Summary
Flypub-analysen mäter de beteenden som fruktflugan Drosophila melanogaster visar under påverkan av etanol. Analysen kan lätt behärskas av experimentörer på alla nivåer och tillämpas på olika förångade stimuli, underlätta missbruk och studier missbruk.
Abstract
Alkoholmissbruk (AUD) är fortfarande ett allvarligt problem i vårt samhälle. För att utveckla effektiva insatser för missbruk är det viktigt att förstå de underliggande neurobiologiska mekanismerna, för vilka olika experimentella metoder och modellsystem behövs. Den viktigaste ingrediensen i alkoholhaltiga drycker är etanol, vilket orsakar adaptiva förändringar i centrala nervsystemet och beteende vid kroniskt intag. Beteendemässig sensibilisering (dvs. eskalerade svar) i synnerhet utgör en viktig adaptiv förändring underliggande missbruk. De flesta etanol-inducerad beteendesensibilisering studier i djurmodeller har utförts på locomotor aktivera effekten av etanol. En framträdande effekt av etanol är beteendemässiga disinhibition. Beteendemässiga sensibilisering till disinhibition effekten av etanol, är dock underrepresenterad. För att lösa detta problem utvecklade vi Flypub-analysen som gör det möjligt att mäta den eskalerade ökningen av ohämmad uppvaktningsaktiviteter vid återkommande etanolexponering i Drosophila melanogaster. Här rapporterar vi steg-för-steg Flypub-analysen inklusive montering av etanolexponeringskammare, installation av analysstationen, kriterier för flygvård och insamling, etanolleverans, kvantifiering av hämningslös uppvaktningsverksamhet, databehandling och statistisk analys. Också tillhandahålls är hur man felsöker kritiska steg, övervinna begränsningar och utöka dess verktyg för att bedöma ytterligare etanol-inducerad beteenden. Flypub-analysen i kombination med kraftfulla genetiska verktyg i Drosophila melanogaster kommer att underlätta uppgiften att upptäcka mekanismen bakom etanolinducerad beteendesensibilisering.
Introduction
Alkohol är en av de mest lättillgängliga och allmänt konsumerade droger i världen. Det har stor potential för missbruk och missbruk; Den mekanism som ligger till grund för denna process är dock fortfarande ofullständigt förstådd. Etanol inducerar avhämning, eufori, kognitiv svikt, hyperaktivitet, förlust av motorisk kontroll och sedering i maskar1, bananflugor1,,2,,3, möss4, råttor5 och människor6, vilket indikerar vanliga neurobiologiska komponenter som förmedlar etanols effekter från ryggradslösa djur till däggdjur inklusive människor. Kroniskt etanolintag orsakar neurala anpassningar och beteendeförändringar som ligger till grund för AUD. En av anpassningarna är beteendemässig sensibilisering definieras som det förstärkta svaret med upprepade erfarenheter av etanol7,,8,,9 eller andra beroendeframkallande ämnen10,11,12.
Under årtiondena har studierna om etanolinducerad beteendesensibilisering (EIBS) fokuserat på den rörelsestimulerande effekten, som används som en proxy för ett euforiskt svar7,,8,9,13. Råttor eller möss som upprepas (var 24, 48 eller 72 h) etanoladministration visar till exempel den förstärkta rörelseaktiviteten mätt med gånghastighet8,,14,15,16,17,18,19,20,21. På samma sätt uppvisar fruktflugorna som utsätts för den andra exponeringen för etanolånga 4 h efter den första exponeringen den förbättrade rörelseresponsen mätt med gånghastighet samt22. Det finns ingen information om den mekanism som ligger till grund för EIBS för den rörelsestimulerande effekten hos bananflugor, men studierna på råttor och möss har avslöjat de molekylära och signalkomponenter (t.ex. dopamin-, glutamat- och GABA-systemen) samt neurala substrat och kretsar (t.ex. det ventrala tegmentalområdet, nucleus accumbens, amygdala och prefrontal cortex) som spelar viktiga roller för EIBS6,,9,23.
Disinhibition är en viktig effekt av etanol och leder till manifestation av beteenden som vanligtvis är begränsade. Den disinhibiting effekt utövas på motoriska, känslomässiga, sociala, sexuella och kognitiva funktioner, vilket kan leda till olämpligt sexuellt beteende, verbal eller fysisk aggression och impulsiva handlingar hos människor och djurmodeller24,25,26,27,28,29. Etanol-inducerad disinhibition har undersökts i djurmodeller för mekanistiska studier och de inkluderar motorisk impulsivitet och aggression hos gnagare och apor samt födosök disinhibition i maskar6,9,24,28,29,30. Vi har visat att bananflugor visar ohämmat sexuellt beteende under påverkan av etanol31. Specifikt, vilda män flyger sällan domstol andra män utan etanol31 och när de gör, hovman aktivt avvisa uppvakta män. Under påverkan av etanol, dock manliga flugor visar mer uppvaktning mot andra män och hovdjur uppvisar mindre avslag, vilket resulterar i övergripande förbättrad intermale uppvaktning. Framför allt utvecklar flugor beteendemässig sensibilisering till disinhibition-effekten vid återkommande etanolexponering, som fungerar som ett unikt system för att studera EIBS31,32.
I den här rapporten beskriver vi hur man ställer in, utför, felsöker och analyserar Flypub-analysen och data för att studera etanolinducerad disinhibition och sensibilisering i fruktflugan Drosophila melanogaster. För att ge dess nytta och effektivitet, testade vi vildtyp Canton-S (CS; kontroll fluga stam) tillsammans med flugor brist på tyramin β hydroxylase (tβh) som syntetiserar oktopamin (OA). OA är en viktig neuromodulator i ryggradslösa djur33,34 och spelar en nyckelroll i utvecklingen av etanoltolerans i flugor22. Vi rapporterar här för första gången att OA är viktigt för EIBS.
Protocol
OBS: I protokollavsnittet beskrivs de förberedande, Flypub-analys- och analyssteg som inkluderar (1) montering av kammaren, (2) flygvård och insamling, (3) analysstationsinställningar, (4) etanolexponering, (5) uppvaktningsbedömning och dataanalys samt (6) statistisk analys. De viktigaste stegen för att genomföra Flypub-analysen och analysen visas i ett arbetsflöde (figur 1).
1. Församlingen av kammaren (figur 2)
- Skär av den nedre delen av den runda Drosophila flaskan vid 25 ml-märket med ett rakblad.
- Gör ett hål, 5 mm i diameter, vid 50 ml märket på flaskan med hjälp av en varm lödkolv.
OBS: Detta är den åtkomstpunkt där flugorna kommer att överföras till kammaren. - Skär ett nätark i en cirkel, 54 mm i diameter, för att få plats i Drosophila-flaskan vid 75 ml-märket.
- Säkra nätet vid flaskans 75 ml-märke med varmt lim.
- Skär polykarbonat plastfolie i en cirkel, 70 mm i diameter.
- Fäst polykarbonat plastfolie på flaskan på 25 ml märket (botten öppet område i steg 1.1) med varmt lim.
- Tryck ner med hjälp av vikter för att säkerställa att polykarbonatrundan är ordentligt fastsatt på botten.
- Tvätta pubarna med etanol för att avlägsna lukter och skölj dem ymnigt flera gånger under rinnande destillerat vatten. Skaka pubarna kraftigt för att ta bort överflödigt vatten.
- Torka pubarna genom att lägga ner dem horisontellt på pappershanddukar i rumstemperatur.
2. Flygvård och insamling
- Håll flugorna på en standard majsmjöl / agar / socker / jäst mat medium (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
- Samla in en till två dagar gamla hanar flyger in i en grupp på 33, som representerar en datapunkt, under koldioxid (CO2)anestesi. Se till att välja flugor med intakt morfologi och lägg dem i en matflaska för att återhämta sig.
OBS: Två fler eller tre mindre flugor per grupp är acceptabla. Beteenden kan vara känsliga för experimentella inställningar, vilket innebär att ett totalt flugnummer per pub kan behöva justeras med en kontrollflyglinje.
OBS: Se till att matflaskan är fastsatt på sidan så att de sövda flugorna inte fastnar på maten. - Håll flugorna i 25 °C-inkubatorn med minst 50 % relativ fuktighet och en 12 h ljus / 12 h mörk cykel i 2 dagar före etanolexponering.
OBS: CO2 clearance är avgörande för att eliminera eventuella CO2-inducerad fysiologiskaeller beteendemässiga effekter som kan förändra etanol-inducerad svar. - Använd koder för att blinda flyga genotyper eller behandlingsvillkor till de experimentörer som utför etanolexponering och scoring uppvaktning beteenden.
BLINDtester hjälper till att eliminera experimentell bias.
3. Analysstation inrättad(figur 3A)
- Sätt upp ett kopieringsställ med en fäst mittarm på en bänkskiva i ett väl ventilerat rum.
OBS: Kopieringsstället är inte obligatoriskt. Alla mellanlagringsenheter som tillhandahåller en nivåplattform är tillräckliga. - Kläm fast de två laterala armarna till stativet, med varje arm ca 18 cm ut från mitten av stativet.
- Placera ett lysrör på varje arm av stativet och en i mitten.
- Fäst videobandspelaren på mittarmen, cirka 38 cm ovanför mitten av basen. Detta kommer att spela in pubar från en toppvy.
- Täck basen av stativet med vitt papper, vilket hjälper till att visualisera mörka flugor för att skapa kontrast.
- Under exponeringsdagen slår du på lysrören och datorn som är ansluten till videokameran som är ansluten till kopieringsstativet (bild 3A).
OBS: Ljusintensiteten 2100-2200 lux ger god kvalitet på inspelade beteenden för poängsättning. De omgivande ljusförhållandena i laboratoriet är dock tillräckliga för att observera uppvaktningsverksamhet som orsakas av etanol. - Bered de artiklar som ska användas för etanolexponering som avbildas i figur 3B.
- Samla sex rena, monterade pubar för en uppsättning experiment och märk dem med koden 1 till 6.
OBS: Se till att placera de randomiserade koderna på flyggenotyper eller behandlingstillstånd.
4. Exponering för etanol(figur 3)
- Överför försiktigt en grupp på 33 hanar till en Flypub kammare genom hålet vid 50 ml-märket med hjälp av en liten tratt.
OBS: För att minimera mekanisk påfrestning på flugorna, placera en musmatta eller något dämpande material under puben under överföringen. - Täck hålet med ett band.
OBS: Bandet används för att stänga hålet, förhindra flugor från att fly ut ur puben. - Rikta pubarna på scenen från 1 till 6.
- Acklimatisera flugorna till kammaren i 10 min (Figur 3D).
- Justera kamerainställningarna inklusive fokus, zoom och ljusstyrka och spela in de sista 5 minuters acklimatiseringsnivån för att mäta en basal uppvaktningsnivå.
OBS: För att eliminera bländning som genereras av ljusreflektion från en pub, placera lab våtservetter (vanligtvis 4 lager eller mindre än 1 mm tjocklek) längst ner på puben för att justera vinkeln. - Förbered bomullsrondeller för etanolleverans genom att skära en dyna i fyra lika stora kvadranter med ren sax och trimma sedan hörnen så att den passar in i en petriskål under acklimatisering (figur 3C).
OBS: Använd inte bara händer för att hantera bomullsrondorna. Använd pincett för att hantera bomullsrondorna för att undvika eventuell överföring av lukter. - Tillsätt en bomullstuss i varje petriskål.
- Tillsätt 1 ml 95% etanol till varje bomullsrondell, se till att etanollösningen fördelas jämnt på hela dynans yta.
- Täck med dubbelskiktade lab våtservetter för att undvika snabb etanol avdunstning.
- Placera den lilla petriskålen som innehåller den etanoldränkta bomullsdynan och de dubbelskiktade labbservetterna genom pubens bottenöppning efter acklimatisering.
- Rikta in pubarna på scenen, börja spela in och starta samtidigt en timer.
- Spela in pubar som innehåller flugor under etanolexponering tills flugorna slutar uppvakta eller flytta på grund av sedering.
- Ta bort petriskålen som innehåller etanol från varje pub med en spatel när över 90% av flugorna är sövda.
- Överför försiktigt flugor tillbaka till sina tilldelade flaskor genom hålet vid 50 ml-märket på puben.
OBS: Placera en tratt ovanpå mat injektionsflaskan för att underlätta överföringen. Se till att placera sövda flugor på sidan av mat injektionsflaskan för att förhindra att de fastnar i maten. - Rengör pubarna med etanol för att avlägsna lukter och skölj dem ymnigt flera gånger under rinnande destillerat vatten. Skaka pubarna kraftigt för att ta bort överflödigt vatten.
- Torka pubarna genom att lägga ner dem horisontellt på pappershanddukar i rumstemperatur.
- Håll flugorna i 25 °C-inkubatorn med minst 50 % relativ luftfuktighet och en 12 h ljus / 12 h mörk cykel.
- Upprepa stegen 4.1-4.17 var 24:e timme under sex dagar i följd och se till att genomföra etanolexponeringen vid samma tidpunkt på dagen för att undvika dygnsrytmeffekter.
OBS: Byt mat injektionsflaska var 2 - 3 dagar för att upprätthålla friska flugor.
5. Bedömning av uppvaktning och dataanalys(figur 4-6)
- Öppna de inspelade videorna med en mediaspelare (t.ex.Figure 4A
- Koppla tidskoden till videon (bild 4B).
- Räkna antalet män som deltar i uppvaktning verksamhet inklusive följande, ensidiga vinge förlängning, uppvaktning kedja, uppvaktning cirkel, buken böjning och montering för varje 10 s tid block31 (figur 5).
- Ange antalet män som visar uppvaktning för varje 10-tals tidsblock i ett kalkylblad (bild 6A).
- Använd det maximala antalet uppvaktande hanar i de tre på varandra följande 10-talstidsblocken som representativ datapunkt (figur 6B).
- Beräkna genomsnittet på 10 på varandra följande datapunkter med det högsta värdet (figur 6C) och detta motsvarar procentandelen intermale uppvaktning per pub (figur 6A).
6. Statistisk analys (tilläggstal 1)
- Öppna programvara för statistisk analys (t.ex.
OBS: Alla statistiska analysprogram kan användas. - Om du vill bestämma fördelningen av data (antingen normal eller icke-normal fördelning) går du till fliken Stat, väljer Grundläggande statistik och klickar på alternativet Normalitetstest (Tilläggsbild 1Ai). Basic Statistics
- I Variabelväljer du enskilda kolumner (varje kolumn som representerar en datauppsättning av en genotyp eller behandling som studeras), väljer Anderson-Darling-testet och klickar på OK (Supplemental Figure 1Aii).
Normalitetssannolikhetsdiagrammet visar det beräknade P-värdet: om P-värdet är större än 0,05 distribueras data normalt. Om P-värdet är mindre än 0,05 distribueras uppgifterna inte normalt(tilläggsfigur 1Aiii). - För jämförelse av flera grupper, stapla kolumnerna att jämföra genom att klicka på fliken Data, välj Stackoch sedan Kolumner (Tilläggsbild 1Bi).
- I fönstret Stapelkolumner markerar du de datakolumner som ska staplas, markerar staplingen som görs antingen i Nytt kalkylblad eller Kolumn med aktuellt kalkylblad med nästa kolumn som är avsedd för att ange nedsänkt (t.ex. datagruppsidentitet; Kompletterande figur 1Bii-1Biii).
- Klicka på fliken Stat, välj ANOVA-testet, välj den allmänna linjära modellen och klicka sedan på den allmänna linjära modellen Anpassa allmänt (kompletterande bild 1Ci).
- I fönstret Allmän linjär modell markerar du de kolumner som ska jämföras i rutan Svar, markerar kolumnen med nedsänkt i rutan Faktorer och klickar på OK, vilket leder till statistiska analysresultat (Tilläggsfigur 1Cii-1Ciii).
- För jämförelse av två grupper med normalt distribuerade data klickar du på fliken Stat, väljer grundstatistikoch väljert-testet 2 -Prov (Supplemental Figure 1Di).
- I fönstret 2-exempel t för medelvärdet väljer du Varje prov i en egen kolumn, från en listruta, välj de två grupperna att jämföra i rutorna Prov 1 och Prov 2 och klicka sedan på OK, vilket leder till de statistiska analysresultaten (Tilläggsfigur 1Dii-1Diii).
- För jämförelse av två grupper med icke-normalt distribuerade data, gå till fliken Stat, välj Nonparametrics och klicka på Mann-Whitney (Supplemental Figure 1Ei)
- I fönstret Mann-Whitney väljer du de två grupperna som ska jämföras i rutorna Första prov och andra prov och klickar sedan på OK, vilket leder till statistiska analysresultat (Supplemental Figure 1Eii-1Eiii).
- För jämförelse av tre eller flera grupper av icke-normalt distribuerade data, gå till fliken Stat, välj Nonparametricsoch klicka sedan på Kruskal-Wallis-testet (Supplemental Figure 1Fi).
- I fönstret Kruskal-Wallis markerar du de kolumner som ska jämföras i rutan Svar, markerar kolumnen med nedsänkt i rutan Faktor och klickar på OK, vilket leder till statistiska analysresultat (Supplemental Figure 1Fii-1Fiii).
Representative Results
Det här avsnittet visar resultaten av ett representativt Flypub-experiment. Drosophila män uppvaktar sällan andra män35,36. Under den första etanolexponeringen uppvisade hanarna av den vilda typen Canton-S (CS)en liten men obetydlig ökning av den ohämmade intermale uppvaktningen31 (figur 7A). Cs-män visade dock de eskalerade ökningarna i den ohämmade uppvaktningsaktiviteten i efterföljande etanolexponeringar (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65,21, p < 0,0001; n = 12. Figur 7A), som indikerar beteendemässig sensibilisering till etanolens disinhibitionseffekt. Vi har tidigare visat att denna typ av EIBS kräver dopamin och dopaminreceptorn DopEcR i svamp nervceller31,32.
För att identifiera om ytterligare neuromodulatorer är involverade i EIBS undersökte vi OA:s roll genom att testa flugorna (tβh; nM18 null allel)37,38 saknar tyramin β hydroxylase, det hastighetsbegränsande enzymet i OA-biosyntesen, vilket är bristfälligt i OA. T tβh hanarna i CS genetisk bakgrund (en snäll gåva från Dr Andreas Thum, University of Leipzig , Tyskland) visade sensibiliserade disinhibited uppvaktning svar på dagliga etanol exponeringar (ANOVA GLM, tβh: R2= 0,67, F(5,66) = 27,60, p < 0,0001; n = 12. Figur 7B) men på den reducerade nivån jämfört med CS (ANOVA GLM, interaktionseffekt: F =2,50, p <0,034). Vid post hoc-analys uppvisade tβh hanar lägre nivåer av intermale uppvaktning vid varje exponering som är tydligast under den fjärde till sjätte etanolexponeringar jämfört med CS (Två-prov t-test: p < 0,002 i EXP4, p < 0,004 i EXP5, p < 0,021 i EXP6; n = 12. Bild 7C). Tillsammans tyder dessa resultat på att OA kan spela en roll i EIBS för etanolns disinhibitioneffekt. Ännu viktigare, dessa datamängder visar tydligt nyttan och effektiviteten av Flypub-analysen i att studera etanol-inducerad disinhibition och sensibilisering.
Bild 1: Flypub-analysarbetsflöde. Ett arbetsflödesdiagram som belyser de viktigaste stegen för att genomföra Flypub-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flypub kammare material och montering. (A)Material som krävs för att bygga en Flypub kammare inkluderar(i)varmt lim pistol lim pinne, (ii) varmt lim pistol, (iii)rakblad,iv) lödkolv, (v) linjal, (vi)mesh, (vii) polykarbonat plastfolie, och (viii) rund-botten Drosophila flaska. (B)Schematisk representation av Flypub-kammarens sammansättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Etanolexponering. (A)En färdigmonterad Flypub station. (B)Material som krävs för etanolexponering omfattari) P1000 micropipette, (ii)tejp,( iii)bomullstuss,iv) Petriskål,v) lab våtservetter, (vi) liten tratt, (vii) timer,viii) medelstora tratt, (ix)musmatta,x) sax, (xi) 95% etanol, (xii) pincett och (xiii) spatula. (C)Steg på hur man skär bomullsrondeller. (D)Top view bild av pubar i linje på scenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Videoinställningar för beteendemässiga poängsättning. Visas är steg-för-steg guide på (A) hur man zoomar in på videon och (B) hur man sätter in tidskodfilen i VLC mediaspelare för beteendemässiga scoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Manliga uppvaktning beteenden. Representativa bilder illustrerar Drosophila manliga uppvaktning beteenden inklusive följande och ensidiga vinge förlängning för (A) uppvaktning sång, (B) uppvaktning kedja, (C) uppvaktning cirkel (D) buken böjning och (E) montering som används för beteendemässiga scoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Inmatning och analys av uppgifter. (A)Antalet män som deltar i uppvaktning i varje 10 s tid block transkriberas till ett kalkylblad. Det högsta antalet uppvaktande män på tre på varandra följande 10-talstidsblock (grön pil) används som representativ datapunkt. Genomsnittet av 10 på varandra följande datapunkter (blå eller orange konsol) med det högsta värdet representerar procentandelen av den intermanska uppvaktningen per pub [orange konsol; MAX (medel), svart pil]. (B,C) De kalkylbladsformler som används för att beräkna den maximala representativa datapunkten och det maximala genomsnittet på 10 på varandra följande representativa datapunkter per pub. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Etanolinducerad beteendehämhföring och sensibilisering i CS och tβh. (A,B) CS och tβh hanar visade sensibiliserad uppvaktning disinhibition med upprepade etanol exponeringar (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66)= 65,21, p < 0,0001; tβh: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) Hanarnah visade mindre ohämmad uppvaktning jämfört med CS (n=12). Post hoc-analysernas p-värden visas ovanför linjen. Den intermale uppvaktningsaktiviteten analyserades från de videor som genererades för varje etanolexponering. Alla data rapporteras som medelvärdet ± standardfel för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Statistisk analys. Stegen i Minitab 17-programvaran om hur man utför(A)Normalitetstestet, (B) stapling av data, (C) Allmän linjär modell ANOVA test, (D) Två-prov t-test, (E) Mann-Whitney test och(F) Kruskal-Wallis test. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
I den här rapporten har vi beskrivit inställningarna och det detaljerade protokollet för Flypub-analysen. en ny metod för att mäta hur återkommande etanolexponering utlöser hämningslös uppvaktning och beteendemässig sensibilisering. Även om Flypub-analysen är relativt enkel, kräver flera steg omsorg och uppmärksamhet för att säkerställa tillförlitliga resultat. För det första måste flugorna för testning vara fullt pigmenterade (dvs. fullt utvecklade vuxna flugor), friska och intakta. Missbildningar eller skador särskilt i sina vingar eller ben kan påverka mannens förmåga att domstol. För det andra är flygåldern viktig och måste matchas mellan kontroll- och försöksgrupper (optimal ålder: 3-5 dagar vid etanolexponering 1). Två veckor och äldre vilda manliga flugor tenderar att visa de förhöjda nivåerna av ohämmad uppvaktning31. Således är korrekt åldersmatchning av flugor under studie avgörande för att undvika varierande resultat. För det tredje är flugnumret per pub viktigt (optimalt: 33 per pub). Den lägre eller högre fluga nummer per pub kan kraftigt skeva uppvaktning poäng (data visas inte). För det fjärde måste Flypub-kamrarna ha identiska volymer enligt figur 2B. Detta säkerställer att flugor får etanol ånga synkront och framkallade beteenden är konsekventa. För det femte är tydlig videoinspelning och exakt uppvaktning poäng viktigt. Detta protokoll beror starkt på beteendemässiga observationer, så noggrann efterlevnad av den standardiserade uppvaktning scoring protokollet är grundläggande för att minimera inkonsekventa resultat. Slutligen rekommenderas det starkt att både etanolexponering och uppvaktningspoäng steg utföras blint, där en experimentör är omedveten om flyga genotyper eller experimentella behandlingar, vilket förhindrar experimentell partiskhet.
Flypub-analysen har flera fördelar. För det första kan flera grupper av flugor testas och jämföras samtidigt. För det andra är det billigt, enkelt att installera och lätt att lära sig, vilket gör det mycket mottagliga för experimenterare på alla nivåer, inklusive grundskola, grundutbildning och doktorander, postdoktorer och fakultet samt undervisning laboratorier med begränsat utrymme och budgetar. För det tredje kan det användas för att mäta ytterligare beteenden såsom ohämmad uppvaktning av kvinnliga flugor och lugnande effekt av etanol eller andra lugnande medel för att bedöma inledande känslighet och tolerans utveckling och underhåll31,32. Tillsammans är Flypub en mångsidig metod för att studera olika funktioner i AUD.
Den stora begränsningen av Flypub-analysen är den rigorösa och mödosamma uppvaktningsskickningsregimen. Uppvaktning beteende under påverkan av etanol är mycket dynamisk på ett sätt som uppvaktning varaktighet varierar från mindre än en sekund till många minuter och flugor engagerade i uppvaktning är ganska ofta förändras. Poängsättningssystemet som presenteras här utvecklades för att införliva denna dynamiska karaktär och för att ge konsekventa poäng på enskilda etanolexponeringar för en viss genotyp31,32. Som nämnts i protokollet, är uppvaktningsaktiviteten manuellt poäng, vilket är tidskrävande. Flera automatiserade scoring program har utvecklats för att underlätta opartisk hög genomströmning beteendemässiga screening och som alla är beroende av enskilda flugor rörelser och platser39,40,41,42,43,44,45. Vi försökte också utveckla en datorprogramvara för att automatiskt räkna uppvaktningsaktiviteten men kunde inte få konsekventa och tillförlitliga resultat. Detta kan bero på det faktum att beteendemässiga scoring innehåller flera uppvaktning steg (dvs. efter, ensidiga vinge förlängning, buken böjning och montering)35,36,46 av flera flugor på en gång. Även med denna begränsning, en experimentör med adekvat utbildning bör kunna kvantifiera etanol-inducerad uppvaktning beteenden med konsekvens och noggrannhet. Ändå skulle det vara till stor hjälp och betydelse att anta maskininlärning eller andra avancerade algoritmer som en uppföljning.
I likhet med gnagare modeller, studierna på etanol i flugan modellen har till stor del fokuserat på etanol rörelsekomotor stimulerande och lugnande effekter. Den Flypub analys mäter dock hämningslös uppvaktning, en typ av kognitiv disinhibition som är ny31,32. Därför kan Flypub stöd för att belysa molekylära spelare, cellulära vägar och neurala kretsar samt riskfaktorer (t.ex. ålder, sömn, kost eller social miljö) avgörande för beteendemässiga disinhibition och sensibilisering. Vi har tidigare visat att dopaminsignalering krävs för EIBS, vilket är i linje med resultaten i gnagare modeller och försökspersoner6,9,31. Även som ett proof of concept undersökte vi tβh mutant saknar OA (ryggradslösa motsvarigheten till noradrenalin) och fann att OA är också viktigt för beteendemässiga sensibilisering till etanol disinhibition effekt även om dess bidrag är relativt liten jämfört med dopamin31. Detta konstaterande står i kontrast till iakttagelsen av Scholz47 att tβh mutant flugor uppvisar inga uppenbara försämringar i sensibilisering till etanolens rörelsemotor aktiverande effekt47. Detta tyder på distinkta molekylära, cellulära och neurala vägar medla beteendemässiga sensibilisering till disinhibition kontra locomotor aktivering. Uppföljande studier bör ytterligare samarbeta denna kittlande begrepp.
Sammanfattningsvis är Flypub en billig, mångfacetterad och effektiv metod för att undersöka beteendemässiga svar på etanol, särskilt disinhibition och beteendemässiga sensibilisering, som kan bidra till att främja vår förståelse av AUD och ge insikt i effektiva insatser för denna kroniska sjukdom.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD och NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster bidrag. Vi är också tacksamma för NIH-finansierade RISE-programmet (NIGMS 5R25GM069621) för att stödja NMD och CMS, UTEP COURI-EXCEED-programmet för att stödja NMD, NIH-finansierade MARC-programmet (NIGMS 2T34GM008048-31) för att stödja AA, och Dr Keelung Hong Graduate Fellowship för att stödja EBS. Vi uppskattar verkligen UTEP kommunikationsavdelningen: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez och musikavdelningen: Stephen A. Haddad för deras hjälp i video och voice-over produktion. Slutligen är vi mycket tacksamma mot Dr Andreas Thum för att dela tβh mutant i Canton-S bakgrund tillsammans med kontroll Canton-S flugor; och Jessica Burciaga för hennes värdefulla bidrag till de inledande studierna om oktopamin och Han lab medlemmar för diskussion och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
References
- Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
- Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
- Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
- Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
- Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
- Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
- Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
- Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C.
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
- Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
- Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
- Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
- Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
- Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
- Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
- Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
- Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U.
- Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
- Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
- Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
- Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
- Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
- Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
- Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
- Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
- Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
- Roeder, T.
- Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
- Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
- Spieth, H. T.
- Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
- Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
- Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
- Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).
