Summary
Vi beskriver procedurerne for isolering af voksende oocytter fra ovariefoskler i de tidlige udviklingsstadier samt opsætningen af et in vitro-kultursystem, der kan understøtte vækst og differentiering op til den fuldt udvoksede fase.
Abstract
Den begrænsede reserve af modne, befrugtende oocytter udgør en stor hindring for succes assisteret reproduktion hos pattedyr. I betragtning af, at i løbet af den reproduktive levetid kun omkring 1% af oocytter i en æggestenning modne og ægløsning, flere teknikker er blevet udviklet for at øge udnyttelsen af æggestokkene reserve til den voksende befolkning af ikke-ægløsning follikler. Sådanne teknologier har gjort det muligt at beskytte frugtbarhed, udvælgelsesprogrammer i husdyr og bevarelse af truede arter. Det store potentiale i æggestokkene er dog stadig stort set uudnyttet. F.eks. er der gjort forsøg på at støtte in vitro-kulturen i oocytter på specifikke udviklingsstadier, men der er endnu ikke udviklet effektive og pålidelige protokoller. Her beskriver vi et kultursystem, der gengiver de fysiologiske forhold i det tilsvarende follikulære stadium, defineret til at udvikle in vitro voksende oocytter indsamlet fra kvæg tidlige antral follikler til den fuldt udvoksede fase, svarende til medium antral follikel in vivo. En kombination af hormoner og en fosfordiesterase 3-hæmmer blev brugt til at forhindre alt for tidlige meiotiske genoptagelse og til at guide oocyt's differentiering.
Introduction
I løbet af den reproduktive levetid, kun en minimal brøkdel af oocytter, der er til stede i en æggesto, frigives i æggelederne ved ægløsning, og er til rådighed for at blive befrugtet og udvikle sig til en levedygtig embryo1. På den anden side, de fleste af de oocytter inden for en æggestor gennemgå atresi og er aldrig ægløsning. In vitro embryoproduktion (IVP) teknologier har forsøgt at øge udnyttelsen af æggestokkene reserve2,3. Hidtil har sådanne teknologier tilladt interventioner frugtbarhed bevarelse, udvælgelsesprogrammer i husdyr, og bevarelse af truede arter. Ikke desto mindre, de fleste protokoller bruger oocytter, der har stort set afsluttet vækstfasen inden for antral ovariesækken, og dermed omtales som fuldt udvokset oocytter. Hos kvæg, hvor IVP-teknologier anvendes i vid udstrækning, når fuldvoksne oocytter en endelig diameter på ca. 120 μm og indsamles fra follikler, der spænder fra 2 til 8 mm i diameter (medium antralsækler)1. Efter isolering fra folliklerne, er sådanne oocytter in vitro modnet og befrugtet. Zygoterne dyrkes derefter op til blastocyst-scenen og overføres enten til en modtager eller cryopreserved. Hos kvæg og mange andre arter er antallet af in vitro-producerede embryoner pr. ko ikke i vid udstrækning blevet bedre i de sidste 40 år på trods af ivp's potentiale. Dette skyldes til dels det begrænsede antal fuldt udvoksede oocytter,der befolker en æggesting på et givet tidspunkt , som kan hentes og underkastes standard IVP-teknikker4,5,6.
Oocytterne, der er omgivet af tidlige antralsækkler,dvs.7 Disse oocytter er dog stadig i vækstfasen og har endnu ikke nået den fuldt udvoksede fase9. Som sådan er de stadig transskriptionelt aktive, der producerer mRNA'er, der vil blive gemt til senere udviklingsmæssige trin, og har endnu ikke gennemgået alle de differentiering proces, der kræves for at give oocytter med evnen til spontant at genoptage og færdiggøre meiose jeg engang isoleret fra follikulære rum10,11. De kan derfor ikke direkte underkastes standardin vitromodningsprotokoller (IVM), men de kræver en yderligere kulturperiode, der vil gøre det muligt for dem at fuldføre vækstfasen og skelne korrekt.
Overgangen fra den voksende til den fuldt udvoksede fase, som hos kvæg opstår, når follikel udvikler sig fra den tidlige antral til medium antral fase, er et af de kritiske skridt under oocyt udvikling. Hos kvæg forsøgte flere undersøgelser at opsummere disse begivenheder in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Til dato er der imidlertid ikke udviklet pålidelige protokoller, og der er kun rapporteret om begrænset succes. Ifølge tidligere undersøgelser20udgør disse voksende oocytter en homogen population. Ud over at være transskriptionelt aktiv, deres kromatin er spredt i germinale vesicle (GV), i en konfiguration, der hedder GV02,21. Omvendt er populationen af fuldvoksne oocytter fremstillet af medium antralsækkene mere heterogen, en tilstand, der afspejles af de forskellige grader af kromatinkomprimering (GV1, GV2 og GV3), der kan observeres20. Blandt disse har tidligere data vist, at GV2 og GV3 oocytter generelt er kendetegnet ved en bedre kvalitet og højere embryonale udviklingskompetence20,21,22,23,24.
Med udgangspunkt i ovenstående observationer beskriver vi her et 5-dages langt kultursystem af oocytter (L-IVCO), der gør det muligt at differentiere oocytter isoleret som cumulus-oocytkomplekser (COC'er) fra tidlige antralsækkene. Denne kultur strategi har udviklet sig fra 10 år lange undersøgelser udført i vores laboratorium og rødder sin jord på den tidligere udviklede 24-48 timer in vitro oocyt kultur (IVCO)2,præmaturation systemer23,,25 og zink tilskud under oocyt kultur. En kombination af follikel stimulerende hormon (FSH) og en fosfordiesterase-3 (PDE3) hæmmer, i stand til at forbedre cumulus-oocytkommunikation 2, forhindre alt for tidlige meiotiske genoptagelse2, og støtte oocyt vækst2 blev brugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Æggestokkene blev indsamlet fra 4 til 8 år gamle Holstenske malkekøer genvundet på det lokale slagteri (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Forberedelse af medier
BEMÆRK: Alle medier skal være forberedt mindst fire timer før brug. Natriumbikarbonat-puffede medier inkuberes ved 38,5 °C og 5% CO2 i luft, maksimal luftfugtighed. HEPES-puffede medier vedligeholdes ved 38,5 °C i termostatovn.
- Lang in vitro kultur oocytter (L-IVCO) medium
- Forbered 15 ml af det grundlæggende dyringsmedie (M199-B): Tillæg M199 med 2 mM glutamin, 0,4% fedtsyrefri kvægserumalbumin (BSA), 0,2 mM natriumpyruvat, 25 mM natriumbikarbonat, 0,1 mM cysteamin, 21,3 μg/ml phenolrød, 75 μg/ml kanamycin og 4% Polyvinylpyrolidon (PVP; 360 k molekylvægt).
- Der klargørs 3 ml af holdemediet (M199-H): Til M199-B tilsættes 5 μM cilostamid og hældes det i en 35 mm petriskål.
- L-IVCO-mediet (M199-L): Tillæg M199-B med 0,15 μg/ml Znsulfat, 10-4 IE/ml FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosteron, 50 ng/mL progesteron og 5 Mμlostamide.
- Placer 200 μL M199-L medium i hver brønd af den 96 velbelagte plade. Fyld brøndene i pladens fire kanter med sterilt kulturvand for at kompensere for fordampning og for at opretholde en passende fugtighed under kulturen.
- 96 brøndpladen og M199-H-mediet inkuberes i inkubatoren ved 38,5 °C og 5% CO2 i luft, maksimal luftfugtighed.
- Dissektion medium
- Dissektionsmediet (M199-D): Tillæg M199 med 0,4% BSA fraktion V, 0,164 mM penicillin, 0,048 mM streptomycin, 1790 enheder/L heparin. M199-D kan fremstilles i løs vægt, udleveres i 20 ml aliquots og opbevares ved 4 °C i 6 måneder. Når det er nødvendigt, varm og supplement 1 aliquot.
- Der klargøres 20 ml M199-D suppleret med 5 μM cilostamid (M199-D cilostamid).
2. Indsamling og forarbejdning af æggestokke
BEMÆRK: Alle procedurer udføres ved stuetemperatur (26 °C), medmindre andet er angivet.
- Genvind æggestokkene på slagteriet fra køer.
- Æggestokkene i sterilt saltvand (NaCl, 9 g/L) ved 26 – 28 °C tilsat med penicillin 100 U/ml og streptomycin 0,1 mg/ml.
- Transporter organerne til laboratoriet i varmt sterilt saltvand inden for 4 timer.
- Æggestokkene vaskes 4x i sterilt saltvand, der holdes ved 26 °C.
- Fjern alle mid-til-store antralsækker ved at aspirere alle follikler mere end 2 mm i diameter ved hjælp af en 18 G nål forbundet til en aspirationspumpe med vakuumtryk indstillet til -28 mmHg og placere de indsugning æggestokke i et bægerglas med sterilt saltvand ved 26 °C.
BEMÆRK: Fjernelse af indholdet af follikler > 2 mm er et kritisk skridt til at fjerne så meget som muligt kilden til fuldvoksne oocytter, der ville 'forurene' forsøget. - Under en vandret laminar flow hætte, placere en æggestan på det tidspunkt på en steril polytetrafluorethylen skærebræt. Ved hjælp af en kirurgisk klinge Nr. 22 monteret på en skalpel håndtag, skåret skiver af æggestokkene cortex (den ydre del af æggestokkene, som indeholder follikler), 1,5 – 2 mm tyk og parallelt med den største akse af orglet.
- Læg skiverne af æggestokkene cortex i et sterilt glas Petri fad dækket med dissekere medium på en varm plade ved 38,5 °C.
BEMÆRK: Fra nu af udføres alle procedurer ved 38,5 °C ved hjælp af en varm plade.
3. Udvælgelse og isolering af follikler og genfinding af de fælles markedskort
- Placer en æggestokkene cortex skive i en 60 mm glas petriskål med 2-3 ml M199-D.
- Ved hjælp af et dissektionsmikroskop skal du vælge folliklerne mellem 0,5 – 2 mm ved hjælp af et mikrometerudstyret okular.
- Identificer de sunde, ikke-atretiske follikler under stereomikroskopet. Vurdere follikel atresi ved at observere morfologiske parametre, såsom meget klart gennemskinneligt udseende, med en mørk COC indeni. Kassér atretiske follikler og behandle alle de andre.
- Ved hjælp af en kirurgisk klinge Nr. 22 monteret på en skalpel håndtag fjerne æggestokkene væv omkring follikel på den ene side, indtil follikel er udsat på den ene kant.
- Ved hjælp af en 26G nål monteret på en sprøjte, omhyggeligt lave en slids i den udsatte follikel væg. Denne handling vil frigive follikulærindholdet, der omfatter COC, follikulært væske og klumper af celler.
- Identificer COC under mikroskopet og undersøg for cumulus integritet, zona pellucida integritet og homogenitet af cytoplasmaet. Hvis disse kriterier er opfyldt, skal du aspirere coc'en ved hjælp af en P20-pipette.
- Placer den isolerede COC i M199-D cilostamid.
- Fortsæt isolationsproceduren i 30 min.
4. Udvælgelse af p-piller, der skal underkastes in vitro-kultur
- Under dissektionsmikroskopet skal du vælge sunde p-piller baseret på kriterierne i trin 3.6.
- I en 60 mm petriskål tilberedes 16 dråber 20 μL M199-D cilostamid, og der skal anvendes en sund COC pr. dråbe (Figur 1A).
- Ved hjælp af en omvendt mikroskop knyttet til et kamera måle oocyt diameter, undtagen zona pellucida, ved hjælp af software, der leveres med kameraet.
- Med en klar visualisering af oocytet foretages der to vinkelrette målinger eksklusive zona pellucida (Figur 1B).
- Sørg for, at middeltægten for de to oocytes måling, bortset fra zona pellucida, ligger inden for et interval på 100 – 110 μm. Kassér p-piller med ikke-afrundet formet oocyt eller med oocytter, der ikke kan måles.
- De valgte p-piller overføres i en 35 mm skål, der indeholder M199-H-medium, og de opbevares i inkubatoren ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal luftfugtighed indtil trin 5.1.
- Gentag trin 3 og 4 op til 4x. Den samlede arbejdstid må ikke overstige 2 timer.
5. Lang in vitro kultur oocytter (L-IVCO)
- Overfør en COC pr. brønd i midten af en brønd af de 96 brøndplade, der skal tilberedes i trin 1.1.5.
- Pladen inkuberes i 5 dage ved 38,5 °C og 5% CO2 i luft, maksimal luftfugtighed.
- Hver anden dag (dag 2 og dag 4) forberede frisk M199-L som beskrevet i trin 1.
- Halvdelen af mediet fornys ved at fjerne 100 μL medium og erstattes med 100 μL frisklavet M199-L. Udfør mediefornyelsen under stereomikroskopet, og undgå at flytte p-pillerne ind i brønden.
6. COC-klassificering efter kulturen
- I slutningen af L-IVCO analyseres p-pc'ernes morfologi under dissektionsmikroskopet.
- Klassificeres som afbildet i figur 2.
- Klassificeres som klasse 1, hvis p-piller viser en kompakt cumulus celle investering uden tegn på cumulus ekspansion og celle degeneration.
- Klassificeres som klasse 2, hvis COC'er viser en kompakt cumulus celle investering uden tegn på cumulus ekspansion og celle degeneration og med antrum-lignende dannelse i cumulus masse.
- Klassificeres som klasse 3, hvis p-piller viser flere lag cumulus celle uden tegn på cumulus ekspansion og nogle disagggeret celler i det ydre lag af cumulus celler og ingen antrum-lignende dannelse.
- Klassificeres som klasse 4, hvis p-piller viser rigelige tab af cumulus celler strækker sig for mere end 50% af oocyt overfladen, og tegn på celle degeneration og cellerester.
7. Evaluering af meiotisk progression efter kultur
- Oocyte denudation
- Placer hver COC i en enkelt brønd af en fire-brønd plade, der indeholder 400 μL af 199D per brønd.
- Under et dissektionsmikroskop fjernes forsigtigt cumuluscellerne mekanisk ved gentagne pipettering ved hjælp af en pipette, der er indstillet til 130-140 μL.
- Når oocytterne er fri for cumulus investering, overføre dem til en anden brønd, der indeholder 199D.
- Gentag processen, indtil alle oocytterne er helt fornægtede.
- Oocyte nukleare farvning
BEMÆRK: Fra nu af udføres alle procedurer ved stuetemperatur. Reagenser er ved stuetemperatur.- Fastgør oocytterne i paraformaldehyd 4% i fosfat buffer saltvand (PBS) i 1 time.
FORSIGTIG: Bær personlige værnemidler ved håndtering af paraformaldehyd og bortskaf kontaminerede materialer i overensstemmelse med retningslinjerne for bortskaffelse af farligt affald. - Vask oocytterne 3x i 5 min. hver i PBS, der indeholder 1% polyvinylalcohol (PVA).
BEMÆRK: Prøverne kan behandles med det samme eller opbevares ved 4 °C i højst en uge. - Placer oocytterne i PBS, der indeholder 0,1% Triton X i 10 min.
- Vask oocytterne 3x i 5 min hver i PBS, der indeholder 1% PVA.
- Oocytterne sættes ental i dråber på 5 μL antifademedium suppleret med 4,,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilat (1 μg/ml) over et dias.
- Placer to strimler af dobbeltsidet tape langs de lange sider af diaset, for at undgå overdreven udfladning af oocytter, når du sætter dækslet slip på toppen.
- Placer dækslet på toppen, gør det holde sig til båndet og holde i mørke, mens behandlingen af alle prøverne.
- Analysér oocytterne ved hjælp af et konventionelt epifluorescensmikroskop udstyret med DAPI-filtre (Excitation/Emission: 358⁄461) for at vurdere oocytternes meiotiske progression.
- Klassificere oocytterne efter deres meiotiske progression: GV - oocytter med forskellige grader af kromatinkondensering inden for GV; MI - oocytter fra GV nedbryde til metafase I; og degenerere - oocytter, der ikke kunne identificeres som værende på nogen af de tidligere stadier.
- Fastgør oocytterne i paraformaldehyd 4% i fosfat buffer saltvand (PBS) i 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved afslutningen af L-IVCO blev co-pillernes bruttomorfologi ændret, og 4 klasser blev identificeret på grundlag af cumuluscellernes udseende, som vist i figur 2. Baseret på de morfologiske kriterier, der almindeligvis blev vedtaget for at vælge sunde p-pc'er11,,26,27, blev klasse 1, 2 og 3 anset for sunde, mens klasse 4, som viste klare tegn på degeneration, såsom fraværet af komplette lag af cumulusceller omkring oocytterne, blev anset for alvorligt kompromitteret og uegnet til at gennemgå downstream-procedurer i en prospektiv IVP-indstilling. I alt blev 74 oocytter i 5 biologiske replikater analyseret, hvoraf 9,45% var i klasse 4 og blev kasseret fra yderligere evaluering.
Som vist i figur 3 og figur 4viste vurderingen af den meiotiske fase ved afslutningen af L-IVCO, at en betydeligt højere procentdel af oocytterne (78,57 ± 4,43 %) forblev arresteret på det umodne stadium, hvor kromatin stadig er lukket inde i GV (derfor også kaldet GV-fasen), uden at degenerere. Blandt dem 59,43% var i en GV2/3 konfiguration. En lille procentdel genoptaget meiose nå metafase I fase (13,76 ± 5,85%) eller degenerere (7,67 ± 4,61 %). Samlet set blev 67 oocytter i 5 biologiske replikater analyseret. Alt i alt viser disse data, at L-IVCO-kulturen understøtter oocytens levedygtighed, samtidig med at meiotiske genoptagelse i 5 dage forhindres.
Figur 1: Kontur af skålen, der anvendes til måling af oocytdiameteren og et repræsentativt billede af en COC. a) Skematisk gengivelse af en 60 mm petriskål med 16 dråber M199-D, som hver indeholder en enkelt COC. b )repræsentativtbillede af et COC med den akse, der anvendes til måling af diameteren. Bemærk, at zona pellucida ikke er inkluderet. Skala bar 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af p-piller på indsamlingstidstidstidstids- og efter L-IVCO. (A, B, C, D) Den øverste række (Indsamling) repræsenterer p-pc'er på hentningstidstid. a', B', C', D') Den samme COC er afbilledet 5 dage senere, i slutningen af L-IVCO og klassificeret som rapporteret i trin 6.1. Den nederste række (5 dage) repræsenterer p-piller klassificeret som: klasse 1, der viser en kompakt cumulus celle investering uden tegn på ekspansion og celle degeneration (A'); Klasse 2, der viser en kompakt cumulus celle investering uden tegn på ekspansion og celle degeneration og med antrum-lignende dannelse (pile) i cumulus masse (B'); Klasse 3, der viser flere lag cumulus celle uden tegn på cumulus ekspansion og nogle opdelte celler i det ydre lag af cumulus celler (C'); Klasse 4, der viser rigelige tab af cumulus celler på mere end 50% af oocyt overfladen og tegn på celledegeneration og celleaffald (D'). Skala bar 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af den meiotiske progression. Den øverste række (DNA-farvning) viser dna'et (blåt) af repræsentative oocytter på (A) GV0-trinnet og (B) GV2-lignende konfiguration, (C) MI-fase og(D) degenererede oocytter, (A) på indsamlingstidstids gang og (B, C, D) efter 5 dages L-IVCO. Den nederste række er det tilsvarende billede i lyst felt af oocyt i den øverste række. Pilen angiver GV. Skalabar 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Meiotic progression af oocytter i slutningen af kulturen. Søjlediagrammet repræsenterer fordelingen af oocytter på GV- og MI-fasen og degenererede oocytter i slutningen af L-IVCO. De oocytter, der tidligere var klassificeret i klasse 4, blev udelukket. Data blev analyseret af 1-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's multiple sammenligning test og værdier er midler ± SEM (N = 5; P<0.05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi et kultursystem til dyrkning af oocytter, der fremmer oocytudvikling i 5 dage ved at støtte deres levedygtighed og forhindre meiotisk genoptagelse. Sidstnævnte aspekt er af allerstørste betydning for at muliggøre den fortsatte vækst og differentiering, der er nødvendig for at give oocytet meiotisk og embryonisk udviklingskompetence2,20, som ellers ville blive blokeret af en for tidlig genoptagelse af meiotisk opdeling.
Da vi udviklede dette kultursystem, tog vi hensyn til flere karakteristika ved den fysiologiske vækst og differentiering, der forekommer i hårsækken. I dette afsnit giver vi et overblik over de vigtigste aspekter, som vi overvejede, da vi udviklede denne strategi.
For det første tager det ca. 5 dage at dyrke oocytter hos kvæg tidlige antralsækkene at gennemgå overgangen fra den voksende til den fuldt udvoksede fase in vivo8,19. Derfor blev længden af kulturen øget til 5 dage i modsætning til tidligere forsøg i vores laboratorium, hvor oocytterne blev dyrket i op til 24 h2.
En anden faktor, som vi inkluderede i L-IVCO, var den øgede viskositet af det medium, som de amerikanske p-piller dyrkes i, for at efterligne follikulært fluidens fysiologiske viskositet. Dette blev genskabt ved at tilføje 4% PVP og sammen med brugen af Kollagen jeg belagt kultur overflade, det fremmes dannelsen af en 3D lignende kultur, som rapporteret af tidligere undersøgelser13.
Cilostamide, en PDE3-hæmmer, blev tilføjet for at opretholde oocytter meiotisk arresteret på GV fase, forhindrer precocious meiotiske genoptagelse ved at holde høje niveauer af cykliske nukleotider inden for oocytter2,19,25,28,29. Vores resultater viser, at en 5-dages lang behandling med cilostamid ikke har en grov indvirkning på cocs sundhed, som kun en lille brøkdel af komplekser degenereret, også i overensstemmelse med resultaterne af Alam et al.19.
Inddragelsen af Zn sulfat og dets koncentration underbygges af de seneste resultater, der viser, at dette sporstof spiller en rolle med hensyn til at støtte differentieringen og transskriptionen af kvægdyrkningsstoffer ikultur 30.
Endelig, en kombination af hormoner blev indført for nøje at efterligne den fysiologiske hormonelle miljø typisk for den tidlige antral follikel31,,32,33. For eksempel estradiol har kendte aktiviteter til støtte for oocyt vækst16,17,19 og forbindelserne mellem granulosa celler17, samtidig med at fremme erhvervelsen af meiotiske kompetence34. Tilsvarende, testosteron, udover at være en forløber for østradiol, stimulerer også follikulær vækstog udvikling 35, mens progesteron blev hovedsageligt tilføjet til sin antiapoptotiske aktivitet36.
Vigtigt og i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse2, koncentrationen af FSH blev holdt i en koncentration, der er fysiologisk for vækstfasen. Faktisk en lav FSH koncentration fremmer oocyt udvikling ved at opretholde gap-junction medieret kommunikation mellem oocyt og følgesvend cumulus celler og fremmer transskriptionel aktivitet og oocyte differentiering uden at fremkalde meiotiske genoptagelse2.
Det er vores erfaring, at en af nøglerne til L-IVCO's succes er udvælgelsen af en homogen population af sunde p-pc'er, der kommer fra tidlige antrale follikler. Ifølge data i litteraturen, 80% af oocytter indsamlet fra tidlige antral follikler er karakteriseret ved kromatin organiseret i en konfiguration kaldet GV020. Denne homogenitet er en fordel for in vitro-kulturen, da den i princippet sikrer, at cellerne opfører sig på samme måde, når de udsættes for kulturmiljøet. Med dette in mente skal indsamlingen af p-piller udføres i forsøget på at minimere "forureningen" med p-piller, der kommer fra mindre eller mere avancerede stadier af differentiering. Men på grund af det faktum, at behandlingen af de kortikale skiver er ganske tidskrævende og bør udføres i en relativt kort tid, indsamling / udvælgelse trin sandsynligvis repræsenterer den mest kritiske passage af L-IVCO. For at opnå dette, bør nogle vigtige overvejelser være skæg i tankerne.
For eksempel skal forskeren/teknikeren uddannes til at genkende og kassere follikler med tegn på follikulær atresi. På dette stadium, kun morfologiske parametre kan bruges til at genkende atretiske follikler, såsom meget klart gennemskinneligt udseende, og tilstedeværelsen af en mørk COC indeni. Alle de andre follikler, hvor der ikke kan skelnes klart mellem atretiske tegn, bør åbnes, og der bør foretages yderligere udvælgelse baseret på de isolerede p-pillers morfologi for at identificere desunde 2,3,,37,38,39. Dette opnås igen ved morfologiske observationer såsom tilstedeværelsen af mindst fire lag cumulus celler, groft sfærisk form, intakt oolemma og homogen og fint granuleret ooplasm11,26,27.
CoCs isolation og manipulation udgør en yderligere teknisk udfordring, som kræver kvalificeret personale og korrekt udstyr til mikrodissektion under stereomikroskopet og nøjagtig bestemmelse af oocytdiameter. Dette sidste trin er afgørende for at udvælge en ensartet population af oocytter og dermed udelukke enhver mulig forureningskilde med p-piller fra andre follikulære faser. Det er derfor vigtigt at sikre, at de oocytter, der er omgivet af de hentede p-piller, har en diameter på mellem 100 og 110 μm2,40.
Ud over at støtte oocyt levedygtighed og forhindre meiotisk genoptagelse, L-IVCO fremmet overgangen af kromatin konfiguration fra GV0 til gradvist mere kondenseret GV2 og GV3 i 59% af oocytter. Især kromatin kondens i GV er en markør for 'gevinst' af meiotiske og udviklingsmæssige kompetence i stort set alle pattedyr oocytter undersøgt hidtil20. Dette resultat er meget lovende, især i forhold til vores tidligere 24 timer IVCO system. I denne undersøgelse blev den højeste grad af kromatinkomprimering inden for GV ikke nået, og 22 % af oocytterne blev fundet med en GV1-konfiguration2, en fase, der var forbundet med fuld meiotisk kompetence , men stadig knap udviklingskompetence20. Selv under disse forhold var de ellers inkompetente dyrkningsstøvler i stand til at modnes og producere embryoner, om end i begrænset mængde. Den konsekvente stigning i GV2/3-fasen i L-IVCO er derfor forenelig med et større potentiale for at producere levedygtige embryoner. Vi er i færd med at teste denne hypotese eksperimentelt ved at indsende p-piller fra L-IVCO til følgende trin i IVP (in vitro modning, befrugtning og embryo kultur op til blastocyst fase). Hvis det bekræftes, vil L-IVCO frigøre nogle af de endnu uudnyttede potentiale æggestokkene reserve, med vigtige konsekvenser for flere områder af interesse for kvindelige fertilitetsbevarelse. For eksempel vil det øge kilden til befrugtbare gameter, der skal anvendes i bevarelse programmer af høj genetisk værdi opdrættere. Et andet program, som vi forudser, er for den genetiske bjærgning af truede arter af bovid familien samt af lokale racer, der er truet eller i risiko for genetisk erosion på grund af den udbredte udbredelse af kosmpolit racer. Sidst men ikke mindst repræsenterer L-IVCO et værktøj for alle forskere, der er interesseret i at dissekere de cellulære og molekylære processer, der regulerer dannelsen af en kompetent gamet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 og UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J.
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
