Summary
Gelişimin erken aşamalarında yumurtalık foliküllerinden büyüyen yumurtaların izolasyonuna yönelik prosedürlerin yanı sıra büyümeyi ve farklılaşmayı tam olarak büyümüş aşamaya kadar desteklendirebilecek bir in vitro kültür sisteminin kurulumunu anlatıyoruz.
Abstract
Olgun, döllenebilir yumurtaların sınırlı rezervi, memelilerde yardımcı üremenin başarısı için önemli bir engel teşkil eder. Üreme ömrü boyunca yumurtalıkolgun ve yumurtlayan yumurtaların sadece %1'inin yumurtalıkların sadece %1'inde yumurtalık rezervinin yumurtalık dışı foliküllerin artan popülasyonuna olan sömürüsünü artırmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık ta seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin vemiştir. Ancak, yumurtalık rezervinin büyük potansiyeli hala büyük ölçüde sömürülmemaktadır. Örneğin, belirli gelişimsel evrelerde yumurtaların in vitro kültürünü desteklemek için bazı girişimlerde bulunulmuş, ancak verimli ve güvenilir protokoller henüz geliştirilmemiştir. Burada, sığır erken antral foliküllerinden tam olarak yetiştirilen evreye kadar toplanan in vitro büyüyen oositlerin geliştirilmesi için tanımlanan, ilgili foliküler evrenin fizyolojik koşullarını yeniden üreten bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Hormonlar ve fosfodiesteraz 3 inhibitörü bir arada zamansız meiyotik devamı önlemek ve oosit farklılaşması rehberlik etmek için kullanılmıştır.
Introduction
Üreme ömrü boyunca, bir yumurtalık olgun mevcut yumurtaların sadece minimal bir kısmını, yumurtlama üzerine fallop tüpleri serbest bırakılır, ve döllenmiş olmak ve uygun bir embriyo haline geliştirmek için kullanılabilir1. Öte yandan, bir yumurtalık içinde oositlerin çoğu atrezi geçmesi ve yumurtalık asla. In vitro embriyo üretimi (IVP) teknolojileri yumurtalıkrezervi2,3sömürü artırmak için çalıştılar. Şimdiye kadar, bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin verdi. Yine de, çoğu protokol temelde antral yumurtalık folikül içinde büyüme aşaması tamamlamış yumurta kullanın, ve dolayısıyla tam büyümüş yumurta olarak adlandırılır. IVP teknolojilerinin yaygın olarak kullanıldığı sığırlarda, tam olarak yetiştirilen yumurtalar yaklaşık 120 μm'lik bir çapa ulaşır ve çapı 2 ila 8 mm arasında değişen foliküllerden toplanır (orta antral foliküller)1. Foliküllerden izolasyon üzerine, bu tür yumurtalar in vitro olgunlaşmış ve döllenmiş. Zigotlar daha sonra blastosist evresine kadar kültürlenir ve ya alıcıya aktarılır ya da kriyokorunmuş olur. Sığır, yanı sıra diğer birçok tür, IVP tarafından sunulan potansiyele rağmen, başına üretilen in vitro embriyo sayısı büyük ölçüde son 40 yıldır artmadı. Bu kısmen alınabilir ve standart IVP teknikleri 4 tabi belirli bir zamanda bir yumurtalık doldurmak tam olarak yetiştirilen yumurta sınırlı sayıda nedeniyle4,5,6.
Erken antral foliküller içinde kapalı oositler, yani, çapı 2 mm'den az olan bu foliküller, doğurganlık koruma programlarında kullanılmak üzere potansiyel bir kaynak temsil7 , bir yumurtalık kabaca orta antral daha 10 kat daha erken antral foliküller içerir8. Ancak, bu oositler hala büyüme aşamasında ve henüz tam olarak yetiştirilen aşama9ulaşmadı . Bu nedenle, hala transkripsiyon elverişsal aktif, daha sonraki gelişimsel adımlar için saklanacak mRNA'lar üreten, ve henüz kendiliğinden devam etme ve mayoz tamamlama yeteneği ile oositler vermek için gerekli tüm farklılaşma sürecinden geçmedi bir kez foliküler bölmesi izole10,11. Bu nedenle, doğrudan standart in vitro olgunlaşma (IVM) protokollerine sunulamaz, ancak büyüme aşamasını tamamlamak ve düzgün bir şekilde ayırt etmek için izin verecek ek bir kültür dönemi gerektirir.
Folikül erken antral evresinden orta antral evreye geliştiğinde sığırlarda meydana gelen büyüme den tam olarak yetiştirilen evreye geçiş, yumurta gelişimi sırasında kritik adımlardan biridir. Sığır, çeşitli çalışmalarda bu olayları in vitro2,12,13,,14,15,16,17,18,19olarak özetlemeye çalıştı. Ancak, bugüne kadar hiçbir güvenilir protokoller geliştirilmiştir ve sadece sınırlı başarı bildirilmiştir. Önceki çalışmalara göre20, Bu büyüyen yumurta homojen bir popülasyon oluşturmaktadır. Transkripsiyonel aktif olmasının yanı sıra, onların kromatin germinal vezikül dağılır (GV), GV02,adlı bir yapılandırma,21. Tersine, orta antral foliküllerden elde edilen tam büyümüş oositlerin popülasyonu daha heterojendir, kromatin sıkıştırmanın çeşitli dereceleri (GV1, GV2 ve GV3) ile yansıtılan birdurumdur 20. Bunlar arasında, önceki veriler GV2 ve GV3 oositler genel olarak daha kaliteli ve daha yüksek embriyonik gelişimsel yeterlilik20,21,,22,23,24ile karakterize olduğunu göstermiştir.
Yukarıdaki gözlemlerden yola çıkarak, burada, erken antral foliküllerden kümülüs-oosit kompleksleri (COC) olarak izole edilmiş yumurtaların farklılaşmasını sağlayan 5 günlük bir kültür yumurtası sistemini (L-IVCO) açıklıyoruz. Bu kültür stratejisi laboratuarımızda yürütülen 10 yıllık uzun çalışmalardan gelişti ve daha önce geliştirilen 24-48 saat in vitro oosit kültürü (IVCO)2,prematürasyon sistemleri23,25 ve oosit kültürü sırasında çinko takviyesi üzerine zemin kökleri . Folikül uyarıcı hormon (FSH) ve fosfodiesteraz-3 (PDE3) inhibitörü kombinasyonu, kümülüs-oositiletişiminigeliştirebilen 2 , zamansız meiyotik devamı önlemek2, ve destek oosit büyüme2 kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yumurtalıklar yerel mezbahada (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, İtalya) bulunan 4 ila 8 yaşındaki Holstein süt ineklerinden toplanmıştır.
1. Medya hazırlığı
NOT: Tüm ortamlar kullanımdan en az dört saat önce hazırlanmalıdır. Sodyum bikarbonat tamponlu ortam 38,5 °C ve %5 CO2 hava, maksimum nem de kuluçkaya yatırılır. HEPES-tamponlu ortam termostatik fırında 38.5 °C'de muhafaza edilir.
- Yumurtaların uzun in vitro kültürü (L-IVCO) orta
- Temel kültür ortamının (M199-B) 15 mL'sini hazırlayın: 2 mM glutamin ile M199 takviyesi, %0.4 yağ asidi içermeyen sığır serum albumini (BSA), 0.2 mM sodyum pirüuvat, 25 mM sodyum bikarbonat, 0.1 mM sibuharin, 21.3 g/mL fenol kırmızısı, 75 g/mL kanamisin ve %4 Polivinilpyrrolidone (PVP; 360 k moleküler ağırlık).
- Tutma ortamının 3 mL'sini (M199-H): M199-B'ye 5 m simide ekleyin ve 35 mm Petri kabına dökün.
- L-IVCO ortamını (M199-L): 0,15 μg/mL Zn sülfat, 10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosteron, 50 ng/mL progesteron ve 5 μM Simide ile Takviye M199-B' yi hazırlayın.
- 96 iyi kaplanmış plakanın her kuyusunun her kuyununa 200 μL M199-L orta yerleştirin. Buharlaşmayı telafi etmek ve kültür sırasında uygun nemi korumak için plakanın dört kenarındaki kuyuları steril kültür suyuyla doldurun.
- 96 kuyu plakasını ve M199-H ortamını kuvözde 38,5 °C ve %5 CO2 hava, maksimum nem de kuluçkaya yatırın.
- Diseksiyon ortamı
- Diseksiyon ortamını (M199-D) hazırlayın: Ek M199 % 0.4 BSA fraksiyonu V, 0.164 mM penisilin, 0.048 mM streptomisin, 1790 adet/L heparin ile. M199-D toplu olarak hazırlanabilir, 20 mL aliquots dağıtılabilir ve 4 °C'de 6 ay saklanabilir. Gerektiğinde, sıcak ve ek 1 aliquot.
- 5 μM silostamid (M199-D silostamid) ile takviye m199-D 20 mL hazırlayın.
2. Yumurtalık toplama ve işleme
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında (26 °C) yapılır.
- Mezbahadaki yumurtalıkları kurtarın.
- Yumurtalıkları 26 – 28 °C penisilin 100 U/mL ve streptomisin 0.1 mg/mL ile eklenen steril saline (NaCl, 9 g/L) yerleştirin.
- Organları 4 saat içinde sıcak steril salin le laboratuvara taşıyın.
- Yumurtalıkları 26 °C'de tutulan steril salinde 4 kat yıkayın.
- -28 mmHg'de vakum basıncı ile bir aspirasyon pompasına bağlı 18 G iğnesi kullanarak çapı 2 mm'den fazla olan tüm folikülleri aspire ederek tüm orta-büyük antral folikülleri çıkarın ve emişli yumurtalıkları 26 °C'de steril saliniçeren bir kabın üzerine yerleştirin.
NOT: Foliküllerin içeriğinin kaldırılması > 2 mm, deneyi 'kirletecek' tam büyümüş yumurtaların kaynağını mümkün olduğunca kaldırmak için kritik bir adımdır. - Yatay bir laminar akış kaputunun altında, steril bir politetrafloroetilen kesme tahtası üzerine aynı anda bir yumurtalık yerleştirin. Bir neşter sapı üzerine monte edilmiş bir cerrahi bıçak No. 22 kullanarak, yumurtalık korteks dilimleri kesilmiş (yumurtalık dış kısmı, foliküller içeren), 1.5 - 2 mm kalınlığında ve organın ana eksenine paralel.
- Yumurtalık korteks dilimlerini 38,5 °C'de sıcak bir tabağa kesme ortamıile kaplı steril cam Petri kabına yerleştirin.
NOT: Bundan böyle tüm işlemler 38.5 °C'de sıcak bir plaka kullanılarak yapılmaktadır.
3. Foliküllerin seçilmesi ve izole edilmesi ve COC'ların alınması
- M199-D 2-3 mL ile 60 mm cam Petri çanak bir yumurtalık korteks dilim yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, mikrometre donanımlı bir mercek kullanarak 0,5 ila 2 mm arasındaki folikülleri seçin.
- Stereomikroskop altında sağlıklı, atreetik olmayan folikülleri tanımlayın. Folikül atrezisini, içinde koyu bir COC olan çok net yarı saydam görünüm gibi morfolojik parametreleri gözlemleyerek değerlendirin. Atreetik folikülleri atın ve tüm diğerleri işlemek.
- Bir neşter sapı üzerine monte edilmiş bir cerrahi bıçak No 22 kullanarak folikül bir kenarında maruz kalana kadar bir tarafta folikül çevreleyen yumurtalık dokusu kaldırın.
- Bir şırınga üzerine monte edilmiş 26G iğne kullanarak, dikkatlice maruz folikül duvarında bir yarık yapmak. Bu eylem foliküler içerik yayınlayacak, COC oluşan, foliküler sıvı ve hücrelerin kümeleri.
- Mikroskop altında COC'yi belirleyin ve kümülüs bütünlüğü, zona pellucida bütünlüğü ve sitoplazmanın homojenliğini inceleyin. Bu kriterler yerine getirilirse, P20 pipetkullanarak COC aspire edin.
- M199-D simide izole COC yerleştirin.
- 30 dk boyunca izolasyon işlemine devam edin.
4. İn vitro kültüre tabi tutulacak CO'ların seçimi
- Diseksiyon mikroskobu altında, adım 3.6'daki kriterlere göre sağlıklı COC'lar seçin.
- 60 mm petri kabında, 20 μL M199-D silostamid'in 16 damlası hazırlayın ve damla başına bir sağlıklı COC yerleştirin(Şekil 1A).
- Kameraya bağlı ters bir mikroskop kullanarak, kamerayla sağlanan yazılımı kullanarak zona pellucida hariç, yumurta çapı ölçülür.
- Yumurtanın net bir görselleştirmesi ile zona pellucida hariç iki dik ölçüm yapın (Şekil 1B).
- Zona pellucida hariç iki oositin ölçüm ortalamasının 100 - 110 μm aralığında olup olmadığına emin olun. Yuvarlak olmayan şekilli yumurta veya ölçülebilir olmayan oositlerle COC'leri atın.
- Seçilen COC'leri M199-H orta içeren 35 mm'lik bir kapta aktarın ve 5.1 adıma kadar maksimum nem oranı olan 38.5 °C ve %5 CO2'de kuvözde tutun.
- 3 ve 4 adımlarını 4x'e kadar tekrarlayın. Toplam çalışma süresi 2 saati geçmemelidir.
5. Yumurtaların uzun in vitro kültürü (L-IVCO)
- Adım 1.1.5'te hazırlanacak 96 kuyu plakasının merkezinde kuyu başına bir COC aktarın.
- Plakayı 38,5 °C'de 5 gün, havada %5 CO2'de maksimum nemde kuluçkaya yatırın.
- Her gün (gün 2 ve gün 4) adım 1'de açıklandığı gibi taze M199-L hazırlayın.
- 100 μL orta yıkArak ve 100 μL taze hazırlanmış M199-L ile değiştirerek ortamın yarısını yenileyin. Stereomikroskop altında orta yenilemeyi gerçekleştirin ve COC'leri kuyuya taşımaktan kaçının.
6. Kültürden sonra COC sınıflandırması
- L-IVCO'nun sonunda, COC'lerin morfolojisini diseksiyon mikroskobu altında analiz edin.
- Şekil 2'debetimlenen gibi sınıflandırın.
- COC'ler kümülüs genişlemesi ve hücre dejenerasyonu belirtisi olmadan kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteriyorsa Sınıf 1 olarak sınıflandırın.
- COC'ler kümülüs genişlemesi ve hücre dejenerasyonu belirtisi olmayan ve kümülüs kütlesinde antrum benzeri formasyon içeren kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteriyorsa Sınıf 2 olarak sınıflandırın.
- COC'lar kümülüs genişlemesi belirtisi olmayan birkaç kümülüs hücresi katmanı ve kümülüs hücrelerinin dış tabakasında bazı ayrışmış hücreler ve antrum benzeri bir oluşum yoksa Sınıf 3 olarak sınıflandırın.
- COC'ler yumurta yüzeyinin %50'sinden fazlasını genişleten kümülüs hücrelerinin bol miktarda kaybını ve hücre dejenerasyonu ve hücre enkazını gösteriyorsa Sınıf 4 olarak sınıflandırın.
7. Kültür sonrası meyotik ilerlemenin değerlendirilmesi
- Oosit denudasyonu
- Her COC'yi, kuyu başına 400 μL 199D içeren dört kuyuluk tek bir kuyuya yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, 130-140 μL'lik bir pipet seti kullanarak tekrarlanan pipetleme ile kümülüs hücrelerini mekanik olarak çıkarın.
- Yumurtalar kümülüs yatırımından kurtulduktan sonra, bunları 199D içeren başka bir kuyuya aktarın.
- Tüm yumurtalar tamamen inkar edilene kadar işlemi tekrarlayın.
- Oosit nükleer boyama
NOT: Bundan böyle tüm işlemler oda sıcaklığında yapılmaktadır. Reaktifler oda sıcaklığındadır.- Paraformaldehitteki oositleri 1 saat boyunca fosfat tampon salininde (PBS) %4 oranında düzeltin.
DİkKAT: Paraformaldehit ilerlerken kişisel koruyucu ekipman giyin ve kontamine olmuş maddeleri tehlikeli atık bertaraf kurallarına uygun olarak imha edin. - % 1 polivinilalkol (PVA) içeren PBS 5 dakika her için yumurta 3x yıkayın.
NOT: Numuneler hemen işlenebilir veya en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. - 10 dakika boyunca % 0.1 Triton X içeren PBS'ye yumurtaları yerleştirin.
- % 1 PVA içeren PBS 5 dakika her için oositler 3x yıkayın.
- 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dilaktilat (1 μg/mL) ile takviye antifade orta 5 μL damla ları tekil yumurta yerleştirin.
- Kapağı üstüne koyarken yumurtaların aşırı düzlememasını önlemek için, slaytın uzun kenarları boyunca iki şerit çift taraflı bant yerleştirin.
- Kapak fişini üste yerleştirin, teybinyapışmasını ve tüm örnekleri işlerken karanlıkta kalmasını sağlayabilir.
- Oositlerin meyotik ilerlemesini değerlendirmek için DAPI filtreleri (Uyarma/Emisyon: 358,461) ile donatılmış geleneksel epifloresan mikroskobu kullanarak yumurtaları analiz edin.
- Oositleri meyiyotik progresyonlara göre sınıflandırın: GV - GV içinde farklı derecede kromatin yoğuşması olan oositler; MI – GV'den yumurtalar metafaz I'e kadar parçalanıyor; ve dejenere - önceki aşamaların herhangi birinde olduğu tespit edilemez oositler.
- Paraformaldehitteki oositleri 1 saat boyunca fosfat tampon salininde (PBS) %4 oranında düzeltin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L-IVCO sonunda, COCs brüt morfolojisi değişti ve 4 sınıf kümülüs hücrelerinin görünümüne göre tespit edildi, Şekil 2'degösterildiği gibi . SağlıklıCOC'ların 11,,26,,27, sınıf 1, 2 ve 3'ü seçmek için yaygın olarak kabul edilen morfolojik kriterlere göre sağlıklı değerlendirilirken, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerinin tam tabakalarının yokluğu gibi açık dejenerasyon belirtileri gösteren sınıf 4, olası bir IVP ayarında ciddi şekilde tehlikeye atılmış ve aşağı akım prosedürlerinden geçmek için uygun değildir. Toplamda 5 biyolojik kopyada 74 oosit analiz edildi ve bunların %9,45'i sınıf 4'te ydi ve ileri değerlendirmeden çıkarıldı.
Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterildiği gibi, L-IVCO sonundaki meyiyotik evrenin değerlendirilmesi yumurtaların anlamlı olarak daha yüksek bir yüzdesinin (%78,57 ± %4,43) olduğunu göstermiştir. olgunlaşmamış aşamada tutuklandı kaldı, kromatin hala GV içinde kapalı (bu nedenle, ayrıca GV aşaması olarak anılacaktır), dejeneratif olmadan. Bunların %59,43'ü GV2/3 konfigürasyonunda ydı. Metafaz I evresine ulaşan küçük bir yüzdeli meyozis (%13.76 ± %5.85) veya dejenere (7,67 ± %4,61). Toplamda 5 biyolojik kopyada 67 oosit analiz edildi. Bu veriler, L-IVCO kültürünün 5 gün boyunca meyotik devamı önlerken oosit canlılığını desteklediğini göstermektedir.
Şekil 1: Bir COC'nin yumurta çapını ve temsili görüntüsünü ölçmek için kullanılan yemeğin anahattı. (A) 60 mm'lik petri kabının şematik gösterimi ve her biri tek bir COC içeren 20°L 20l'lik 16 damla. (B) Çapı ölçmek için kullanılan eksenile bir COC'nin temsili görüntüsü. Zona pellucida dahil olmadığını unutmayın. Ölçek çubuğu 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toplama sırasında ve L-IVCO sonrası COC'ların temsili görüntüleri. (A, B, C, D) Üst satır (Koleksiyon) alma sırasında COC'ları temsil eder. (A', B', C', D') Aynı COC 5 gün sonra, L-IVCO sonunda resimde ve adım 6.1 bildirilen olarak sınıflandırılır. Alt satır (5 gün) olarak sınıflandırılan COC'ları temsil eder: Sınıf 1, genişleme ve hücre dejenerasyonu (A') belirtisi olmayan kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteren; Sınıf 2, genişleme ve hücre dejenerasyonu belirtisi olmayan ve kümülüs kütlesinde (B') antrum benzeri formasyon (oklar) ile kompakt bir kümülüs hücre yatırımı gösteren; Sınıf 3, kümülüs hücrelerinin dış tabakasında kümülüs genişlemesi ve bazı ayrışmış hücreler (C'); Sınıf 4, yumurta yüzeyinin %50'sinden fazlaküm hücrelerinin bol miktarda kaybı ve hücre dejenerasyonu ve hücre enkazı (D') belirtileri gösteriyor. Ölçek çubuğu 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Meyotik ilerlemenin temsili görüntüleri. Üst sıra (DNA boyama) (A) GV0 aşamasında ve (B) GV2 benzeri yapılandırma, (C) MI evresi ve (D) dejenere oositler, (A) toplama sırasında ve (B, C, D) 5 gün l-IVCO'dan sonra temsili yumurtaların DNA'sını (mavi) gösterir. Alt satır, üst sıradaki yumurtanın parlak alanında karşılık gelen görüntüdür. Ok GV'yi gösterir. Ölçek çubuğu 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kültürün sonunda ki yumurtaların Meiotik ilerlemesi. Çubuk grafiği, GV ve MI aşamasındaki yumurtaların ve L-IVCO'nun sonundaki dejenere yumurtaların dağılımını temsil eder. Daha önce Sınıf 4'te sınıflandırılan oositler hariç tutulmuş. Veriler 1 yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ve değerleri SEM ± anlamına gelir (N=5; P<0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yumurtaların canlılığını destekleyerek ve meyozis inmesini engelleyerek 5 gün boyunca yumurta gelişimini destekleyen yumurtaların büyümesini sağlayan bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu ikinci yönü sürekli büyüme ve farklılaşma meiyotik ve embriyonikgelişimselyetkinlik2,20ile oosit vermek için gerekli izin vermek için en önemli öneme sahiptir , aksi takdirde meiyotik bölünme erken bir devamı tarafından bloke olacaktır.
Bu kültür sistemini geliştirirken folikülde oluşan fizyolojik büyüme ve farklılaşmanın çeşitli özelliklerini göz önünde bulundurduk. Bu bölümde, bu stratejiyi geliştirirken göz önünde bulunduğumuz ana hususlara genel bir bakış sayılacağız.
İlk olarak, sığır erken antral folikülleri büyüyen oositler vivo8tam olarak yetiştirilen aşamasına geçiş geçmesi için yaklaşık 5 gün sürer,19. Bu nedenle, yumurtaların 24 saat2'yekadar kültürlendiği laboratuarımızda yapılan önceki girişimlere karşılık kültürün uzunluğu 5 güne çıkarıldı.
L-IVCO'ya dahil ettiğimiz bir diğer faktör de, COC'lerin foliküler sıvının fizyolojik viskozitesini taklit etmek için kültüre sahip olduğu ortamın viskozitesi arttı. Bu% 4 PVP ekleyerek yeniden oluşturuldu ve birlikte Kollajen I kaplamalı kültür yüzeyinin kullanımı ile, daha önceki çalışmalarda rapor edildiği gibi, kültür gibi bir 3D oluşumunu teşvik13.
Silostamide, bir PDE3 inhibitörü, oositler meiyotik GV aşamasında tutuklandı korumak için eklendi, yumurtalar içinde siklik nükleotitlerin yüksek düzeyde tutarak erken meyotik devamı önlenmesi2,19,25,28,29. Sonuçlarımız, silostamid ile 5 günlük bir tedavinin, komplekslerin sadece küçük bir kısmı dejenere olduğu için, Alam ve ark.19'unelde ettiği sonuçlarla uyum içinde, COC'ların sağlığı üzerinde brüt bir etkisi olmadığını göstermektedir.
Zn sülfat dahil, ve konsantrasyonu, bu eser elementkültür 30 yumurta yetiştiriciliği farklılaşma ve transkripsiyonaktivitesini destekleyen bir rolü olduğunu gösteren son sonuçlar ile kanıtlanmıştır30.
Son olarak, hormonların bir arada yakından erken antral folikül tipik fizyolojik hormonal ortam taklit tanıtıldı31,32,33. Örneğin estradiol oosit büyümesini destekleyen faaliyetleri bilinmektedir16,17,19 ve granulosa hücreleri arasındaki bağlantıları17, Aynı zamanda meiyotik yetkinlik edinimi teşvik ederken34. Benzer şekilde, testosteron, estradiol bir öncüsü olmanın yanı sıra, aynı zamanda foliküler büyüme ve gelişme uyarır35, progesteron esas olarak antiapoptotik aktivite için eklendi iken36.
Daha da önemlisi ve önceki çalışmamız2ile uyum içinde, FSH konsantrasyonu büyüme aşaması için fizyolojik bir konsantrasyonda tutuldu. Gerçekten de, düşük FSH konsantrasyonu yumurta ve eşlik eden kümülüs hücreleri arasında boşluk-kavşak aracılı iletişim idame ettirerek yumurta gelişimini teşvik eder ve meiyotikdevamıindüklemeden transkripsiyonel aktivite ve yumurta farklılaşmasını teşvik 2 .
Deneyimlerimize göre, L-IVCO'nun başarısının anahtarlarından biri erken antral foliküllerden gelen homojen sağlıklı COC popülasyonunun seçilmesidir. Literatürdeki verilere göre, erken antral foliküllerden toplanan yumurtaların %80'i GV020olarak adlandırılan bir konfigürasyonda düzenlenmiş kromatin ile karakterizedir. Bu homojenlik in vitro kültür için bir avantaj teşkil eder, prensipte hücrelerin kültür ortamına maruz kaldığında benzer şekilde şekilde şekilde durmasını sağlar. Bunu göz önünde bulundurarak, COC'lerin toplanması, daha az veya daha ileri düzeylerde farklılaşma dan gelen COC'larla 'kontaminasyonu' en aza indirmeye çalışarak yapılmalıdır. Ancak, kortikal dilimlerin işlenmesi nin oldukça zaman alıcı olması ve nispeten kısa bir süre içinde yapılması gerektiği gerçeği nden dolayı, toplama/seçim adımı muhtemelen L-IVCO'nun en kritik geçişini temsil eder. Bunu başarmak için, bazı önemli hususlar akılda sakal olmalıdır.
Örneğin, araştırmacı / teknisyen tanımak ve foliküler atrezi belirtileri ile folikülleri atmak için eğitilmiş olması gerekir. Bu aşamada, sadece morfolojik parametreler atreetik folikülleri tanımak için kullanılabilir, çok net yarı saydam görünüm gibi, ve içinde koyu bir COC varlığı. Atreetik bulguların açıkça ayırt edilemediği diğer tüm foliküller açılmalı ve izole edilmiş COC'ların morfolojisine göre daha fazla seçim yapılmalıdır.,3,37,38,39 Bu kümülüs hücrelerinin en az dört tabaka varlığı gibi morfolojik gözlemler ile tekrar elde edilir, brüt küresel şekil, bozulmamış oolemma ve homojen ve ince granüllü ooplazm11,26,27.
COCs izolasyon ve manipülasyon stereomikroskop altında mikro-diseksiyon ve yumurta çapı doğru belirlenmesi altında mikro-diseksiyon için yetenekli personel ve uygun ekipman gerektiren ek bir teknik sorun temsil eder. Bu son adım, böylece diğer foliküler aşamalarından gelen COCs ile kontaminasyon olası bir kaynak hariç, yumurta tek tip bir nüfus seçmek için gereklidir. Bu nedenle, alınan COC'larda bulunan yumurtaların çapının 100 ile 110m2,40arasında olduğundan emin olmak önemlidir.
L-IVCO, oositcanlılığını desteklemenin ve meiyotik yeniden başlamayı önlemenin yanı sıra, kromatin konfigürasyonunun GV0'dan giderek daha yoğun gv2 ve GV3'e geçişini yumurtaların %59'unda destekledi. Özellikle GV içinde kromatin yoğuşma temelde tüm memeli oositler şimdiye kadar çalışılan meyotik ve gelişimsel yeterlilik 'kazanç' bir göstergesidir20. Bu sonuç, özellikle önceki 24 saat IVCO sistemi ile karşılaştırıldığında, çok umut verici. Bu çalışmada, GV içinde kromatin sıkıştırma en yüksek derecesine ulaşılamadı ve oositlerin% 22 GV1 yapılandırma sı ile bulundu2, tam meiyotik yetkinlik ile ilişkili bir aşama ama hala kıt gelişimsel yetkinlik20. Bu koşullarda bile, aksi takdirde yetersiz büyüyen oositler olgun ve embriyo üretmek başardık, sınırlı miktarda olmasına rağmen. Bu nedenle L-IVCO'da gözlenen GV2/3 evrelerinde ki tutarlı artış, canlı embriyo üretme potansiyeli ile uyumludur. L-IVCO'dan elde edilen COC'ları IVP'nin aşağıdaki adımlarına (in vitro maturasyon, döllenme ve embriyo kültürünü blastosist aşamasına kadar) göndererek bu hipotezi deneysel olarak test etme aşamasındayız. Eğer doğrulanırsa, L-IVCO yumurtalık rezervi henüz kullanılmayan potansiyel bazı açığa çıkaracaktır, kadın doğurganlık korunması için ilgi çeşitli alanlarda önemli etkileri ile. Örneğin, yüksek genetik liyakat yetiştiricilerinin koruma programlarında kullanılacak döllenebilir gametlerin kaynağını artıracaktır. Öngördüğümüz bir diğer uygulama da, kozmopolite ırklarının yaygın yayılması nedeniyle nesli tükenmekte olan veya genetik erozyon riski altında olan bovid ailesinin tehdit altındaki türlerinin yanı sıra yerel ırkların genetik olarak kurtarılmasıdır. Son olarak, L-IVCO yetkili bir gamet oluşumunu düzenleyen hücresel ve moleküler süreçleri incelemek isteyen tüm bilim adamları için bir araç temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 ve UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J.
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
