Summary
Flypub tsay meyve etanol etkisi altında Drosophila melanogaster görüntüler sineği davranışları ölçer. Tsay kolayca her düzeyde deneyciler tarafından hakim olabilir ve çeşitli buharlaşmış uyaranlara uygulanabilir, madde bağımlılığı ve bağımlılık çalışmaları kolaylaştırmak.
Abstract
Alkol kullanımı bozukluğu (AUD) toplumumuzda ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bağımlılık için etkili müdahaleler geliştirmek için, farklı deneysel yaklaşımlar ve model sistemlerine ihtiyaç duyulan temel nörobiyolojik mekanizmaları anlamak önemlidir. Alkollü içeceklerin ana bileşeni etanol, merkezi sinir sisteminde adaptif değişikliklere neden olur ve kronik alımı üzerine davranış. Davranışsal duyarlılık (yani, artan tepkiler) özellikle bağımlılığın altında yatan önemli bir adaptif değişimi temsil eder. Hayvan modellerinde etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmalarının çoğu etanolün lokomotor aktive edici etkisi üzerine yapılmıştır. Etanolönemli bir etkisi davranışsal disinhibition olduğunu. Ancak, etanolün disinhibition etkisine karşı davranışsal duyarlılık yeterince temsil edilememaktadır. Bu sorunu gidermek için, Biz Drosophila melanogastertekrarlayan etanol maruz kalma üzerine disinhibited kur faaliyetlerinde artan artış ölçmesağlayan Flypub titre geliştirdi. Burada, etanol maruziyet odalarının montajı, tahlil istasyonunun kurulumu, sinek bakımı ve toplama kriterleri, etanol teslimatı, engelsiz kur faaliyetlerinin sayısallaştırılması, veri işleme ve istatistiksel analiz dahil olmak üzere adım adım Flypub tahlillerini rapor ediyoruz. Ayrıca, kritik adımları gidermek için nasıl sağlanan sınırlamalar aşmak ve ek etanol kaynaklı davranışları değerlendirmek için yardımcı programı genişletmek. Drosophila melanogaster güçlü genetik araçlar ile birlikte Flypub tsay etanol kaynaklı davranışsal sensitizasyon altında yatan mekanizma keşfetmek görevi kolaylaştıracaktır.
Introduction
Alkol dünyada en çok kullanılan ve yaygın olarak tüketilen ilaçlardan biridir. Bu kötüye kullanım ve bağımlılık için yüksek potansiyele sahiptir; ancak, bu sürecin altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Etanol disinhibition, öfori, bilişsel bozukluk, hiperaktivite, motor kontrol kaybı ve solucanlarsedasyon1, meyve sinekler1,2,3, fareler4, sıçanlar5 ve insanlar6, insanlar da dahil olmak üzere omurgasızlar için memelilere etanol etkileri aracılık ortak nörobiyolojik bileşenleri gösteren inhibe eder. Kronik etanol alımı aud altında yatan nöral adaptasyonlar ve davranışdeğişiklikleri neden olur. Adaptasyonlardan biri etanoltekrarlanandeneyimleri ile artırılmış tepki olarak tanımlanan davranışsal duyarlılık 7,8,9 veya diğer bağımlılık yapıcı maddeler10,11,12.
On yıllar boyunca, etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmaları (EIBS) lokomotor uyarıcı etkisi üzerinde duruldu, hangi bir öforik yanıt için bir proxy olarak kullanılır7,8,9,13. Örneğin, tekrarlanan üzerine sıçan veya fareler (her 24, 48 veya 72 saat) etanol yönetimi yürüme hızı8,14,15,,16,1717,18,19,20,21ile ölçülen artırılmış lokomotor aktivitesini görüntüler. Benzer şekilde, meyve sinekler etanol buharı ikinci maruz kalma tabi 4 saat ilk maruz kalma dan sonra gelişmiş lokomotor tepki sergi olarak yürüme hızı ile ölçülen yanı sıra22. Meyve sineklerinde lokomotor uyarıcı etkiye karşı AyİBS'nin altında yatan mekanizma hakkında bilgi bulunmamakla birlikte, sıçan ve fareler de çalışmalar moleküler ve sinyal bileşenleri ortaya çıkarmış (örneğin, dopamin, glutamat ve GABA sistemleri) yanı sıra nöral substratlar ve devre (örneğin, ventral tegmental alan, çekirdek accumbens, amigdala ve prefrontal korteks) EIBS için önemli roller oynamaktadır6,9,23.
Disinhibition etanol önemli bir etkisidir ve genellikle sınırlı davranışların tezahürü yol açar. Disinhibiting etkisi motor, duygusal, sosyal, cinsel ve bilişsel işlevler üzerinde uygulanan, hangi uygunsuz cinsel davranış, sözlü veya fiziksel saldırganlık ve dürtüsel eylemlere yol açabilir insan ve hayvan modellerinde24,25,26,27,28,29. Etanol kaynaklı disinhibisyon mekanistik çalışmalar için hayvan modellerinde araştırılmıştır ve onlar kemirgenler ve maymunlar da motor dürtüsellik ve saldırganlık yanı sıra solucanlar6,9,,24,28,29,30arama disinhibition içerir . Biz meyve sinekleri etanol etkisi altında cinsel davranış çekingen göstermek göstermiştir31. Özellikle, vahşi tip erkekler nadiren etanol31 olmadan diğer erkekler mahkeme uçar ve bunu, nazik aktif erkekler kur reddediyorum. Etanol etkisi altında, ancak, erkek sinekler diğer erkekler ve kur daha az reddi sergileyen karşı daha fazla kur göstermek, genel olarak geliştirilmiş intermale kur ile sonuçlanan. Özellikle, sinekler tekrarlayan etanol maruziyeti üzerine disinhibition etkisi davranışsal duyarlılık geliştirmek, Hangi EIBS31çalışma için benzersiz bir sistem olarak hizmet vermektedir,32.
Bu raporda, nasıl kurmak, gerçekleştirmek, sorun giderme ve etanol kaynaklı inhibisyon ve meyve sinek Drosophila melanogasterduyarlılık çalışma flypub analizi ve veri analiz açıklar. Faydasını ve etkinliğini sağlamak için, yaban tipi Kton-S 'yi(CS; kontrol sinek suşu) ve ahtapotin (OA) sentezleyen tiramin β hidroksilaz (tβh) eksikliği olan sineklerle birlikte test ettik. OA omurgasızlar büyük bir nöromodülatör33,34 ve sinekler etanol toleransgelişiminde önemli bir rol oynar22. Burada ilk kez OA'nın EIBS için önemli olduğunu bildiriyoruz.
Protocol
NOT: Protokol bölümünde(1) odanın montajı, (2) sinek bakım ve toplama, (3) tahlil istasyonu kurulumu, (4) etanol maruziyeti, (5) kur puanlama ve veri analizi ve (6) istatistiksel analiz içeren hazırlık, Flypub tahlil ve analiz adımları ayrıntılı olarak anlatılabilir. Flypub tahlil ve analizinin yürütülmesi için önemli adımlar bir iş akışında gösterilmiştir (Şekil 1).
1. Odanın montajı (Şekil 2)
- Yuvarlak Drosophila şişesinin alt kısmını jilet kullanarak 25 mL marktan kesin.
- Sıcak lehim demiri kullanarak şişenin 50 mL işaretinde 5 mm çapında bir delik aç.
NOT: Burası sineklerin odaya aktarılabildiği erişim noktasıdır. - 75 mL işaretinde Drosophila şişesine sığacak şekilde 54 mm çapında bir daire içine bir örgü levha kesin.
- Sıcak tutkal kullanarak şişenin 75 mL işaretinde kafesi sabitleyin.
- Polikarbonat plastik levhayı 70 mm çapında bir daire şeklinde kesin.
- Polikarbonat plastik levhayı sıcak tutkal kullanarak 25 mL işaretinde (adım 1.1'de yapılan alt açık alan) şişeye takın.
- Polikarbonat mermisinin dibe sıkıca bağlı olduğundan emin olmak için ağırlıkları kullanarak basınç uygulayın.
- Herhangi bir kokuları kaldırmak ve bolca distile su altında birden çok kez durulayın etanol ile barlar yıkayın. Aşırı su kaldırmak için şiddetle barlar çalkalayın.
- Oda sıcaklığında kağıt havlular üzerine yatay olarak koyarak barları kurulayın.
2. Sinek bakım ve toplama
- Standart bir mısır unu / agar / şeker / maya gıda orta (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html) üzerinde sinek ler koruyun.
- Bir-iki günlük erkek sinekleri toplayın 33 kişilik bir gruba, bir veri noktasını temsil eden, karbondioksit (CO2)anestezisi altında. Bozulmamış morfolojisi ile sinekler seçmek ve kurtarmak için bir gıda şişe koymak emin olun.
NOT: Grup başına iki veya üç daha az sinek tolere edilebilir. Davranışlar deneysel ayarlara duyarlı olabilir, bu nedenle bar başına toplam sinek sayısının bir kontrol uçuş çizgisi ile ayarlanması gerekebilir.
NOT: Anesteziye dayalı sineklerin yiyeceğe yapışmaması için gıda şişesinin yan tarafa serildiklerinden emin olun. - Sinekleri 25 °C'lik inkübatörde en az %50 bağıl nem ve etanol maruziyetinden 2 gün önce 12 saat açık / 12 saat karanlık döngü ile saklayın.
NOT: CO2 temizliği, etanol kaynaklı yanıtları değiştirebilecek herhangi bir CO2kaynaklı fizyolojik veya davranışsal etkiyi ortadan kaldırmak için çok önemlidir. - Etanol maruziyeti ve puanlama kur davranışları yürüten deneycilere sinek genotiplerini veya tedavi koşullarını kör etmek için kodları kullanın.
NOT: Kör testler deneysel önyargıortadan yardımcı olur.
3. Sayis istasyonu kurulumu (Şekil 3A)
- İyi havalandırılan bir odada bankın üst kısmında ekli bir orta kol ile bir kopya standı ayarlayın.
NOT: Kopyalama standı zorunlu değildir. Seviye platformu sağlayan herhangi bir evreleme cihazı yeterlidir. - Her kol standın merkezinden yaklaşık 18 cm uzakta olacak şekilde iki yan kolu standa kelepçele.
- Standın her koluna ve ortasına bir floresan ışık yerleştirin.
- Video kaydediciyi tabanın merkezinden yaklaşık 38 cm yukarıda, orta kola takın. Bu, barları en üstten kaydeder.
- Kontrast oluşturmak için koyu renkli sinekleri görselleştirmeye yardımcı olan beyaz kağıt ile standın tabanını kapatın.
- Pozlama günü boyunca, floresan ışıkları ve fotokopi standına bağlı video kameraya bağlı bilgisayarı açın (Şekil 3A).
NOT: Işık yoğunluğu 2100-2200 lux puanlama için kaydedilen davranışların iyi kalite sağlar. Ancak, laboratuvardaki ortam aydınlatma koşulları etanol kaynaklı kur faaliyetlerini gözlemlemek için yeterlidir. - Şekil 3B'degösterilen etanol maruziyeti için kullanılacak öğeleri hazırlayın.
- Bir dizi deney için altı temiz, bir araya getirilmiş pub toplayın ve bunları kod 1'den 6'ya kadar etiketleyin.
NOT: Sinek genotiplerine veya tedavi koşullarına randomize kodları yerleştirdiğinden emin olun.
4. Etanol maruziyeti (Şekil 3)
- 33 erkekten oluşan bir grubu küçük bir huni kullanarak 50 mL işaretindeki delikten Flypub odasına yavaşça aktarın.
NOT: Sineklere karşı mekanik stresi en aza indirmek için, aktarım sırasında pub'ın altına bir fare yastığı veya herhangi bir yastıklama malzemesi yerleştirin. - Deliği bir bantla kapatın.
NOT: Bant, sineklerin bardan kaçmasını önleyerek deliği kapatmak için kullanılır. - Sahnedeki barları 1'den 6'ya hizala.
- Acclimate 10 dakika için odaya sinekler (Şekil 3D).
- Odak, yakınlaştırma ve parlaklık da dahil olmak üzere kamera ayarlarını ayarlayın ve bazal kur düzeyini ölçmek için son 5 dakikaalış seviyesini kaydedin.
NOT: Bir pub'ın ışık yansımasının yarattığı parlamayı ortadan kaldırmak için, açıyı ayarlamak için pub'ın altına laboratuvar mendilleri (genellikle 4 kat veya 1 mm'den az kalınlık) yerleştirin. - Temiz makas ile dört eşit dörtte bir ped keserek etanol teslimat ı için pamuk pedleri hazırlayın ve sonra uyum sırasında bir Petri kabına sığacak şekilde köşeleri kırpın(Şekil 3C).
NOT: Pamuk pedleri işlemek için çıplak eller kullanmayın. Kokuların olası transferini önlemek için pamuk pedleri işlemek için forceps kullanın. - Her Petri kabına bir pamuk ped ekleyin.
- Her pamuk pede 1 mL %95 etanol ekleyin, etanol çözeltisinin tüm ped alanına eşit olarak dağıtılmasını unutmayın.
- Hızlı etanol buharlaşmasını önlemek için çift katmanlı laboratuvar mendilleri ile kaplayın.
- Etanol ile ıslatılmış pamuk ped ve çift katmanlı laboratuvar silme içeren küçük Petri çanak yere uyum sonra pub alt açılış yoluyla.
- Sahnede ki barları hizala, kayıt yapmaya başla ve aynı anda bir zamanlayıcı başlat.
- Sinekler kur veya sedasyon nedeniyle hareket durdurmak kadar etanol maruz kalma sırasında sinekler içeren barlar kaydedin.
- Sineklerin %90'ından fazlası sakinleştirildiğinde her pub'dan etanol içeren Petri kabını spatula ile çıkarın.
- Yavaşça transfer barda 50 mL işareti delikten kendi atanan şişeleri geri uçar.
NOT: Transfere yardımcı olmak için gıda şişelerinin üzerine bir huni yerleştirin. Yiyeceklere yapışmasını önlemek için sakinleştirilmiş sinekleri yiyecek şişelerinin kenarına yerleştirdiğinden emin olun. - Herhangi bir kokuları kaldırmak için etanol ile barlar temizleyin ve bolca distile su altında çalışan altında birden fazla kez durulayın. Aşırı su kaldırmak için şiddetle barlar çalkalayın.
- Oda sıcaklığında kağıt havlular üzerine yatay olarak koyarak barları kurulayın.
- Sinekleri en az %50 bağıl nem ve 12 saat Açık / 12 saat karanlık döngü ile 25 °C'lik kuluçka makinesinde tutun.
- Adımları tekrarlayın 4.1-4.17 her 24 saat altı gün boyunca ve herhangi bir sirkadiyen etkileri önlemek için günün aynı saatinde etanol maruziyeti yapmak için emin olun.
NOT: Sağlıklı sinekleri korumak için her 2 -3 günde bir gıda şişelerini değiştirin.
5. Kur puanlama ve veri analizi (Şekil 4-6)
- Kaydedilen videoları bir medya oynatıcı kullanarak açın (örn. VLC) ve puanı elde etmek için sinekleri net bir şekilde gözlemlemek için videoyu yakınlaştırın(Şekil 4A).
- Zaman kodunu videoya takın (Şekil 4B).
- Aşağıdaki, tek taraflı kanat uzatma, kur zinciri, kur çemberi, karın bükme ve montaj dahil olmak üzere kur faaliyetleri yapan erkek sayısını saymak her 10 zaman bloğu31 (Şekil 5).
- Her 10 zaman bloğu için kur gösteren erkek sayısını bir çalışma sayfasına girin (Şekil 6A).
- Temsili veri noktası olarak art arda üç 10 s zaman bloğunda en yüksek sayıda erkek kur yaptı (Şekil 6B).
- En yüksek değere sahip 10 ardışık veri noktasının ortalamasını hesaplayın(Şekil 6C)ve bu durum pub başına erkekler arası kur yapma yüzdesini temsil eder (Şekil 6A).
6. İstatistiksel analiz (Ek Şekil 1)
- Açık istatistiksel analiz yazılımı (örneğin, Minitab 17) ve çalışma sayfasına kur verileri ekleyin.
NOT: Herhangi bir istatistiksel analiz yazılımı kullanılabilir. - Verilerin dağılımını (normal veya normal olmayan dağılım) belirlemek için Stat sekmesine gidin, Temel İstatistikler'iseçin ve Normallik Testi seçeneğini tıklayın(Ek Şekil 1Ai).
- Değişken'de,tek tek sütunları seçin (her sütun bir genotip veya çalışma altında tedavi veri kümesini temsil eden), Anderson-Darling testini seçin ve Tamam 'ı(Ek Şekil 1Aii)tıklatın.
NOT: Normallik Olasılık Çizimi hesaplanan P-Değerini gösterir: P-Değeri 0,05'ten büyükse, veriler normal olarak dağıtılır. P-Değeri 0,05'ten azsa, veriler normal olarak dağıtılmamıştır(Ek Şekil 1Aiii). - Birden çok grubun karşılaştırılması için, Veri sekmesini tıklatarak karşılaştırmak için sütunları yığını, Yığın'ıve ardından Sütunları (Ek Şekil 1Bi)seçin.
- Yığın Sütunları penceresinde, istiflenecek veri sütunlarını seçin, Yeni çalışma sayfasında veya geçerli çalışma sayfasısütununda yapılan istifleme yi seçin ve alt yazıyı (örn. veri grubu kimliğini) belirtmek için bir sonraki sütunu belirleyin; New worksheet Ek Şekil 1Bii-1Biii).
- Stat sekmesini tıklatın, ANOVA testini seçin, Genel Doğrusal Modeli seçin ve ardından Fit Genel Doğrusal Modeli'ni tıklatın ( Ek Şekil1Ci).
- Genel Doğrusal Model penceresinde, Yanıtlar kutusunda karşılaştırıldığında sütunları seçin, Etkenler kutusunda alt yazı içeren sütunu seçin ve istatistiksel analiz sonuçlarına yol açan Tamam'ıtıklatın (Ek Şekil 1Cii-1Ciii).
- Normal dağıtılmış verilerle iki grubun karşılaştırılması için Stat sekmesini tıklatın, Temel İstatistikleriseçin ve 2-Örnek t-testi (Ek Şekil 1Di)seçeneğini belirleyin.
- Ortalama pencere için 2-Örnek t'de, her örnek kendi sütunundadır,açılır kutudan, Örnek 1 ve Örnek 2 kutularında karşılaştırmak için iki grubu seçin ve sonra Tamam'ıtıklatın, bu da istatistiksel analiz sonuçlarına yol açar(Ek Şekil 1Dii-1Diii).
- Normal olarak dağıtılmayan verilerle iki grubun karşılaştırılması için Stat sekmesine gidin, Nonparametrics'i seçin ve Mann-Whitney 'i tıklatın (Ek Şekil 1Ei)
- Mann-Whitney penceresinde, Birinci Örnek ve İkinci Örnek kutularında karşılaştırmak için iki grubu seçin ve ardından istatistiksel analiz sonuçlarına yol açan Tamam'ıtıklatın(Ek Şekil 1Eii-1Eiii).
- Normalde dağıtılmamış üç veya daha fazla veri grubu karşılaştırması için Stat sekmesine gidin, Nonparametrics'iseçin ve ardından Kruskal-Wallis testini tıklatın (Ek Şekil 1Fi).
- Kruskal-Wallis penceresinde, Yanıt kutusunda karşılaştırıldığında sütunları seçin, Faktör kutusunda alt yazı içeren sütunu seçin ve istatistikselanaliz sonuçlarına yol açan Tamam'ı tıklatın (Ek Şekil 1Fii-1Fiii).
Representative Results
Bu bölümde temsili bir Flypub deneyinin sonuçları gösteriş. Drosophila erkekler nadiren mahkeme diğer erkekler35,36. İlk etanol maruziyeti sırasında, yabani tip Kton-S (CS)erkekler, disinhibited intermale kur küçük ama önemsiz bir artış sergiledi31 (Şekil 7A). Ancak, CS erkekler sonraki etanol maruziyetinde (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65.21, p < 0.0001; n = 12; Şekil 7A), etanoldin disinhibition etkisine davranışsal duyarlılık gösterir. Biz daha önce EIBS bu tür mantar nöronlar dopamin ve dopamin reseptördopEcR gerektirir göstermiştir31,32.
Ek nöromodülatörlerin EIBS'de yer alıp almadığını belirlemek için, oa biyosentezinde hız sınırlayıcı enzim olan tiramin β hidroksilaz dan yoksun37,38nolu sinekleri test ederek OA'nın rolünü araştırdık.t38 CS genetik geçmişindeki tβh erkekler (Leipzig Üniversitesi, Almanya'dan Dr. Andreas Thum'un bir tür hediyesi) günlük etanol maruziyeti (ANOVA GLM, tβh: R2=0,67, F(5,66) =27.60, p < 0.0001; n = 12; Şekil 7B) ancak CS'e göre düşük seviyededir (ANOVAGLM, etkileşim etkisi: F =2.50, p <0.034). Post hoc analizi üzerine, tβh erkekler cs (Iki örnek t-testi: p < 0.002 EXP4, p < 0.004 EXP5, p < 0.021 EXP6 ile karşılaştırıldığında dördüncü ila altıncı etanol maruz kalma sırasında en belirgin her pozlama da erkekler arası kur daha düşük seviyelerde sergiledi; n = 12; Şekil 7C). Birlikte, bu sonuçlar OA etanol disinhibition etkisi EIBS bir rol oynayabilir göstermektedir. Daha da önemlisi, bu veri setleri açıkça etanol kaynaklı disinhibisyon ve sensitizasyon çalışmalarında Flypub tsay yarar ve etkinliğini göstermektedir.
Şekil 1: Flypub titreiş akışı. Flypub tamsasını yürütmek için önemli adımları vurgulayan bir iş akışı diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Flypub oda malzemeleri ve montajı. (A) Bir Flypub odası inşa etmek için gerekli malzemeler (i) sıcak tutkal tabancası tutkal sopa, (ii) sıcak tutkal tabancası, (iii) jilet, (iv) lehim demir, (v) cetvel, (vi) mesh, (vii) polikarbonat plastik levha, ve (viii) yuvarlak alt Drosophila şişe. (B) Flypub oda meclisinin şematik temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Etanol maruziyeti. (A) Tam olarak monte edilmiş bir Flypub istasyonu. (B) Etanol maruziyeti için gerekli malzemeler arasında (i) P1000 mikropipet, (ii) bant, (iii) pamuk ped, (iv) Petri çanak, (v) laboratuvar mendilleri, (vi) küçük huni, (vii) zamanlayıcı, (viii) orta boy huni, (ix) fare yastığı, (x) makas, (xi) % 95 etanol, (xii) forceps ve (xiii) spatula. (C) Pamuk pedlerin nasıl kesilen etütler üzerine adımlar. (D) Sahnede hizalanmış pubların üst görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Davranışsal puanlama için video kurulumu. Gösterilen (A) üzerinde adım adım kılavuz nasıl video yakınlaştırmak ve (B) nasıl davranışsal puanlama için VLC medya oynatıcı içine zaman kodu dosyası eklemek için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Erkek kur davranışları. Temsili görüntüler aşağıdaki ve tek taraflı kanat uzantısı da dahil olmak üzere Drosophila erkek kur davranışları göstermek (A) kur şarkısı, (B) kur zinciri, (C) kur daire (D) karın bükme ve (E) davranışsal puanlama için kullanılan montaj. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Veri girişi ve analizi. (A) Her 10'daki zaman bloğunda kur yapan erkek sayısı bir çalışma sayfasına dönüştürülr. Üç ardışık 10 s zaman blokları (yeşil ok) kur erkek en yüksek sayıda temsili bir veri noktası olarak kullanılır. Maksimum değere sahip 10 ardışık veri noktasının (mavi veya turuncu parantez) ortalaması, pub başına erkekler arası kur yapma yüzdesini temsil eder [turuncu parantez; MAX (ortalama), siyah ok]. (B,C) Maksimum temsili veri noktasını ve pub başına 10 ardışık temsili veri noktasının maksimum ortalamasını hesaplamak için kullanılan çalışma sayfası formülleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: CS ve tβ h'de etanol indüklenen davranışsal disinhibition ve sensitizasyon.h. (A,B) CS ve tβh erkekleri tekrarlanan etanol maruziyeti (ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66)=65.21, p < 0.0001; tβh: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) Tβh erkeklerde CS'ye göre daha az çekingen kur (n=12) saptırıldı. Post hoc analizlerinin p değerleri çizginin üzerinde gösterilir. Erkekler arası kur yapma etkinliği, her etanol maruziyeti için oluşturulan videolardan analiz edildi. Tüm veriler ortalama ± standart hata anlamına gelir olarak rapor edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: İstatistiksel analiz. Minitab 17 yazılımındaki adımlar (A) Normallik testi, (B) veri istifleme, (C) Genel doğrusal model ANOVA testi, (D) İki örnekli t-testi, (E) Mann-Whitney testi ve (F) Kruskal-Wallis testi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bu raporda, Flypub testinin kurulum ve ayrıntılı protokolünü açıkladık; tekrarlayan etanol maruziyetinin, çekingen kur ve davranışsal duyarlılığı nasıl tetiklediğini ölçmek için yeni bir yöntem. Flypub tahsini nispeten basit olmasına rağmen, güvenilir sonuçlar elde etmek için birkaç adım dikkat ve dikkat gerektirir. İlk olarak, test için sinekler tamamen pigmentli olmalıdır (yani, tamamen gelişmiş yetişkin sinekler), sağlıklı ve bozulmamış. Özellikle kanatlarında veya bacaklarında oluşan deformiteler veya hasarlar erkeğin mahkeme yeteneğini etkileyebilir. İkinci olarak, sinek yaşı önemlidir ve kontrol ve deneysel gruplar arasında eşleşmelidir (optimal yaş: 3-5 gün etanol maruziyeti 1). İki hafta ve daha yaşlı vahşi tip erkek sinekler disinhibited kur yüksek seviyelerde görüntülemek eğilimindedir31. Bu nedenle, çalışma altında sineklerin uygun yaş eşleştirme değişken sonuçlar önlemek için esastır. Üçüncü olarak, pub başına sinek sayısı hayati önem taşımaktadır (optimal: pub başına 33). Pub başına daha düşük veya daha yüksek sinek numaraları büyük ölçüde kur puanları çarpık olabilir (veriler gösterilmez). Dördüncü olarak, Flypub odaları Şekil 2B'degösterildiği gibi aynı hacimlere sahip olması gerekir. Bu, sineklerin eşzamanlı olarak etanol buharı almasını ve ortaya çıkan davranışların tutarlı olmasını sağlar. Beşinci olarak, net video kaydı ve kesin kur puanlama esastır. Bu protokol ağır davranışsal gözlemlere bağlıdır, bu nedenle standart kur puanlama protokolüne titiz bir şekilde uyulması tutarsız sonuçları en aza indirmek için temeldir. Son olarak, hem etanol maruziyeti hem de kur puanlama adımlarının körü körüne yapılması tavsiye edilir, deneyci sinek genotiplerinden veya deneysel tedavilerden habersizdir ve bu da deneysel önyargıyı önler.
Flypub testinin birçok avantajı vardır. İlk olarak, birden fazla sinek grubu aynı anda test edilebilir ve karşılaştırılabilir. İkinci olarak, ucuz, kurulumu basit ve öğrenmesi kolay, lise, lisans ve yüksek lisans öğrencileri, doktora ve fakülte ile sınırlı alan ve bütçeleri ile öğretim laboratuvarları ile ilköğretim de dahil olmak üzere her düzeyde deneyciler için son derece münasip hale. Üçüncü olarak, bu kadın sinekler ve etanol veya diğer yatıştırıcı yatıştırıcı yatıştırıcı etkisi ilk duyarlılık ve tolerans geliştirme ve bakım değerlendirmek için sedatif etkisi gibi ek davranışları ölçmek için kullanılabilir31,32. Flypub, AUD'un çeşitli özelliklerini birlikte incelemek için çok yönlü bir yöntemdir.
Flypub testinin en büyük sınırlaması sıkı ve zahmetli kur puanlama rejimidir. Etanol etkisi altında kur davranışı kur süresi az bir saniyeden birkaç dakika arasında değişmektedir ve kur yapan sinekler oldukça sık değişiyor bir şekilde son derece dinamiktir. Burada sunulan puanlama rejimi ve bu dinamik doğa dahil etmek için belirli bir genotip31,,32için bireysel etanol pozlama tutarlı puanları sağlamak için geliştirilmiştir. Protokolde belirtildiği gibi, kur yapma faaliyeti elle puanlandırılır, bu da zaman alıcıdır. Birkaç otomatik puanlama programları tarafsız yüksek iş bölümü davranış tarama kolaylaştırmak için geliştirilmiştir ve bunların hepsi bireysel sinek 'hareketleri ve yerleri39,40,41,42,43,44,45güveniyor . Ayrıca kur yapma etkinliğini otomatik olarak saymak için bir bilgisayar yazılımı geliştirmeye çalıştık ancak tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde edemedik. Bu davranışsal puanlama birden fazla kur adımları (yani, aşağıdaki, tek taraflı kanat uzatma, karın bükme ve montaj)35,36,aynı anda birden fazla sinek46 içerir gerçeği nedeniyle olabilir. Bu sınırlama ya da olsa, yeterli eğitime sahip bir deneyci, etanol kaynaklı kur davranışlarını tutarlılık ve doğrulukla ölçebilmelidir. Yine de, bir takip olarak makine öğrenimi veya diğer gelişmiş algoritmalar benimsemek için büyük yardım ve önem olacaktır.
Kemirgen modelleri ne kadar benzer, sinek modelinde etanol üzerinde yapılan çalışmalar büyük ölçüde etanolün lokomotor uyarıcı ve sedatif etkileri üzerinde yoğunlaşmış. Flypub tsay ancak, önlemler disinhibited kur, roman31olan bilişsel disinhibition bir tür,32. Bu nedenle, Flypub moleküler oyuncular, hücresel yollar ve sinir devreleri yanı sıra risk faktörleri (örneğin, yaş, uyku, diyet veya sosyal çevre) davranışsal çekingenlik ve duyarlılık için kritik açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir. Daha önce dopamin sinyalizasyonu eibs için gerekli olduğunu göstermiştir, hangi kemirgen modelleri ve insan deneklerde bulgular doğrultusunda6,9,31. Ayrıca kavram kanıtı olarak, biz tβh mutant OA eksik inceledi (norepinefrin omurgasız meslektaşı) ve oa etanol disinhibition etkisi davranışsal sensitizasyon için de önemli olduğunu bulundu katkısı dopamin göre nispeten küçük olmasına rağmen31. Bu bulgu Scholz47 tarafından tβh mutant sinekler etanol lokomotor aktivasyon etkisi47sensitizasyon belirgin bir bozukluk sergilemek gözlem aksine . Bu farklı moleküler düşündürmektedir, hücresel ve nöral yollar lokomotor aktivasyon karşı disinhibition davranışsal duyarlılık aracılık. Takip çalışmaları bu tantalizing kavramı daha da işbirliği gerekir.
Özetle, Flypub düşük maliyetli, çok yönlü ve etkili bir yöntem etanol davranışsal tepkileri araştırmak için, özellikle disinhibition ve davranışsal duyarlılık, aud anlayışımızı ilerletmek ve bu kronik bozukluk için etkili müdahaleler hakkında fikir sağlamak yardımcı olabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD ve NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster hibeleri tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Nih tarafından finanse edilen RISE programına (NIGMS 5R25GM069621) NMD ve CMS'yi, NMD'yi destekleyen UTEP COURI-SURPASS programını, NIH tarafından finanse edilen MARC programına (NIGMS 2T34GM008048-31) AA'yı ve EBS'yi desteklemek için Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship'i desteklemekiçin müteşekkiriz. Biz büyük ölçüde UTEP iletişim departmanı için teşekkür ederiz: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez ve Müzik departmanı: Stephen A. Haddad video ve seslendirme üretim onların yardım için. Son olarak, Dr Andreas Thum kontrol Kton-S uçar ile birlikte Kton-S arka plan içinde tβh mutant paylaştığı için çok müteşekkiriz; ve Jessica Burciaga tartışma ve destek için ahtapotamin ve Han laboratuvar üyeleri üzerinde ilk çalışmalara yaptığı değerli katkı için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
References
- Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
- Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
- Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
- Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
- Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
- Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
- Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
- Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C.
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
- Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
- Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
- Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
- Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
- Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
- Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
- Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
- Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U.
- Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
- Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
- Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
- Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
- Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
- Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
- Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
- Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
- Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
- Roeder, T.
- Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
- Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
- Spieth, H. T.
- Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
- Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
- Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
- Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).
