Summary
We beschrijven de procedures voor isolatie van groeiende eicellen uit eierstokzakjes in een vroeg stadium van ontwikkeling, evenals de opzet van een in vitro cultuursysteem dat de groei en differentiatie tot aan de volgroeide fase kan ondersteunen.
Abstract
De beperkte reserve van volwassen, bevruchtbare eicellen vormt een belangrijke barrière voor het succes van geassisteerde voortplanting bij zoogdieren. Gezien het feit dat tijdens de reproductieve levensduur slechts ongeveer 1% van de eicellen in een eierstok volwassen en ovuleren, verschillende technieken zijn ontwikkeld om de exploitatie van de eierstokreserve te verhogen tot de groeiende bevolking van niet-ovulatory follikels. Dergelijke technologieën hebben toegestaan interventies van vruchtbaarheid behoud, selectie programma's in vee, en het behoud van bedreigde soorten. Het enorme potentieel van de eierstokreserve is echter nog grotendeels onbenut. Bij koeien zijn bijvoorbeeld pogingen ondernomen om de in vitrocultuur van eicellen in specifieke ontwikkelingsstadia te ondersteunen, maar efficiënte en betrouwbare protocollen zijn nog niet ontwikkeld. Hier beschrijven we een kweeksysteem dat de fysiologische omstandigheden van het overeenkomstige folliculaire stadium reproduceert, gedefinieerd om in vitro groeiende eicellen te ontwikkelen die afkomstig zijn van runderige antrale follikels tot het volgroeide stadium, wat overeenkomt met de gemiddelde antral follikel in vivo. Een combinatie van hormonen en een fosfodiesterase 3 remmer werd gebruikt om voortijdige meiotische hervatting te voorkomen en om oocyte's differentiatie te begeleiden.
Introduction
Tijdens de reproductieve levensduur, slechts een minimale fractie van de eicellen die aanwezig zijn in een eierstok volwassen, worden vrijgegeven in de eileiders bij de ovulatie, en zijn beschikbaar voor bevrucht en ontwikkelen tot een levensvatbare embryo1. Aan de andere kant ondergaan de meeste eicellen in een eierstok atresie en worden ze nooit ovulated. In vitro embryoproductie (IVP) technologieën hebben geprobeerd de exploitatie van de eierstokreserve2,3teverhogen . Tot nu toe hebben dergelijke technologieën toegestaan interventies van vruchtbaarheid behoud, selectie programma's in vee, en het behoud van bedreigde soorten. Niettemin, de meeste protocollen gebruiken eicellen die in principe hebben voltooid de groeifase binnen de antral eierstok follikel, en dus worden aangeduid als volgroeide eicellen. Bij runderen, waar IVP-technologieën op grote schaal worden gebruikt, bereiken volgroeide eicellen een uiteindelijke diameter van ongeveer 120 μm en worden ze verzameld uit follikels met een diameter van 2 tot 8 mm (middelgrote antralzakjes)1. Bij isolatie van de follikels worden dergelijke eicellen in vitro gerijpt en bevrucht. De zygotes worden vervolgens gekweekt tot de blastocyst fase en ofwel overgebracht naar een ontvanger of cryopreserved. Bij runderen, maar ook bij vele andere soorten, ondanks het potentieel van IVP, is het aantal in vitro geproduceerde embryo's per koe de afgelopen 40 jaar niet grotendeels verbeterd. Dit is deels te wijten aan het beperkte aantal volgroeide eicellen die een eierstok bevolken op een bepaald moment dat kan worden opgehaald en onderworpen aan standaard IVP-technieken4,5,6.
De eicellen ingesloten in vroege antral follikels, dat wil zeggen, die follikels die minder dan 2 mm in diameter, vertegenwoordigen een potentiële bron te worden gebruikt in de vruchtbaarheid behoud programma's7 , als een eierstok bevat ruwweg 10 keer meer vroege antrale follikels dan medium antral8. Deze eicellen bevinden zich echter nog in de groeifase en hebben nog geen volgroeide fase9bereikt . Als zodanig zijn ze nog steeds transcriptie actief, produceren mRNAs die zullen worden opgeslagen voor latere ontwikkelingsstappen, en hebben nog niet ondergaan alle differentiatie proces dat nodig is om de eicellen te verlenen met de mogelijkheid van spontaan hervatten en het invullen van meiose Ik eenmaal geïsoleerd uit de folliculaire compartiment10,11. Daarom kunnen ze niet rechtstreeks worden onderworpen aan standaard in vitro maturatie (IVM) protocollen, maar ze vereisen een extra periode van cultuur die hen in staat zou stellen om de groeifase te voltooien en goed te differentiëren.
De overgang van het groeiende naar het volgroeide stadium, dat bij runderen optreedt wanneer de follikel zich ontwikkelt van de vroege antraal naar de gemiddelde antrarale fase, is een van de kritieke stappen tijdens de ontwikkeling van de eicel. Bij runderen probeerden verschillende studies deze voorvallen samen te vatten in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Tot op heden zijn er echter geen betrouwbare protocollen ontwikkeld en is slechts beperkt succes gemeld. Volgens eerdere studies20, deze groeiende eicellen vormen een homogene populatie. Naast transcriptie actief, wordt hun chromatine verspreid in de kiersyscle (GV), in een configuratie die GV02,21heet . Omgekeerd is de populatie van volgroeide eicellen verkregen uit middelgrote antralzakjes heterogeener, een aandoening die wordt weerspiegeld door de verschillende graden van chromatineverdichting (GV1, GV2 en GV3) die kunnen worden waargenomen20. Uit eerdere gegevens is gebleken dat GV2 en GV3-eicellen over het algemeen worden gekenmerkt door een betere kwaliteit en een hogere embryonale ontwikkelingscompetentie20,21,22,23,24.
Uitgaande van de bovenstaande waarnemingen beschrijven we hier een 5-dagen lang kweeksysteem van eicellen (L-IVCO) dat de differentiatie van eicyten geïsoleerd als cumulus-eicellencomplexen (COC's) van vroege mierenfollillen mogelijk maakt. Deze cultuurstrategie is geëvolueerd van 10 jaar lange studies uitgevoerd in ons lab en wortels zijn grond op de eerder ontwikkelde 24-48 uur in vitro eicelcultuur (IVCO)2, voorverzadigingssystemen23,25 en zink suppletie tijdens de eicelcultuur . Een combinatie van follikel stimulerend hormoon (FSH) en een fosfodiesterase-3 (PDE3) remmer, in staat om cumulus-eicelcommunicatie te verbeteren2,voortijdige meiotische hervatting2te voorkomen en oocytengroei2 te ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eierstokken werden verzameld van 4 tot 8 jaar oude Holstein melkkoeien teruggewonnen in het lokale slachthuis (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italië).
1. Voorbereiding van de media
LET OP: Alle media moeten ten minste vier uur voor gebruik worden voorbereid. Natriumbicarbonaat gebufferde media worden geïncubeerd bij 38,5 °C en 5% CO2 in de lucht, maximale vochtigheid. HEPES-gebufferde media worden gehandhaafd op 38,5 °C in thermostatische oven.
- Lange in vitro cultuur van eicellen (L-IVCO) medium
- Bereid 15 mL van het basiscultuurmedium (M199-B): Supplement M199 met 2 mM glutamine, 0,4% vetzuurvrij runderserum albumine (BSA), 0,2 mM natriumpyruvaat, 25 mM natriumbicarbonaat, 0,1 mM cysteamine, 21,3 μg/mL fenolrood, 75 μg/mL kanamycine en 4% Polyvinylpyrrolidone (PVP; 360 k moleculair gewicht).
- Bereid 3 mL van het houdmedium (M199-H): Voeg aan M199-B 5 μM cilostamide toe en giet het in een petrischaal van 35 mm.
- Bereid het L-IVCO-medium (M199-L): Supplement M199-B voor met 0,15 μg/mL Zn sulfaat, 10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosteron, 50 ng/mL progesteron en 5 μM Cilostamide.
- Plaats 200 μL M199-L medium in elke put van de 96 goed gecoate plaat. Vul de putten in de vier randen van de plaat met steriel kweekwater om verdamping te compenseren en de juiste vochtigheid tijdens de cultuur te behouden.
- Incubeer de 96 putplaat en het M199-H medium in de couveuse bij 38,5 °C en 5% CO2 in de lucht, maximale luchtvochtigheid.
- Ontledingsmedium
- Bereid het dissectiemedium (M199-D) voor: Supplement M199 met 0,4% BSA-fractie V, 0,164 mM penicilline, 0,048 mM streptomycine, 1790 eenheden/L heparine. M199-D kan in bulk worden bereid, in 20 mL aliquots worden afgegeven en gedurende 6 maanden bij 4 °C worden opgeslagen. Indien nodig, warm en aan te vullen 1 aliquot.
- Bereid 20 mL ML M199-D voor aangevuld met 5 μM cilostamide (M199-D cilostamide).
2. Eierstokverzameling en -verwerking
LET OP: Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (26 °C), tenzij anders aangegeven.
- Haal de eierstokken bij het slachthuis terug van koeien.
- Plaats de eierstokken in steriele zoutoplossing (NaCl, 9 g/L) op 26 – 28 °C toegevoegd met penicilline 100 U/mL en streptomycine 0,1 mg/mL.
- Vervoer de organen binnen 4 uur in warme steriele zoutoplossing naar het laboratorium.
- Was de eierstokken 4x in steriele zoutoplossing op 26 °C.
- Verwijder alle mid-to-large antral follikels door alle follikels met een diameter van meer dan 2 mm in diameter op te zuipen met behulp van een naald van 18 G die is aangesloten op een aspiratiepomp met vacuümdruk op -28 mmHg en plaats de aangezogen eierstokken in een beker met steriele zoutoplossing bij 26 °C.
OPMERKING: Het verwijderen van de inhoud van follikels > 2 mm is een cruciale stap om zoveel mogelijk de bron van volgroeide eicellen te verwijderen die het experiment zouden 'besmetten'. - Plaats onder een horizontale laminaire stroomkap één eierstok op dat moment op een steriele polytetrafluorethyleen snijplank. Met behulp van een chirurgisch mes nr.
- Plaats de plakjes eierstokschors in een steriel glas Petrischaal bedekt met ontleed medium op een warme plaat op 38,5 °C.
LET OP: Vanaf nu worden alle procedures uitgevoerd bij 38,5 °C met behulp van een warme plaat.
3. Selectie en isolatie van de follikels en het ophalen van de COC's
- Plaats een ovariale cortex slice in een 60 mm glazen petrischaal met 2-3 mL M199-D.
- Selecteer met behulp van een dissectiemicroscoop de follikels tussen 0,5 – 2 mm met behulp van een met micrometer uitgerust oculair.
- Identificeer de gezonde, niet-atretische follikels onder de stereomicroscoop. Beoordeel follikelatresie door morfologische parameters, zoals een zeer duidelijk doorschijnend uiterlijk, met een donker COC binnenin te observeren. Gooi de atretische follikels weg en verwerk alle anderen.
- Met behulp van een chirurgisch mes nr.
- Met behulp van een 26G naald gemonteerd op een spuit, voorzichtig een spleet in de blootgestelde follikel wand. Deze actie zal het folliculaire gehalte vrijgeven, bestaande uit het COC, folliculaire vloeistof en klonten cellen.
- Identificeer het COC onder de microscoop en onderzoek op cumulus integriteit, zona pellucida integriteit en homogeniteit van het cytoplasma. Als aan deze criteria wordt voldaan, u het COC aanzuigen met behulp van een P20-pipet.
- Plaats het geïsoleerde COC in M199-D cilostamide.
- Zet de isolatieprocedure 30 minuten voort.
4. Selectie van COC's die aan in vitrocultuur worden onderworpen
- Selecteer onder de dissectiemicroscoop gezonde COC's op basis van de criteria in stap 3.6.
- Bereid in een petrischaaltje van 60 mm 16 druppels van 20 μL M199-D cilostamide en plaats één gezond COC per druppel (figuur 1A).
- Met behulp van een omgekeerde microscoop bevestigd aan een camera meet de oocyte diameter, met uitzondering van de zona pellucida, met behulp van de software die met de camera.
- Met een duidelijke visualisatie van de eicel, maak twee loodrechte metingen met uitzondering van de zona pellucida (Figuur 1B).
- Zorg ervoor dat het gemiddelde van de meting van de twee eicellen, met uitzondering van de zona pellucida, zich binnen een bereik van 100 – 110 μm bevindt. Gooi COC's weg met niet-afgeronde gevormde eicellen of met eicellen die niet meetbaar zijn.
- Breng de geselecteerde COC's over in een schaal van 35 mm met M199-H-medium en bewaar ze in de couveuse op 38,5 °C en 5% CO2 in de lucht, maximale luchtvochtigheid tot stap 5.1.
- Herhaal stap 3 en 4 tot 4x. De totale arbeidstijd mag niet meer dan 2 uur bedragen.
5. Lange in vitro cultuur van de eicellen (L-IVCO)
- Breng één COC per put in het midden van een put van de 96 putplaat om in stap 1.1.5 voorbereid te zijn.
- De plaat 5 dagen uitbroeden bij 38,5 °C en 5% CO2 in de lucht, maximale luchtvochtigheid.
- Om de andere dag (dag 2 en dag 4) bereiden verse M199-L zoals beschreven in stap 1.
- Vernieuw de helft van het medium door 100 μL medium te verwijderen en te vervangen door 100 μL vers bereide M199-L. Voer de medium vernieuwing onder de stereomicroscoop uit en vermijd het verplaatsen van de COC's in de put.
6. COC-indeling naar cultuur
- Analyseer aan het einde van de L-IVCO de morfologie van de COC's onder de dissectiemicroscoop.
- Classificeren zoals afgebeeld in figuur 2.
- Classificeren als klasse 1 als COC's een compacte cumuluscelinvestering laten zien zonder teken van cumulusuitbreiding en celdegeneratie.
- Classificeren als klasse 2 als COC's een compacte cumuluscelinvestering vertonen zonder teken van cumulusuitbreiding en celdegeneratie en met antrumachtige vorming in de cumulusmassa.
- Classificeren als klasse 3 als COC's meerdere lagen cumuluscel tonen zonder teken van cumulusuitbreiding en enkele uitgesplitste cellen in de buitenste laag van cumuluscellen en geen antrumachtige vorming.
- Classificeren als klasse 4 als COC's een overvloedig verlies van cumuluscellen vertoont die zich uitbreiden voor meer dan 50% van het eiceloppervlak, en tekenen van celdegeneratie en celpuin.
7. Evaluatie van meiotische progressie na cultuur
- Oocyte denudatie
- Plaats elke COC in één put van een vierputige plaat met 400 μL 199D per put.
- Verwijder onder een dissectiemicroscoop de cumuluscellen voorzichtig door herhaaldelijk pipetting te gebruiken met behulp van een pipetset op 130-140 μL.
- Zodra de eicellen zijn vrij van de cumulus investering, breng ze naar een andere put met 199D.
- Herhaal het proces totdat alle eicellen volledig zijn ontdaan.
- Eicelachtige nucleaire kleuring
LET OP: Vanaf nu worden alle procedures uitgevoerd bij kamertemperatuur. Reagentia zijn op kamertemperatuur.- Bevestig de eicellen in paraformaldehyde 4% in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) voor 1 uur.
LET OP: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van paraformaldehyde en gooi verontreinigde materialen in overeenstemming met de richtlijnen voor de verwijdering van gevaarlijke afvalstoffen. - Was de eicellen 3x gedurende 5 minuten in PBS met 1% polyvinylalcohol (PVA).
LET OP: De monsters kunnen meteen worden verwerkt of maximaal een week bij 4 °C worden bewaard. - Plaats de eicellen in PBS met 0,1% Triton X gedurende 10 minuten.
- Was de eicellen 3x gedurende 5 minuten in PBS met 1% PVA.
- Plaats de eicellen enkelvoud in druppels van 5 μL antifade medium aangevuld met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) dilactaat (1 μg/mL) over een dia.
- Plaats twee stroken dubbelzijdige tape langs de lange zijden van de dia, om overmatige afvlakking van de eicellen te voorkomen bij het aanbrengen van de afdeksel op de top.
- Plaats de cover slip op de top, maak het hechten aan de tape en houd in het donker tijdens de verwerking van alle monsters.
- Analyseer de eicellen met behulp van een conventionele epifluorescentiemicroscoop uitgerust met DAPI-filters (Excitation/Emission: 358·461) om de meiotische progressie van de eicellen te beoordelen.
- Classificeer de eicellen op basis van hun meiotische progressie: GV - eicellen met verschillende graden van chromatinecondensatie binnen de GV; MI – eicellen van GV afbreken tot metafase I; en gedegenereerd – eicellen die niet konden worden geïdentificeerd als zijnde in een van de vorige stadia.
- Bevestig de eicellen in paraformaldehyde 4% in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) voor 1 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aan het einde van de L-IVCO veranderde de grove morfologie van de COC's en werden 4 klassen geïdentificeerd op basis van het uiterlijk van de cumuluscellen, zoals weergegeven in figuur 2. Op basis van de morfologische criteria die gewoonlijk werden vastgesteld om gezonde COC's11,26,27, de klasse 1, 2 en 3 te selecteren, werden de klasse 4, die duidelijke tekenen van degeneratie vertoonde, zoals het ontbreken van volledige lagen cumuluscellen rond de eicyten, beschouwd als ernstig gecompromitteerd en ongeschikt om downstream-procedures te ondergaan in een prospectieve IVP-instelling. In totaal werden 74 eicellen in 5 biologische replica's geanalyseerd, waarvan 9,45% in klasse 4 en werden weggegooid bij verdere evaluatie.
Zoals blijkt uit figuur 3 en figuur 4, bleek uit de beoordeling van de meiotische fase aan het einde van de L-IVCO dat een aanzienlijk hoger percentage van de eicellen (78,57 ± 4,43%) bleef gearresteerd in het onrijpe stadium, met chromatine nog ingesloten binnen GV (daarom, ook bedoeld als stadium GV), zonder het degenereren. Onder hen was 59.43% in een GV2/3 configuratie. Een klein percentage hervat meiosis het bereiken van de metafase I fase (13,76 ± 5,85%) of gedegenereerd (7,67 ± 4,61%). In totaal werden 67 eicellen in 5 biologische replica's geanalyseerd. Al met al geven deze gegevens aan dat de L-IVCO-cultuur de levensvatbaarheid van de eicel ondersteunt en tegelijkertijd een meiotische hervatting gedurende 5 dagen voorkomt.
Figuur 1: Overzicht van de schotel die wordt gebruikt voor het meten van de eidiameter en het representatieve beeld van een COC. (A) Schematische weergave van een petrischaal van 60 mm met 16 druppels van 20 μL M199-D, elk met één COC. (B) Representatieve afbeelding van een COC met de as die wordt gebruikt voor het meten van de diameter. Houd er rekening mee dat de zona pellucida niet is inbegrepen. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve afbeeldingen van COC's op het moment van de verzameling en na L-IVCO. (A, B, C, D) De bovenste rij (Collectie) vertegenwoordigt COC's op het moment van ophalen. A', B', C', D") Hetzelfde COC wordt 5 dagen later afgebeeld, aan het einde van L-IVCO en geclassificeerd als gerapporteerd in stap 6.1. De onderste rij (5 dagen) vertegenwoordigt COC's ingedeeld als: Klasse 1, met een compacte cumuluscelinvestering zonder teken van expansie en celdegeneratie (A'); Klasse 2, met een compacte cumuluscelinvestering zonder teken van expansie en celdegeneratie en met antrumachtige vorming (pijlen) in de cumulusmassa (B'); Klasse 3, met verschillende lagen cumuluscel zonder teken van cumulusuitbreiding en enkele uitgesplitste cellen in de buitenste laag van cumuluscellen (C'); Klasse 4, met overvloedig verlies van cumuluscellen op meer dan 50% van het eiceloppervlak en tekenen van celdegeneratie en celpuin (D'). Schaalbalk 40 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van de meiotische progressie. De bovenste rij (DNA-kleuring) toont het DNA (blauw) van representatieve eicellen op (A) de GV0-fase en (B) GV2-achtige configuratie, (C) MI stadium en (D) gedegenereerde eicellen, (A) op het moment van verzameling en (B, C, D) na 5 dagen L-IVCO. De onderste rij is de overeenkomstige afbeelding in het heldere veld van de oocyte in de bovenste rij. De pijl geeft de GV aan. Schaalbalk 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Meiotische progressie van de eicellen aan het einde van de cultuur. De staafgrafiek vertegenwoordigt de verdeling van eicellen in het GV- en MI-stadium en gedegenereerde eicellen aan het einde van de L-IVCO. De eerder in klasse 4 geclassificeerde eicellen werden uitgesloten. Gegevens werden geanalyseerd door 1-weg ANOVA gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest en waarden zijn middelen ± SEM (N=5; P<0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een cultuursysteem voor het kweken van eicellen dat de ontwikkeling van eicel bevordert gedurende 5 dagen door hun levensvatbaarheid te ondersteunen en meiotische hervatting te voorkomen. Dit laatste aspect is van het grootste belang om de verdere groei en differentiatie mogelijk te maken die nodig zijn om de eicel te voorzien van meiotische en embryonale ontwikkelingscompetentie2,20, die anders zou worden geblokkeerd door een voortijdige hervatting van de meiotische divisie.
Bij de ontwikkeling van dit cultuursysteem hebben we rekening gehouden met verschillende kenmerken van de fysiologische groei en differentiatie die optreedt in de follikel. In deze sectie geven we een overzicht van de belangrijkste aspecten die we hebben overwogen bij het ontwikkelen van deze strategie.
Ten eerste duurt het ongeveer 5 dagen voordat de teelt van eicellen in runderige antralzakjes ongeveer 5 dagen in gebruik is om de overgang van het groeiende naar het volgroeide stadium in vivo8,19teondergaan . Daarom werd de lengte van de cultuur verhoogd tot 5 dagen in tegenstelling tot eerdere pogingen in ons lab waar de eicellen werden gekweekt voor maximaal 24 uur2.
Een andere factor die we in de L-IVCO hebben opgenomen, was de verhoogde viscositeit van het medium waarin de COC's worden gekweekt om de fysiologische viscositeit van de folliculaire vloeistof na te bootsen. Dit werd nagemaakt door het toevoegen van 4% PVP en, samen met het gebruik van collageen ik gecoate cultuur oppervlak, het bevorderde de vorming van een 3D-achtige cultuur, zoals gerapporteerd door eerdere studies13.
Cilostamide, een PDE3-remmer, werd toegevoegd om eicellen meiotically gearresteerd in de GV fase te handhaven, het voorkomen van vroegrijpe meiotische hervatting door het houden van hoge niveaus van cyclische nucleotiden binnen de eicellen2,19,25,28,29. Onze resultaten geven aan dat een 5-daagse behandeling met cilostamide geen bruto-impact heeft op de gezondheid van COC's, aangezien slechts een klein deel van de complexen ontaardde, ook in overeenstemming met de resultaten verkregen door Alam et al.19.
De opname van Zn-sulfaat en de concentratie ervan wordt gestaafd door recente resultaten waaruit blijkt dat dit spoorelement een rol speelt bij het ondersteunen van de differentiatie en transcriptieactiviteit van runderteeltocyten in cultuur30.
Ten slotte werd een combinatie van hormonen geïntroduceerd om de fysiologische hormonale omgeving die kenmerkend is voor de vroege mierenfollile31,32,33nauw na te bootsen . Zo heeft estradiol activiteiten gekend bij het ondersteunen van de eicelgroei16,17,19 en de verbindingen tussen granulosacellen17, terwijl ook de verwerving van meiotische competentie34wordt bevorderd . Op dezelfde manier stimuleert testosteron, naast het feit dat het een voorloper van estradiol is, ook folliculaire groei en ontwikkeling35, terwijl progesteron voornamelijk werd toegevoegd voor zijn antiapoptotische activiteit36.
Belangrijk en in overeenstemming met onze vorige studie2, werd de concentratie van FSH gehouden in een concentratie die fysiologisch is voor de groeifase. Inderdaad, een lage FSH concentratie bevordert de ontwikkeling van eicellen door het ondersteunen van gap-junction bemiddelde communicatie tussen de eicellen en de metgezel cumulus cellen en bevordert transcriptie activiteit en eicellen differentiatie zonder inductie meiotische hervatting2.
In onze ervaring is een van de sleutels tot het succes van de L-IVCO de selectie van een homogene populatie van gezonde COC's afkomstig van vroege antralzakjes. Volgens gegevens in de literatuur, 80% van de eicellen verzameld uit vroege antral follikels worden gekenmerkt door chromatine georganiseerd in een configuratie genoemd GV020. Deze homogeniteit is een voordeel voor de in vitro cultuur, omdat het er in principe voor zorgt dat de cellen zich op dezelfde manier gedragen wanneer ze worden blootgesteld aan de cultuuromgeving. Met dit in gedachten moet de COC-verzameling worden uitgevoerd om de 'verontreiniging' met COC's uit minder of meer gevorderde stadia van differentiatie tot een minimum te beperken. Echter, vanwege het feit, dat de verwerking van de corticale plakjes is vrij tijdrovend en moet worden uitgevoerd in een relatief korte tijd, de collectie / selectie stap vertegenwoordigt waarschijnlijk de meest kritische passage van de L-IVCO. Om dat te bereiken, moeten sommige belangrijke overwegingen baard in mening zijn.
Zo moet de onderzoeker/technicus worden opgeleid om follikels te herkennen en weg te gooien met tekenen van folliculaire atresie. In dit stadium kunnen alleen morfologische parameters worden gebruikt om atretische follikels te herkennen, zoals een zeer duidelijk doorschijnend uiterlijk en de aanwezigheid van een donker COC binnenin. Alle andere follikels, waarin atretische tekens niet duidelijk te onderscheiden zijn, moeten worden geopend en verdere selectie op basis van de morfologie van de geïsoleerde COC's moet worden uitgevoerd om de gezonde2,3,37,38,39te identificeren .37 Dit wordt opnieuw bereikt door morfologische waarnemingen zoals de aanwezigheid van ten minste vier lagen cumuluscellen, schromelijk bolvormige vorm, intact oolemma en homogeen en fijn korrelig ooplasma11,26,27.
CoCs isolatie en manipulatie vormen een extra technische uitdaging, die bekwaam personeel en de juiste apparatuur voor micro-dissectie onder de stereomicroscoop en nauwkeurige bepaling van oocyte diameter vereist. Deze laatste stap is essentieel om een uniforme populatie eicellen te selecteren, waarbij elke mogelijke bron van verontreiniging met COC's uit andere folliculaire stadia wordt uitgesloten. Daarom is het belangrijk ervoor te zorgen dat de eicellen in de opgehaalde COC's een diameter hebben tussen 100 en 110 μm2,40.
Naast het ondersteunen van de levensvatbaarheid van de eicel en het voorkomen van meiotische hervatting, bevorderde de L-IVCO de overgang van de chromatineconfiguratie van GV0 naar de geleidelijk meer gecondenseerde GV2 en GV3 in 59% van de eicellen. Met name chromatinecondensatie binnen de GV is een merker van 'winst' van meiotische en ontwikkelingscompetentie in in principe alle zoogdierocyten die tot nu toe zijn bestudeerd20. Dit resultaat is veelbelovend, vooral in vergelijking met ons vorige 24 uur IVCO-systeem. In die studie werd de hoogste graad van chromatineverdichting binnen de GV niet bereikt en werd 22% van de eicellen gevonden met een GV1-configuratie2, een fase die verband houdt met volledige meiotische competentie, maar nog steeds schaarse ontwikkelingscompetentie20. Zelfs in die omstandigheden waren de anders incompetente groeiende eicellen in staat om te rijpen en embryo's te produceren, zij het in beperkte mate. De consistente toename van GV2/3-stadia die in de L-IVCO worden waargenomen, is derhalve verenigbaar met een hoger potentieel om levensvatbare embryo's te produceren. We zijn bezig deze hypothese experimenteel te testen door COC's die zijn afgeleid van L-IVCO in te dienen bij de volgende stappen van IVP (in vitro rijping, bevruchting en embryocultuur tot aan het blastocyststadium). Indien bevestigd, zal de L-IVCO ontketenen een deel van de nog onbenut potentieel van de eierstokreserve, met belangrijke gevolgen voor verschillende gebieden van belang voor de vrouwelijke vruchtbaarheid behoud. Bijvoorbeeld, het zal de bron van bevruchtbare gameten te gebruiken in het behoud programma's van hoge genetische verdienste fokkers te verhogen. Een andere toepassing die we voorzien is voor de genetische berging van bedreigde soorten van de bovid familie en van lokale rassen die in gevaar zijn of het risico lopen op genetische erosie als gevolg van de wijdverbreide verspreiding van kosmologie rassen. Last but not least, L-IVCO vertegenwoordigt een instrument voor alle wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het ontleden van de cellulaire en moleculaire processen die de vorming van een bevoegde gamete reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 en UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J.
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
