Summary
Fornecemos um protocolo para gerar um modelo de rato de dytonia DYT/PARK-ATP1A3 farmacológico através da implantação de cânulas em gânglios basais e cerebelo ligados a bombas osmóticas. Descrevemos a indução de movimentos semelhantes à distonia através da aplicação de um desafio motor e a caracterização do fenótipo através de sistemas de pontuação comportamental.
Abstract
Modelos de camundongos geneticamente modificados enfrentam limitações, especialmente quando estudam distúrbios de movimento, onde a maioria dos modelos de roedores transgênicos disponíveis não apresentam um fenótipo motor que se assemelha aos aspectos clínicos da doença humana. Modelos de camundongos farmacológicos permitem um estudo mais direto dos mecanismos e seus efeitos sobre o fenótipo comportamental. Bombas osmóticas conectadas às cânulas cerebrais abrem a possibilidade de criar modelos farmacológicos de camundongos através da entrega local e crônica de medicamentos. Para a desordem de movimento hereditário de distonia-parkinsonismo de início rápido, a mutação de perda de função na subunidade α3 do Na+/K+-ATPase pode ser simulada por um bloqueio altamente específico através do ouabain glicoside. A fim de bloquear localmente a subunidade α3 no gânglio basal e no cerebelo, que são as duas estruturas cerebrais que se acredita estarem fortemente envolvidas na patogênese do de início rápido de distonia-parkinsonismo, uma cânula bilateral é estereotaxicamente implantada no estriado e uma cânula única adicional é introduzida no cerebelo. As cânulas são conectadas via tubo de vinil a duas bombas osmóticas, que são subcutâneas implantadas na parte de trás dos animais e permitem a entrega crônica e precisa de ouabain. O modelo de camundongo farmacológico para distonia-parkinsonismo de início rápido carrega a vantagem adicional de recapitular as características clínicas e patológicas dos portadores de mutação assintomática e sintomática. Assim como os portadores de mutação de parkinsonismo de distonia de início rápido, os camundongos com ouabaina-perfusados desenvolvem movimentos semelhantes à distonia somente após exposição adicional ao estresse. Demonstramos um leve paradigma de estresse e introduzimos dois sistemas de pontuação modificados para a avaliação de um fenótipo motor.
Introduction
As vantagens de uma entrega contínua de drogas diretamente no cérebro são numerosas. Injeções repetitivas e frequentes, que representam um fator de estresse desnecessário para os animais, podem ser evitadas e uma concentração intracerebral mais constante da droga pode ser alcançada. Isso é especialmente válido quando drogas administradas sistematicamente não penetram facilmente na barreira cerebral do sangue. Além disso, a entrega crônica de medicamentos através de bombas osmóticas permite a entrega localizada de substratos que, de outra forma, teriam efeitos colaterais em todo o sistema. As drogas podem ser entregues de forma direcionada às estruturas cerebrais desejadas, o efeito resultante pode, portanto, ser diretamente rastreado. Isso pode ser utilizado para uma série de aplicações, como o estudo de efeitos terapêuticos, bem como o estudo de mecanismos de pathomecanismos. Esta última aplicação foi usada no projeto aqui para criar um modelo de mouse farmacológico para distonia.
A análise e compreensão das síndromes tásticas, que representam o terceiro transtorno de movimento mais comum, têm sido fortemente limitadas pelo fato de que os modelos genéticos de animais em grande parte não conseguem reproduzir o fenótipo da doença encontrado no ser humano doente, bem como na fisiopatologia. Esta questão não se limita às síndromes tásticas, mas na verdade diz respeito a muitos modelos de roedores transgênicos no campo dos distúrbios do movimento1,,2. A razão para a falta de um fenótipo em modelos de roedores transgênicos pode ser baseada em mecanismos compensatórios altamente eficazes3. No caso da distonia, a doença é caracterizada por contrações musculares involuntárias que causam movimentos torcidos e posturas anormais4. O estudo de causas secundárias (ou seja, lesão cerebral) de sintomas disstônicos, tem ajudado a identificar as estruturas envolvidas na manifestação dessas anormalidades motoras, como a gânglio basal5. Estudos de imagem cerebral de formas hereditárias de distonia mostraram anormalidades funcionais em quase todas as regiões cerebrais responsáveis pelo controle motor e integração sensorial6,,7. No entanto, modelos de roedores ainda são necessários para aprofundar a compreensão das disfunções neurais em um nível de rede molecular e em grande escala, bem como para o desenvolvimento de opções terapêuticas. É aí que modelos de camundongos farmacológicos oferecem a possibilidade de replicar as características clínicas e patológicas de uma doença de forma mais precisa.
Distonia-parkinsonismo de início rápido (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) é uma das formas hereditárias de distonia. É causada por mutações de perda de função no gene ATP1α3, que codifica para a subunidade α3 do Na+/K+-ATPase8. Além disso, reconhece-se que os portadores de mutação genética podem estar livres de sintomas por anos antes de desenvolver em agudamente a persistente distonia generalizada e parkinsonismo após a exposição a um evento estressante. De fato, a penetração do DYT/PARK-ATP1A3 é incompleta e eventos estressantes agindo como um gatilho que vão desde o excesso físico e temperaturas extremas até o consumo excessivo de álcool e infecções9,,10. A fim de estudar DYT/PARK-ATP1A3 e encontrar possíveis intervenções terapêuticas, tem sido tentado inúmeras vezes imitar o desenvolvimento de doenças dependentes do estresse em modelos de roedores. No entanto, além do modelo genético existente dyt/PARK-ATP1A3, onde movimentos anormais transitórios e semelhantes a convulsões foram induzidos por hipotermia, todos os modelos de camundongos genéticos publicados para DYT/PARK-ATP1A3 falharam em produzir sintomas tísônicos1,,11,,12. Calderon et al. demonstraram anteriormente que bloquear a α3-subunidade bilateralmente na gânglio basal e no cerebelo através do glicoside ouabain cardíaco em camundongos do tipo selvagem resulta em leve perturbação da marcha13. A exposição adicional a choques elétricos nos pés em um ambiente quente levou a um fenótipo tástico e bradykinético, demonstrando assim que a perfusão crônica e direcionada de ouabain seguida pelo estresse imita com sucesso o fenótipo DYT/PARK-ATP1A3.
No entanto, expor animais a choques elétricos nos pés em um ambiente quente de 38-40 °C durante um período de duas horas induz dor e ansiedade nos animais, o que representa fatores confusos, especialmente para a avaliação de mudanças no sistema de catecolamina relacionadas ao desenvolvimento da distonia. Assim, descrevemos aqui um tipo diferente de paradigma de estresse com alto valor translacional, que se relaciona com o fato de que o exercício leve a moderado tem sido descrito como gatilhos em pacientes DYT/PARK-ATP1A39. Além disso, o exercício repetitivo é um gatilho bem conhecido para a distonia focal14. Os ratos foram repetidamente submetidos a tarefas motoras desafiadoras compostas por três descendentes de um poste de madeira ("teste de polo") e três corridas em um aparelho Rotarod ("Teste de desempenho Rotarod"). A colocação de animais no topo de um poste de madeira de 50 cm foi usada para coagir os animais a descer, o aparelho Rotarod foi empregado para submeter camundongos à atividade forçada, colocando-os em uma vara giratória.
A caracterização do fenótipo motor de um modelo de rato para distonia é particularmente desafiadora devido à falta de testes e pontuações predefinidos. No entanto, uma variação de uma avaliação de incapacidade motora tem sido repetidamente utilizada ao longo dos últimos anos para avaliar a gravidade e a distribuição de movimentos semelhantes à distonia em roedores13,,15,16. Nós apresentamos aqui uma versão modificada da escala de classificação da distonia, que se mostrou eficaz na avaliação do fenótipo de animais semelhante à distonia quando observado durante um período de tempo de quatro minutos. Como um segundo método de avaliação de movimentos semelhantes à distonia, apresentamos um sistema de pontuação recém-desenvolvido para a avaliação de movimentos anormais durante um teste de suspensão de cauda. Permite a avaliação da frequência e duração dos movimentos e posturas semelhantes à distonia dos membros dianteiros, desaguarda, bem como do tronco.
Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais, nacionais e/ou institucionais aplicáveis para o cuidado e uso dos animais. As autoridades locais do Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha, aprovaram todos os experimentos com animais.
1. Priming de bombas osmóticas
NOTA: Esta etapa deve ser realizada pelo menos 48h antes da cirurgia. As bombas osmóticas ALZET precisam ser pré-preenchidas para garantir que a taxa de bombeamento atinja um estado estável antes da implantação.
- Prepare a solução desejada para perfusão crônica de antemão. Certifique-se de que o solvente e o agente são compatíveis com as bombas e cateteres osmóticos. Para o projeto aqui, descongele uma solução de estoque de 10x de ouabain (armazenado a -20 °C) à temperatura ambiente e vórtice para 10 s.
ATENÇÃO: A eabaina é tóxica: deve ser manuseada apenas com luvas e aberta apenas sob um capô estéril para evitar a inalação. - Ligue o capô estéril; desinfetar o capô, bem como todos os instrumentos e materiais necessários antes de colocá-los sob o capô.
- Coloque luvas cirúrgicas antes de manusear as bombas osmóticas. Prepare separadamente a solução de ouabain designada para as bombas do estriado e do cerebelo.
NOTA: Considere que a concentração da solução na bomba para o estriado deve ser dobrada em comparação com a concentração da solução na bomba designada para o cerebelo. Isso se deve ao fato de que a bomba para o estriado está conectada a uma cânula dupla, a taxa de fluxo, no entanto, é a mesma da bomba do cerebelo, que está conectada a uma única cânula. - Calcule a quantidade de solução necessária usando a seguinte fórmula:
taxa de entrega em massa (ko) = taxa de entrega de volume (Q) x concentração do agente no veículo (Cd)
Para o presente projeto, as bombas osmóticas foram preparadas e preenchidas com solução ouabain a uma concentração de 11,2 ng/h ou 0,9% salina para o grupo controle. - Vortex ambas as soluções de ouabain para 10 s e filtro estéril (ou seja, filtro de ponta de seringa de 0,22 μm) em tubos separados e novos microcentrifuus, usando um filtro diferente para cada solução.
- Pesar as bombas osmóticas vazias junto com o moderador de fluxo (cerca de 0,4 g).
- Encha uma seringa de 1 mL com uma cânula de enchimento de 27 G (de preferência com uma ponta cega) com solução de ouabain filtrada estéril ou solução de veículo.
- Tire todas as bolhas de ar da seringa, segure a bomba osmótica em uma posição vertical, insira a cânula até a bomba e encha lentamente o reservatório até que o excesso de solução apareça por cima (evite o enchimento rápido, pois isso pode levar a bolhas de ar na bomba). Em seguida, insira o moderador de fluxo na bomba (a solução em excesso deve aparecer na parte superior).
- Puxe o moderador de fluxo para fora (cerca de 5 mm), retire cuidadosamente a flange branca com uma tesoura e conecte um pedaço de tubo de vinil ao moderador de fluxo. Certifique-se de que o cateter tenha um comprimento de aproximadamente 2 cm para permitir a mobilidade adequada do animal.
- Pesar a bomba osmótica preenchida mais uma vez para garantir que a diferença de peso entre a bomba preenchida e vazia seja concordância com o peso esperado da solução carregada.
NOTA: Para a maioria das soluções aquosas este peso é igual ao volume em microliters. Se o peso não corresponder ao volume esperado, o ar pode ficar preso dentro da bomba, que precisa ser esvaziada e reabastecida. - Para a escorraça das bombas, prepare dois tubos de microcentrifuuge de 2 mL, um tubo para o estriado e outro para o cerebelo.
- Submergir as bombas nos tubos de microcentrifuuge preenchidos na metade com solução salina de 0,9%. Não submergir a extremidade aberta do cateter. Coloque os tubos de microcentrifutura em um termociclador por 48 h a 37 °C, a fim de garantir que a bomba tenha atingido uma taxa de bombeamento constante antes da implantação e os cateteres sejam pré-preenchidos.
2. Implantação da bomba de cânula e osmótica
- Coloque o rato (masculino, C57Bl/6N, 11-12 semanas de idade) em uma câmara projetada para anestesia de inalação; definir a taxa de fluxo de isoflurane para 2-3% e a taxa de fluxo de oxigênio para 2 L/min.
- Depois que o camundongo é profundamente anestesiado de acordo com os protocolos aprovados, raspe a parte superior da cabeça do animal, pescoço dorsal e terço proximal das costas.
- Coloque o animal em uma estrutura estereotática e continue a anestesia com isoflurane através de uma máscara de anestesia do rato projetada para o instrumento estereotático (taxa de fluxo isoflurane 1,5-2%, 2 L/min de oxigênio).
- Usando pontas de borracha ou barras de ouvido não rompidas, fixe a cabeça do animal no quadro estereotático, tomando cuidado para que a cabeça esteja nivelada.
- Para evitar hipotermia, coloque uma almofada de aquecimento sob o animal, insira uma sonda de temperatura reta e afina a temperatura para 37 °C. Proteja os olhos do animal de secar usando uma gota de pomada oftálmica em cada olho.
- Aplique um analgésico, como Carprofen (peso corporal de 5 mg/kg), subcutâneamente antes de iniciar a cirurgia.
- Com uma seringa subcutânea injetar até 0,2 mL de bupivacaína 0,25% e esperar 30 s para que a anestesia local entre em vigor.
- Desinfete as áreas raspadas completamente com um antisséptico, como dihidrocloreto de dihidrocloreto de octenidina.
- Após a desinfecção completa da área cirúrgica, use um bisturi para colocar uma incisão na parte superior da cabeça e use uma tesoura para continuar a incisão até os membros da frente. Exponha o crânio com a ajuda de grampos de buldogue e limpe o periósteo com um aplicador de ponta de algodão estéril.
- Alinhe uma caneta ou a ponta de uma cânula manchada em tinta preta com bregma e use as coordenadas apropriadas para marcar os três pontos de entrada para as cânulas cerebrais no crânio (coordenadas para os orifícios bilaterais necessários para a perfusão da gânglio basal: anterior/posterior: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1,50 mm (+ indicando o lado direito, - o lado esquerdo em relação ao bregma); coordenadas para o orifício na linha média do cerebelo: anterior/posterior: - 6,90 mm). Em seguida, faça cuidadosamente os furos para a cânula dupla designada para o gânglio basal e a cânula única designada para o cerebelo(Figura 1A).
- Faça um quarto furo para um pequeno parafuso entre o estriado e o cerebelo. Este parafuso será eventualmente incorporado em cimento dental e fornecerá um porão adicional para as cânulas. Usando fórceps finos e uma chave de fenda, introduza cuidadosamente o parafuso no pequeno orifício até que esteja firmemente fixado no crânio. Não implante o parafuso muito profundamente, pois isso danifica o tecido cerebral.
NOTA: Recomenda-se continuar com a implantação da bomba osmótica antes de inserir as cânulas osmóticas. Isso evita causar qualquer dano acidental às cânulas ao implantar as bombas. - Para criar um pequeno bolso para a bomba osmótica de cada lado dos animais para trás, use fórceps teciduais para separar as camadas de tecido subcutânea. Avance os fórceps em direção a uma perna traseira e abra ligeiramente os fórceps, a fim de ampliar o bolso subcutâneo. Repita o mesmo procedimento para o outro lado, primeiro removendo os fórceps da incisão e, em seguida, empurrando-os suavemente em direção à segunda perna traseira.
NOTA: O bolso deve permitir que a bomba deslize facilmente, no entanto, não deve ter muito espaço para se mover sob a pele. - Com a ajuda de fórceps de tecido, pegue a primeira bomba junto com o pedaço conectado de tubulação e deslize-a em um bolso subcutâneo. Repita o mesmo procedimento com a segunda bomba.
- Usando um suporte de minibomba, introduza uma única cânula osmótica com um comprimento personalizado de 3,0 mm no orifício perfurado na linha média do cerebelo. Retire a cabeça da cânula cuidadosamente e conserte a cânula, bem como o pequeno parafuso com cimento dental, tomando cuidado para não cobrir a peça de conexão para o tubo da bomba osmótica. Certifique-se de que o cimento dental ao redor da cânula secou completamente antes de continuar com a cirurgia.
- Antes de inserir uma cânula dupla com uma distância centro-centro de 3,0 mm e comprimento personalizado de 4,0 mm nos orifícios bilateralmente perfurados acima da gânglio basal, conecte duas peças curtas de tubo de vinil (0,5 cm) às duas peças de conexão da cânula dupla. Conecte os tubos de vinil com um adaptador de bifurcação e preenchi cuidadosamente todo o sistema de tubulação, incluindo o adaptador e a cânula com solução ouabain ou veículo (temperatura ambiente, filtrado estéril de antemão). Isso pode ser feito melhor com uma seringa de 1 mL e uma cânula de enchimento de 27 G introduzida na extremidade traseira única do adaptador de bifurcação(Figura 1B).
- Usando um suporte de minibomba, insira cuidadosamente a cânula dupla nos orifícios bilaterais. Use um grampo para desprender a cabeça da cânula e fixar a cânula dupla com cimento dental.
- Conecte os cateteres das bombas osmóticas ao adaptador de bifurcação, bem como à cânula única, respectivamente. Certifique-se de que os cateteres tenham um forte domínio sobre as peças de conexão das cânulas.
NOTA: Ambas as bombas têm uma taxa de fluxo igual, por isso tenha cuidado para conectar a bomba osmótica com a solução dupla concentrada ao adaptador de bifurcação para garantir que a mesma concentração atinja tanto o gânglio basal quanto o cerebelo. - Feche a incisão na parte de trás dos animais com pontos o mais longe possível na direção do crânio, tomando cuidado para não esticar demais a pele(Figura 1C).
- Injete subcutâneamente 0,5 mL de soro fisiológico de 0,9%, que deve ter temperatura corporal, em uma dobra de pele em cada lado da parte de trás dos animais, a fim de evitar a desidratação dos camundongos, evitando cuidadosamente as bombas.
3. Desafio motor
- Sujeito a camundongos ou perfumados de veículos para tarefas motoras desafiadoras como uma forma de exposição ao estresse leve 4h após a cirurgia e repetidamente a cada 24 horas depois, a fim de induzir movimentos semelhantes à distonia. Isso não inclui uma caracterização comportamental; seu objetivo é induzir um nível de estresse mais alto em comparação com a manutenção normal da gaiola.
- Coloque o mouse sobre um poste de madeira de 50 cm de superfície áspera com um diâmetro de 1 cm, nariz voltado para baixo. Certifique-se de que o poste é colocado em uma gaiola grande com roupa de cama suficiente em caso de quedas. Não é necessário medir o tempo de descida, mas procurar hiperextensões involuntárias de membros frontais e patas traseiras apresentadas por animais com ouabaina durante a descida do polo. Deixe os ratos descerem o polo três vezes e permitir 2 minutos de recuperação entre os descendentes.
NOTA: Os camundongos com perfusão de ouabain devem apresentar os primeiros sintomas como a bradiquinia 4h após a cirurgia. No entanto, 24 horas após a cirurgia os camundongos devem começar a apresentar hiperextensões involuntárias de membros frontais e preços traseiros como sinal de movimentos semelhantes à distonia durante a descida. - Para a segunda tarefa do motor, coloque os ratos na haste rotativa como feito para o teste de desempenho Rotarod. O aparelho Rotarod não é usado como medida da latência para cair, o objetivo é submeter os camundongos à atividade forçada. Coloque os ratos na haste giratória três vezes e permita 2 minutos de recuperação entre os testes.
NOTA: Para aumentar a exposição ao estresse, use um aparelho Rotarod acelerado. Para o projeto aqui descrito, a haste acelera de 5 a 50 rpm durante um período de tempo definido de 300 segundos. - Deixe os animais se recuperarem por 30 minutos entre o teste do polo e o teste de desempenho rotarod e novamente mais 30 minutos antes de marcar para movimentos semelhantes à distonia, conforme descrito no protocolo passo 4. Entre as exposições de estresse repetitivo, permitem que os camundongos se recuperem por intervalos de 24 horas.
4. Sistemas de pontuação para a avaliação de movimentos semelhantes à distonia
NOTA: O experimentador deve ficar cego à atribuição do grupo analisada para evitar viés. Os testes comportamentais utilizados para caracterizar o fenótipo dos camundongos são dois sistemas de pontuação: uma escala de classificação de distonia marcando movimentos anormais, movimentos semelhantes à distonia e uma pontuação comportamental usando o teste de suspensão da cauda. Avalie os movimentos semelhantes à distonia após um tempo de recuperação de 30 minutos após a exposição ao estresse leve.
- Escala de classificação da Distonia
NOTA: Devido à falta de tarefas comportamentais predefinidas, a escala de classificação da distonia foi estabelecida como um sistema de pontuação baseado em observadores semelhante às escalas de classificação clínica da distonia humana. É uma versão modificada da escala de classificação da distonia usada por Calderon et al.13.- Regissão recorde e marcha de animais durante um período de 4 minutos após os animais terem sido colocados em uma caixa de plástico ou madeira.
- Pontuação para frequência e distribuição de movimentos semelhantes à distonia de 0 a 4 pontos: (0) comportamento motor normal; (1) comportamento motor anormal, sem movimentos semelhantes à distonia; (2) prejuízo motor leve com movimentos leves semelhantes à distonia focal; (3) comprometimento motor moderado com movimentos graves semelhantes à distonia focal; (4) comprometimento severo, com movimentos sustentados e generalizados semelhantes à distonia(Figura 2). Considere os seguintes movimentos ou posturas como distonia: hiperextensão de membros dianteiros, postura larga ou hiperextensão de hindlimbs, bem como cifose. Considere a distonia como focal no caso de uma única parte do corpo ser afetada e generalizada no caso do tronco e pelo menos duas outras partes do corpo forem afetadas.
- Teste de suspensão de cauda
NOTA: O teste de suspensão da cauda é frequentemente usado para observar e pontuar para aperto de cetado traseiro. Este é, no entanto, um fenótipo altamente inespecífico que indica um prejuízo motor. O protocolo a seguir propõe um sistema de pontuação específico para movimentos semelhantes à distonia. Devido à generalização da distonia em pacientes DYT/PARK-ATP1A3, os movimentos semelhantes à distonia devem ser avaliados em membros da frente, tronco e patas traseiras. Foi desenvolvido um sistema de pontuação recém-desenvolvido de 0-8 pontos, uma pontuação total < 2 indicou que não havia movimentos semelhantes à distonia(Figura 3).- Pegue o rato pela cauda perto de sua base e levante o animal. Grave um vídeo de 2 minutos do teste de suspensão da cauda e atribua uma pontuação em uma análise subsequente e completa da gravação.
- Marcar os membros dianteiros de 0 a 4 pontos, onde retrações tônicas repetidas ou sustentadas de um ou ambos os membros dianteiros, bem como uma hiperextensão combinada com o cruzamento dos membros da frente, foram classificadas como distonia-like: (0) sem movimentos anormais; (1) redução do movimento dos membros dianteiros com hiperextensão das patas observadas ≥ 50% do tempo registrado; (2) movimentos leves semelhantes à distonia dos membros dianteiros < 50% do tempo registrado; (3) movimentos leves semelhantes à distonia dos membros dianteiros ≥ 50% do tempo registrado ou severo < 50% do tempo registrado; (4) movimentos severos semelhantes à distonia dos membros dianteiros ≥ 50% do tempo registrado.
NOTA: O aperto de cílima hind é um movimento anormal que não deve ser marcado como distonia. - Marcar os retalhos traseiros de 0 a 3 pontos, onde a retração e o aperto dos membros traseiros, bem como a hiperextensão sustentada foram avaliados como distonia- like: (0) sem movimentos anormais; (1) redução do movimento de preços traseiros com hiperextensão de patas vistas ≥ 50% do tempo registrado; (2) movimentos semelhantes à distonia de um retrocesso; (3) movimentos semelhantes à distonia de ambos os obstáculos.
- Em caso de distorção truncal > 80% do tempo registrado, um ponto adicional é adicionado à pontuação.
- Coloque o animal de volta em sua gaiola.
Representative Results
A Figura 4 foi modificada de Rauschenberger et al.17. Para análise de dados tanto da escala de classificação da distonia (A) quanto do teste de suspensão da cauda(B),calcule a pontuação total de cada ponto de tempo para cada animal. A média de cada ponto de tempo e cada grupo deve ser plotado em um gráfico apropriado. A distribuição dos valores deve ser investigada e o teste estatístico adequado deve ser aplicado para determinar a significância. Com um número suficiente de animais, um fenótipo motor pode ser detectado tanto com a escala de classificação da distonia quanto com a avaliação de movimentos anormais no teste de suspensão da cauda. O fenótipo semelhante à distonia é demonstrado pelo escore motor significativamente maior em ambas as avaliações no grupo de ouabain-perfused, estressado em comparação com os camundongos não estressados e não estressados, bem como os ratos de controle.
Figura 1: Os principais passos cirúrgicos para implantação da bomba canânula e osmótica. (A) Para as coordenadas indicadas, os orifícios precisam ser perfurados bilateralmente para a cânula dupla designada para o gânglio basal e para a cânula única colocada na linha média do cerebelo. As duas bombas osmóticas totalmente construídas são mostradas em cada lado do animal. (B) A imagem mostra uma cânula única implantada no cerebelo, fixada com cimento dental. A cânula dupla para o gânglio basal deve ser conectada ao adaptador de bifurcação e pré-preenchida com ouabain antes da implantação. (C) Imagem do procedimento final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação de movimentos semelhantes à distonia com uma escala de classificação de distonia. Durante um vídeo de 4 minutos, movimentos semelhantes à distonia foram pontuados com base na distribuição e duração do corpo. A hiperextensão involuntária dos membros da frente, uma postura ampla ou hiperextensão de hindlimbs, bem como a cifose foram classificadas como distonia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação dos movimentos semelhantes à distonia durante um teste de suspensão da cauda. O sistema de pontuação recém-desenvolvido para movimentos anormais durante um teste de suspensão de cauda de 2 min avalia movimentos semelhantes à distonia nos membros da frente, flexs traseiros e tronco de 0-8 pontos no total. Para os membros dianteiros, uma hiperextensão e cruzamento dos membros dianteiros, bem como uma flexão tônica em direção ao tronco qualificada como distonia. Para os obstáculos, a hiperextensão involuntária, bem como a retração com extensão sobre a linha média foi pontuada como distonia. Uma distorção truncal acima de 80% do tempo registrado foi marcada com um ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gráficos representativos da escala de classificação da distonia e do teste de suspensão da cauda. (A) O gráfico retrata a escala de classificação de distonia para ratos estressados e perfusados de NaCl (linha preta pontilhada), camundongos não estressados e não estressados (linha laranja pontilhada) e camundongos estressados com ouabain (linha azul escura). Para cada ponto de tempo, são mostrados os valores médios ± erro padrão da média (SEM). (B) O diagrama mostra a avaliação dos movimentos anormais durante um teste de suspensão de cauda de 2 minutos para camundongos com perfusão de NaCl (linha preta pontilhada), camundongos com perfusão de ouabain (linha laranja pontilhada) e camundongos com perfusão de ouabain (linha azul escura). A análise estatística foi feita para a escala de classificação da distonia e a pontuação do teste de suspensão de cauda usando o teste mann-whitney de duas caudas. A correção de Bonferroni-Holm (§) dos valores p mostrou diferença significativa para o período observacional de 72 h. Azul escuro * denote diferenças significativas entre camundongos perfusados, estressados e camundongos com perfusão de ouabain, camundongos não estressados, pretos * denotam diferenças significativas entre nacl-perfused, camundongos estressados e camundongos com ouabain perfused, bem como entre nacl-perfused, ratos estressados e camundongos ouabain-perfused, não estressados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este modelo de camundongos farmacológicos DYT/PARK-ATP1A3 permite a análise detalhada das alterações estruturais e neuroquímicas intracerebrals induzidas unicamente pela inibição da bomba de íons de sódio-potássio na gânglio basal e cerebelo, bem como alterações relacionadas à exposição ao estresse. No caso de camundongos, um máximo de duas bombas osmóticas pode ser subcutâneamente implantado. Nós apresentamos aqui um método detalhando a entrega de drogas crônicas a múltiplas estruturas cerebrais, implementando uma cânula dupla conectada a um adaptador de bifurcação, além de uma única cânula. Essa metodologia pode ser usada para qualquer aplicação que exija que múltiplas estruturas cerebrais sejam perfundidas simultaneamente e cronicamente.
Apresentamos um modelo de camundongo de uma doença de movimento raro, onde os pacientes desenvolvem sintomas permanentes após a exposição ao estresse. Essa suposta interação gene-ambiental ainda não é bem compreendida, mas pode representar um dos principais mecanismos no desenvolvimento dyt/PARK-ATP1A3. Diferentes métodos de expor camundongos ao estresse foram publicados no passado e incluem choques elétricos nos pés, contenção, ambiente frio ou quente e exposição a vários odores11,,12,13. Em um esforço para expor os ratos a um leve fator de estresse com valor translacional, descrevemos aqui a sujeição repetitiva de ratos a tarefas motoras desafiadoras. Para o teste do polo, os animais com perfusão de ouabain revelaram hiperextensão involuntária de membros dianteiros e colírios traseiros. Esses movimentos foram muito semelhantes aos movimentos semelhantes à distonia observados durante a gravação de vídeo de 4 minutos dos animais, bem como o teste de suspensão da cauda. A aplicação de estresse leve na forma de tarefas motoras desafiadoras pode ser útil em outros modelos de camundongos que mostram sintomas motores ou neurodegeneração, onde interações gene-ambientais influenciam maciçamente o grau de progressão da doença.
Há uma falta geral de tarefas comportamentais predefinidas, bem como escalas de classificação para classificar movimentos e posturas anormais em camundongos. A maioria das tarefas motoras disponíveis revelam anormalidades inespecíficas, como o aperto de barras, que é um fenômeno bem conhecido em muitos modelos de camundongos de distúrbios de movimento com neurodegeneração18,19. Para a caracterização adequada de um fenótipo, no entanto, é necessário analisar se o modelo do camundongo recapitula as características marcantes da doença. Aqui, apresentamos a versão modificada de uma escala de classificação de distonia usada anteriormente para a avaliação da deficiência motora nos modelos de camundongos de distonia15,16. Também desenvolvemos um sistema de pontuação baseado em observadores para o teste de suspensão da cauda, que foi estabelecido de forma semelhante às escalas de classificação clínica da distonia humana. Ambas as escalas de classificação mostram uma pontuação significativamente maior em camundongos com perfusão de ouabain, estressados em comparação com animais não estressados e não estressados, bem como animais com perfusão de veículos. As desvantagens de qualquer sistema de pontuação baseado em observadores são o treinamento necessário dos avaliadores para garantir uma pontuação consistente e reduzir a variabilidade dos observadores, bem como o perigo de um possível viés do rater se não totalmente cego para o grupo analisado. No entanto, os sistemas de pontuação baseados em observadores ainda apresentam um método de fácil acesso para caracterizar um fenótipo e podem ser adaptados ao modelo do mouse analisado, como feito no presente projeto para a avaliação de movimentos semelhantes à distonia. Para garantir uma pontuação consistente entre diferentes avaliadores, os vídeos de treinamento devem ser disponibilizados. Para reduzir qualquer viés potencial, recomenda-se que diferentes avaliadores marquem os mesmos clipes de vídeo e que as pontuações individuais sejam médias. Ambos os sistemas de pontuação mencionados neste trabalho registram a presença de movimentos semelhantes à distonia em animais. As escalas de classificação podem ser adaptadas de acordo com os requisitos específicos dentro de um projeto, como feito anteriormente por Ip et al., onde apenas os barras traseiras foram pontuados para movimentos semelhantes à distonia em um modelo de mouse para distonia 1 (DYT-TOR1A)20. As escalas de classificação podem ser complementadas por outros sistemas de pontuação publicados anteriormente, avaliando, por exemplo, o grau de bradiquinia em roedores como feito com o escore de incapacidade de locomoção por Calderon et al.13.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa (BMBF DysTract to C.W.I.) e pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade de Würzburg (Z2-CSP3 a L.R.). Os autores agradecem Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger e Heike Menzel e por sua assistência técnica, bem como Helga Brünner pelo cuidado com os animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
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