Summary
השיטת Flypub מודדת את ההתנהגויות שבהן מציג הפרי את מלאנוזופילה מלוגסטר תחת השפעת האתנול. ניתן לשלוט בקלות על ידי הניסויים בכל הרמות וליישם גירויים שונים, הקלה על שימוש בסמים ולימודי התמכרות.
Abstract
הפרעת אלכוהול בשימוש (AUD) נותרה בעיה רצינית בחברה שלנו. כדי לפתח התערבויות אפקטיביות להתמכרות, חשוב להבין את המנגנונים הנוירויולוגיים הבסיסיים, שעבורם יש צורך בגישות נסיוניות ומערכות מודל מגוונות. המרכיב העיקרי של משקאות אלכוהוליים הוא אתנול, אשר גורם שינויים גמישים במערכת העצבים המרכזית והתנהגות על צריכת כרונית. רגישות התנהגותית (כלומר, הסלמה תגובות) במיוחד מייצגת שינוי מפתח אדפטיבית התמכרות. רוב האתנול המושרה לימודי התנהגותיות במודלים בעלי חיים נערכו על ההשפעה locomotor הפעלה של אתנול. השפעה בולטת של אתנול היא ביטול עכבה התנהגותית. לעומת זאת, רגישות התנהגותית להשפעה של אתנול, עם זאת, אינה מיוצגת. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו את הטיפול של Flypub המאפשר למדוד את העלייה הסלמה בפעילויות חיזור disinhibited על חשיפת אתנול חוזר ב Drosophila ילה melanogaster. כאן, אנו מדווחים על שיטת הפעולה צעד אחר צעד Flypub כולל הרכבה של תאי חשיפה האתנול, ההתקנה של תחנת הטיפול, קריטריונים עבור לטוס לטפל ואיסוף, אתנול משלוח, קוונפיקציה של פעילויות חיזור disinhibited, עיבוד נתונים וניתוח סטטיסטי. כמו כן מסופק כיצד לפתור שלבים קריטיים, להתגבר על מגבלות ולהרחיב את כלי השירות שלה כדי להעריך התנהגויות נוספות המושרה אתנול. שיטת Flypub בשילוב עם כלים גנטיים רבי-עוצמה ב- Drosophila ילה melanogaster יקל על המשימה של גילוי המנגנון הבסיסי המושרה אתנול התנהגותי רגישות.
Introduction
אלכוהול הוא אחד התרופות הזמינות והנפוצות ביותר בעולם. יש לו פוטנציאל גבוה לשימוש לרעה והתמכרות; עם זאת, המנגנון שבבסיס תהליך זה נשאר ברור לחלוטין. אתנול מעורר ביטול עכבה, אופוריה, ליקוי קוגניטיבי, היפראקטיביות, אובדן שליטה מוטורית והרגעה בתולעים1, פירות זבובים1,2,3, עכברים4, חולדות5 ובני אדם6, המציין רכיבים נוירוביולוגי נפוצות תיווך ההשפעות של אתנול מיצורים חסרי חוליות ליונקים כולל בני אדם. צריכת אתנול כרונית גורמת לעיבודים עצביים ושינויים התנהגותיים שאינם משקרים AUD. אחד העיבודים הוא רגישות התנהגותית המוגדרים כתגובה מורחבת עם חוויות חוזרות של אתנול7,8,9 או חומרים ממכרים אחרים10,11,12.
במהלך העשורים, המחקרים על השפעות ההתנהגות המושרה אתנול (eibs) התמקדו השפעה locomotor מגרה, אשר משמש כפרוקסי לתגובה אופוריה7,8,9,13. לדוגמה, חולדות או עכברים על חוזר (כל 24, 48 או 72 h) מינהל אתנול להציג את פעילות locomotor מורחבת כפי שנמדד על ידי מהירות הליכה8,14,15,16,17,18,19,20,21. באופן דומה, זבובים הפרי חשופים החשיפה השנייה אדי אתנול 4 h לאחר החשיפה הראשונה את התגובה locomotor משופרת כפי שנמדד על ידי מהירות הליכה כמו גם22. בעוד מידע לא זמין על המנגנון הבסיסי eibs לאפקט מגרה locomotor בזבובי פירות, המחקרים בחולדות ועכברים חשפו את הרכיבים המולקולריים והאותות (לדוגמה, הדופמין, גלוטמט ומערכות הנגבה), כמו גם מצעים עצביים ומעגל (לדוגמה, האזור tegmental הגחוני, הגרעין accumbens, אמיגדלה וקליפת המוח) המשחק תפקידים עיקריים עבור eibs6,9,23.
ביטול העכבה הוא השפעה גדולה של אתנול ומובילה לביטוי של התנהגויות שבדרך כלל מוגבלות. האפקט הבלתי מעורער מופעל על פונקציות מוטוריות, רגשיות, חברתיות, מיניות וקוגניטיביות, שעלולות לגרום להתנהגות מינית בלתי הולמת, תוקפנות מילולית או פיזית ומעשים אימפולסיבית בבני אדם ובדגמי בעלי חיים24,25,26,27,28,29. ביטול ביטול האתנול המושרה נחקר בדגמי בעלי חיים למחקרים מכניסטיים והם כוללים אימפולסיביות מוטוריים ותוקפנות אצל מכרסמים וקופים וכן ביטול ביטול מזון בתולעים6,9,24,28,29,30. הדגמנו כי זבובי פירות להראות disinhibited התנהגות מינית תחת השפעת אתנול31. במיוחד, זכרים מסוג פראי זבובים מבית המשפט לעתים רחוקות גברים אחרים ללא אתנול31 וכאשר הם עושים, האדיבות לדחות גברים החיזור. תחת השפעת האתנול, עם זאת, זבובים זכרים להראות חיזור יותר לקראת זכרים אחרים התערוכה דחייה פחות, וכתוצאה מכך חיזור הכוללת משופרת הבין גברים. בעיקר, זבובים לפתח רגישות התנהגותית לאפקט ביטול על השפעת אתנול חוזר, אשר משמש מערכת ייחודית ללמוד eibs31,32.
בדוח זה, אנו מתארים כיצד להגדיר, לבצע, לפתור ולנתח את שיטת Flypub ונתונים כדי ללמוד אתנול המושרה והרגישות של הפרי זבוב Drosophila ילה melanogaster. כדי לספק את השירות ואת האפקטיביות שלה, בדקנו את מסוג פראי -S קנטון (CS; בקרת לעוף להתאמץ) יחד עם זבובים לקויה tyramine β הידרוקסילז (tβh) כי בגדלים שונים אוקטואמין (OA). OA הוא כינוי עצבי מרכזי בחסרי חוליות33,34 ומשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של סובלנות אתנול בזבובים22. אנו מדווחים כאן בפעם הראשונה כי OA חשוב EIBS.
Protocol
הערה: מקטע הפרוטוקול מפרט את המכינה, הטיפול והניתוח של Flypub הכוללים (1) הרכבה של החדר, (2) התקנה ואיסוף, (3) שיטת הגדרת תחנת בדיקות, (4) חשיפה לאתנול, (5) חיזור הבקיע וניתוח נתונים, ו (6) ניתוח סטטיסטי. השלבים המרכזיים לניהול האנליזה והניתוח של Flypub מתוארים בתהליך עבודה (איור 1).
1. הרכבת הקאמרית (איור 2)
- חותכים את החלק התחתון של בקבוק הסיבוב העגול בבקבוק 25 מ ל בעזרת להב גילוח.
- לעשות חור, 5 מ"מ בקוטר, בסימן 50 mL של הבקבוק באמצעות ברזל הלחמה חם.
הערה: זוהי נקודת הגישה שבה יועברו הזבובים אל החדר. - חותכים גיליון רשת שינוי למעגל, 54 מ"מ קוטר, כדי להתאים את בקבוק Drosophila ילה בסימן 75 mL.
- אבטח את הרשת בסימן 75 mL של הבקבוק באמצעות דבק חם.
- חותכים את הסדין פלסטיק פוליקרבונט למעגל, 70 מ"מ קוטר.
- חבר את גיליון פלסטיק פוליקרבונט לבקבוק בסימן 25 מ"ל (השטח הפתוח התחתון עשה בשלב 1.1) באמצעות דבק חם.
- לחץ למטה באמצעות משקולות כדי להבטיח את סיבוב הפוליקרבונט מחובר היטב לתחתית.
- רוחצים את הפאבים באתנול כדי להסיר ריחות ולשטוף אותם פעמים רבות תחת הפעלת מים מזוקקים. לנער את הפאבים במרץ כדי להסיר את המים העודפים.
- לייבש את הפאבים על ידי הנחת אותם באופן אופקי על מגבות נייר בטמפרטורת החדר.
2. לטוס לטיפול ולאיסוף
- שמרו על הזבובים על מזון רגיל/מאכלים מהמטבח של אגר/סוכר/שמרים (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
- לאסוף אחד עד שני זבובים הזכר הישן לתוך קבוצה של 33, אשר מייצגים נקודת נתונים אחת, תחת פחמן דו חמצני (CO2) הרדמה. הקפד לבחור את הזבובים עם מורפולוגיה שלם ולשים אותם בבקבוקון מזון כדי להתאושש.
הערה: החברה נסבלת פעמיים או שלוש פחות. התנהגויות יכול להיות רגיש להגדרות ניסיוני ולכן מספר לעוף לכל פאב עשוי להיות צריך להיות מותאם עם שליטה לטוס קו.
הערה: ודא כי בקבוקון המזון מונח בצד כך שהזבובים ההרדמה אינם נתקעים במזון. - שמור את הזבובים בחממה 25 ° c עם לפחות 50% לחות יחסית ו 12 h אור/12 h מחזור כהה עבור יומיים לפני חשיפה אתנול.
הערה: קו משותף2 הוא קריטי כדי לחסל כל CO2המושרה השפעות פיסיולוגיים או התנהגותיים שעשויים לשנות תגובות אתנול המושרה. - השימוש בקודים להגנוטיפוסים עיוורים או תנאי טיפול לניסויים בביצוע חשיפה לאתנול והתנהגויות חיזור הבקיע.
הערה: בדיקות עיוורות מסייעות לחסל את ההטיה הניסיונית.
3. תחנת שיטתהגדרת (איור 3a)
- הגדר דוכן עותקים עם זרוע מרכזית צמודה על ראש ספסל בחדר מאוורר היטב.
הערה: מעמד ההעתקה אינו חובה. כל התקן אחסון זמני המספק פלטפורמת רמה מספיקה. - הצמד את שתי הזרועות הצדדיים למעמד, כאשר כל זרוע היא כ -18 ס מ ממרכז המעמד.
- הניחו אור פלורסנט על כל זרוע של הדוכן ואחד באמצע.
- חברו את מקליט הווידיאו לזרוע המרכזית, כ-38 ס מ מעל למרכז הבסיס. זה יהיה להקליט את הפאבים מהנוף העליון.
- כסו את בסיס המעמד בנייר לבן, המסייע לדמיין זבובים בצבע כהה כדי ליצור ניגודיות.
- במהלך יום החשיפה, הפעל את נוריות הפלורסנט ואת המחשב המחובר למצלמת הווידאו המצורפת לעמוד ההעתקה (איור 3A).
הערה: עוצמת האור 2100-2200 lux מספק איכות טובה של התנהגויות מוקלטות עבור הבקיע. עם זאת, תנאי תאורה סביבתי במעבדה מספיקים כדי להתבונן בפעילות חיזור המושרה האתנול. - הכינו את הפריטים שישמשו לחשיפה לאתנול שתוארה באיור 3B.
- אסוף שישה בפאבים נקיים ומורכבים לערכת ניסויים ותייג אותם בקוד 1 עד 6.
הערה: הקפד למקם את הקודים אקראי על גנוטיפים לטוס או תנאי טיפול.
4. חשיפה לאתנול (איור 3)
- בעדינות להעביר קבוצה של 33 זכרים לתוך חדר Flypub דרך החור בסימן 50 mL באמצעות משפך קטן.
הערה: כדי למזער את הלחץ המכני על הזבובים, למקם משטח העכבר או כל חומר ריפוד מתחת לפאב במהלך ההעברה. - . כסו את החור בקלטת
הערה: הקלטת משמשת לסגירת החור ולמניעת הימלטות מתוך הפאב. - יישר את הפאבים על הבמה מ-1 עד 6.
- Acclimate את הזבובים לחדר עבור 10 דקות (איור 3D).
- כוונן את הגדרות המצלמה, כולל המיקוד, הזום והבהירות, והקלט את 5 הדקות האחרונות של ההתאמה כדי למדוד את רמת החיזור בבסיס.
הערה: כדי למנוע בוהק שנוצר על ידי השתקפות אור מפאב, מגבונים למקום (בדרך כלל 4 שכבות או פחות מ 1 מ"מ עובי) בתחתית הפאב כדי לכוונן את הזווית. - להכין רפידות כותנה למסירה אתנול ידי חיתוך כרית לארבעה רבעים שווים עם מספריים נקיים ולאחר מכן לקצץ את הפינות כדי להפוך אותו לתוך צלחת פטרי במהלך הסתגלות (איור 3C).
הערה: אין להשתמש בידיים חשופות כדי לטפל בתחבושות הכותנה. השתמש מלקחיים לטפל רפידות כותנה כדי למנוע כל העברה פוטנציאלית של ריחות. - הוסיפו כרית כותנה לכל צלחת פטרי.
- הוסף 1 מ ל של 95% אתנול לכל משטח כותנה, לוודא פתרון אתנול להיות מופץ באופן שווה על האזור כולו של הלוח.
- כיסוי עם מגבונים כפולים שכבתית כדי למנוע אידוי האתנול מהר.
- מניחים את צלחת הפטרי הקטנה המכילה את כרית הכותנה הספוגה באתנול ואת מגבונים לחים באמצעות הפתיחה התחתונה של הפאב לאחר הסתגלות.
- יישר את הפאבים על הבמה, התחל בהקלטה ובמקביל הפעל טיימר.
- הקלט את הפאבים המכילים זבובים במהלך החשיפה לאתנול עד הזבובים להפסיק לחיזור או לנוע עקב הרגעה.
- הסר את צלחת פטרי המכילה אתנול מכל פאב עם מרית כאשר מעל 90% הזבובים הם הרגעה.
- בעדינות להעביר זבובים חזרה לבקבוקונים שהוקצו שלהם דרך החור בסימן 50 mL בפאב.
הערה: הניחו משפך על גבי מבחנות מזון כדי לסייע בהעברה. הקפידו להניח זבובים על הצד של מבחנות המזון כדי למנוע מהם להיתקע באוכל. - נקו את הפאבים באתנול כדי להסיר ריחות ולשטוף אותם פעמים רבות תחת הפעלת מים מזוקקים. לנער את הפאבים במרץ כדי להסיר את המים העודפים.
- לייבש את הפאבים על ידי הנחת אותם באופן אופקי על מגבות נייר בטמפרטורת החדר.
- שמרו על הזבובים בחממה של 25 ° c עם לפחות 50% לחות יחסית ו-12 שעות אור מחזור כהה.
- חזור על השלבים 4.1-4.17 כל 24 שעות במשך שישה ימים רצופים ולוודא לבצע את חשיפת האתנול באותו הזמן של היום כדי למנוע כל השפעות מעגליות.
הערה: מחליפים מזון מדי 2 – 3 ימים כדי לשמור על זבובים בריאים.
5. הבקיע וניתוח נתונים (איור 4-6)
- פתח את קטעי וידאו מוקלט באמצעות נגן מדיה (למשל, VLC) ולהגדיל את הווידאו כדי לצפות בבירור זבובים להבקיע (איור 4A).
- הצמד את קוד הזמן לווידאו (איור 4B).
- לספור את מספר הזכרים העוסקים בפעילות חיזור כולל להלן, הארכה כנף חד צדדית, שרשרת חיזור, מעגל חיזור, כיפוף הבטן והרכבה עבור כל 10 s לחסום זמן31 (איור 5).
- הזן את מספר הזכרים המציגים חיזור עבור כל 10 הזמן בבלוק לתוך גליון עבודה (איור 6A).
- השתמש במספר המקסימלי של הזכרים המחזרים בשלושת גושי הזמן הרצופים של 10 השעות כנקודת נתונים ייצוגית (איור 6B).
- חישוב ממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות בעלי הערך הגבוה ביותר (איור 6C) ומייצג את אחוז החיזור הבין-גברי לכל פאב (איור 6c).
6. אנליזה סטטיסטית (איור משלים 1)
- פתח תוכנה לניתוח סטטיסטי (לדוגמה, Minitab 17) והוסף נתוני חיזור בגליון העבודה.
הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנת ניתוח סטטיסטי. - כדי לקבוע את התפלגות הנתונים (התפלגות רגילה או שאינה נורמלית), עבור אל הכרטיסיה סטטיסטיקה , בחר באפשרות סטטיסטיקה בסיסיתולחץ על אפשרויות בדיקה נורמליות (איור משלים 1ai).
- במשתנה, בחר עמודות בודדות (כל עמודה המייצגת ערכת נתונים של גנוטיפ או טיפול תחת המחקר), בחר במבחן אנדרסון-דרלינג ולחץ על אישור (איור משלים 1aii).
הערה: מחלקת ההסתברות הנורמליות תציג את ערך ה-P המחושב: אם ערך ה-P גדול מ-0.05, הנתונים מופצים בדרך כלל. אם ערך ה-P קטן מ-0.05, הנתונים לא מופצים בדרך כלל (איור משלים 1Aiii). - להשוואה בין קבוצות מרובות, יש לערום את העמודות להשוואה על-ידי לחיצה על כרטיסיית נתונים , לבחור מחסניתולאחר מכן עמודות (איור משלים 1bi).
- בחלון מחסנית עמודות , בחר את עמודות הנתונים שיהיו מוערמות, בחר את הערימה שנעשתה בגליון עבודה או בעמודה חדשה של גליון העבודה הנוכחי עם העמודה הבאה המיועדת לציון כתב תחתי (לדוגמה, זהות קבוצתית של נתונים; משלים איור 1Bii-1Bii).
- לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה , בחר את בדיקת ANOVA , בחר את המודל הליניארי הכללי ולאחר מכן לחץ על התאמה למודל הליניארי הכללי (איור משלים 1Ci).
- בחלון מודל ליניארי כללי , בחר את העמודות שיש להשוותו בתיבה תגובות , בחר את העמודה עם כתב תחתי בתיבה גורמים ולחץ על אישור, המוביל לתוצאות הניתוח הסטטיסטי (איור משלים 1cii-1ciii).
- להשוואת שתי קבוצות עם נתונים שהופצו בדרך כלל, לחץ על לשונית Stat , בחר את הסטטיסטיקה הבסיסיתובחרבמבחן t 2 לדוגמה (איור משלים 1Di).
- ב 2-לדוגמה t עבור חלון ממוצע , בחר כל מדגם הוא בעמודה משלו, מתוך תיבה נפתחת, בחר את שתי הקבוצות כדי להשוות את לדוגמה 1 ולדוגמה 2 תיבות ולאחר מכן לחץ על אישור, אשר מוביל את תוצאות הניתוח הסטטיסטי (משלים איור 1dii-1diii).
- להשוואת שתי קבוצות עם נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, עבור לכרטיסייה Stat , בחר Nonparametrics ולחץ על מאן-ויטני (איור משלים 1ei)
- בחלון מאן-ויטני , בחר בשתי הקבוצות להשוואה בדוגמה הראשונה ובתיבות הדוגמה השניה ולאחר מכן לחץ על אישור, שיוביל לתוצאות הניתוח הסטטיסטי (איור משלים 1eii-1eiii).
- להשוואת שלוש קבוצות או יותר של נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, עבור לכרטיסיה Stat , בחר Nonparametricsולאחר מכן לחץ על מבחן קרוקל-ווליס (איור משלים 1fi).
- בחלון קרוקל-ווליס , בחר את העמודות שיש להשוותו בתיבה תגובה , בחר את העמודה עם כתב תחתי בתיבה פקטור ולחץ על אישור, אשר מוביל לתוצאות הניתוח הסטטיסטי (איור משלים 1fii-11).
Representative Results
סעיף זה ממחיש את התוצאות של ניסוי Flypub נציג. Drosophila 35לרוב הזכרים האחרים 35,36. במהלך החשיפה הראשונה אתנול, סוג פראי קנטון-S (CS) גברים הציגו גידול קטן אך חסר משמעות בחיזור disinhibited intermale31 (איור 7a). עם זאת, זכרים בפקולטה הראו עליות הסלמה בפעילות disinhibited חיזור בעקבות חשיפות אתנול עוקבות (ANOVA Glm, CS: R2= 0.83, F(5, 66) = 65.21, p < 0.0001; n = 12; איור 7A), המעיד על רגישות התנהגותית לתופעת האנוטיזציה של אתנול. בעבר הצגנו כי סוג זה של eibs דורש דופמין ואת קולטן דופמין דופקאר בנוירונים פטריות31,32.
כדי לזהות אם הנוירומודולטורים נוספים מעורבים eibs, חקרנו את התפקיד של OA על ידי בדיקת הזבובים (tβh; nM18 null אלל)37,38 tyramine β הידרוקסילז, האנזים הגבלת קצב ב biosynthesis oa, ובכך לקויה ב oa. הזכרים tβh ברקע גנטי במדעי הבית (מתנה מסוג ד ר אנדריאס Thum, אוניברסיטת לייפציג, גרמניה) הציג את התגובה הdisinhibited חיזור הרגישות על ידי היום חשיפות האתנול (ANOVA glm, tβh: R2= 0.67, F(5, 66) = 27.60, p < 0.0001; n = 12; איור 7B) אבל ברמה מופחתת לעומת CS (ANOVA glm, אינטראקציה אפקט: F = 2.50, p < 0.034). לאחר ניתוח post-הוק, הזכרים tβh הציגו רמות נמוכות יותר של חיזור בין-גברי בכל חשיפה כי הוא בולט ביותר במהלך הרביעי עד שישי חשיפות האתנול כאשר לעומת CS (שני לדגום t-TEST: p < 0.002 ב EXP4, p < 0.004 ב EXP5, p < 0.021 בEXP6; n = 12; איור 7C). יחד, תוצאות אלה מציינות כי OA עשוי לשחק תפקיד EIBS לאפקט ביטול העכבה של אתנול. חשוב יותר, אלה מערכות נתונים להפגין בבירור את השירות ואת האפקטיביות של שיטת Flypub בלמידה אתנול המושרה והרגישות.
איור 1: זרימת העבודה של שיטת Flypub. דיאגרמת זרימת עבודה המדגיש את שלבי המפתח לניהול השיטת Flypub. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: החומרים הקאמריים של הפלייפאב וההרכבה. (א) חומרים הנדרשים כדי לבנות קאמרית flypub כוללים (i) חם דבק אקדח דבק, (ii) אקדח דבק חם,(iii) סכין גילוח,(iv) הלחמה ברזל, (v) סרגל, (vi) רשת, (vii) גיליון פלסטיק פוליקרבונט, ו (viii) בקבוק מתחת לקצה התחתון. (ב) ייצוג סכימטי של הרכבת הקאמרית של flypub. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חשיפה לאתנול. (א) תחנת flypub המלאה במלואה. (ב) חומרים הנדרשים לחשיפה לאתנול כוללים (i) P1000 מיקרופיפטה, (ii) סרט, (iii) כותנה, (iv) צלחת פטרי, (v) מגבונים, (vi) קטן משפך, (vii) טיימר, (viii) בגודל בינוני, (ix) עכבר pad, (x) מספריים, (xi) 95% אתנול, (xii) מלקחיים ו (xiii) מרית. (ג) צעדים על איך לחתוך רפידות כותנה. (ד) התצוגה העליונה של הפאבים המיושרים על הבמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדרת וידאו עבור ניקוד התנהגותי. מוצג הוא מדריך צעד-אחר-צעד ב (א) כיצד להגדיל את התצוגה בווידאו ו (ב) כיצד להוסיף את קובץ קוד הזמן לנגן המדיה VLC לקבלת ניקוד התנהגותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התנהגויות חיזור של גברים. תמונות מייצגות ממחישים את התנהגויות החיזור הגברי של דרוזוהילה , כולל הארכת כנף חד-צדדית (A), שרשרת החיזור (ב)מעגל החיזור (D) הבטן כיפוף ו (E) הרכבה המשמשים לניקוד התנהגותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קלט וניתוח נתונים. (א) מספר הזכרים העוסקים בחיזור בגוש הזמן של כל 10 הימים מועתק לגליון עבודה. המספר הגבוה ביותר של החיזור זכרים של שלושה בלוקים ברציפות של 10 הזמן (החץ הירוק) משמש כנקודת נתונים ייצוגית. הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות (סוגר כחול או כתום) בעל הערך המקסימלי מייצג את אחוז החיזור הבין-גברי לכל פאב [סוגר כתום; MAX (ממוצע), חץ שחור]. (ב, ג) נוסחאות גליון העבודה המשמשות לחישוב נקודת הנתונים של הנציג המקסימלי והממוצע המקסימלי של 10 נקודות מידע מייצגות עוקבות לכל פאב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אתנול המושרה ביטול עכבה התנהגותית ורגישות בפקולטה למדעי ההתנהגות tβh. (א, ב) הזכרים CS ו tβh הציגו ביטול החיזור באמצעות חשיפות באמצעות כיווני האתנול חוזר (ANOVA glm, CS: R2= 0.83, F(5, 66)= 65.21, p < 0.0001; tβh: R2= 0.67, F(5, 66)= 27.60, p < 0.0001; n = 12). (ג) הזכרים tβh הראו חיזור פחות disinhibited לעומת CS (n = 12). ערכי p של הניתוח הפוסט-הוק מוצגים מעל לקו. פעילות חיזור בין גברים נותחו מתוך קטעי וידאו שנוצרו עבור כל חשיפה אתנול. כל הנתונים מדווחים כאמצעי ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1: אנליזה סטטיסטית. השלבים בתוכנה Minitab 17 על איך לבצע את (א) מבחן נורמליות, (ב) הערמה את הנתונים, (ג) המודל הליניארי הכללי מבחן ANOVA, (D) שני לדגום t-test, (E) המבחן מאן-ויטני ו (F) מבחן קרוקל-ווליס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
בדוח זה, תיארנו את ההתקנה ואת הפרוטוקול המפורט של הגדרת הארגון של Flypub; שיטה הרומן למדוד כיצד חשיפה אתנול חוזר מעורר disinhibited חיזור ורגישות התנהגותית. למרות השיטת Flypub היא פשוטה יחסית, מספר צעדים דורשים טיפול ותשומת לב כדי להבטיח תוצאות אמינות. ראשית, זבובים לבדיקה חייב להיות פיגמנט מלא (כלומר, מפותח לגמרי זבובים), בריא ושלמים. עיוותים או נזק במיוחד בכנפיים או ברגליים יכולים להשפיע על יכולתו של הזכר לבית המשפט. שנית, גיל לטוס הוא חשוב ויש להתאים בין קבוצות שליטה וניסיוני (גיל אופטימלי: 3-5 ימים בחשיפה לאתנול 1). שבועיים ומעלה פראי סוג זבובים הזכרים נוטים להציג את רמות גבוהות של חיזור disinhibited31. כך, הגיל המתאים התאמה של זבובים במחקר חיוני כדי למנוע תוצאות משתנה. שלישית, מספר הטיסה לכל פאב חיוני (אופטימלי: 33 לכל פאב). מספרי הטיסה הנמוכים או הגבוהים ביותר לכל פאב יכולים להטות באופן משמעותי את ציוני החיזור (נתונים לא מוצגים). רביעית, מלון Flypub צ'יימברס צריך להיות בעלי כרכים זהים כפי שמודגם באיור 2B. הדבר מבטיח כי זבובים יקבלו אדי אתנול באופן סינכרוני והתנהגויות המועלות עקביות. חמישית, הקלטת וידאו ברורה וניקוד מדויק של חיזור הם חיוניים. פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על תצפיות התנהגותיות, כל כך מוקפד הקפדה על פרוטוקול הניקוד הסטנדרטי מהווה בסיסי כדי למזער תוצאות לא עקביות. לבסוף, מומלץ מאוד לבצע את החשיפה של האתנול ואת צעדי החיזור באופן עיוור, כאשר ניסוי ניסיוני אינו מודע לזבובים או לטיפולים ניסיוניים, ובכך מונע הטיה ניסיונית.
לשיטת Flypub יש יתרונות רבים. ראשית, ניתן לבדוק קבוצות מרובות של זבובים ולהשוותו בו. שנית, זה זול, פשוט להתקנה וקל ללמוד, מה שהופך אותו נוח מאוד לניסויים בכל הרמות כולל יסודי באמצעות התיכון, סטודנטים לתואר ראשון ולתארים מוסמכים, פוסט-דוקטורנטים והוראה, כמו גם מעבדות ההוראה עם מרחב מוגבל תקציבים. שלישית, זה יכול להיות מנוצל כדי למדוד התנהגויות נוספות כגון disinhibited חיזור של זבובים נקבה ואת השפעת הרגעה של אתנול או הרגעה אחרים כדי להעריך רגישות ראשונית ופיתוח עמידות ותחזוקה31,32. ביחד, Flypub הוא שיטה רב-תכליתית ללמוד תכונות מגוונות של AUD.
המגבלה העיקרית של שיטת Flypub הוא משטר הניקוד קפדני ומפרך. התנהגות החיזור תחת השפעת האתנול הוא דינמי מאוד באופן שמשך החיזור נע בין פחות משנייה אחת לכמה דקות והזבובים העוסקים בחיזור משתנים לעתים קרובות למדי. המשטר הבקיע הציג כאן פותחה כדי לשלב את הטבע הדינמי הזה כדי לספק ציונים עקביים על חשיפות אתנול בודדים עבור גנוטיפ נתון31,32. כפי שצוין בפרוטוקול, פעילות החיזור הוא הבקיע באופן ידני, וזה זמן רב. מספר תוכניות הניקוד האוטומטי פותחו כדי להקל על ההקרנה משוחדת התנהגותי גבוהה תפוקה וכולם אשר להסתמך על בודדים זבובים ' תנועות ומיקומים39,40,41,42,43,44,45. ניסינו גם לפתח תוכנת מחשב כדי לספור באופן אוטומטי את פעילות החיזור אך לא היתה אפשרות להשיג תוצאות עקביות ואמינות. זה יכול להיות בגלל העובדה שניקוד התנהגותי כולל שלבי חיזור מרובים (כלומר, בעקבות, הארכה כנף חד צדדית, כיפוף בטן והרכבה)35,36,46 של זבובים מרובים בבת אחת. גם עם מגבלה זו, הניסויים עם הכשרה נאותה צריך להיות מסוגל לכמת את התנהגויות חיזור המושרה האתנול עם עקביות ודיוק. עם זאת, זה יהיה לעזר רב וחשיבות לאמץ למידה ממוחשבת או אלגוריתמים מתקדמים אחרים כטיפול.
בדומה מודלים מכרסם, המחקרים על אתנול במודל לטוס יש התמקדו במידה רבה על הlocomotor של אתנול השפעות הרגעה. שיטת flypub עם זאת, מדדים disinhibited חיזור, סוג של היפוביטול קוגניטיבית שהוא הרומן31,32. לכן, Flypub יכול לסייע להבהיר את השחקנים המולקולריים, מסלולים סלולריים ומעגלים עצביים, כמו גם גורמי הסיכון (למשל, גיל, לישון, דיאטה או סביבה חברתית) קריטי עבור ביטול התנהגות התנהגותי ורגישות. יש לנו בעבר הפגינו כי דופמין איתות נדרש עבור eibs, אשר בקנה אחד עם הממצאים של דגמי מכרסמים ונושאים אנושיים6,9,31. גם כהוכחה של המושג, בדקנו את מוטציה tβh חסר OA (המקבילה חסרי חוליות של norepinephrine) ומצא oa הוא גם חשוב לרגישות התנהגותית להשפעה של האתנול למרות התרומה שלה הוא קטן יחסית לעומת זה של דופמין31. ממצא זה הוא בניגוד להתבוננות על ידי שסץ47 כי tβh מוטציה זבובים התערוכה אין ליקויים ברורים ברגישות locomotor ההפעלה של אתנול אפקט47. זה מציע ברורים מולקולרית, מסלולים סלולריים ועצביים למדיזציה התנהגותית לעומת הlocomotor הפעלה. מחקרים מעקב צריכים לשתף פעולה ברעיון מפתה זה.
לסיכום, Flypub הוא שיטה בעלות נמוכה, רבת פנים ויעילה כדי לחקור את התגובות התנהגותיות לאתנול, במיוחד ביטול ורגישות התנהגותית, זה עשוי לעזור לקדם את ההבנה שלנו של AUD ולספק תובנה התערבויות יעיל עבור הפרעה כרונית זו.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, המוח & התנהגות קרן מחקר NARSAD, ו NIMH 2G12MD007592 מענקים אשכול NMD. אנחנו גם אסירי תודה על תוכנית העלייה NIH במימון (כלומר 5R25GM069621) עבור תמיכה NMD ו-CMS, התוכנית UTEP קורא-לעלות תמיכה NMD, ממומן במימון התוכנית מארק (2T34GM008048-31) עבור תמיכה AA, ואת ד ר. Keelung הונג בוגר מלגת תמיכה בס. אנו מעריכים מאוד את מחלקת התקשורת UTEP: דרלין בראחס, כריסטיאן ריברה, קארינה מורנו, חוסה לויה פרננדז והחוג למוסיקה: סטפן חדד על עזרתם בהפקה וידאו וקול. לבסוף, אנו מודים מאוד לד ר אנדריאס Thum על שיתוף מוטציה tβh ב קנטון-s הרקע יחד עם השליטה של קנטון-s זבובים; ו ג'סיקה Burciaga על תרומתו היקר שלה למחקרים הראשונית על אוקטואמין וחברי המעבדה האן לדיון ותמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
References
- Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
- Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
- Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
- Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
- Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
- Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
- Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
- Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C.
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
- Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
- Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
- Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
- Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
- Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
- Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
- Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
- Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U.
- Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
- Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
- Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
- Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
- Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
- Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
- Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
- Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
- Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
- Roeder, T.
- Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
- Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
- Spieth, H. T.
- Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
- Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
- Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
- Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).
