantitativo de citometría de flujo puede generar una gran cantidad de información útil para los investigadores.
Con estos ensayos, los investigadores pueden observar fácilmente defectos hematopoyéticos en animales vertebrados. Modificar las vías genéticas con MOs o CRISPR y luego realizar citometría de flujo para dilucidar si el gen juega un papel en la hematopoyesis se puede hacer rápidamente y es cuantitativo. Además, se pueden realizar pantallas genéticas hacia adelante (siempre y cuando los animales tengan una etiqueta fluorescente) y evaluar los defectos. El pez cebra también se ha convertido en un excelente modelo para las pantallas de drogas a gran escala6,7,8,9,10,permitiendo ensayos eficientes de detección de drogas en organismos vivos para observar si los fármacos son eficaces y si tienen efectos negativos en el desarrollo / supervivencia. El acoplamiento de este ensayo con tecnología automatizada de citometría de flujo mejorada por la robótica lo haría aún más eficiente20,21,22,permitiendo un análisis y cribado verdaderamente a gran escala de vías importantes en la génesis, el crecimiento y la regulación de las células sanguíneas que permanecen oscuras.
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Disclosures
D.L.S. es consultor científico y ha recibido una compensación de Finless Foods, Inc. y Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. no declara intereses competidores.
Acknowledgments
La financiación fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH: R15 DK114732-01 a D.L.S.), la Fundación Nacional de Ciencias (NSF: RMN 1626406 a D.L.S.), y del Programa de Honor en la Universidad Estatal chico de California (a K.F.R.). Los autores agradecen a Betsey Tamietti por la gestión de laboratorios y a Kathy Johns por su asistencia administrativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
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