Summary
Мы предоставляем протокол для создания фармакологических DYT/PARK-ATP1A3 дистония мыши модели через имплантацию канюли в базальных ганглиев и мозжечка подключены к осмотических насосов. Мы описываем индукцию дистонии, как движения с помощью применения двигательного вызова и характеристики фенотипа с помощью поведенческих систем скоринга.
Abstract
Генетически модифицированные модели мышей сталкиваются с ограничениями, особенно при изучении двигательных расстройств, где большинство доступных трансгенных моделей грызунов не представляют моторный фенотип, напоминающий клинические аспекты болезни человека. Фармакологические модели мышей позволяют более непосредственно изучать патомеханизмы и их влияние на поведенческий фенотип. Осмотические насосы, подключенные к канюли мозга, открывают возможность создания фармакологических моделей мышей с помощью местных и хронических лекарств. Для наследственного расстройства движения быстрого начала дистонии-паркинсонизма, потеря функции мутации в No 3-субъединицыNaq/K-ATPase может быть смоделирована весьма специфической блокады через гликозид уабаин. Для того, чтобы локально блокировать No 3-субъединит в базальных ганглиев и мозжечка, которые являются двумя структурами мозга, как полагают, активно участвует в патогенеза быстрого начала дистонии-паркинсонизма, двусторонняя канюля стереотаксис имплантируется в стриатум и дополнительные одной канюли вводится в мозжечок. Каннулы соединены через виниловые трубки с двумя осмотическими насосами, которые подкожно имплантируются на спину животных и позволяют хронические и точные поставки уабаина. Фармакологическая модель мыши для быстрого начала дистонии-паркинсонизма несет в себе дополнительное преимущество повторения клинических и патологических особенностей азимптоматических и симптоматических носителей мутаций. Так же, как носители мутации быстрого начала дистонии паркинсонизма, уабаин проникнуты мышей развивать дистония, как движения только после дополнительного воздействия стресса. Мы демонстрируем мягкую парадигму стресса и внедряем две модифицированные системы скоринга для оценки фенотипа двигателя.
Introduction
Преимущества непрерывной доставки препарата непосредственно в мозг многочисленны. Повторяющиеся и частые инъекции, которые представляют собой ненужный фактор стресса для животных, можно избежать и более постоянная внутримозговая концентрация препарата может быть достигнута. Это особенно актуально, когда системно вводимые препараты не могут легко проникнуть в геммоугефалический барьер. Кроме того, хроническая доставка лекарств с помощью осмотических насосов позволяет локализовать доставку субстратов, которые в противном случае были бы системно-широкими побочными эффектами. Препараты могут быть доставлены в целенаправленной образом желаемых структур мозга, в результате эффект может быть непосредственно прослеживается. Это может быть использовано для целого ряда приложений, таких как изучение терапевтических эффектов, а также изучение патомеханизмов. Последнее приложение было использовано в проекте в настоящем для того, чтобы создать фармакологическую модель мыши для дистонии.
Анализ и понимание дистонических синдромов, которые представляют собой третье наиболее распространенное расстройство движения, были сильно ограничены тем фактом, что генетические модели животных в значительной степени не в состоянии воспроизвести фенотип болезни, найденный у больного человека, а также патофизиологии. Этот вопрос не ограничивается дистоническими синдромами, но на самом деле касается многих трансгенных моделей грызуновв области нарушений движения 1,,2. Причина отсутствия фенотипа в трансгенных моделях грызунов может быть основана на высокоэффективных компенсационных механизмах3. В случае дистонии, болезнь характеризуется непроизвольными сокращениями мышц, вызывая скручивание движений и ненормальные позы4. Изучение вторичных причин (т.е. черепно-мозговой травмы) дистонических симптомов, помогло определить структуры, участвующие в проявлении этих двигательных аномалий, таких как базальныеганглии 5. Исследования изображений мозга наследственных форм дистонии показали функциональные аномалии почти во всех областях мозга, ответственных за контроль двигателя и сенсорнойинтеграции 6,7. Тем не менее, модели грызунов по-прежнему необходимы для углубления понимания нервных дисфункций на молекулярном и крупномасштабном сетевом уровне, а также для разработки терапевтических вариантов. Именно здесь фармакологические модели мышей предлагают возможность более точной репликации клинических и патологических особенностей заболевания.
Быстрый дистония-паркинсонизм (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) является одной из наследственных форм дистонии. Это вызвано потерей функциональных мутаций в гене АТФ1-3, который кодирует для 3-субъединитNaq/K-ATPase8. Кроме того, признается, что носители генных мутаций могут быть свободны от симптомов в течение многих лет, прежде чем остро развивается постоянная обобщенная дистония и паркинсонизм после воздействия стрессового события. Действительно, penetrance DYT/PARK-ATP1A3 является неполным и стрессовых событий, действующих в качестве триггера диапазоне от физического перенапряжения и экстремальных температур чрезмерного потребления алкоголяи инфекций 9,10. Для того, чтобы изучить DYT/PARK-ATP1A3 и найти потенциальные терапевтические вмешательства, он был опробован много раз, чтобы имитировать стресс-зависимого развития болезни в моделях грызунов. Однако, помимо одной существующей генетической модели мыши DYT/PARK-ATP1A3, где переходные ненормальные и судороги, как движения были вызваны переохлаждением, все опубликованные генетические модели мыши для DYT/PARK-ATP1A3 не смогли произвести дистонические симптомы1,11,12. Кальдерон и др. ранее продемонстрировали, что блокирование No 3-субъединит на двусторонней основе в базальных ганглиев и мозжечка через сердечный гликозид уабаин в диких мышей типа приводит к мягкой походкенарушения 13. Дополнительное воздействие электрошоков в теплой среде привело к дистонической и брадикинетической фенотип, тем самым продемонстрировав, что хроническая и целевая перфузия уабаина с последующим стрессом успешно имитирует фенотип DYT/PARK-ATP1A3.
Тем не менее, подвергая животных электрическим током ног в теплой среде 38-40 градусов по Цельсию в течение двух часов-период вызывает боль и беспокойство у животных, которые представляют собой смешанные факторы, особенно для оценки изменений в системе катехоламинов, связанных с развитием дистонии. Таким образом, мы описываем другой вид стресса парадигмы с высокой трансляционной стоимости, которая относится к тому, что легкой до умеренной упражнения были описаны как триггеры в DYT/ PARK-ATP1A3пациентов 9. Кроме того, повторяющиеся упражнения является известным триггером для очаговой дистонии14. Мыши неоднократно подвергались сложным моторным задачам, состоящим из трех спусков деревянного столба ("полюс-тест") и трех пробежек на аппарате Ротарода ("Тест производительности Ротарода"). Размещение животных на вершине 50-сантиметрового деревянного столба было использовано для принуждения животных к спуску, аппарат Ротарода использовался для принудительной деятельности мышей, помещая их на вращающийся стержень.
Характеристика моторного фенотипа мышиной модели для дистонии является особенно сложной из-за отсутствия предопределенных тестов и оценок. Тем не менее, один вариант оценки двигательной инвалидности неоднократно использовался в течение последних лет для того, чтобы оценить тяжесть и распределение дистонии, как движенияу грызунов 13,15,16. Настоящим мы представляем модифицированную версию рейтинговой шкалы дистонии, которая доказала свою эффективность в оценке фенотипа животных, похожего на дистонию, при наблюдении в течение четырех минут. В качестве второго метода оценки дистонии, как движения, мы представляем недавно разработанную систему скоринга для оценки ненормальных движений во время теста подвески хвоста. Это позволяет оценить частоту и продолжительность дистонии, как движения и позы передних конечностей, задних конечностей, а также туловища.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с применимыми международными, национальными и/или институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных. Местные власти в Regierung фон Unterfranken, Вюрцбург, Германия, одобрили все эксперименты на животных.
1. Грунт осмотических насосов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен по крайней мере 48 ч до операции. Осмотические насосы АЛЗЕТ должны быть предварительно заполнены для того, чтобы скорость перекачки достигла стабильного состояния перед имплантацией.
- Заранее подготовье желаемого раствора для хронической перфузии. Убедитесь, что растворитель и агент совместимы с осмотическими насосами и катетерами. Для проекта в настоящем случае, оттепель 10x фондовый раствор уабаина (хранится при -20 градусов по Цельсию) при комнатной температуре и вихрь в течение 10 с.
ВНИМАНИЕ: Ouabain является токсичным: он должен быть обработан только с перчатками и открыт только под стерильным капюшоном, чтобы избежать вдыхания. - Включите стерильный капюшон; дезинфицировать капот, а также все инструменты и материалы, необходимые, прежде чем положить их под капот.
- На надеть хирургические перчатки перед обработкой осмотических насосов. Отдельно подготовьем уабаин-раствор, предназначенный для насосов стриатума и мозжечка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учту, что концентрация раствора в насосе для стриатума должна быть удвоена по сравнению с концентрацией раствора в насосе, предназначенном для мозжечка. Это связано с тем, что насос для стриатума соединен с двойной канюлей, скорость потока, однако, такая же, как и для насоса мозжечка, который соединен с одной канюлей. - Рассчитайте количество раствора, необходимого по следующей формуле:
скорость массовой доставки (ko) - скорость доставки объема (я) x концентрация агента в транспортном средстве (Cd)
Для настоящего проекта осмотические насосы были загрунтованы и заполнены раствором уабаина с концентрацией 11,2 нг/ч или 0,9% солевым раствором для контрольной группы. - Vortex как ouabain решения для 10 с и стерильный фильтр (т.е. 0,22 мкм шприц-конец фильтра) их в отдельные, новые микроцентрифуг трубки, используя различные фильтры для каждого решения.
- Взвешивание пустых осмотических насосов вместе с модератором потока (около 0,4 г).
- Заполните шприц 1 мл с 27 G заполнения канюли (желательно с тупым кончиком) со стерильным фильтрованным ouabain-решение или раствор транспортного средства.
- Получить все пузырьки воздуха из шприца, держать осмотический насос в вертикальном положении, вставить канюлю всю дорогу в насос и медленно заполнить резервуар, пока избыток раствора появляется на вершине (избегайте быстрой заполнения, как это может привести к пузырькам воздуха в насосе). Затем вставьте модератор потока в насос (сверху должно появиться избыточное решение).
- Вытяните модератор потока (около 5 мм), аккуратно смахите белый фланг ножницами и подключите кусок виниловых труб к модератору потока. Убедитесь, что катетер имеет длину около 2 см, чтобы обеспечить надлежащую подвижность животного.
- Взвесь заполненный осмотический насос еще раз, чтобы убедиться, что разница в весе между заполненным и пустым насосом соотносяна с ожидаемым весом загруженного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства aqueous решений этот вес равен объему в микролитров. Если вес не соответствует ожидаемому объему, воздух может оказаться в ловушке внутри насоса, который необходимо опорожнить и пополнить. - Для грунтовки насосов приготовьте две 2 мл микроцентрифуг трубки, одну трубку для стриатума и одну для мозжечка.
- Погрузите насосы в микроцентрифуговые трубки, заполненные на полпути солевым раствором 0,9%. Не погружать открытый конец катетера. Поместите микроцентрифуг трубки в термоциклер на 48 ч при 37 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что насос достиг стабильной скорости перекачки до имплантации и катетеры предварительно заполнены.
2. Имплантация канюли и осмотического насоса
- Поместите мышь (мужчина, C57Bl/6N, 11-12 недель) в камеру, предназначенную для ингаляционной анестезии; установить скорость потока изофлюрана до 2-3% и скорость потока кислорода до 2 л/мин.
- После того, как мышь глубоко анестезируется в соответствии с утвержденными протоколами, побрить верхнюю часть головы животного, спинной шеи и проксимальной трети спины.
- Поместите животное в стереотаксическую рамку и продолжайте анестезию изофлюраном с помощью маски для анестезии мыши, предназначенной для стереотаксического инструмента (скорость потока изофлюрана 1,5-2%, 2 л/мин кислорода).
- Используя резиновые наконечники или не разрываемые ушные прутья, зафиксв голову животного в стереотаксической раме, заботясь о том, чтобы голова выровнялась.
- Чтобы предотвратить переохлаждение, поместите под животное грелку, вставьте зонд прямой температуры и установите температуру до 37 градусов по Цельсию. Защитите глаза животного от высыхания с помощью капли офтальмологической мази на каждом глазу.
- Нанесите обезболивающее, такое как карпрофен (5 мг/кг массы тела), подкожно перед началом операции.
- Со шприцем подкожно вводят до 0,2 мл бутивакаина 0,25% и ждут, когда местная анестезия вступят в силу.
- Тщательно дезинфицировать бритые участки антисептиком, таким как дигидрохлорид октенидин.
- После тщательной дезинфекции хирургической области, используйте скальпель, чтобы поместить разрез в верхней части головы и использовать ножницы, чтобы продолжить разрез до конечностей. Разоблачить череп с помощью бульдога зажимы и протрите периостеум с стерильным хлопчатобумажным аппликатором.
- Выровнять ручку или кончик канюли, окрашенные черными чернилами с брегмой и использовать соответствующие координаты, чтобы отметить три точки входа для мозга канюли на черепе (координаты для двусторонних отверстий, необходимых для перфузии базальных ганглиев: передние / задние: 0,74 мм, медиальный/боковой: 1,50 мм (яп. Далее тщательно просверлите отверстия для двойной канюли, предназначенные для базальных ганглиев и одной канюли, предназначенных длямозжечка (рисунок 1A).
- Просверлите четвертое отверстие для небольшого винта между стриатумом и мозжечок. Этот винт в конечном итоге будет встроен в зубной цемент и обеспечить дополнительное удержание для канюли. Используя тонкие типсы и винт водителя, осторожно ввести винт в небольшое отверстие, пока он твердо закреплен в черепе. Не имплантировать винт слишком глубоко, как это повреждает ткани мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется продолжать имплантацию осмотического насоса перед вставкой осмотических канюл. Это позволяет избежать причинения каких-либо случайных повреждений канюли при имплантации насосов. - Для того, чтобы создать небольшой карман для осмотического насоса с каждой стороны спины животных, используйте ткани force, чтобы отделить слои подкожной ткани. Заранее типсы к одной задней ноге и открыть миппы немного для того, чтобы расширить подкожный карман. Повторите ту же процедуру для другой стороны, сначала удалив типсы из разреза, а затем толкая их осторожно к второй задней ноге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Карман должен позволить насосу легко скользить, однако, он не должен иметь слишком много места для перемещения под кожей. - С помощью тканевых типсов возьмите первый насос вместе с подключенным куском трубки и сдвиньте его в один подкожный карман. Повторите ту же процедуру со вторым насосом.
- Используя держатель minipump, ввемите один osmotic cannula с изготовленной на заказ длиной 3.0 mm в отверстие просверленное в midline мозжечка. Отсоедините голову канюли тщательно и исправить канюлю, а также небольшой винт с зубным цементом, заботясь, чтобы не покрыть соединительный кусок для труб осмотического насоса. Убедитесь, что зубной цемент, окружающий канюлю, полностью высох, прежде чем продолжить операцию.
- Перед вставкой двойной канюли с расстоянием от центра до центра 3,0 мм и индивидуальной длиной 4,0 мм в двусторонние пробуренные отверстия над базальными ганглиями прикрепите два коротких куска виниловых труб (0,5 см) к двум соединительным частям двойной канюли. Соедините виниловые трубки с адаптером бифуркации и тщательно заполните всю трубную систему, включая адаптер и канюлю с раствором уабаина или транспортным средством (комнатная температура, стерильная фильтрованная заранее). Это может быть сделано лучше всего с 1 мл шприца и 27 G заполнения канюли введены в одном задней части адаптера бифуркации (Рисунок 1B).
- Используя держатель minipump, тщательно вставьте двойную канюлю в двусторонние отверстия. Используйте зажим, чтобы отсоединить голову канюлы и исправить двойной канюле с зубным цементом.
- Подключите катетеры осмотических насосов к адаптеру бифуркации, а также к одной канюле, соответственно. Убедитесь, что катетеры имеют сильную провести на соединительные части канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба насоса имеют равную скорость потока, так что будьте осторожны, чтобы соединить осмотический насос с двойным концентрированным раствором для адаптера бифуркации, чтобы гарантировать, что та же концентрация достигает как базальных ганглиев и мозжечка. - Закройте разрез на спине животных швами, насколько это возможно в направлении черепа, будьте осторожны, чтобы не перенапряжение кожи(рисунок 1C).
- Подкожно вводят 0,5 мл 0,9% солевого раствора, который должен иметь температуру тела, в складку кожи с каждой стороны спины животных, чтобы избежать обезвоживания мышей, тщательно избегая насосов.
3. Двигатель вызов
- Тема ouabain- или транспортного средства проникнуты мышей сложных двигательных задач в качестве одной из форм мягкого воздействия стресса 4 ч после операции и повторяется каждые 24 ч после этого для того, чтобы вызвать дистонии, как движения. Это не включает в себя поведенческую характеристику; его цель состоит в том, чтобы вызвать более высокий уровень стресса по сравнению с нормальным содержанием клетки.
- Поместите мышь на 50 см грубой поверхности, деревянный столб диаметром 1 см, нос лицом вниз. Убедитесь, что полюс помещается в большую клетку с достаточным количеством постельных принадлежностей в случае падения. Не нужно измерять время спуска, но при спуске с полюса следует присмотреться к непроизвольным гиперэкспер напряжениям передних конечностей и задних конечностей, представленным животными, пропитанными уабаином. Пусть мыши спуститься полюс три раза и позволяют 2 мин восстановления между спусками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уабаин проникнуты мышей должны представить первые симптомы, как bradykinesia 4 ч после операции. Тем не менее, 24 ч после операции мышей должны начать представлять непроизвольные гиперэкс напряженности передних конечностей и задних конечностей в знак дистонии, как движения во время спуска. - Для выполнения второй моторной задачи поместите мышей на вращающийся стержень, как это было сделано для теста производительности Rotarod. Аппарат Rotarod не используется в качестве меры задержки падения, цель состоит в том, чтобы подвергать мышей принудительной деятельности. Поместите мышей на вращающийся стержень три раза и дайте 2 мин восстановления между тестами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения воздействия стресса используйте ускоряющийся аппарат Rotarod. Для проекта, описанного в настоящем, стержень ускоряется от 5 до 50 об /мин в течение установленного периода времени 300 сек. - Пусть животные восстановить в течение 30 минут между полюсом тест и Rotarod производительности теста и снова еще 30 минут, прежде чем забил для дистонии, как движения, как описано в протоколе шаг 4. В промежутках между повторяющимися воздействиями стресса, позволяют мышам восстановиться в течение 24 часов-интервалов.
4. Скоринг системы для оценки дистонии, как движения
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатор должен быть ослеплен групповым заданием, проанализированным для предотвращения предвзятости. Поведенческие тесты, используемые для характеристики фенотипа мышей две системы скоринга: дистония рейтинговая шкала забил ненормальным, дистония, как движения и поведенческие оценки с помощью теста подвески хвоста. Оцените дистонии, как движения после восстановления время 30 минут после воздействия легкого стресса.
- Шкала рейтинга Дистонии
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за отсутствия предопределенных поведенческих задач, шкала рейтинга дистонии была создана в качестве системы скоринга на основе наблюдателей, аналогичной клиническим шкалам рейтингов человеческой дистонии. Это модифицированная версия рейтинговой шкалы дистонии, используемая Calderon et al.13.- Запись осанки и походки животных в течение 4 минут после того, как животные были помещены в пластиковый или деревянный ящик.
- Оценка частоты и распределения дистонии, как движения от 0 до 4 баллов: (0) нормальное поведение двигателя; (1) аномальное моторное поведение, никаких дистония-как движения; (2) легкие двигательные нарушения с легкой фокусной дистонией, как движения; (3) умеренное двигательное нарушение с тяжелыми очаговыми дистониями, как движения; (4) тяжелые нарушения, с устойчивыми, обобщенными дистонией, как движения (Рисунок 2). Рассмотрим следующие движения или позы, как дистония, как: гиперэкстензия передних конечностей, широкая позиция или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз. Рассмотрим дистонии в качестве координационного в случае, если одна часть тела влияет и как обобщенные в случае ствола и по крайней мере две другие части тела страдают.
- Испытание подвески хвоста
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест подвески хвоста часто используется для наблюдения и оценки за задний сжимая. Это, однако, весьма неспецифический фенотип, указывающий на двигательные нарушения. Следующий протокол предлагает скоринговую систему, специфичную для дистонийных движений. В связи с обобщением дистонии у пациентов DYT/PARK-ATP1A3, дистония, как движения должны быть оценены в передних конечностях, туловище и задние конечности. Недавно разработанная система подсчета очков от 0-8 баллов была разработана, общий балл Lt; 2 указал, что нет дистонии, как движения присутствовали (Рисунок 3).- Возьмите мышь за хвост возле ее основания и поднимите животное вверх. Зафиксируем 2-минутный видео теста на подвеску хвоста и назначьте оценку в последующем тщательном анализе записи.
- Оценка передних конечностей от 0 до 4 точек, где повторяющиеся или устойчивые тонизирующие опровержения одной или обеих передних конечностей, а также гиперэкстензия в сочетании с пересечением передних конечностей, были классифицированы как дистония,как: (0) никаких ненормальных движений; (1) уменьшенное движение передних конечностей с гиперэкстензией лап видел 50% от записанного времени; (2) мягкие дистонии, как движения передней конечности (ы) Lt; 50% от записанного времени; (3) мягкие дистония, как движения передней конечности (ы) - 50% от записанного времени или тяжелой lt; 50% от записанного времени; (4) тяжелые дистония, как движения передней конечности (ы) 50% от записанного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Hindlimb сжимая является ненормальным движением, которое не должно быть забил, как дистония-как. - Оценка задних конечностей от 0 до 3 баллов, где опровержение и сжатие задних конечностей, а также устойчивые гиперэкстензии были оценены как дистония-как: (0) никаких ненормальных движений; (1) уменьшенное движение задних конечностей с гиперэкстензией лап видел 50% от записанного времени; (2) дистония, как движения одного хиндлимба; (3) дистония, как движения обеих задних конечностей.
- В случае truncal искажения 80% записанного времени, дополнительное очко добавляется к счету.
- Поместите животное обратно в клетку.
Representative Results
Рисунок 4 был изменен из Rauschenberger и др.17. Для анализа данных как по шкале рейтинга дистонии(A), так ипо тесту подвескихвоста (B),вычислите общий балл за каждую точку времени для каждого животного. Среднее время каждой точки времени и каждой группы должно быть вы построения на соответствующем графике. Следует иззнать распределение значений и продать соответствующий статистический тест для определения значимости. При достаточном количестве животных, моторный фенотип может быть обнаружен как по шкале оценки дистонии, так и с оценкой аномальных движений в тесте подвески хвоста. Дистония-как фенотип демонстрируется значительно более высокий двигатель оценка в обеих оценках в уабаин-perfused, подчеркнул группы по сравнению с уабаин проникнуты, не подчеркнул мышей, а также контроля мышей.
Рисунок 1: Основные хирургические шаги для имплантации канюли и осмотического насоса. A)Для указанных координат отверстия необходимо просверлить на двусторонней основе для двойной канюли, предназначенной для базальных ганглиев и для одной канюли, помещенной в средней линии мозжечка. Два полностью построенных осмотических насоса показаны с каждой стороны животного. (B)На рисунке показан имплантированный одиночный канюлю в мозжечок, закрепленный зубным цементом. Двойная канюля для базальных ганглиев должна быть подключена к адаптеру бифуркации и предварительно заполнена уабаином перед имплантацией. (C)Изображение готовой процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка дистонии, как движения с дистонией рейтинговой шкалы. Во время 4 мин видео, дистония, как движения были забиты на основе распределения тела и продолжительности. Непроизвольная гиперэкстензия передних конечностей, широкая позиция или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз были оценены как дистония-как. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Оценка дистонии, как движения во время теста подвески хвоста. Недавно разработанная система скоринга для аномальных движений во время 2-минутного теста подвески хвоста оценивает дистонии, как движения в передних конечностях, задних конечностей и туловища от 0-8 баллов в общей сложности. Для передних конечностей, гиперэкстензии и пересечения передних конечностей, а также тонизирующее сгибание к стволу квалифицированы как дистония- как. Для задних конечностей непроизвольная гиперэкстензия, а также опровержение с расширением над средней линией был забит как дистония-как. С одним очком было забито truncal искажение более 80% записанного времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные графики шкалы оценки дистонии и тест на подвеску хвоста. (A) График изображает дистония-рейтинг шкалы для NaCl-perfused, подчеркнул мышей (пунктирная черная линия), ouabain проникнуты, не подчеркнул мышей (пунктирная оранжевая линия) и уабаин проникнуты, подчеркнул мышей (темно-синяя линия). Для каждой точки времени отображаются средние значения и стандартная погрешность среднего (SEM). (B) Диаграмма показывает оценку аномальных движений во время 2-минутного теста подвески хвоста для NaCl-perfused, подчеркнул мышей (пунктирная черная линия), уабаин проникнуты, не подчеркнул мышей (пунктирная оранжевая линия) и ouabain-perfused, подчеркнул мышей (темно-синяя линия). Статистический анализ был сделан для шкалы рейтинга дистонии и теста подвески хвоста, используя двуххвостый тест Манн-Уитни. Коррекция р-значений Bonferroni-Holm показала существенную разницу за период наблюдений 72 ч. Темно-синий - обозначают значительные различия между ouabain-perfused, подчеркнул мышей и уабаин проникнуты, не-напряженных мышей мышей, черный - обозначают значительные различия между NaCl-perfused, подчеркнул мышей и уабаин-perfused, подчеркнул мышей, а также между NaCl-perfused, подчеркнул мышей и ouabain-perfused, не-напряженных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Эта фармакологическая модель мыши DYT/PARK-ATP1A3 позволяет детально анализ внутримозговых структурных и нейрохимических изменений, вызванных исключительно ингибированием ионного насоса натрия и калия в базальных ганглиях и мозжечках, а также изменениями, связанными со стрессовым воздействием. В случае мышей, максимум два осмотических насосов могут быть подкожно имплантированы. В настоящем настоящем мы представляем метод, подробно описывающий хроническую доставку лекарств в несколько структур мозга путем реализации двойной канюли, подключенной к адаптеру бифуркации в дополнение к одной канюле. Эта методология может быть использована для любого приложения, требующего нескольких структур мозга, которые будут проникнуты одновременно и хронически.
Мы представляем модель мыши редкого расстройства движения, где у пациентов развиваются постоянные симптомы после воздействия стресса. Это предполагаемое генно-экологическое взаимодействие до сих пор не изучено, но может представлять собой один из ключевых патомеханизмов в развитии DYT/PARK-ATP1A3. Различные методы подвергая мышей стресс были опубликованы в прошлом и включают в себя электрическим током ноги, сдерживание, холодная или теплая окружающая среда и воздействиеразличных запахов 11,12,13. В попытке подвергать мышей мягкому стресс-фактору с трансляционным значением, мы описываем повторяющееся субъективим мышей сложным моторным задачам. Для полюса тест, ouabain перфузных животных показали непроизвольные гиперэкстензии передних конечностей и задних конечностей. Эти движения были очень похожи на дистонии, как движения, наблюдаемые во время 4-минутной видеозаписи животных, а также хвост подвески испытания. Применение легкого стресса в виде сложных двигательных задач может оказаться полезным в других моделях мыши, показывающих двигательные симптомы или нейродегенерацию, где генно-экологические взаимодействия массово влияют на степень прогрессирования заболевания.
Существует общее отсутствие предопределенных поведенческих задач, а также рейтинговых шкал для классификации аномальных движений и поз у мышей. Большинство доступных двигательных задач выявить неспецифические аномалии, такие как задняя сжимая, который является известным явлением во многих моделях мыши двигательных расстройств с нейродегенерации18,19. Для правильной характеристики фенотипа, однако, необходимо проанализировать, является ли модель мыши резюмирует основные особенности заболевания. В этом случае мы представляем модифицированную версию шкалы рейтинга дистонии, используемую ранее для оценки двигательной инвалидности в моделяхмышей дистонии 15,,16. Мы дополнительно разработали систему оценки на основе наблюдателей для теста на подвеску хвоста, которая была создана по аналогии с клиническими рейтинговыми шкалами дистонии человека. Обе шкалы рейтинга показывают значительно более высокий балл в ouabain-perfused, подчеркнул мышей по сравнению с ouabain перфектом, не подчеркнул животных, а также транспортных средств проникнуты животных. Недостатками любой системы подсчета очков на основе наблюдателей являются необходимая подготовка тарифов для обеспечения последовательного скоринга и уменьшения изменчивости наблюдателей, а также опасность возможного смещения тарифера, если он не будет полностью ослеплен анализируемой группой. Тем не менее, системы оценки на основе наблюдателей по-прежнему представляют можно легкодоступный метод характеристики фенотипа и могут быть адаптированы к модели мыши проанализированы, как это делается в настоящем проекте для оценки дистонии, как движения. Для обеспечения последовательного скоринга среди различных тарифов, учебные видео должны быть доступны. Чтобы уменьшить любые потенциальные предубеждения, рекомендуется, чтобы различные тарифы оценка же видеоклипы и что отдельные баллы усредняться. Обе системы скоринга, упомянутые в этой работе, записывают наличие дистонии, как движения у животных. Шкалы рейтинга могут быть адаптированы в соответствии с конкретными требованиями в рамках проекта, как это было сделано ранее Ip et al., где исключительно задние конечности были забиты для дистонии, как движения в мышиной модели для дистонии 1 (DYT-TOR1A)20. Рейтинговые шкалы могут быть дополнены другими ранее опубликованными системами скоринга, оценивая, например, степень брадикинезии у грызунов, как это делается с оценкой инвалидности передвижения Calderon et al.13.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF DysTract to C.W.I.) и Междисциплинарным центром клинических исследований при Университете Вюрцбурга (No2-CSP3 в Лос-Анджелесе). Авторы благодарят Луизу Фриш, Кеали Рём, Веронику Сенгер и Хайко Менцеля, а также Хельгу Брюннер за заботу о животных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
