Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för att generera en farmakologisk DYT/PARK-ATP1A3 dystoni mus modell via implantation av kanylerna i basala ganglierna och lillhjärnan ansluten till osmotiska pumpar. Vi beskriver induktion av dystoni-liknande rörelser via tillämpning av en motor utmaning och karakterisering av fenotyp via beteendemässiga poängsystem.
Abstract
Genetiskt modifierade musmodeller möter begränsningar, särskilt när man studerar rörelsestörningar, där de flesta av de tillgängliga transgena gnagarmodellerna inte presenterar en motorisk fenotyp som liknar de kliniska aspekterna av den mänskliga sjukdomen. Farmakologiska musmodeller möjliggör en mer direkt studie av pathomechanisms och deras effekt på beteendemässiga fenotyp. Osmotiska pumpar som är anslutna till hjärnkanyler öppnar möjligheten att skapa farmakologiska musmodeller via lokal och kronisk läkemedelsleverans. För den ärftliga förflyttningsstörningen av snabb-debuten dystoni-parkinsonism, kan förlust-of-function mutationen i α3-subenhet av Na+/ K+-ATPase simuleras genom en mycket specifik blockad via glykosiden ouabain. För att lokalt blockera α3-subenhet i basala ganglierna och lillhjärnan, som är de två hjärnan strukturer tros vara starkt involverade i patogenesen vid snabb-debuten dystoni-parkinsonism, är en bilateral kanyl stereotaxically implanteras i striatum och en ytterligare enda kanyl införs i lillhjärnan. Kanylerna är anslutna via vinylslangar till två osmotiska pumpar, som subkutant implanteras på djurens baksida och möjliggör kronisk och exakt leverans av ouabain. Den farmakologiska mus modell för snabb-instövning dystoni-parkinsonism bär den ytterligare fördelen av recapitulating de kliniska och patologiska funktionerna i asymtomatiska och symptomatiskt mutation bärare. Precis som mutation bärare av snabb debut dystoni parkinsonism, ouabain-perfused möss utveckla dystoni-liknande rörelser först efter ytterligare exponering för stress. Vi visar en mild stress paradigm och införa två modifierade poängsystem för bedömning av en motor fenotyp.
Introduction
Fördelarna med en kontinuerlig läkemedelsleverans direkt in i hjärnan är många. Repetitiva och frekventa injektioner, som utgör en onödig stressfaktor för djur, kan undvikas och en mer konstant intrakraniell koncentration av läkemedlet kan uppnås. Detta är särskilt giltigt när systemiskt administrerade läkemedel misslyckas med att lätt tränga igenom blod-hjärnbarriären. Dessutom, kronisk läkemedelsleverans via osmotiska pumpar möjliggör lokaliserad leverans av substrat som annars skulle ha systemomfattande biverkningar. Läkemedlen kan levereras på ett målinriktat sätt till de önskade hjärnstrukturerna, den resulterande effekten kan därmed direkt spåras. Detta kan utnyttjas för en rad applikationer, såsom studiet av terapeutiska effekter samt studiet av pathomechanisms. Denna sista ansökan användes i projektet häri för att skapa en farmakologisk musmodell för dystoni.
Analysen och förståelsen av dystonsyndrom, som representerar den tredje vanligaste rörelsestörningen, har varit starkt begränsad av det faktum att genetiska djurmodeller till stor del misslyckas med att reproducera sjukdomen fenotyp som finns i sjuka mänskliga samt patofysiologi. Denna fråga är inte begränsad till dystoniska syndrom, men i själva verket berör många transgena gnagare modeller inom området för rörelsestörningar1,2. Orsaken till avsaknaden av en fenotyp i modeller för transgena gnagare kan vara baserad på mycket effektiva kompensationsmekanismer3. När det gäller dystoni, sjukdomen kännetecknas av ofrivilliga muskelsammandragningar orsakar vrida rörelser och onormala ställningar4. Studien av sekundära orsaker (dvs, hjärnskada) av dystoniska symtom, har bidragit till att identifiera de strukturer som deltar i manifestationen av dessa motoriska avvikelser, såsom de basala ganglierna5. Hjärnavbildningsstudier av ärftliga former av dystoni har visat funktionella avvikelser i nästan alla hjärnregioner som ansvarar för motorisk kontroll och sensorimotorisk integration6,7. Emellertid, gnagare modeller behövs fortfarande för att fördjupa förståelsen av de neurala dysfunktioner på en molekylär och storskalig nätverksnivå samt för utveckling av terapeutiska alternativ. Det är där farmakologiska musmodeller erbjuder möjligheten att replikera de kliniska och patologiska egenskaperna hos en sjukdom på ett mer exakt sätt.
Snabb-debut dystoni-parkinsonism (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) är en av de ärftliga formerna av dystoni. Det orsakas av förlust-of-function mutationer i ATP1α3 genen, som kodar för α3-subenhet av Na+/ K+-ATPase8. Vidare är det erkänt att genmutation bärare kan vara fri från symptom i flera år innan akut utveckla långlivade generaliserade dystoni och Parkinsonism efter exponering för en stressande händelse. I själva verket är penemetris av DYT/PARK-ATP1A3 ofullständiga och stressande händelser som fungerar som en utlösare sträcker sig från fysisk överansträngning och extrema temperaturer till överkonsumtion av alkohol och infektioner9,10. För att studera DYT/PARK-ATP1A3 och för att hitta potentiella terapeutiska interventioner har man försökt många gånger att imitera den stressberoende sjukdomsutvecklingen hos gnagaremodeller. Men bortsett från den en befintliga genetiska DYT/PARK-ATP1A3 mus modell, där övergående onormala och konvulsion-liknande rörelser var framkallas av hypotermi, alla publicerade genetiska mus modeller för DYT/PARK-ATP1A3 har misslyckats med att producera dystoniska symtom1,11,12. Calderon et al. har tidigare visat att blockering av α3-subenheten bilateralt i basala ganglierna och lillhjärnan via hjärtglykosiden ouabain i vilda typ möss resulterar i mild gång störning13. Den ytterligare exponering för elektriska fot chocker i en varm miljö ledde till en dystonisk och bradykinetic fenotyp, vilket visar att kronisk och riktade perfusion av ouabain följt av stress framgångsrikt imiterar DYT/PARK-ATP1A3 fenotyp.
Att utsätta djur för elektriska fotchocker i en varm miljö på 38-40 °C under en tvåtimmarsperiod framkallar dock smärta och ångest hos djur, som representerar sammanbluffande faktorer, särskilt för bedömning av förändringar i katekolaminsystemet relaterat till utvecklingen av dystoni. Således beskriver vi häri en annan typ av stressparadigm med högt translationellt värde, som relaterar tillbaka till det faktum att mild till måttlig motion har beskrivits som utlösare i DYT/PARK-ATP1A3 patienter9. Dessutom är repetitiv motion en välkänd utlösande faktor för fokal dystoni14. Möss utsattes upprepade gånger för utmanande motoriska uppgifter bestående av tre nedstiger av en trästolpe ("stolpetest") och tre körningar på en Rotarod-apparat ("Rotarod performance test"). Placeringen av djur på toppen av en 50 cm trästolpe användes för att tvinga djuren att stiga ner, rotarodapparaten var anställd för att utsätta möss för tvångsaktivitet genom att placera dem på en roterande stav.
Karakterisering av motor fenotyp av en mus modell för dystoni är särskilt utmanande på grund av bristen på fördefinierade tester och poäng. En variant av en bedömning av motorisk funktionsnedsättning har dock upprepade gånger använts under de senaste åren för att utvärdera svårighetsgraden och fördelningen av dystoniliknande rörelser hos gnagare13,15,16. Vi häri presentera en modifierad version av skalan dystonia betyg, som visat sig vara effektiva i utvärderingen av dystonia-liknande fenotyp av djur när observerats under en tidsperiod på fyra minuter. Som en andra metod för att bedöma dystonia-liknande rörelser, presenterar vi en nyligen utvecklat poängsystem för bedömning av onormala rörelser under en svans suspension test. Det möjliggör bedömning av frekvensen och varaktigheten av dystoni-liknande rörelser och ställningar av de främre extremiteterna, hindlimbs samt bålen.
Protocol
Alla förfaranden utfördes i enlighet med tillämpliga internationella, nationella, och/eller institutionella riktlinjer för vård och användning av djur. De lokala myndigheterna vid Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland, godkände alla djurförsök.
1. Priming av osmotiska pumpar
OBS: Detta steg måste utföras minst 48 h före operationen. ALZET osmotiska pumpar måste förfyllas för att säkerställa att pumpningshastigheten når ett stadigt tillstånd före implantation.
- Förbered önskad lösning för kronisk perfusion i förväg. Se till att lösningsmedlet och medlet är kompatibla med de osmotiska pumparna och katetrarna. För projektet häri tina en 10x stamlösning av ouabain (förvaras vid -20 °C) vid rumstemperatur och virvel i 10 s.
FÖRSIKTIGHET: Ouabain är giftigt: det ska hanteras endast med handskar och öppnas endast under en steril huva för att undvika inandning. - Slå på den sterila huvan; desinficera huven samt alla instrument och material som behövs innan du lägger dem under huven.
- Ta på operationshandskar innan du hanterar de osmotiska pumparna. Preparera separat ouabain-lösningen som designeras för pumparna av striatumen och cerebellumen.
OBS: Tänk på att koncentrationen av lösningen i pumpen för striatum måste fördubblas jämfört med koncentrationen av lösningen i pumpen som utsetts för lillhjärnan. Detta beror på det faktum att pumpen för striatum är ansluten till en dubbel kanyl, är flödet dock samma som för pumpen av lillhjärnan, som är ansluten till en enda kanyl. - Beräkna hur mycket lösning som behövs med hjälp av följande formel:
massa leveranshastighet (ko) = volym leveranshastighet (Q) x koncentration av medlet i fordonet (Cd)
För det aktuella projektet var de osmotiska pumparna primade och fyllda med antingen ouabainlösning vid en koncentration av 11,2 ng/h eller 0,9% saltlösning för kontrollgruppen. - Vortex båda ouabain lösningar för 10 s och sterilt filter (dvs. 0,22 μm spruta-end filter) dem i separata, nya mikrocentrifugrör, med hjälp av ett annat filter för varje lösning.
- Väg de tomma osmotiska pumparna tillsammans med flödesmoderatorn (ca 0,4 g).
- Fyll en 1 mL spruta med en 27 G fyllningskayl (helst med trubbig spets) med steril filtrerad ouabain-lösning eller fordonslösning.
- Få ut alla luftbubblor ur sprutan, håll den osmotiska pumpen i upprätt läge, sätt in kanylen hela vägen in i pumpen och fyll långsamt behållaren tills överskottslösningen visas ovanpå (undvik snabb fyllning eftersom detta kan leda till luftbubblor i pumpen). Därefter sätter du in flödesmoderatorn i pumpen (överflödig lösning ska visas på toppen).
- Dra flödet moderator ut (ca 5 mm), försiktigt ta av den vita flänsen med sax och anslut en bit av vinyl slangar till flödet moderator. Se till att katetern har en längd av ca 2 cm för att medge korrekt rörlighet hos djuret.
- Väg den fyllda osmotiska pumpen en gång till för att säkerställa att skillnaden i vikt mellan fylld och tom pump är konkordant med den förväntade vikten på lösningen laddad.
OBS: För de flesta vattenlösningar är denna vikt lika med volymen i mikroliter. Om vikten inte motsvarar den förväntade volymen, kan luft fastna inuti pumpen, som måste tömmas och fyllas på. - För priming av pumparna, förbereda två 2 mL microcentrifug rör, ett rör för striatum och en för lillhjärnan.
- Dränk pumparna i mikrocentrifugrören fyllda halvvägs med 0,9% saltlösning. Du får inte dränka kateterns öppna ände. Sätt mikrocentrifugrören i en termocyklare i 48 h vid 37 °C för att säkerställa att pumpen har nått en jämn pumphastighet före implantation och katetrarna förfylls.
2. Kanyl- och osmotisk pumpimplantation
- Placera musen (hane, C57Bl/6N, 11-12 veckors ålder) i en kammare som är avsedd för inhalationsbedövning; ställa in flödeshastigheten för isofluran till 2-3% och flödet av syre till 2 L/min.
- Efter musen är djupt sövd enligt godkända protokoll, raka toppen av djurets huvud, rygghals och proximal tredjedel av ryggen.
- Placera djuret i en stereotaktisk ram och fortsätt anestesin med isofluran via en musbedövningsmask som är avsedd för det stereotaktiska instrumentet (isofluranflödeshastighet 1,5-2%, 2 L/min syre).
- Med hjälp av gummispetsar eller icke-brista öronstänger, fixera djurets huvud i stereotaktisk ram, var noga med att huvudet är utjämnat.
- För att förhindra hypotermi, placera en värmedyna under djuret, sätt in en rektaltemperatursond och ställ in temperaturen på 37 °C. Skydda ögonen på djuret från att torka ut genom att använda en droppe oftalmisk salva på varje öga.
- Applicera ett smärtstillande medel, såsom Carprofen (5 mg/kg kroppsvikt), subkutant innan operationen påbörjas.
- Med en spruta subkutant injicera upp till 0,2 mL bupivacaine 0,25% och vänta 30 s för den lokala anestesi att träda i kraft.
- Desinficera de rakade områdena noggrant med ett antiseptiskt medel, såsom oktenidindikhydroklorid.
- Efter noggrann desinfektion av operationsområdet, använd en skalpell för att placera ett snitt på toppen av huvudet och använda sax för att fortsätta snittet ner till förlemmad extremiteterna. Exponera skallen med hjälp av bulldog klämmor och torka av benhinna med en steril bomullsspetsad applikator.
- Rikta antingen en penna eller spetsen på en kanyl som färgats i svart bläck med bregma och använd lämpliga koordinater för att markera de tre inkörställarna för hjärnkanylerna på skallen (koordinater för de bilaterala hål som behövs för perfusion av de basala ganglierna: främre/bakre: + 0,74 mm, mediala/laterala: +/- 1,50 mm (+ som anger den högra sidan, - den vänstra sidan i förhållande till bregma); koordinater för hålet vid lillhjärnans mittlinje: främre/bakre: - 6,90 mm). Därefter borra försiktigt hålen för den dubbla kanylen som är utsedd för de basala ganglierna och den enkelskanula som utsetts för lillhjärnan (Figur 1A).
- Borra ett fjärde hål för en liten skruv i-mellan striatum och lillhjärnan. Denna skruv kommer så småningom att bäddas in i tandcement och ge ytterligare stadga för kanylerna. Med hjälp av fina tlysen och en skruv drivrutin, försiktigt införa skruven i det lilla hålet tills den är ordentligt fast i skallen. Implantera inte skruven för djupt eftersom detta skadar hjärnvävnaden.
OBS: Det rekommenderas att fortsätta med den osmotiska pumpen implantation innan du sätter i osmotiska kanylerna. På så sätt undviker man att orsaka några oavsiktliga skador på kanylerna vid implantering av pumparna. - För att skapa en liten ficka för den osmotiska pumpen på var sida om djuren tillbaka, använd vävnadstövningar för att separera de subkutana vävnadsskikten. För fram tyforna mot ett bakben och öppna tövådarna något för att vid vidga den subkutana fickan. Upprepa samma procedur för den andra sidan, först ta bort tänjarna från snittet och sedan trycka dem försiktigt mot andra bakbenet.
OBS: Fickan ska tillåta pumpen att enkelt glida in, dock bör den inte ha för mycket utrymme att röra sig under huden. - Med hjälp av vävnadstövlar ta den första pumpen tillsammans med den anslutna bit av slangar och skjut in den i en subkutan ficka. Upprepa samma procedur med den andra pumpen.
- Med hjälp av en minipumphållare, införa en enda osmotisk kanyl med en anpassad längd på 3,0 mm i hålet borras i mittlinjen av lillhjärnan. Lösgör kanylhuvudet försiktigt och fixera kanylen samt den lilla skruven med tandcement, var noga med att inte täcka anslutningsstycket för slangen på den osmotiska pumpen. Säkerställ att den tandcement som omger kanylen har torkat helt innan du fortsätter med kirurgi.
- Innan du sätter in en dubbel kanyl med mitt-till-mitten avstånd på 3,0 mm och skräddarsydd längd på 4,0 mm i de bilateralt borrade hålen ovanför basal ganglierna, fäst två korta bitar av vinylrör (0,5 cm) till de två anslutningsbitarna i dubbel kanylen. Anslut vinylslangarna med en bifurkationadaptor och förfyll noggrant hela slangsystemet inklusive adapter och kanyl med ouabainlösning eller fordon (rumstemperatur, sterilt filtrerat i förväg). Detta kan göras bäst med en 1 mL spruta och en 27 G fyllningskantyl införs i den enda bakre änden av bifurcation adaptor (Figur 1B).
- Med hjälp av en minipumphållare för du försiktigt in den dubbla kanylen i de bilaterala hålen. Använd en klämma för att lossa kanylhuvudet och fixera dubbel kanylen med tandcement.
- Anslut katetrar av osmotiska pumpar till bifurkation adapter samt den enda kanyl, respektive. Se till att katetrarna har ett starkt grepp om kanylernas anslutningsbitar.
OBS: Båda pumparna har en lika stor flödeshastighet, så var försiktig så att den osmotiska pumpen ansluts med den dubbla koncentrerade lösningen till bifurkationsadaptorn för att säkerställa att samma koncentration når både de basala ganglierna och lillhjärnan. - Stäng snittet på djurens baksida med stygn så långt som möjligt i skallens riktning, var noga med att inte överanstränga huden (Figur 1C).
- Subkutant injicera 0,5 mL 0,9% saltlösning, som bör ha kroppstemperatur, i en hudvecka på varje sida av djurens baksida för att undvika uttorkning av mössen, försiktigt undvika pumparna.
3. Motorisk utmaning
- Ämne ouabain- eller fordon-perfused möss till utmanande motoriska uppgifter som en form av mild stress exponering 4 h post-kirurgi och repetitivt varje 24 h efteråt för att inducera dystoni-liknande rörelser. Detta inkluderar inte en beteendemässiga karakterisering; dess syfte är att framkalla en högre stressnivå jämfört med normal burhållning.
- Placera musen på en 50 cm grov-yta, trä stolpe med en diameter på 1 cm, näsa nedåt. Se till att stången placeras i en stor bur med tillräckligt med strö vid fall. Det är inte nödvändigt att mäta tiden för nedstigning, men se upp för ofrivillig hyperextensions av främre lemmar och bakben som presenteras av ouabain-perfused djur medan fallande stolpen. Låt möss ner på polen tre gånger och tillåta 2 min återhämtning mellan fallande.
OBS: Ouabain-perfused möss bör presentera första symtom som bradykinesi 4 h post kirurgi. 24 h efter kirurgi möss bör dock börja presentera ofrivilliga hyperextensions av främre lemmar och hindlimbs som ett tecken på dystonia-liknande rörelser under nedstigande. - För den andra motoriska uppgiften, placera möss på den roterande staven som gjort för Rotarod prestandatest. Rotarod-apparaten används inte som ett mått på latensen att falla, syftet är att utsätta möss för tvångsaktivitet. Placera mössen på den roterande staven tre gånger och låt 2 min återhämtning mellan testerna.
OBS: För att öka stressexponeringen, använd en accelererande Rotarodapparat. För projektet som beskrivs häri accelererar staven från 5 till 50 rpm under en fastställd tidsperiod på 300 sek. - Låt djuren återhämta sig i 30 min mellan poltestet och Rotarod-prestandatestet och återigen ytterligare 30 min innan du gör poäng för dystoniliknande rörelser som beskrivs under protokollsteg 4. Mellan de repetitiva stressexponeringarna, låt möss återhämta sig i 24 h-intervall.
4. Poängsättningssystem för bedömning av dystoniliknande rörelser
OBS: Försöks- och experimentören ska förblindas för gruppuppgiften som analyseras för att förhindra bias. De beteendetester som används för att karakterisera mössens fenotyp är två poängsystem: en dystoniklassificeringsskala som gör onormala, dystoniska rörelser och en beteendepoäng med hjälp av svansupphängningstestet. Bedöma dystoni-liknande rörelser efter en återhämtningstid på 30 min efter exponeringen för mild stress.
- Skala över dystonibetyg
OBS: På grund av bristen på fördefinierade beteendemässiga uppgifter, var dystoni rating skalan inrättades som en observatör-baserade poängsystem som liknar de kliniska betyg skalor av mänsklig dystoni. Det är en modifierad version av dystoni betygsskalan som används av Calderon et al.13.- Registrera kroppsställning och gångart av djur under en period av 4 min efter att djur har placerats i en plast- eller trälåda.
- Poäng för frekvens och fördelning av dystoniliknande rörelser från 0 till 4 poäng: (0) normalt motoriskt beteende; (1) onormalt motoriskt beteende, inga dystoniliknande rörelser; (2) mild motorisk försämring med milda fokal dystoniliknande rörelser; (3) måttlig motorisk funktionsnedsättning med svåra fokal dystoniliknande rörelser; (4) svår funktionsnedsättning, med ihållande, generaliserade dystoniliknande rörelser (Figur 2). Överväga följande rörelser eller ställningar som dystoni-liknande: hyperextension av främre lemmar, bred hållning eller hyperextension av hindlimbs samt kyfos. Betrakta dystoni som focal i fall en enda kroppsdel påverkas och som generaliserad i fall bålen och minst två andra kroppsdelar påverkas.
- Test för upphängning av svans
OBS: Svansupphängningstestet används ofta för att observera och poäng för bakblyvning. Detta är emellertid en mycket ospecifik fenotyp som indikerar en motorisk försämring. I följande protokoll föreslås ett poängsystem som är specifikt för dystoniliknande rörelser. På grund av generalisering av dystoni i DYT/PARK-ATP1A3 patienter, dystonia-liknande rörelser bör bedömas i främre lemmar, bål och bakben. Ett nyutvecklat poängsystem från 0-8 poäng utvecklades, en totalpoäng < 2 indikerade att inga dystoniliknande rörelser var närvarande (Figur 3).- Plocka upp musen vid svansen nära dess bas och lyft djuret upp. Spela in en 2 min video av svansen suspension test och tilldela en poäng i en efterföljande, grundlig analys av inspelningen.
- Betyg de främre lemmar från 0 till 4 poäng, där upprepade eller ihållande tonic upprullningar av en eller båda främre lemmar, samt en hyperextension kombinerat med korsning av de främre lemmar, klassificerades som dystoni-liknande: (0) inga onormala rörelser; (1) minskad rörelse av främre extremiteter med hyperextension av tassar sett ≥ 50% av den inspelade tiden; (2) mild dystoni-liknande rörelser framtill lem (s) < 50% av den inspelade tiden; (3) mild dystoniliknande rörelser av främre extremiteter(er) ≥ 50% av den inspelade tiden eller svår < 50% av den inspelade tiden; (4) svåra dystoniliknande rörelser av främre extremiteter(er) ≥ 50 % av den inspelade tiden.
OBS: Hindlimb knäppning är en onormal rörelse som inte bör poäng som dystoni-liknande. - Poäng hindlimbsna från 0 till 3 poäng, där upprullning och knöt av bakre extremiteter samt ihållande hyperextension bedömdes som dystoniliknande: (0) inga onormala rörelser; (1) minskad rörelse av bakben med hyperextension av tassar som setts ≥ 50% av den inspelade tiden; (2) dystoniliknande rörelser av en bakben; (3) dystoni-liknande rörelser av båda bakbenen.
- Vid truncaldistorsion > 80 % av den registrerade tiden läggs ytterligare en punkt till i poängen.
- Placera djuret tillbaka i sin bur.
Representative Results
Figur 4 har modifierats från Rauschenberger et al.17. För dataanalys av både dystoniklassificeringsskalan (A) och svansupphängningstestet (B), beräknar du totalpoängen för varje tidspunkt för varje djur. Medelvärdet för varje tidspunkt och varje grupp bör ritas på en lämplig graf. Fördelningen av värdena bör undersökas och lämpligt statistiskt test bör tillämpas för att fastställa signifikans. Med ett tillräckligt antal djur kan en motorfenotyp detekteras både med dystoniklassificeringsskalan liksom med bedömningen av onormala rörelser i svansupphängningstestet. Dystoni-liknande fenotyp framgår av den betydligt högre motor poäng i båda bedömningarna i ouabain-perfused, stressad grupp jämfört med ouabain-perfused, icke-stressade möss samt kontroll möss.
Bild 1: De huvudsakliga kirurgiska stegen för kanyl och osmotisk pumpimplantation. (A) För de angivna koordinaterna behöver man borra hål bilateralt för den dubbla kanyl som utsetts för de basala ganglierna och för den enkelskakola som placeras vid lillhjärnans mittlinje. De två fullt konstruerade osmotiska pumparna visas på var sida om djuret. (B) Bilden visar en implanterad, enkel kanyl in i lillhjärnan, fast med tandcement. Den dubbla kanylen för de basala ganglierna ska anslutas till bifurkationsadaptorn och förfyllas med ouabain före implantation. (C) Bild av den färdiga proceduren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Bedömning av dystoniliknande rörelser med en betygsskala för dystoni. Under en 4 min video, dystoni-liknande rörelser var poäng baserat på organ distribution och varaktighet. Ofrivillig hyperextension av de främre lemmar, en bred hållning eller hyperextension av hindlimbs samt kyphosis var klassade som dystonia-liknande. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av dystoniliknande rörelser under ett svansupphängningstest. Det nyligen utvecklade poängsystemet för onormala rörelser under en 2 min svans suspension test utvärderar dystoni-liknande rörelser i främre lemmar, bakben och bålen från 0-8 poäng totalt. För de främre lemmar, en hyperextension och korsning av de främre lemmar samt en tonic flexion mot bålen kvalificerad som dystoni-liknande. För hindlimbs den ofrivilliga hyperextension samt upprullning med förlängning över mittlinjen var poäng som dystonia-liknande. En truncal distorsion över 80% av den registrerade tiden gjordes med en poäng. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa grafer över dystoniklassificeringsskalan och testet för svansupphängning. (A) Diagrammet skildrar dystoni-rating skala för NaCl-perfused, stressade möss (prickade svarta linjen), ouabain-perfused, icke-stressade möss (prickade orange linje) och ouabain-perfused, stressade möss (mörkblå linje). För varje tidspunkt visas medelvärdena ± standardfel för medelvärdet (SEM). (B) Diagrammet visar bedömningen av onormala rörelser under ett 2-min tail suspension test för NaCl-perfunderade, stressade möss (prickade svarta linjen), ouabain-perfunderade, icke-stressade möss (streckad orange linje) och ouabain-perfunderade, stressade möss (mörkblå linje). Statistisk analys gjordes för dystoni betygskalan och svansen suspension test scoring med hjälp av två-tailed Mann-Whitney test. Bonferroni-Holm-korrigering (§) av p-värdena visade en signifikant skillnad för observationsperioden på 72 h. Mörkblå * betecknar signifikanta skillnader mellan ouabain-perfused, stressade möss och ouabain-perfused, icke-stressade möss möss, svart * betecknar signifikanta skillnader mellan NaCl-perfused, stressade möss och ouabain-perfused, stressade möss samt mellan NaCl-perfused, stressade möss och ouabain-perfused, icke-stressade möss. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Denna DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiska mus modell möjliggör en detaljerad analys av intrakraniell strukturella och neurokemiska förändringar som framkallas enbart genom hämning av natrium-kaliumjon pumpen i basala ganglierna och lillhjärnan samt ändringar i samband med stress exponering. Vid möss kan högst två osmotiska pumpar subkutant implanteras. Vi häri presentera en metod som beskriver kronisk drug leverans till flera hjärnan strukturer genom att genomföra en dubbel kanyl ansluten till en bifurcation adapter förutom en enda kanyl. Denna metodik kan användas för alla program som kräver flera hjärnstrukturer att perfused samtidigt och kroniskt.
Vi presenterar en mus modell av en sällsynt rörlighet störning, där patienter utvecklar permanenta symtom efter exponering för stress. Denna förmodade gen-miljö interaktion är fortfarande inte väl förstått, men kan utgöra en av de viktigaste pathomechanisms i DYT/PARK-ATP1A3 utveckling. Olika metoder för att utsätta möss för stress har publicerats i det förflutna och inkluderar elektriska fotstötar, fasthållande, kall eller varm miljö och exponering för olikalukter 11,12,13. I ett försök att exponera möss för en mild stressfaktor med translationellt värde beskriver vi här mössens repetitiva undersã¤ttning till utmanande motoriska uppgifter. För poltestet avslöjade ouabain-perfused djur ofrivillig hyperextension av främre lemmar och bakben. Dessa rörelser var mycket lika de dystoni-liknande rörelser som observerats under 4-min videoinspelning av djuren samt svans suspension test. Tillämpningen av mild stress i form av utmanande motoriska uppgifter kan visa sig användbart i andra musmodeller som visar motoriska symtom eller neurodegeneration, där gen-miljömässiga interaktioner kraftigt påverkar graden av sjukdomsprogression.
Det finns en allmän brist på fördefinierade beteendemässiga uppgifter samt betygsskalor för att klassificera onormala rörelser och ställningar hos möss. De flesta av de tillgängliga motoruppgifter avslöja ospecifika avvikelser, såsom hindlimb knäppning, som är ett välkänt fenomen i många mus modeller av rörelsestörningar med neurodegeneration18,19. För den rätta karakteriseringen av en fenotyp är det dock nödvändigt att analysera om musmodellen rekapitulerar sjukdomens framträdande egenskaper. Häri presenterar vi den modifierade versionen av en dystoni rating skala som tidigare använts för bedömning av motoriska funktionshinder i dystoni mus modeller15,16. Vi utvecklade dessutom en observatör-baserade poängsystem för svansen suspension test, som fastställdes på liknande sätt till de kliniska rating skalor av mänskliga dystoni. Båda betygsskalorna visar en betydligt högre poäng i ouabain-perfused, stressade möss jämfört med ouabain-perfused, icke-stressade djur samt fordon-perfused djur. Nackdelarna med alla observatörsbaserade poängsystem är den utbildning som krävs av bedömare för att säkerställa en konsekvent poängsättning och för att minska observatörsvariabiliteten samt risken för en eventuell bias av bedömaren om den inte är helt förblindad för den analyserade gruppen. Observatörsbaserade poängsystem presenterar dock fortfarande en lättillgänglig metod för att karakterisera en fenotyp och kan anpassas till den musmodell som analyseras, vilket görs i det föreliggande projektet för bedömning av dystoniliknande rörelser. För att säkerställa konsekvent poängsättning bland olika raters, utbildning videor bör göras tillgängliga. För att minska eventuella bias, rekommenderas att olika raters poäng samma videoklipp och att de enskilda poängen är i genomsnitt. Båda poängsystem som nämns inom detta arbete registrera förekomsten av dystoni-liknande rörelser hos djur. Betygskalorna kan anpassas enligt de särskilda kraven inom ett projekt, som tidigare gjorts av Ip et al., där enbart bakfoterna poängserades för dystoniliknande rörelser i en musmodell för dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Betygskalorna kan kompletteras med andra tidigare publicerade poängsystem, och bedöma till exempel graden av bradykinesi hos gnagare som gjort med förflyttningshandvissan av Calderon et al.13.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF DysTract till C.W.I.) och av tvärvetenskapligt Center for Clinical Research (IZKF) vid universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 till L.R.). Författarna tackar Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger och Heike Menzel och för deras tekniska hjälp samt Helga Brünner för djurvården.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
