Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نماذج الاستزراع المشترك للموائع الدقيقة لتشريح الاستجابة المناعية في البيئات الدقيقة للورم في المختبر

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

في عصر العلاج المناعي والتنميط الجينومي أحادي الخلية ، تتطلب بيولوجيا السرطان أدوات جديدة في المختبر وحسابية للتحقيق في واجهة الورم المناعية في سياق زماني مكاني مناسب. نحن نصف بروتوكولات لاستغلال الثقافات المشتركة للسوائع الدقيقة المناعية للورم في إعدادات 2D و 3D ، متوافقة مع المراقبة الديناميكية متعددة المعلمات للوظائف الخلوية.

Abstract

تتطلب نماذج الأمراض المعقدة أدوات متطورة قادرة على تقديم رؤى ذات صلة من الناحية الفسيولوجية والمرضية وقابلة للتنفيذ ، وكشف النقاب عن عمليات غير مرئية. تثبت فحوصات الخلايا المتقدمة التي تحاكي عن كثب مشهد الجسم الحي نفسها كطرق جديدة لتصور وقياس التفاعل ثنائي الاتجاه بين الورم والمضيف الذي يؤثر على تطور السرطان. هنا نصف بروتوكولين متعددي الاستخدامات لإعادة إنشاء ثقافات مشتركة 2D و 3D يمكن التحكم فيها بدرجة عالية في الأجهزة الدقيقة ، مما يحاكي تعقيد البيئة المكروية للورم (TME) ، تحت المراقبة المناعية الطبيعية والناجمة عن العلاج. في القسم 1 ، يتم توفير إعداد تجريبي لمراقبة الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية الملتصقة والمجموعات المناعية العائمة ، عن طريق الفحص المجهري الساطع للفاصل الزمني. كسيناريو تطبيقي ، نقوم بتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان ، مثل ما يسمى بمحفزات موت الخلايا السرطانية المناعية على تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية. في القسم 2 ، يتم تجميع البيئات الدقيقة المناعية للورم 3D في تخطيط تنافسي. تتم مراقبة التسلل المناعي التفاضلي من خلال لقطات مضان تصل إلى 72 ساعة ، لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المركبة. في كلا الإعدادين ، يتم توضيح خطوات معالجة الصور لاستخراج عدد كبير من معلمات الخلايا المناعية (على سبيل المثال ، هجرة الخلايا المناعية وتفاعلها ، والاستجابة للعوامل العلاجية). يمكن تصميم هذه الطرق البسيطة والقوية بشكل أكبر لمحاكاة تعقيد TME الذي يشمل عدم تجانس ومرونة السرطان والأنواع الفرعية للخلايا اللحمية والمناعية ، بالإضافة إلى تفاعلاتها المتبادلة كمحركات لتطور السرطان. يمكن أن يؤدي امتثال هذه التقنيات سريعة التطور للتصوير عالي المحتوى للخلايا الحية إلى إنشاء مجموعات بيانات إعلامية كبيرة ، مما يؤدي إلى ظهور تحديات جديدة. في الواقع ، فإن مثلث "الثقافات المشتركة / الفحص المجهري / تحليل البيانات المتقدم" يحدد الطريق نحو معلمة مشكلة دقيقة قد تساعد في بروتوكولات علاجية مصممة خصيصا. نتوقع أن يؤدي التكامل المستقبلي للمناعة ضد السرطان على رقاقة مع الذكاء الاصطناعي للمعالجة عالية الإنتاجية إلى تآزر خطوة كبيرة إلى الأمام في الاستفادة من القدرات كأدوات تنبؤية وما قبل السريرية للدقة وعلم الأورام الشخصي.

Introduction

يعتمد تطور فروع الطب المختلفة كتخصصات تجريبية على القدرة على التعامل مع عدد الخلايا ووظائف الأعضاء في ظل ظروف خاضعة للرقابة1. هذه القدرة لها جذورها في توافر نماذج قابلة للقياس قادرة على تلخيص العمليات التي تحدث في أجسامنا.

في عصر العلاج المناعي والتنميط الجيني أحادي الخلية 2 ، تحتاج بيولوجيا السرطان إلى الاستفادة من النماذج الناشئة في المختبر والحسابية للتحقيق في واجهة الورم المناعية في سياق زماني مكاني مناسب 2,3.

البيئة المكروية للورم4 (TME) هي نسيج معقد حيث تتفاعل الخلايا السرطانية باستمرار وتتطور ديناميكيا مع المكونات الخلوية الأخرى (الخلايا المناعية واللحمية والبطانية) وغير الخلوية (المصفوفة خارج الخلية ، ECM). تحدد الطبيعة الديناميكية لهذا المشهد المعقد ما إذا كانت الخلايا المناعية تلعب دور الأصدقاء أو الأعداء للخلايا الخبيثة ، مما يؤثر بشدة على كل من تطور المرض والاستجابة للعلاج. في الوقت الحاضر ، تتقارب الجهود الكبيرة من علماء المناعة السرطانية والمعلوماتية الحيوية وخبراء بيولوجيا الأنظمة لمعالجة الأهمية السريرية لعدم تجانس السرطان 5,6 ، إما في الفضاء (أي في مناطق الورم المتميزة) والوقت (أي في مراحل تطور الورم المتميزة)5,6 ، وتوصيف السرطان والنمط الظاهري للخلايا المناعية ووظيفتها على مستوى خلية واحدة. كمثال على هذا التآزر ، يتم الآن استخدام تقنيات الرؤية الحاسوبية المتقدمة بشكل روتيني لرسم الخرائط المكانية للتسلل المناعي في العينات النسيجية 7,8.

على جبهة النماذج التجريبية ، وسد الدراسات الحيوانية والطرق التقليدية في المختبر ، والتقدم في علم الموائع الدقيقة وتقنيات الزراعة المشتركة تتيح الوصول إلى فئات مختلفة من النماذج الخلوية المهندسة الدقيقة مثل المواد العضوية والأنظمة الفسيولوجية الدقيقة9،10،11 (MPS) والأعضاء على الرقاقة12،13،14 (OOC). يشتركون في السمة المشتركة لتكبير عرض "الصورة الكبيرة" للنظم الإيكولوجية الخلوية وتوسيع الإمكانات في المختبر للتحكم في العوامل البيئية الدقيقة مع استغلال الفحص المجهريعالي المحتوى 15 ونهج معالجة الصور.

في الوقت الحاضر ، بدأت أحدث أنظمة MPS و OOC في تضمين الجوانب المناعية ، ودمج أنواع فرعية مختلفة من الخلايا المناعية في الأنسجة الموجودة والثقافات المشتركة ، وذلك لاستكشاف وقياس مجموعة متنوعة من العمليات مثل الأمراض الالتهابية ، والتئام الجروح ، والمناعة المخاطية ، والاستجابة للسموم أو المنتجات الغذائية اليومية16. تم تطوير نماذج TME-on-a-chip 10،11،12،13،14،15،16،17 ، المدمجة أيضا مع الأوعية الدقيقة القابلة للكسر18،19،20،21 ، للتحقيق في التفاعلات المعتمدة على نوع الخلية ، والاضطرابات الفيزيائية والكيميائية ، والنشاط السام للخلايا تسلل الخلايا الليمفاوية22 ، وكذلك العوامل المناعية ذات الصلةسريريا 23.

هنا ، نقدم بروتوكولات متعددة الاستخدامات ، تمتد من تحميل الخلايا في الرقائق إلى أدوات معالجة الصور ، لاستغلال الثقافات المشتركة المتقدمة للسوائع الدقيقة المناعية للورم في إعدادات 2D (القسم 1) و 3D (القسم 2)16 ، متوافقة مع المراقبة الديناميكية متعددة المعلمات24 وتصور الوظائف الخلوية. يتم تحقيق ذلك مع الحفاظ على سهولة الاستخدام والمرونة في كل من إدارة العينات وتحليل البيانات ، والاستفادة من برامج فيجي المجانية وصناديق أدواتها25,26.

تم تصميم جهاز الموائع الدقيقة ، الموصوف في القسم 1 ، لأداء الثقافات المشتركة ثنائية الأبعاد للسرطان الملتصق والخلايا المناعية العائمة. تم التحقق من صحة هذه المنصة للقياس في المختبر لسلوك الخلايا المناعية في وجود طفرات جينية27 و / أو نقص المناعة28. هنا ، نوضح خطوات تتبع الخلايا المناعية في صور المجال الساطع ذات الفاصل الزمني ، من خلال استغلال طريقة شبه تلقائية تعتمد على Trackmate (مكون إضافي تم تنفيذه في برنامج فيجي). يتيح هذا الإجراء استخراج الواصفات الحركية للهجرة المناعية 29 والاستجابة (أي أوقات التفاعل) لاستهداف الخلايا السرطانية ، المعالجة أم لا بمحفزات موت الخلايا المناعية27.

الأهم من ذلك أن هذه المعلمات ، المستخرجة من صور السلاسل الزمنية ، يمكن معالجتها باستخدام آلات رياضية متقدمة. كمثال على إمكانات هذا النهج ، نشرت مجموعاتنا مؤخرا تحليلا يعتمد على الأساليب الرياضية من العمليات العشوائية والميكانيكا الإحصائية لنمذجة خصائص الشبكة الخلوية وتقديم وصف معلمات لسلوك الخلايا المناعية (أي المشي العشوائي المتحيز أو غير المرتبط ، الحركة المنسقةللغاية أو غير المنسقة 30,31).

يعتمد إعداد 3D ، المقدم في القسم الثاني ، على بروتوكول الثقافة المشتركة لإعادة إنشاء TMEs أكثر تعقيدا من المناعة المضمنة في منطقتين هلاميتين مع مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا والأدوية بطريقة تنافسية. هنا ، يتم وصف خطوات معالجة الصور لقياس ، في نقاط زمنية مختلفة ، تسلل الخلايا المناعية الملطخة في خلايا سرطان الجلد البشرية A375M المزروعة داخل Matrigel ، لتقييم مجموعات العوامل المضادة للأورام32. تم اختيار خط A375M ، وهو خط خلية مشتق من A375P يتميز بنمط ظاهري نقيلي للغاية لتقييم قدرتها النقيلية في وجود الخلايا المناعية32.

يمكن أن تكون النماذج الموصوفة متوافقة تماما مع مصادر الخلايا المختلفة (الفئران وخطوط الخلايا البشرية الخالدة أو الأولية ، والمواد العضوية ، والطعوم الخارجية ، وغيرها). في الدراسات الحديثة لمختبرنا ، من خلال الجمع بين الفحص المجهري للفيديو عالي المحتوى وتحليل الصور ، تم تطبيق تخطيط 3D التنافسي للتحقيق: i) استجابة مناعية مضادة للورم (السمية الخلوية بوساطة الأجسام المضادة ، ADCC) وتشريح دور الخلايا الليفية في مقاومة علاج تراستوزوماب في نماذج سرطان الثدي HER2 + على الرقاقة33 ؛ عمل الخلايا النخاعية (أي الضامة المرتبطة بالسرطان) في آليات التهرب من الورم وتجنيد الخلايا التائية34 ؛ فعالية أنظمة العلاج المناعي ، وتحديدا على أساس الخلايا المتغصنة المكيفة بالإنترفير α ون (IFN-DCs) ، المزروعة بخلايا سرطان القولون المعالجة بالعقاقير في مصفوفات الكولاجين ، وتقييم الحركة الفعالة وأحداث البلعمة اللاحقة35 ؛ iv) الهجرة الكيميائية للحمضات المشتقة من نخاع العظم نحو خلايا سرطان الجلد المعالجة أو غير المعالجةIL-33 36.

يمكن أن تكون هذه النماذج المتقدمة بمثابة نوافذ مراقبة لفهم دور النسيج المناعي في ورم خبيث للسرطان وآليات المقاومة ، ولكن هناك حاجة إلى بذل جهود لترجمة النتائج إلى العيادات ، وسد الفجوة مع البحث الأساسي37.

كسيناريو ناشئ ، فإن تسخير قوة الفحص المجهري الآلي عالي المحتوى إلى جانب استخدام أنظمة دقيقة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يفتح تحديات محتملة جديدة للتعامل مع ومعالجة وتفسير مئات ، بل آلاف ، غيغابايت من البيانات متعددة المعلمات ، والتي يمكن إنشاؤها من حملة تجريبية واحدة. وهذا يعني وجود صلة مباشرة لتجارب OOC مع الذكاء الاصطناعي38،39،40،41،42 (الذكاء الاصطناعي) () - الخوارزميات القائمة على كل من التحليل الآلي المتقدم ، وتوليد الميزات التي يمكن أن تغذي بدورها في نماذج السيليكو للتفاعل المناعي للسرطان 43 ، مع تطبيقات جديدة مثيرة في الأفق ، مثل تطوير فحوصات فحص الأدوية التنبؤية 44.

يركز تدفق الجهود المتزايد باستمرار على تصميم نماذج الأمراض جنبا إلى جنب مع تحسين الاستراتيجيات لتنفيذ شاشات الاضطراب واسعة النطاق مع قراءات متعددة الخلايا أحادية الخلية. سيساعد هذا بلا شك في تطوير ، ونأمل ، التنفيذ السريري ، مصحوبا بدرجة مناسبة من توحيد الطريقة ، لنهج منهجي لعلم المناعة على رقاقة لاكتساب رؤى جديدة حول الاضطرابات المناعية وآليات نشر السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم رقاقة للخلايا الملتصقة والعائمة الثقافات المشتركة 2D

ملاحظة: يتميز تخطيط الاستزراع المشترك ثنائي الأبعاد (الشكل 1A-C) بثلاث غرف (ارتفاع 100 ميكرومتر) مترابطة بمجموعتين من صفائف القنوات الدقيقة (500 × 12 × 10 ميكرومتر3 ، L×W ×H). تشكل الغرفة الوسيطة مقصورتين مغلقتين مسدودتين تمنعان الخلايا المناعية العائمة التي تفيض في موقع الورم أثناء خطوة التحميل 2.5. هذا النوع من الأجهزة مفيد للقياسات ثنائية الأبعاد في الوقت الفعلي لحركة الخلية الواحدة (إما الملتصقة أو العائمة) ، وتفاعلات الخلاياالخلوية 16،27،28،30،31. تجمع دراسة هجرة الخلايا النموذجية (التي أجريت من عدة ساعات إلى عدة أيام) بين الفحص المجهري للخلايا الحية وخوارزميات معالجة الصور45 ، من أجل ترجمة تسلسلات الصور المكتسبة إلى ميزات عددية25. بناء على أنماط الهجرة ، يمكن تقدير العديد من المؤشرات الفيزيائية الحيوية ، مثل إزاحة الخلايا وسرعتها ، وكذلك مدة تفاعلات الخلايا المناعية والخلايا المستهدفة24.

  1. تحضير السرطان وخلايا PBMC
    1. زراعة الخلايا السرطانية
      ملاحظة: MDA-MB-231 ثلاثي سلبي [مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) - ، مستقبلات البروجسترون (PR) - ، ومستقبل عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2)-] تزرع خلايا سرطان الثدي الغدي البشري بشكل روتيني في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط مكمل ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) ، 2 mM L- الجلوتامين ، 100 وحدة دولية مل −1 البنسلين G ملح الصوديوم و 100 ميكروغرام مل −1 كبريتات الستربتومايسين (وسط النمو) ، في ظل ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
      1. لتحسين نمو زراعة الخلايا ، صفيحة خلايا MDA-MB-231 في قارورة 75 سم2 بكثافة 1 × 106 خلايا mL-1 في 12 إلى 15 مل من وسط النمو.
      2. عندما تصل الخلايا إلى 75-80٪ من الالتقاء ، تخلص من وسط النمو ، واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تم تسخينه مسبقا لإزالة FBS تماما ، ثم افصلها بالتربسين المسخن مسبقا (1 إلى 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية).
      3. أضف وسط نمو لتعطيل النشاط الأنزيمي للتربسين وجمع الخلايا المنفصلة. اغسل الخلايا مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
      4. عد الخلايا في شريحة عد الخلايا عن طريق اختبار استبعاد صبغة Trypan Blue ثم أعد زرعها إما لثقافة الصيانة (لما لا يزيد عن 6 مقاطع من الذوبان) أو للإجراءات التجريبية.
      5. بالنسبة لتجارب الموائع الدقيقة ، × البذور 106 خلايا في 6 ألواح جيدة في 3 مل من وسط النمو وإما أن تعالج ب 25 ميكرومتر دوكسوروبيسين (DOXO) أو حجم متساو من مذيب DOXO (PBS) كعنصر تحكم.
      6. بعد أربع إلى 6 ساعات ، اغسل الخلايا المعالجة ب DOXO مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT.
      7. عد خلايا التحكم المعالجة ب DOXO والمعالجة ب PBS على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1.1.5) وقم بتعيين الثقافة المشتركة مع خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في أجهزة الموائع الدقيقة.
    2. عزل PBMC
      1. اجمع الدم الكامل الوريدي (10 مل تقريبا) من متطوعين أصحاء في قوارير هيبارين واخلطها برفق عن طريق قلب الأنبوب 2 إلى 4 مرات47.
      2. تمييع الدم 1: 1 مع برنامج تلفزيوني وطبقة أكثر من 10 مل من Lymphoprep متوسط التدرج الكثافة في أنبوب 50 مل.
        ملاحظة: تأكد من عمل الطبقات بلطف شديد وببطء للسماح للدم و Lymphoprep بتشكيل طبقتين متميزتين.
      3. أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 400 × جم عند 4 درجات مئوية في دلو متأرجح بدون فرامل. ستتشكل أربع طبقات متميزة: (i) البلازما في الأعلى ، (ii) طبقة بيضاء وغائمة تحتوي على PBMCs ، (iii) Lymphoprep ، و (iv) حبيبات من كريات الدم الحمراء والخلايا المحببة.
      4. قم بنضح PBMCs برفق باستخدام ماصة سعة 2 مل وأعد تعليقها على الفور في وسط نمو دافئ (نفس الشيء المستخدم في الخطوة 1.1.1) واغسله مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT.
      5. عد PBMCs الحبيبية على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1.1.5) وإما استخدامها للإجراءات التجريبية أو تجميدها للتخزين طويل الأجل.
  2. تصفيح الخلايا في رقائق 2D
    ملاحظة: PBMCs ليست ملطخة في هذا البروتوكول. لتوصيف أنماط ظاهرية محددة على الرقاقة ، يمكن عزل المجموعات الفرعية للخلايا المناعية عن طريق اختيار حبة مغناطيسية مناعية ، ملطخة بأجهزة تتبع الخلايا الفلورية ، وإعادة مزجها مع الجزء المتبقي غير المسمى ، وبالتالي مواجهة الخلايا السرطانية المستهدفة ، كما ورد في التجارب على الرقاقة ، الموصوفة في Vacchelli et al.27 ، وفي Racioppi et al.34.
    1. قبل البدء في تجارب الاستزراع المشترك ولتسهيل إضافة الكواشف ، قم بتنشيط الرقائق المخزنة عن طريق معالجة بلازما الأكسجين لبضع ثوان. املأ الخزانات على الفور بالماء منزوع الأيونات أو PBS للحفاظ على أسطح PDMS (polydimethylsiloxane) محبة للماء حتى خطوات الطلاء.
      ملاحظة: PDMS كاره للماء في جوهره ، مما قد يؤدي إلى صعوبات في التشغيل وفي انحباس فقاعات الهواء في القنوات الدقيقة. انظر الخطوة 7 في الملف التكميلي الذي يوفر تفاصيل حول تنشيط بلازما الأكسجين.
    2. تعقيم تحت خزانة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة ، وغسل 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني جديد ، ثم احتضان مع وسائل الإعلام الثقافة لمدة 1 ساعة. احتفظ بالرقائق في الحاضنة حتى يتم تنفيذ خطوات الطلاء.
    3. سحب الوسائط الزائدة من جميع الخزانات الستة. احرص على تجنب امتصاص وسائل الإعلام من غرف الثقافة الرئيسية.
    4. ضع ببطء 1 × 105 خلايا سرطانية أعيد تعليقها في 10-20 ميكرولتر من وسط النمو في الخزان الأيسر العلوي ، ثم في البئر السفلي (الشكل 1 أ ، الخزانان 1 و 2). انتظر 5 دقائق للسماح للخلايا بالالتصاق بغرفة الورم. تستقر بعض الخلايا وتعلق في الخزانات.
      ملاحظة: أدخل التعليق الخلوي بجوار فتحات القناة. يتم تطبيق هذا الإجراء على الخلايا السرطانية MDA-MB-231 ، وستتطلب الخطوط الأخرى تحسين كثافة الخلايا. لتحسين ارتباط الخلايا السرطانية ، يمكن إجراء وظيفة طلاء للأسطح (على سبيل المثال ، بولي-L-ليسين ، فيبرونيكتين). يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة مسبقا لخطوات الطلاء16 و 48 و 49 و 50.
    5. على الجانب الأيمن ، يتم إعادة تعليق ماصة 1 × 106 PBMCs برفق في 50 ميكرولتر من وسط النمو في الآبار 3 و 4 (انظر الشكل 1 أ ، الخزانان 3 و 4).
      ملاحظة: بعد التدفق ، سيتم توزيع PBMC في الغرفة الوسيطة لإنشاء "جبهة" ، والتي تمثل نقطة البداية للتجربة.
    6. املأ جميع الخزانات الستة بما يصل إلى 100-150 ميكرولتر من وسط النمو. تحت المجهر ، تحقق من أن الخلايا قد وزعت بشكل صحيح في حجرات الاستزراع كما هو موضح في الشكل 1D-E. يمكن أن تختلف الأحجام النهائية باختلاف حجم الخزانات. اضبط الأحجام لتكون متساوية في جميع الآبار.
    7. ضع الرقائق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 1 ساعة تقريبا لتثبيت النظام قبل تسجيل الفاصل الزمني. أضف وسطا جديدا كل 3 أيام ، حيث قد يتعرض لخسائر التبخر.
      ملاحظة: النظام متوافق مع كل من تحليل الخلايا الحية / الميتة وتوصيف إفراز السيتوكين المتعدد الديناميكي من الوسائط المكيفة. بالنسبة لتحليلات الكيموكين ، يمكن الوصول إلى ما يصل إلى 200-250 ميكرولتر من القسامات الطافية عن طريق جمع الوسائط من خزاني كل حجرة. تتطلب فحوصات تنميط السيتوكين ELISA و Luminex الكلاسيكية حوالي 50 ميكرولتر من المواد الطافعة. يرجى الاطلاع على 51،52 مثالا على دراسات المختبرات الأخرى التي تقوم بتوصيف السيتوكين على نماذج OOC.
  3. اكتساب الفاصل الزمني للسرطان غير المسمى والخلايا المناعية
    ملاحظة: عادة ، يتم ترتيب 3 شرائح على شريحة مجهر واحدة (انظر الشكل 1A لشريحة 2D والشكل 4B لشريحة 3D). باستخدام حاملات المسرح التي تخصص 4 شرائح ، يمكن أن تكون الثقافات المشتركة مناسبة للمراقبة بواسطة الفحص المجهري الآلي عالي المحتوى لتحليل مجموعات كبيرة من الظروف التجريبية. يمكن تركيب الرقائق بسهولة على شرائح بسمك يساوي 1 مم أو 170 ميكرون (أغطية بلاستيكية أو زجاجية ، وآبار متعددة القاع البصري ذات 6 آبار) للتصوير البؤري عالي الدقة.
    1. سجل سلسلة صور المجال الساطع للخلايا غير المسماة عن طريق إعداد مجهر فيديو مجهز بنظام حضانة.
      ملاحظة: هنا تم الحصول على مجموعات بيانات السلاسل الزمنية (النافذة الزمنية: 48 ساعة ، معدل الإطارات: 2 دقيقة) باستخدام مجهر مضان ، مجهز بهدف 4x و CMOS 1.3M بكسل ، محسن ليلائم حاضنة زراعة الخلايا القياسية.
    2. قم بتسخين المجهر لمدة ساعتين على الأقل لموازنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل بدء الاستحواذ.
    3. حدد نافذة المراقبة عن طريق توسيط مجموعة القنوات الدقيقة بين الورم والمقصورة المركزية. هذا يسمح لتصور ديناميات التسلل المناعي والتفاعلات داخل المنطقة التي يتم فيها زرع الخلايا السرطانية.
    4. اضبط شدة الإضاءة وتركيز السرطان والخلايا المناعية.
    5. لبدء اكتساب الفاصل الزمني ، قم بتحسين معدل الإطارات والمدة الزمنية وفقا للتجربة ونوع الخلية قيد الدراسة.
      ملاحظة: يجب تحسين ظروف التصوير لتجنب التعرض المفرط للصور مع الحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة (SNR). نظرا لأن الخلايا المناعية متحركة للغاية ، يجب أن يكون معدل إطارات الاستحواذ مرتفعا بما يكفي لمتابعة العملية الديناميكية ذات الاهتمام وتمكين التتبع السهل53. يجب التوصل إلى حل وسط بين خوارزمية التتبع ، والتوافق مع حجم مجموعة البيانات الناتجة ، وصلاحية الخلايا المرصودة وكثافتها وحركتها.
    6. في نهاية الفاصل الزمني ، استخدم وظيفة استيراد تسلسل الصور وحفظ باسم برنامج ImageJ لتحويل مجموعة بيانات الإطار في ملف فيديو غير مضغوط بمعدل 25 إطارا في الثانية.
      ملاحظة: ملف الفيديو الذي تم إنشاؤه جاهز الآن لتحليل تتبع الخلايا. هنا ، تم جمع صور RGB (1280 × 1024 بكسل) بدقة مكانية تبلغ 1.33 ميكرومتر / بكسل. يتكون فيلم مدته 24 ساعة (مكدس 3.5 جيجابايت) لمجال رؤية واحد (FOV) من 720 إطارا لكل حالة.
  4. تحليل البيانات: استخراج شبه تلقائي للمسارات المناعية غير المسماة بواسطة Trackmate
    ملاحظة: هنا ، يتم إجراء تحليل الحركة المناعية في صور الفاصل الزمني غير المسماة 2D باستخدام TrackMate54، وهو صندوق أدوات مفتوح المصدر متاح في حزمة برمجيات Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). يتم توفير العديد من الخوارزميات لإجراء تتبع آلي لجسيم واحد55(SPT) من الهياكل الشبيهة بالبقع. تم تطبيقها بكفاءة على الصور الفلورية ، حيث تكون الأجسام ساطعة على خلفية داكنة ذات نسبة إشارة إلى الضوضاء عالية (أي بقع الفلورسنت دون الدقة ، والحويصلات المرورية المسماة ، والنوى)1,25,56,57,58. وتستند اللجنة الفرعية لمنع التعذيب أساسا إلى خطوتين متسلسلتين. أولا ، يتم توطين الكائنات بمواضع محددة في إطارات متعددة (تجزئة) ، كما هو مخطط فيالشكل 2. في المرحلة الثانية (ربط الجسيمات) ، يتم ربط البقع المكتشفة على إطارات متتالية لتقدير الحركة وإعادة بناء مساراتها ، في شكل مسار (الشكل 3). يمكن حساب الميزات العددية من كل صفيف إحداثيات X و Y و Z مستخرج بمرور الوقت. يتم الإبلاغ عن الوثائق الموسعة في54وكذلك عبر الإنترنت (http://imagej.net/TrackMate) ، باتباع البرنامج التعليمي لبدء استخدام TrackMate. يمكن فحص دقة العملية على الفور ، والتعامل مع واجهة مستخدم رسومية بديهية (واجهة مستخدم رسومية تشبه المعالج) تمكن المستخدمين ، في كل خطوة ، من إعادة ضبط الإعدادات. يصور الجزء التالي بإيجاز كيفية استخدام Trackmate لمعالجة الصور وخطوات القياس الكمي ، المطبقة على صور الضوء المرئي:
    1. اسحب مكدس الفيديو / الصورة بدوام كامل وأفلته على شريط أدوات فيجي.
    2. إعداد مكدس المعايرة (الشكل 2 أ).
      1. تحقق من الأبعاد وقم بتعيين خصائص الصورة عن طريق تحديد خصائص الصورة> . تعبئة وحدة الطول وأبعاد البكسل ومربعات الفاصل الزمني للإطار.
        ملاحظة: لإجراء المعايرة ، استخدم الطول المعروف للقنوات الدقيقة (500 ميكرومتر ، الشكل 1C) واقسم على الطول المقاس المقابل بالبكسل. بالنسبة للسلاسل الزمنية 2D ، تأكد من تبديل حقل Z / T الذي يدخل 1 كشريحة z والعدد الصحيح لإطارات الأفلام. إذا لم يتم إنجازه ، الإبلاغ عن المخرجات والمعلمات الكمية ل Trackmate بوحدات البكسل والأطر الزمنية.
    3. المعالجة المسبقة للصور.
      1. لتعزيز التمييز الصحيح للخلايا المناعية من خلفية صاخبة ، قم بمعالجة صور المجال الساطع مسبقا لتعويض القطع الأثرية. تأكد من أن مجموعات البيانات تتكون من صور TIFF 8 بت (نطاق السطوع: 0-255).
        ملاحظة: يمكن أن تؤدي الإضاءة غير المتساوية ، وانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والتلوث بجسيمات الحطام الصغيرة في صور الضوء المرئي إلى الإضرار بنجاح عملية تتبع الخلية. هنا ، تتم معالجة مجموعات بيانات السلاسل الزمنية مسبقا من خلال طرح الخلفية ، ووظيفة ضبط السطوع / التباين ، وعن طريق طرح الصورة المحلية لطمس Gaussian من الصور الأصلية. هناك مجموعات أدوات تحليل مختلفة أخرى متوفرة في ImageJ لمعالجة وتجزئة صور تباين الطور أو صور المجال الساطع ، بما في ذلك عتبة التدرج التجريبي (EGT) 59.
    4. لوحة المعايرة الأولى (الشكل 2 أ)
      1. مع تحديد مكدس الصور ، ابدأ تشغيل Trackmate (المكونات الإضافية > التتبع).  مراجعة / تأكيد الأبعاد والنافذة الزمنية للبيانات (أي عرض البكسل والفاصل الزمني للإطار).
        ملاحظة: يقرأ TrackMate تلقائيا في مربع خصائص الصورة لإعطاء نتائج التتبع النهائية بوحدات مادية معايرة (أي ميكرومتر ودقائق).
      2. حدد منطقة ذات أهمية لحساب استخراج المسارات المناعية، عن طريق إدراج القيم يدويا أو عن طريق رسم منطقة مغلقة فوق الصورة النشطة، ثم الضغط على زر تحديث المصدر. لاستخراج مسارات الهجرة المناعية العالمية ، حدد مناطق مستطيلة على التوالي على الجانب الأيمن من القنوات الدقيقة (الغرفة المركزية ، الشكل 1E) وعلى اليسار (غرفة الورم ، الشكل 1D). لتحليل التفاعلات بين السرطان والنقاط الساخنة المناعية ، ارسم مناطق فرعية دائرية باستخدام أدوات عائد الاستثمار (انتقل إلى تحرير → التحديد → تحديد).
        ملاحظة: عند تشغيل صندوق الأدوات هذا لأول مرة على تطبيق بيولوجي جديد ، اقض الوقت اللازم لتحسين الإعدادات لإعادة بناء المسارات.
        ملاحظة: قم بإجراء تتبع يدوي لمسارات الخلية (حوالي 50-100 خلية) للعثور تجريبيا على التكوين الصحيح وبعد ذلك للتحقق من موثوقية الاستخراج التلقائي للحركات كمعيار. بالإضافة إلى ذلك ، اعمل في البداية على مساحة أصغر للتحقق بسهولة من دقة المعلمات المختارة.
    5. خطوة الكشف عن البقع المناعية (الشكل 2 ب)
      1. حدد كاشف لابلاسيان غاوسيان (LoG) الافتراضي. يعمل كاشف LoG على العثور على أجسام مستديرة ساطعة تشبه النقطة وتطبيق مرشح Laplacian of Gaussian على الصورة التي تم ضبطها لأحجام البقع المتوسطة (قطرها من 5 إلى 20 بكسل).
      2. في قطر النقطة المقدر (هنا ، 10-13 ميكرومتر) أدخل قيمة أكبر قليلا من حجم البقعة المتوقع. قم بزيادة قيمة العتبة (هنا 1-3 ميكرومتر) حتى يتم تقليل نقاط الخلفية الزائفة الإضافية ربما دون إزالة ميزات الكائن. سيتم تجاهل الاكتشافات التي تقل عن قيمة العتبة (استنادا إلى مقاييس الجودة) من التحليل اللاحق. حدد المربع الخاص بالمرشح المتوسط وتوطين البكسل الفرعي لتحسين جودة اكتشاف البقعة.
      3. استخدم زر المعاينة لعرض الخلايا المناعية المحددة المتراكبة على الصور بواسطة دوائر أرجوانية اللون وفحصها بسرعة.
        ملاحظة: سيكون للأخطاء أثناء الكشف تأثير كبير على عملية الربط. يمكن تصحيح الاكتشافات الأخرى غير المرغوب فيها في القوائم اللاحقة بواسطة عوامل تصفية محددة من قبل المستخدم (أي حسب كثافة البقعة أو الحجم أو الموضع).
    6. بمجرد الرضا عن التحديدات ، اضغط على التالي.
      ملاحظة: قد تختلف هذه الإعدادات اعتمادا على الإعداد التجريبي وطرق التصوير المكتسب (على سبيل المثال ، مجال الرؤية ، التكبير الموضوعي ، صور المجال الساطع أو الفلورسنت) ، نوع الخلية (الخلايا الملتصقة أو العائمة) ، من الحركة البطيئة أو السريعة ، نوع السلوك الخلوي (التفاعل أم لا) والكثافة المنخفضة / المتوسطة / العالية في منطقة المراقبة.
    7. متابعة وتخطي قائمة العتبة الأولية. حدد نافذة مشغل المكدس الفائق.
    8. اضبط المرشحات على لوحة البقع (الشكل 2C).
      1. حدد: لون موحد. يمكن إضافة المرشحات ، كما هو موضح في الشكل 2C ، للاحتفاظ بالبقع المصنفة بقيم المعالم ، المعروضة في مدرج تكراري ، أعلى أو أسفل عتبة قابلة للعكس.
    9. مرحلة اختيار المتعقب (الشكل 3 أ). اختر متعقب LAP البسيط ، كخوارزمية ربط الجسيمات تطلب ملء ثلاثة حقول (في هذه الحالة ، "ربط المسافة القصوى": 30-50 ميكرومتر ، "المسافة القصوى لإغلاق الفجوة": 25-50 ميكرومتر ، "فجوة الإطار القصوى لإغلاق الفجوة": 4-6). يدير هذا الكاشف أحداث سد الفجوة ، مع حساب ربط التكلفة فقط بناء على المسافة الخاصة بكل منها.
      ملاحظة: الحد الأقصى المسموح به لمسافة الربط يحد من نطاق البحث المكاني للبقع المطابقة المرشحة ، المقابلة للإزاحة القصوى المسموح بها التي يقطعها بين إطارين لاحقين (الشكل 3D).
      1. توفير قيم أكبر للإزاحة القصوى عند ملاحظة تجزئة مسارات الجسيمات عالية الحركة.
        ملاحظة: لن يتم توصيل وصلتين إذا كانت الحركة من إطار إلى إطار أكبر من قيمة المسافة القصوى المحددة. إذا كانت المقاطع تربط بشكل سيئ خليتين مختلفتين ، قلل من قيمة الإزاحة القصوى.
      2. حاول إعادة توصيل النقاط المفقودة ، مع تغيير قيم "المسافة القصوى لإغلاق الفجوة" و "فجوة الإطار القصوى".
        ملاحظة: تتعامل هذه المعلمات مع أحداث إغلاق الفجوة في الإطارات غير المتجاورة. قد يحدث اختفاء موضعي لبعض الإطارات (على سبيل المثال ، الجسيمات خارج التركيز ، والخلايا التي تترك للخارج وفي مجال الرؤية ، وفشل التجزئة في صورة صاخبة).
        ملاحظة: للتعامل مع أحداث التقسيم أو الدمج ، اختر رابط LAP ككاشف يقدم عقوبات مصفوفة تكلفة الربط.
    10. انقر فوق التالي لتشغيل حساب التتبع. اضغط على التالي.
    11. لوحة مسارات التصفية (الشكل 3 ب). قم بتغيير لون المسارات المناعية المحددة ، من القائمة المنسدلة ، "معرف المسار" أو ميزات المسار الأخرى. في هذه المرحلة ، اختر اختياريا لتعيين المرشحات التفاعلية الوظيفية ، لتحسين جودة النتيجة وإعادة النظر في الإجراء.
      ملاحظة: تنشأ البقع الزائفة من الضوضاء في الصورة وفقدان جودة الميزة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء مقاطع قصيرة بينما يمكن تتبع الخلايا ذات الأهمية عبر العديد من الإطارات.
      1. لإزالة المسارات القصيرة ، حاول التصفية ، بناء على عدد البقع التي تحتوي عليها. بالإضافة إلى ذلك ، قم بفرز المسارات باستخدام مجموعة من الخيارات مثل إزاحة المسار أو مدة المسار أو السرعة الدنيا / المتوسطة / القصوى لاستبعاد المسارات الخاطئة أو غير المرغوب فيها (مع عدد أقل من الإطارات فيما يتعلق بالمدة الإجمالية للفاصل الزمني أو التي تتضمن جزيئات متسخة أو غير متحركة) من المعالجة اللاحقة الإضافية.
        ملاحظة: يمكن أن يختلف اختيار المرشحات حسب التطبيق المحدد والنظام البيولوجي.
    12. افحص كل المسارات في واجهة خيارات العرض، وقم بالتمرير عبر الزمن، وتحقق من مدى دقة تطابق المسارات مع مسارات ترحيل الخلايا. توفر القائمة المنسدلة رموز ألوان للبقع والمسارات لسهولة التصور والتصفية بعدة طرائق (على سبيل المثال ، المعلمات الحركية أو الكثافة أو الموقع الزمني أو المكاني).
      ملاحظة: لتتبع الثقافات عالية الكثافة ، أو الخلايا عالية الحركة ، قم بزيادة معدل إطارات الاستحواذ لتقليل إزاحة الخلية التي تنتقل في فترات زمنية متتالية.
    13. التصحيح اليدوي لأخطاء التجزئة والربط (الشكل 3E).
      1. لتحسين جودة النتائج بشكل أكبر ، قم بتحرير البقع يدويا (جزيئات الحطام والخلايا الثابتة) وإزالة المسارات الخاطئة المستمدة من حدود الورم المكتشفة عند تحليل عائد الاستثمار للتفاعل المناعي للورم.
      2. أولا، حدد أداة TrackMate في شريط أدوات ImageJ. لإزالة بقعة موجودة في جميع أنحاء المكدس بأكمله ، اضغط على shift وقم بإنشاء قناع عائد استثمار بواسطة مؤشر الماوس فوق النقطة المستهدفة (تم تحريره في دائرة خضراء) ، ثم اضغط على مفتاح DEL.
      3. لإضافة بقعة جديدة (في حالة فقدان المسارات بسبب اختفاء البقع) ، اضغط على المفتاح A ، وضع الماوس في الموقع المدبب. كرر عملية حساب ربط المسارات بعد هذه الخطوة.
    14. عند الرضا ، حدد تحليل في لوحة خيارات العرض لإنشاء ثلاثة ملفات نصية (الشكل 3C و 3F). يوفر الجدول في "إحصائيات البقع في المسارات" الإحداثيات الزمانية المكانية للبقع المناعية (مواضع X-Y-Z للخلايا الموسومة بالإطار المرتبط ورقم المسار). تحتوي "الروابط في إحصائيات المسارات" و "إحصائيات المسار" على معلومات تتعلق بالمسارات: مدد المسار ، وعدد الفجوات أو النقاط المكتشفة ، والإطار الأولي للمسار وإطار التوقف ، وما إلى ذلك. حفظ وتصدير لكل مجموعة بيانات.
      ملاحظة: عند النقر فوق صف داخل نوافذ النتائج ، يتم تنشيط النقطة أو الرابط أو المسار المعني داخل فيديو الفاصل الزمني للفحص البصري. كرر خطوات التصفية لتحديد / إزالة المسارات. سيتم تحديث جميع البيانات المصدرة في المستقبل. نصيحة: يمكن استغلال قيم المسار الأولي وإطار التوقف ومدة المسار لحساب أوقات الاتصال بين السرطان والخلايا المناعية عند معالجة عائد الاستثمار للتفاعل.
    15. اضغط على زر حفظ لإنشاء ملف XML ناتج يحتوي على كل قيم المعلمات والمسار إلى الصور ومواضع التركيز في الوقت المناسب. يستعيد الأمر "تحميل ملف TrackMate" (تتبع المكونات الإضافية >) جلسة العملية بأكملها لكل ملف فيلم على حدة.
    16. الانتقال إلى اللوحة الأخيرة من واجهة المستخدم الرسومية المسماة تحديد إجراء. في القائمة ، استخدم تراكب الالتقاط> وظيفة التنفيذ لإنتاج مقطع فيديو مع تراكب المسارات. نصيحة: يمكن استخدام خيار "رسم N-spot مقابل الوقت" لحساب الكثافة المكانية للخلايا المناعية في عائد الاستثمار (الشكل 6B ، اللوحة اليمنى).
    17. تحليل ما بعد التجهيز وإحصاءات الهجرة
      1. تحليل البيانات الموضعية الخام مباشرة في Trackmate أو تصدير البيانات لحساب المعلمات الحركية الشاملة29 (أي طول المسار الكلي ، المسافة الإقليدية ، نسبة الحبس ، متوسط الإزاحة التربيعية56 ، متوسط سرعة المسار أو لحظيتها ، معامل الاعتقال ، توزيع زوايا الهجرة ، مؤشر الهجرة الأمامية ، متوسط سرعة الخط المستقيم) لتصنيف سلوك هجرة الخلايا المناعية (على سبيل المثال ، الحركة الموجهة أو المنتشرة 30 ، 31) والاستجابة للخلايا السرطانية المستهدفة (على سبيل المثال ، المعالجة مقابل السيطرة).
        ملاحظة: توفر المكونات الإضافية المفيدة الإضافية مثل The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) رسوما بيانية مختلفة (على سبيل المثال ، Rose أو مخططات قطاعية ، كما هو موضح في الشكل 6) واختبارات إحصائية للتحليل المتقدم وتصور بيانات الهجرة التجريبية والانجذاب الكيميائي. قد يتيح الجمع بين تتبع الخلية وخوارزميات تجزئة الخلايا24،25،45 قياسات المقاييس المورفولوجية على مستوى الخلية الواحدة (أي مساحة سطح الخلية ، وطول المحور الرئيسي والثانوي ، ونسبة العرض إلى الارتفاع للخلية).

2. نموذج 3D للسرطان المناعي على الرقاقة في مقايسة تنافسية

ملاحظة: يتكون تصميم الرقاقة ثلاثية الأبعاد ، الموضح فيالشكل 4 ، من 5 مقصورات رئيسية: واحدة مركزية لدخول الخلايا المناعية العائمة ، ومنطقتان جانبيتان لتضمين الخلايا السرطانية في  مصفوفات هيدروجيل (ارتفاع 150-250 ميكرومتر) ، وغرف تروية الوسائط. ترتبط غرف المناعة والأورام بمجموعتين من الصفائف الضيقة من القنوات الدقيقة (200×12×10 ميكرومتر3 ، L×W×H ، الشكل 4E). تعمل بانتظام 100 ميكروبرين شبه منحرف متساوي الساقين متباعدة (حوالي 25-30 واجهة لكل منطقة هلام جانبية ، الشكل 4C) كحواجز لحصر محلول الهلام أثناء الحقن باستغلال التوازن بين التوتر السطحي والقوى الشعرية60,61 وتوصيل مناطق الورم بغرفتي الوسائط الإضافيتين الجانبيتين من أجل تعيين واجهة هلام سائل (الشكل 5). يتم عرض الميزات التفصيلية للفحص التنافسي ثلاثي الأبعاد في الشكل 4. يمكن مراقبة الهجرة التفضيلية للخلايا المناعية نحو مقصورتي هيدروجيل تستضيفان الخلايا السرطانية التي خضعت لعلاجات مختلفة وقياسها. يمكن تطبيق التصميم التنافسي الخاص للتحقيق في عدد كبير من الأنماط الظاهرية المختلفة لبيولوجيا السرطان (على سبيل المثال ، مقاومة الأدوية مقابل العدوانية ، الأولية أو النقيلي ، المستجيبون مقابل غير المستجيبين). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج المناطق المدمجة في الهلام بسهولة مع مجموعات الخلايا المختلفة لإعادة إنشاء المزيد من TMEs غير المتجانسة ، بما في ذلك المكونات اللحمية (الخلايا الليفية والخلايا البطانية)23 أو لمحاكاة بيئة مثبطة للمناعةمحددة 34 (على سبيل المثال ، البلاعم) لتشريح آليات مقاومة الأدوية والتهرب من الورم.
ملاحظة: يمكن تنفيذ تلطيخ الكاسباز النووي والنشط ، باستخدام مجموعات تجارية للمقايسات الحية / الميتة (على سبيل المثال ، Thermo Fisher Scientific ، كواشف Incucyte) ، لتقييم أحداث الوفاة الانقسامية أو موت الخلايا المبرمج ، كما ورد في Nguyen et al.33.

  1. تحضير محلول المصفوفة بالخلايا والتحميل في الجهاز
    ملاحظة: في الإعداد التجريبي التالي ، تحتوي منطقتا الهلام على خليط من خطوط خلايا سرطان الجلد البشرية A375M ، المزروعة في محلول مصفوفة (على سبيل المثال ، Matrigel) ، معرضة لعوامل علاجية تستخدم كعلاج وحيد أو مجتمعة. سمح لنا هذا الإعداد بتقييم فعالية مزيج من عقارين فيما يتعلق بالأدوية الفردية بطريقة تنافسية وتحديد قدرتها على جذب PBMCs.
    1. قم بإذابة مخزون من محلول المصفوفة (على سبيل المثال ، Matrigel) عن طريق وضعه على الثلج في ثلاجة 4 درجات مئوية قبل يوم واحد من التجربة.
      ملاحظة: لا تعرض المنتج لدورات تجميد وذوبان متعددة لأنه يصبح "متكتلا". يمكن أن تكون بروتوكولات الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية الأخرى مناسبة للاستخدام في هذا الإعداد. يرجى الرجوع إلى 33،34،35 لإعداد الخلايا السرطانية في مصفوفات الكولاجين.
    2. أعد تعليق خلايا سرطان الجلد البشرية A375 ، الملطخة برابط الخلايا الفلورية الخضراء PKH67 المتوافق مع الحياة في محلول مصفوفة (2 مجم مل -1). عند الإشارة ، أضف 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC ؛ 2.5 μM) ، المشار إليه باسم DAC ، و / أو IFN-α2b ، المشار إليه باسم IFN ، بالجرعات المناسبة32.
      ملاحظة: تطابق اللوت # على ورقة مواصفات زجاجة المصفوفة. بناء على التركيز ، احسب حجم الوسط اللازم لتكوين ما يصل إلى 2 مجم مل -1 يرجى ضبط تركيز البروتين الأمثل وتركيز تعليق الخلايا السرطانية وفقا لتطبيق اهتمامك.
    3. ماصة صعودا وهبوطا بعناية لتجنب توليد الفقاعات. احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد أثناء الخلط لمنع أي بلمرة غير مرغوب فيها.
    4. بعد التعقيم ، ضع الأجهزة على الثلج (باستخدام دلو ثلج وغطاء) لتجنب تصلب محلول المصفوفة أثناء الإجراء الكامل لتحميل الخلايا.
    5. قم بحقن مخاليط الخلايا السرطانية IFN و DAC / IFN Matrigel / الخلايا السرطانية ببطء (2-4 ميكرولتر) في منفذ الهلام الأيسر والأيمن ، على التوالي باستخدام ماصة دقيقة 10 ميكرولتر باستخدام أطراف باردة (الشكل 5 أ). اضغط برفق لدفع محلول المصفوفة من جانب واحد حتى يصل إلى الجانب الآخر.
      ملاحظة: تم اختيار حجم محلول المصفوفة لتجنب الفيضان في القنوات المجاورة. لا تمارس ضغطا مفرطا لمنع المحلول من التسرب إلى الوسائط والقنوات المركزية. إذا تم حظر مسار الهلام أثناء التحميل على طول القناة ، فحاول إدخال المحلول من المدخل الآخر حتى تلتقي واجهات الهلام. عند إزالة الماصة الدقيقة من المداخل ، أمسك المكبس ، وإلا فإن الضغط السلبي سوف يستنشق محلول المصفوفة.
    6. ضع الجهاز في حاضنة في وضع رأسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة للسماح بحدوث هلام محلول المصفوفة (الشكل 5B). تعامل مع رقائق العناية مع هلام مدمج غير مبلمر لمنع التسرب من قناة الهلام.
    7. في غضون ذلك ، أعد تعليق PBMCs المسمى PKH67 (1x106 خلايا) في 10 ميكرولتر من DMEM الكامل (وسط النسر المعدل من Dulbecco).
    8. بعد هلام المصفوفة، املأ قنوات الوسائط ب (50-100 ميكرولتر) نفس الحصة من وسط الاستزراع في جميع الخزانات الستة لمنع جفاف الهلام في الرقائق. يحفظ في الحاضنة حتى يعلق الخلايا المناعية البذر.
      ملاحظة: تحقق تحت المجهر من التوزيع الصحيح والمتجانس للخلايا السرطانية في الجل وسلامة حواجز الهلام المبلمرة. تؤدي المناطق أو الفقاعات المتبلورة المنتظمة جزئيا أو غير المنتظم في الخليط إلى التدفق المبكر ل PBMCs في قنوات الوسائط الهلامية عند نقطة بداية التجربة بسبب التقلبات الأولية للضغط.
    9. قم بشفط الوسائط من الآبار الستة وضع الطرف بالقرب من مدخل قناة الوسائط للحقن برفق مع تعليق خلية PBMC بضغط معتدل. يصور الشكل 5 ج التسلسل الزمني للتحميل:
      1. PBMCs في وسط 10 ميكرولتر في البئر المركزي العلوي.
      2. 50-100 ميكرولتر وسط في كل من الآبار الأربعة للقنوات الجانبية.
      3. 40-90 ميكرولتر متوسطة في البئر المركزي العلوي.
      4. 50-100 ميكرولتر متوسطة في البئر المركزي السفلي.
    10. تأكد تحت المجهر من أن توزيع PBMCs يظل محصورا في الغرفة المركزية بعد خطوة التحميل. (الشكل 7 أ).
      ملاحظة: إذا لم يكن هو الأمثل ، اضبط التركيز إذا لزم الأمر وكرر خطوات البذر ، باستخدام رقائق البكر. عند حساب الأحجام للظروف التجريبية المخطط لها ، راجع العدد الزائد من الرقائق (15-20٪) لمراعاة الأخطاء والتعديلات المحتملة. يجب تحسين الأحجام والتركيزات وفقا للتطبيق المحدد.
    11. ضع الأجهزة المجمعة على سطح مستو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للحصول على التصوير الفلوري اللاحق. تعامل مع رقائق العناية بعد تحميل الخلايا المناعية العائمة.
      ملاحظة: تعويض الخسائر التبخرية للأحجام في الخزانات عن طريق استبدال الوسائط كل 2-3 أيام. بالنسبة لتوصيف الكيموكين، يمكن استنشاق ما يصل إلى 100 ميكرولتر من كل بئر من مقصورات الاستزراع، يرجى الرجوع إلى الخطوة 2.7، في الخطوة 1.
  2. العد الآلي ل PBMCs المعينة في صور الفلورسنت أحادية القناة في ImageJ
    ملاحظة: يمكن تطبيق الطرق الكلاسيكية للتألق المناعي للتصوير عالي الدقة متحد البؤر على العمليات على الرقاقة كقياسات لنقطة النهاية. يتضمن إجراء التلوين الأساسي تثبيت الخلية على الرقاقة ، والنفاذية ، والحجب ، وربط الأجسام المضادة ، وتلطيخ النوى مع خطوات الغسيل بينهما. يمكن تثبيت الخلايا المناعية غير المصنفة التي تسللت في مناطق المواد الهلامية ثلاثية الأبعاد مع البيئات الدقيقة للسرطان المضمنة في النقاط الزمنية المرغوبة وتلطيخها لعلامات التعبير عن التنشيط / الإرهاق / النضج (على سبيل المثال ، لخلايا CD8 ، ومراقبة علامات CD69 و CD95 و PD1 و TIM3). في قضية بارلاتو وآخرون.35، تم تقييم البلعمة لخلايا موت الخلايا المبرمج SW620 بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، باستخدام أجهزة مثبتة على أغطية بسمك 170 ميكرومتر. تم تلطيخ IFN-DCs بإضافة قسامات HLA-DR-FITC Ab المضادة للإنسان.
    لحساب مدى تسلل الخلايا المناعية الحية الملطخة بالفلورسنت التي تواجه تحديات بإشارات تنافسية ، يتم تعيين سير عمل شائع لتحليل الصور على النحو التالي (الشكل 7 د-ز):
    1. اكتساب ، في نقاط نهاية زمنية محددة ، تباين الطور ، والقنوات الحمراء / الخضراء صور مجهرية مضان لمناطق الهلام اليسرى واليمنى التي تحتوي على خلايا سرطانية معرضة على التوالي لأنظمة دوائية مفردة أو مختلطة.
      ملاحظة: تم التقاط الصور هنا بواسطة مجهر مضان EVOS-FL بعد تحميل الخلية (0 ساعة) وبعد 48 ساعة وبعد 72 ساعة من الحضانة (الشكل 7A-B). تم استخدام تكبير 4x-10x للحصول على الغرفة المركزية ، ومصفوفات القنوات الدقيقة ، والقناتين الجانبيتين المتجاورة اللتين تحتويان على A375 plus IFN و A375 بالإضافة إلى DAC / IFN.
      1. عند إجراء عمليات الاستحواذ ، ضع في اعتبارك المعلمات لقياس وتجنب تشبع الميزات المراد حسابها. تعتمد نتائج التجزئة المثلى على طبيعة الصور التي تم الحصول عليها ، بسبب التباين في العينات البيولوجية نفسها ، وجودة التلوين ، وتقنيات الفحص المجهري المستخدمة في التطبيقات الموجهة للمستخدم.
    2. قم بتحميل بيانات القناة المفردة الفلورية (في هذه الحالة red = PBMCs) ، في فيجي عن طريق سحبها إلى النافذة الرئيسية (الشكل 7D). قم بتكرار الصورة لتجنب الكتابة فوق البيانات الأولية أثناء تحديد مرشحات المعالجة المسبقة حتى التجزئة النهائية.
      1. إذا كانت الصورة صورة ملونة (RGB) ، فاضغط على Image > Type 8 أو 16 بت للتحويل إلى تدرج رمادي. تحقق من ضبط خيارات تحرير > > التحويلاتعلى القياس عند التحويل.
    3. المعالجة المسبقة للبيانات الأولية عن طريق تنظيف الضوضاء والتحف.
      1. انتقل إلى قائمة المعالجة > طرح الخلفية عن طريق تطبيق خوارزمية الكرة المتدحرجة لتصحيح خلفية الضوضاء غير المستوية مع اختلافات مكانية كبيرة في الشدة. اضبط نصف القطر على حجم أكبر جسيم أمامي على الأقل. اختر مربع المعاينة لإجراء التجربة والخطأ للحصول على أفضل النتائج. قد تؤدي القيم الصغيرة جدا إلى إزالة هياكل الاهتمام بشكل غير صحيح.
      2. في أمر السطوع والتباين اسحب منزلقات الحد الأدنى/الحد الأقصى لتغيير نطاق الشدة في الرسم البياني. قم بإزاحة شريط التمرير الأقصى إلى اليسار لزيادة السطوع ، بدون ميزات الغسل. حرك الشريحة الأدنى إلى اليمين لزيادة تباين الصورة لتجنب اختفاء المعالم الأقل وضوحا في الخلفية. انقر على تطبيق لإصلاح التغييرات.
    4. تحسين الصورة.
      1. انتقل إلى معالجة مرشحات > وجرب المرشحات المتوسطة الغاوسية على الصور (الشكل 7E).
        ملاحظة: يجب تكييف نصف قطر التصفية المسبقة مع وحدات بكسل ضوضاء الصورة. يستبدل المرشح الوسيط غير الخطي قيمة البكسل بالقيمة المتوسطة للجيران ، لتقليل ضوضاء الملح والفلفل. يستخدم "Gaussian Blur" لتنعيم صورة رقمية ، عن طريق استبدال وحدات البكسل بمتوسط مرجح من وحدات البكسل المحيطة. تأتي الأوزان من التوزيع الاحتمالي الغاوسي ، وبالتالي فإن أقرب وحدات البكسل أكثر تأثيرا.
      2. انتقل اختياريا إلى معالجة > الرياضيات > جاما مع مربع معاينة محدد لزيادة التباين.
        ملاحظة: يتم قياس الشدة المحددة في لوحة B&C بين الحدين الأدنى والحد الأقصى. تبرز القيم < 1.0 الاختلافات بين الشدة المنخفضة بينما تبرز القيم > 1.0 الاختلافات بين الشدة العالية. تصحيح جاما وظيفي للعثور على نطاق عرض ، يظهر الكائنات الأكثر خفوتا دون تشبع الأكثر سطوعا.
    5. إنشاء قناع صورة ثنائية.
      1. انتقل إلى الصورة > ضبط > الحد. تعتمد الطريقة الأكثر استخداما لتحديد العتبات على تحليل الرسم البياني لمستويات الشدة ، كما هو موضح في الشكل 7F. في القائمة المنسدلة ، العب بطرق عتبة عالمية مختلفة (في حالتنا ، يتم تطبيق Otsu).
      2. قم بالتمرير يدويا أو اكتب نطاقا معروفا من كثافة البكسل في لوحات الرسم البياني ، ولاحظ تغيير النمط الأحمر الذي يتراكب مع الصورة والذي يشبه في الغالب منطقة الخلية الفعلية. يزيل زر إعادة الضبط التراكب. بمجرد الرضا ، انقر فوق تطبيق لإنشاء نسخة ثنائية من الصورة. تحقق من العملية > خيارات > الثنائية للتحكم في كيفية عرض الصور ذات العتبة وكيفية تعريف الكائنات بواسطة محلل الجسيمات.
    6. استخدم أمر القائمة معالجة/ثنائي/جسيمات مستجمعات المياه لتقسيم متداخلة جزئيا أو مدمجة أثناء العتبة. يمكن لمستجمعات المياه في كثير من الأحيان قطعها بدقة عن طريق إضافة خط بسمك 1 بكسل. قم بإجراء عمليات مورفولوجية مثل عمليات التمدد أو التآكل إما لتنمو أو تزيل البيكسلات من البيكسلات السفلية أو المشبعة بشكل زائد.
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات راجع قسم أوامر القائمة أو الرجوع إلى MorphoLibJ ، وهي مكتبة متكاملة تعتمد على التشكل الرياضي لمعالجة البيانات الثنائية.
    7. وصف ميزة الصورة الكمية.
      1. بمجرد الحصول على التعرف المرضي على الأشياء ، افتح محلل الجسيمات من تحليل > تحليل الجسيمات. يمكن استبعاد الجسيمات حسب حجمها ودائريتها ، معبرا عنها بالبكسل أو بوحدة قياس معايرة (تحقق من المقياس الصحيح بالنسبة لإعدادات المجهر ضمن خصائص > الصورة). لتضمين كل شيء ، احتفظ بالنطاق الافتراضي الافتراضي 0-Infinity والدائرية عند 0.00 - 1.00 (0 = خط مستقيم ، 1 = دائرة مثالية).
      2. لتصفية وحدات البكسل "الضوضاء" الصغيرة أو الميزات التي لا تهمك ، اضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للنطاق. حدد خيارات تضمين الثقوب وإظهار وتحديد الخطوط العريضة وعرض النتائج في حقل النافذة. سيؤدي الاستبعاد على الحواف إلى تجاهل الجسيمات المكتشفة على حدود الصورة. إضافة إلى مدير يضيف التحديد الذي تم الحصول عليه إلى مدير عائد الاستثمار لمزيد من التحليل مع الحفاظ على معلومات موضع الجسيم.
        ملاحظة: في "مدير عائد الاستثمار" ، من الممكن تصحيح الإخراج المسجل للتجزئة التلقائية (دمج الخلايا المنقسمة ، تقسيم الخلايا المدمجة). حدد ، باستخدام أدوات التحديد في شريط أدوات فيجي ، عائد الاستثمار داخل كلتا منطقتي الهلام حيث يتم تضمين الخلايا السرطانية لتقدير التسلل المناعي.
    8. تصدير القيم التي تم الحصول عليها إلى جدول بيانات لإجراء التحليل الإحصائي كما هو موضح في الشكل 7G. تسرد "النتائج" جدول بيانات متعلق بخصائص الجسيمات المحددة المرقمة المحددة. يفتح "تلخيص" نافذة باسم الصورة والأعداد الإجمالية ومعلومات أخرى للصورة بأكملها.
      1. انتقل إلى تحليل > تعيين القياسات لتضمين نطاق واسع من المعلمات.
    9. سجل ماكرو اختياريا (عن طريق تحديد المكونات الإضافية > وحدات الماكرو > السجل) لأتمتة سير عمل المعالجة وتوفير تحليل الوقت على مجموعات البيانات الكبيرة.
      1. استخدم نفس روتين المعالجة لتحليل قناة التألق الخضراء في نفس المناطق لتحليل التغيرات المورفولوجية للخلايا السرطانية في مناطق 3D16

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التسلل المناعي للورم هو معلمة للاستجابة المضادة للورم المضيف. الأورام غير متجانسة في التكوين والكثافة والموقع والحالة الوظيفية للكريات البيض المتسللة التي يمكن أن تكمن التفاعلات مع الخلايا السرطانية في المعلومات ذات الصلة سريريا للتنبؤ بمسار المرض والاستجابة للعلاج. وبهذا المعنى ، يمكن استخدام تقنيات الموائع الدقيقة كأدوات تكميلية ومميزة في المختبر لاستكشاف النسيج المناعي للأورام ، وكذلك لمراقبة الاستجابة للعلاجات المضادة للسرطان. قد يؤدي اقتران فحص الموائع الدقيقة وتصوير الخلايا الحية وبرامج التتبع إلى إنشاء طرق قياس كمية موثوقة لتحديد كيفية ضبط الخلايا المناعية لنمط هجرتها في سياقات مختلفة. في هذا الفصل ، أبلغنا عن خطوات لإعداد ثقافات مشتركة 2D أو 3D متعددة الاستخدامات للخلايا السرطانية المناعية والمستهدفة في أجهزة الموائع الدقيقة المخصصة التي تتحقق من خلال إجراءات الطباعة الحجرية اللينة القياسية. في القسم 1 ، تم استخدام أجهزة الموائع الدقيقة للسماح بالاتصالات الكيميائية والفيزيائية بين السكان الملتصقين (الخلايا السرطانية MDA-MB-231) وغير الملتصقة (PBMCs). يمكن لبعض عوامل العلاج الكيميائي (على سبيل المثال ، أنثراسيكلين وغيرها) أن تحفز موت الخلايا المبرمج "المناعي" للخلايا الخبيثة ، وبالتالي تعزيز ظهورها في المضيفين ذوي الكفاءة المناعية. يتميز موت الخلايا المناعية السرطانية (ICD) بإطلاق إشارات مرتبطة بالغشاء وقابلة للذوبان تنقلها الخلايا الميتة التي تعمل كإنذارات للخلايا المناعية. لتوفير التحقق الكمي من استجابة ICD ، نستخدم البيانات التي تم جمعها في منصة الموائع الدقيقة حيث يمكن أن تتحرك كريات الدم البيضاء عبر جسور microchannel المبنية بشكل مناسب نحو خلاياها المستهدفة. تم إجراء تسجيلات الفاصل الزمني بعد التحميل المشترك ل PBMCs ، من متبرعين أصحاء (WT ، النوع البري) ، مع خلايا سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 المعالجة مسبقا أم لا باستخدام أنثراسيكلين دوكسو. تم إنشاء صور مجهرية كل دقيقتين ، لفترتين زمنيتين متتاليتين من 24 و 48 ساعة. (نموذجي فيلم S1 من 0-24 ساعة الفاصل). تم إجراء تحليل التتبع ل PBMCs الفردية التي تم تحديها مع الخلايا السرطانية المحتضرة (المعالجة ب DOXO) أو الخلايا السرطانية الحية (المعالجة ب PBS) باستخدام المكون الإضافي Trackmate ، كما هو موضح في الشكل 6 أ (اللوحة اليسرى). تم إنشاء قيم الانجذاب الكيميائي ذات الصلة ومخططات الترحيل تلقائيا باستخدام الانجذاب الكيميائي وأداة الترحيل ، كما هو مفصل في62. تم استقراء جميع مسارات الخلية إلى (x ، y) = 0 في الوقت 24 h. أشارت النتائج إلى صورة هجرة مختلفة للخلايا المناعية عند تحميلها مع خلايا سرطان الثدي المعرضة ل DOXO أو PBS. عندما واجهت PBMCs خلايا سرطان موت الخلايا المبرمج ، عبروا القنوات الدقيقة نحو الخلايا الميتة / الميتة (ولكن ليس للعيش في الخلايا غير المعالجة). مؤامرات العنكبوت والورد Migration X / Y ، معروضة في اللوحة اليسرى الشكل 6B-C، وتمت مقارنتها لتسليط الضوء على تأثير عوامل المحرضات المناعية على الاختلافات في ديناميات المناعة. تظهر مخططات الورد أن PBMCs هاجرت بشكل أساسي في جميع الاتجاهات تقريبا في تجربة التحكم ، ولا يتم توجيه سوى جزء ضئيل إلى أعلى التدرج الناتج عن تكاثر الخلايا السرطانية. على العكس من ذلك ، فإن مسارات الخلايا الفردية تسلط الضوء على حركة تحيز قوية على طول اتجاه خلايا سرطان الثدي المبرمج (الاتجاه x السلبي). لتقييم هجرة الخلايا المناعية الموجهة نحو الخلايا السرطانية المعالجة ب DOXO أو المعالجة ب PBS ، يتم حساب العديد من معلمات الانجذاب الكيميائي ، بما في ذلك: أ) مركز الكتلة (نقطة المتوسط المكاني لجميع نقاط النهاية) ؛ ب) الاتجاه؛ ج) مؤشر الهجرة إلى الأمام (أي متوسط إزاحة الخلايا في اتجاه الاهتمام مما يعني نحو موقع الورم المستهدف ، في حالتنا). تمثل القيم الأخيرة قياسا لكفاءة الخلية في الهجرة في الاتجاه المعطى للمحفزات الكيميائية. بعد الوصول إلى الغرفة اليسرى ، أظهر جزء صغير من كريات الدم البيضاء ذات الكثافة المتزايدة خلال 24-48 ساعة اتصالات طويلة الأمد (>60 دقيقة) مع MDA-MB-231 المعالج ب DOXO. تفشل PBMCs في الهجرة على نطاق واسع والانخراط في مثل هذه التفاعلات طويلة الأجل والمستمرة مع الخلايا السرطانية الحية (كما هو موضح في الصور المجهرية التمثيلية للاقتراب من PBMCs في الشكل 6 أ، يمين). لتحديد الاختلافات في التفاعل المناعي للورم ، تم تحديد منطقة الورم بدائرة ثابتة قطرها يتراوح بين 20-80 ميكرون ، تسمى "نقطة ساخنة". يتم عرض القياس الكمي والتحليل من FOVs التمثيلية في الشكل 6 (اللوحة اليمنى ، B-C).

في القسم 2 ، تم وصف نموذج ورم جديد ثلاثي الأبعاد ذو كفاءة مناعية لتحديد تجنيد الخلايا المناعية استجابة لمجموعات مضادة للسرطان من الأدوية اللاجينية32 (DAC / IFN مقابل IFN وحدها) ، مما يسمح بمقارنة حالتين علاجيتين مختلفتين لخلايا سرطان الجلد A375 في وقت واحد. وهكذا ، تم تضمين خلايا سرطان الجلد A375M ، الموسومة بصبغة الفلورسنت الخضراء PKH67 في مصفوفات Matrigel في وجود DAC و / أو IFN في كل غرفة هلام ، في حين تم توزيع PBMCs ذات العلامات الحمراء PKH26 بشكل متجانس في غرفة السوائل المركزية عند نقطة البداية (الشكل 7 أ). قارنا في وقت واحد كتلتي الورم في مصفوفات 3D لقدرتها على جذب PBMCs. عند 48 و 72 ساعة ، يتم توجيه PBMCs بشكل كبير إلى القنوات الدقيقة اليمنى ، كما لوحظ في الشكل 7B.

لوحظ بوضوح توجيه تفضيلي ل PBMCs نحو مصفوفة الهلام التي تحتوي على DAC / IFN المعالج ، بدلا من موقع سرطان الجلد المعالج ب IFN ، في حين كان معدل الهجرة الضعيف مرئيا نحو خلايا A375 المعرضة لعلاج واحد (جانب الرقاقة اليسرى). ينطبق الإعداد التنافسي على التحقيق في عدد كبير من الأنماط الظاهرية المختلفة لبيولوجيا السرطان (على سبيل المثال ، مقاومة الأدوية مقابل العدوانية أو الأولية أو النقيلي (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الجلد A375P مقابل A375M) ، والمستجيبين مقابل غير المستجيبين). يمكن أن تتكون غرف الهلام من ثقافات مشتركة معقدة للخلايا الخبيثة والعديد من الخلايا غير السرطانية المرتبطة بالورم ، مثل الخلايا البطانية والخلايا المناعية والخلايا الليفية33 لتوصيف استجابات الأدوية على مستوى TME. يمكن مراقبة أحداث الانقسام وموت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية عن طريق تلطيخ الأصباغ الحية33. يمكن تكييف إجراءات التلوين المناعي على أجهزة الموائع الدقيقة 3D لتقييم حالات تنشيط الخلايا المناعية المتسللة في مواقع الورم عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر35. وبهذا المعنى ، قد تحاكي أنظمة الموائع الدقيقة 3D هذه هياكل الورم المعقدة والتفاعلات متعددة الخلايا ، وبالتالي فهي منصات قيمة لاختبار الأدوية قبل السريرية الأكثر موثوقية.

Figure 1
الشكل 1. Planimetry من جهاز الموائع الدقيقة لتجميع الثقافات المشتركة المناعية للورم 2D. (أ) صورة مجهرية حقيقية ل 3 رقائق مجمعة في شريحة مجهر واحدة. يتم ترقيم الخزانات اعتمادا على تسلسل التحميل ويتم ترميزها بالألوان مثل غرف الاستزراع المقابلة المدرجة في وسيلة الإيضاح. مقياس ، 6 مم (B) 3D CAD من رقاقة تتكون من ثلاث مناطق زراعة الخلايا الرئيسية متصلة بواسطة microgrooves. ج) تفاصيل جسر الأخاديد الدقيقة الضيق ، والتي توضح الأبعاد المصممة خصيصا للخلايا السرطانية وحجم PBMCs. D-E) تم الحصول على صورة مجهرية للضوء المرئي قبل بداية الفاصل الزمني ، مما يدل على توزيع الخلايا السرطانية و PBMCs على التوالي في الغرفة اليسرى والمتوسطة. مقياس ، 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. خط أنابيب تحليل Trackmate لتوطين البقع المناعية في صور السلاسل الزمنية. أ) اللوحة العلوية: لقطة شاشة لقائمة معايرة صور Trackmate. اللوحة السفلية: فيجي "قائمة خصائص الصورة" لضبط الوقت والوحدات المكانية. ب) اللوحة العلوية: لقطة شاشة لقائمة "اكتشاف البقع" في Trackmate. اللوحة السفلية: صورة الإخراج مع تطبيق قيم مختلفة من "العتبة". ج) اللوحة العلوية: لقطة شاشة لقائمة Trackmate "تصفية البقعة" توضح بعض المرشحات. اللوحة السفلية: صورة نموذجية بفاصل زمني ، تصور البقع المناعية التي تمت تصفيتها حسب الموضع على طول X في الغرفة المتوسطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. خط أنابيب تحليل Trackmate لإعادة بناء المسارات المناعية في تسلسلات صور السلاسل الزمنية. A-C) لقطات شاشة لقوائم Trackmate لبناء المسارات وتصفية المسارات وتصدير البيانات النهائية. د) أمثلة على المسارات التي تم إنشاؤها في صور الفاصل الزمني المعالجة مسبقا والتي تغير إعدادات كاشف الربط. ه) مثال على المسارات الخاطئة والروابط السيئة المستمدة من الكشف عن حدود الخلايا السرطانية. و) يتم تمييز المسارات باللون الأخضر عن طريق تحديد صفوف في ملف .txt النتائج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. نظرة عامة تخطيطية لرقائق الورم المناعية 3D. أ) مثال على سيد السيليكون ذو البنية الدقيقة. تم تصميم طوابع PDMS في مقاومة سلبية SU-8 في منشأة غرف الأبحاث المجهزة بالشعاع الإلكتروني والطباعة الحجرية البصرية. ب) تم تصنيع النسخ المتماثلة PDMS بطرق الطباعة الحجرية اللينة القياسية. تحتوي الوحدة المركزية على غرف ملونة مثل تلك المرسومة في عرض 3D للرقاقة ، كما هو موضح في اللوحة D. C) المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) عرض موسع لمجموعة من micropillars المناسبة لحبس محلول هيدروجيل. د) 3D CAD تظهر الغرف ، متصلة بواسطة microgrooves وآبار التحميل. تتم إحالة الصناديق المتقطعة إلى صور SEM للتفاصيل (اللوحة C و E). ه) صورة SEM لأخاديد دقيقة متصلة بارتفاع 10 ميكرومتر. F) تخطيط 2D CAD يصور أبعاد الهياكل المجهرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. سير العمل التخطيطي لخطوات بروتوكول التحميل الرئيسية لتجميع الثقافات المشتركة 3D. أ) اللوحة العلوية: مخططات خطوة حقن محلول Matrigel في كل منطقة جانبية هلامية. اللوحة السفلية: صورة حقيقية للشريحة تظهر تقدم واجهة الجل على طول القناة أثناء خطوة التحميل. ب) مخططات خطوة بلمرة ماتريجيل. اللوحة السفلية: منظر مجهري على النقيض من الطور لواجهة الهلام والهواء التي تشكلت بعد خطوة الهلام. مقياس ، 100 ميكرومتر. ج)اللوحة العلوية: رسم يصور تحميل الخلايا والوسائط بأحجام مثالية مستخدمة في البروتوكول. اللوحة السفلية: يتم عرض صورة تباين الطور 4X للثقافة المشتركة المجمعة عند 0 ساعة. مقياس ، 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6. تحليل ملامح الهجرة وسلوك تفاعل PBMC تجاه غرفة الورم الميتة / الحية في النافذة الزمنية من 24-48 ساعة. اللوحة اليسرى. أ) لقطات شاشة لصور معالجة مسبقا بفاصل زمني متراكبة مع مسارات ملونة مناعية ، مستخرجة بواسطة Trackmate. يتم الحصول على المسارات المناعية بواسطة مجال رؤية واحد في الظروف التجريبية المشار إليها في الفترة من 24 إلى 48 ساعة في الغرفة المتوسطة. B-C) مسارات الهجرة التمثيلية وقطع الورد من PBMCs المزروعة في حالتين مختلفتين (n = 1550 PBMCs مقابل الخلايا السرطانية المعالجة ب DOXO ، DOXO + أو n = 1434 PBMCs مقابل الخلايا السرطانية الضابطة ، DOXO-). يصور كل سطر داخل مخططات x-y مسارا واحدا ل PBMC وتمثل كل دائرة الموضع النهائي لخلية واحدة فيما يتعلق بالموضع الأولي. يتم تعيين نقاط البداية إلى (0,0) باستخدام تحويل إحداثي. يتم عرض إحداثيات وإزاحة مركز كتلة هجرة الخلايا في الظروف التجريبية المشار إليها. يوفر مركز إحداثيات الكتلة والإزاحة (محسوبا كمتوسط المسافة الإقليدية لمكونات X و Y) مؤشرا على متوسط الاتجاه الذي انتقلت فيه مجموعة الخلايا بشكل أساسي وحجم حركة الخلية الكلية في مجموعات الحالة. تشير الخطوط الزرقاء والخضراء على التوالي إلى المسارات الفردية بقيمة المسافة الإقليدية أكبر / أصغر من قيمة العتبة (100 ميكرومتر). د) مخطط البيانات العددية المستخرجة بواسطة مسار الخلية. E-F) مخطط Box and Whiskers الذي يصور الاتجاه على التوالي (p<0,0001 اختبار t غير المزاوج مع تصحيح ويلش) و FMI (p<0,0001 اختبار t غير المزاوج مع تصحيح ويلش). يمثل الخط الأفقي في المربعات القيم المتوسطة. قيم FMI هي المتوسط لجميع مسارات الخلايا في كل مجموعة شرط. اللوحة اليمنى. أ) لقطات شاشة لعائد الاستثمار المستخرج من Trackmate تظهر التفاعلات التفاضلية بين PBMCs و DOXO أو الخلايا السرطانية المعالجة ب PBS. ب) الكثافة الزمنية ل PBMCs حول الخلايا السرطانية MDA-MB-231 المعالجة ب DOXO أو التحكم فيها. عدد PBMCs الموجودة في عائد استثمار محدد حول الخلايا السرطانية لكل حالة. القيم المبلغ عنها هي متوسط أكثر من 9 عائد استثمار محدد من مجال رؤية واحد بفاصل زمني. يتم تعريف النقاط الساخنة للسرطان في عائد استثمار (قطره 80 ميكرومتر). يتم عرض خريطة الحرارة للكثافة المقابلة. تمثل النقاط متوسط عدد الخلايا المحسوبة على 9 نقاط ساخنة للسرطان في نقاط زمنية محددة. ج) توزيع مرات (دقيقة) من الاتصالات لكل مجموعة تجريبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7. التوظيف التفضيلي ل PBMCs استجابة لمجموعات الأدوية DAC plus IFN في سرطان الجلد التنافسي 3D المناعي على نموذج الرقاقة. أ) توزيع PBMCs المحملة في البداية في الغرفة المركزية لأجهزة الموائع الدقيقة. يتم الحصول على الصور المجهرية بواسطة مجهر مضان EVOS-FL خلال فترة 0-72 ساعة. يمثل التألق الأحمر (الخلايا المصنفة PKH67) PBMCs من متبرعين أصحاء. تم طلاء خلايا سرطان الجلد البشرية (الخضراء) التي تحمل علامة PKH67 المضمنة في Matrigel والتي تحتوي على علاجات تركيبات مفردة أو مزدوجة في غرف جانبية. ب) خلايا A375 بالإضافة إلى IFN على اليسار مقابل A375 بالإضافة إلى DAC / IFN على اليمين. تم عرض صور مضان في 72 ساعة من الثقافة المشتركة. يصور الصندوق الأصفر المتوقف عمليات توظيف ضخمة بشكل واضح في A375 بالإضافة إلى جانب DAC / IFN. ج) يتم احتساب PBMC في أربعة عائد استثمار مختلف من غرف IFN مقابل غرف DAC + IFN. تمثل الرسوم البيانية عدد الخلايا +/- S.D. ؛ خريطة التمثيل اللوني القيم المعدودة من كل عائد استثمار. Scalebars ، 200 ميكرومتر. D-G) مخططات التجزئة وخطوات القياس الكمي ل PBMCs المخترقة في المصفوفات الهلامية المطبقة على صور مضان القناة الواحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي. بروتوكول التصنيع الدقيق الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم التكميلي 1. تسلسل الفاصل الزمني في ثقافة مشتركة 2D مناعة الورم على رقاقة. تم الحصول على الصور المجهرية كل 2 دقيقة ، في فترة زمنية من 0-24 ساعة عن طريق المجهر المضغوط وضعت في حاضنة زراعة الخلايا القياسية. اللوحة اليسرى. فيلم من PBMCs من المتبرعين الأصحاء (WT ، النوع البري) ، مطلي ب MDA-MB-231 يتحكم في خلايا سرطان الثدي. اللوحة اليمنى. فيلم عن هجرة هائلة من PBMCs WT نحو غرفة الرقاقة حيث يتم تحميل الخلايا السرطانية المعالجة MDA-MB-231 DOXO. يتم وصف تخطيط رقاقة 2D بالتفصيل في القسم 1 من البروتوكول ويظهر في الشكل 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحاول الطرق الموصوفة تصميم نهج عام لتلخيص ، بدرجة تعقيد قابلة للتعديل ، جانبين مهمين في مجال علم المناعة السرطاني ، والذي يمكن أن يستفيد من اعتماد نماذج أكثر صلة في المختبر. الأول ينطوي على جانب عدد الخلايا السرطانية ، حيث قد تؤدي معالجة خصائص الخلية المفردة إلى وصف أفضل لعدم التجانس والأهمية البيولوجية والسريرية المرتبطة بما في ذلك مقاومة العلاج ، والوقاية من ورم خبيث ، والخلايا الجذعية ودرجة التمايز. يتم تمثيل الجانب الآخر من القصة من خلال TME ، بما في ذلك المكونات غير السرطانية (الخلايا المناعية واللحمية والأوعية الدموية) والمشهد الكيميائي / الفيزيائي (مكونات ECM ، chemokines وغيرها من العوامل القابلة للذوبان التي تم إطلاقها) التي يمكن أن تشكل بعمق كل من خصائص المرض واستجابة الفرد للعلاج63 ، وخاصة للعلاج المناعي. تجدر الإشارة إلى أن تصدير النهج الموصوف إلى مجالات بحثية أخرى يتطلب فهما عميقا للقيود والتحديات الناجمة عن تطوير واعتماد نماذج جديدة.

نقلا عن مبدأ مطبق في النمذجة الهندسية ("نموذج المشكلة وليس النظام") ، يجب تحسينه وهو الحد الأدنى لعدد المكونات والظروف (الخلوية والفيزيائية والكيميائية) اللازمة لجعل النموذج الخاص على الرقاقة مناسبا بيولوجيا ومستقرا على طول التجربة بأكملها. وبالتالي ، يجب اختيار كل مجموعة من أنواع الخلايا / البيئة الدقيقة / الإعداد التجريبي بدقة وتقييمها ومراقبتها باستمرار على طول التجارب الفردية ومن جلسة إلى أخرى. تشمل هذه الفحوصات ، كما هو مذكور في أقسام البروتوكول ، التحكم الصارم في المعلمات مثل الأحجام في أجهزة الموائع الدقيقة التي يمكن تعديلها بواسطة ظروف الرطوبة أو التسخين من مصادر الإضاءة ، والحركات المحتملة وعدم استواء المراحل التي تسبب انجرافات سائلة غير خاضعة للرقابة ، ولكن أيضا بعض التحقق من نقطة النهاية لحالة الخلية وصلاحيتها وتوصيف النمط الظاهري. تتعلق إحدى الخطوات الحاسمة بقرار استخدام أنظمة التروية لإنشاء هياكل وعائية (مثل) ، أو لتوصيل الدواء على الرقاقة33 ، لأن هذا قد يؤثر على التجارب من حيث زيادة التعقيد ، ومدة زراعة الخلايا ، وتعديل العوامل الكيميائية في وجود الخلايا العائمة مثل الخلايا المناعية.

في ما يلي ، نلخص القضايا الحرجة وذات الصلة الرئيسية الموجودة في البيئات التجريبية وفي أحدث الأدبيات.

ECM وتعريف المناظر الطبيعية الكيميائية
يتأثر TME بشدة أيضا بالخصائص الميكانيكية 64,65 للمحيط63 ، 66. لهذا السبب ، يعد اختيار مصفوفة الاستزراع أمرا أساسيا ، خاصة عند التعامل مع الخلايا المناعية التي ، في ظروف معينة ، يمكن أن تستجيب للإشارات الصادرة عن المصفوفة نفسها. ومن المتوقع حدوث تطورات ذات صلة في المستقبل المقبل أيضا من تصميم وتطوير مواد وهلاميات مائية جديدة (تتميز بصلابة مختلفة ، ومسامية ، ووجود عوامل قابلة للذوبان ، من بين معايير أخرى) التي تمكن من تحسين ECM والتحكم فيه بشكل متزايد ، ومحاكاة خصوصيات الأنسجة المختلفة اليوم ، والمرضى المختلفين غدا. على الجانب الآخر ، من الأهمية بمكان أيضا مراقبة التغييرات التي تسببها مجموعات الخلايا المختلفة في ECM وتحديد استراتيجيات لتضمين هذه المعلومات في التحليلات الديناميكية والمظهرية.

إدارة البيانات
سيستفيد الطريق نحو نشر تقنيات الورم على الرقاقة في سير العمل السريري من العمل التجريبي الضخم الذي يجري في عدة اتجاهات. تعمل نماذج الأعضاء على الرقاقة ، مثل العديد من التقنيات المختبرية ، على الأقل من المحتمل ، لإجراء قياسات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى. أصبح توازي الظروف التجريبية ، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية ، والنسخ المتماثلة التقنية / البيولوجية ممكنا من خلال دمج العديد من الرقائق على نفس اللوحة. تلعب الزيادة في الإنتاجية الكمية دورا حاسما في ترجمة هذه الأنظمة والتحقق من صحتها في خط أنابيب سريع لفحص الأدوية أو الجينات للعلاجات المناعية. في الواقع ، طورت العديد من الشركات بالفعل منصات بتنسيق متعدد الآبار ، ويتم اختبار أساليب تصوير مختلفة للسماح بمراقبة عدد كبير من الأجهزة في وقتواحد 14. في البروتوكولات الموضحة أعلاه ، استخدمنا شرائح المجهر التي تخصص ما يصل إلى 3 شرائح ، مع إمكانية تصور ما يصل إلى 12 حالة تجريبية بالتوازي ، باستخدام درج مجهر قياسي متعدد الشرائح. هذا الإعداد متوافق مع السحب اليدوي ومناسب للتعديلات الموجهة خصيصا التي يتم إجراؤها في منشأة التصنيع الدقيق الخاصة بنا. على العكس من ذلك ، عندما يكون التوازي القوي ضروريا (اختبارات وضوابط فحص متعددة) ، يلزم إجراء تحسينات على الإعداد لتعيين مستوى أعلى من الأتمتة (أي استخدام روبوتات السحب ، والآبار البلاستيكية المتعددة).

عند تصميم التجارب ، يجب مراعاة المفاضلة بين الدقة المكانية والزمانية.

تشكل الكمية الهائلة من البيانات ، التي ينتجها الفحص المجهري عالي المحتوى ، عاملا مقيدا من حيث التخزين والنقل والتحليل. تتم معالجة هذه المشكلات من خلال الأساليب الحسابية التي تنفذ أدوات التعلم الآلي وموارد الأجهزة / البرامج ، والتي قد تعزز الإمكانية المستقبلية لربط التجارب على الرقاقة / في السيليكو67,68 في اختيار الاستراتيجيات العلاجية ، وهذا يمثل فرصة طموحة ولكنها غير قابلة للتأجيل.

ما وراء التصوير الفلوري
لا شك أن وضع العلامات الفلورية ، بواسطة الأصباغ أو جينات المراسل ، نظرا لخصوصيتها العالية ، يمثل الطريقة القياسية الذهبية لتحديد مجموعات الخلايا المختلفة في ظروف الاستزراع المشترك ولحل الخصائص الجزيئية ذات نسبة SNR العالية. في نماذج OOC ، يستخدم هذا النهج بشكل شائع كمرجع وخاصة في البيئات الدقيقة غير المتجانسة للورم على الرقاقة ، يمكن أن يكون من المفيد توصيف النمط الظاهري للخلايا المناعية المتسللة والمتفاعلة.

ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أنه يجب مراقبة التأثيرات الناجمة عن الفلوروفورات وإجراءات التلوين الشاقة وإجراءات الإضاءة وتقليلها69 لأنه يمكن أن يؤثر بعمق على سلوك الخلية والحالة70,71. يبدو هذا الخطر صحيحا بشكل خاص بالنسبة للأنظمة الهشة ، مثل الخلايا المناعية72,73. قد تؤدي التفاعلات السمية الضوئية إلى فرض قيود في تحديد اكتساب النافذة الزمنية للخلايا الحية عند مراقبتها بدقة مكانية وزمانية عالية. علاوة على ذلك ، فإن الثراء في مجموعة متنوعة من المجموعات الفرعية المناعية يجعل من غير الممكن التمييز بينها فقط عن طريق تلطيخ الفلورسنت ، بالنظر إلى العدد المحدود من المرشحات المتاحة بشكل شائع على المجاهر.

لمعالجة هذه المشكلة ، من وجهة نظر مفيدة ، تظهرالآن على المسرح 74 تقنية مجهرية جديدة خالية من الملصقات مثل التصوير المجسم56 أو الفحص المجهري الطيفي57. إنها تعد باستراتيجيات تصنيف عملية خلوية متقدمة تتجاوز التألق ويمكن أن تكون ذات قيمة خاصة لدراسة العينات الحساسة. من وجهة نظر تحليل البيانات ، فإن الأساليب الحسابية المتقدمة ، القائمة على خوارزميات التعلم العميق75 (المدربة بواسطة مجموعات بيانات الصور الفلورية) ، هي فتاحات الأبواب لأداء ما يسمى "في وضع العلامات على السيليكو"76,77. لقد تم تطبيقها بنجاح للتنبؤ بعلامات الفلورسنت من صور المجال الساطع78 ، وتوليد صور مصنفة ، دون تلطيخ الخلايا ، وبالتالي زيادة قوة المعلومات المجهرية للمجال الساطع. يمكن أن تكون هذه الإستراتيجية مفيدة أيضا لتوفير الوقت والقنوات الفلورية للعلامات الأخرى. نعتقد أن مجتمع OOC سيستفيد من هذه التقنيات الجديدة التي تسمح بإجراء دراسة أقل توغلا لتفاعل مجموعات الخلايا.

تحليل البيانات
يمكن التحقيق في آليات التفاعلات بين الخلايا السرطانية المناعية والمستهدفة من خلال تتبع حركات الخلايا28,79. تعد تجارب تتبع الفاصل الزمني في الثقافات المشتركة المعقدة وغير المتجانسة ذات قيمة كبيرة لاستخراج أنماط هجرة الخلايا والتغيرات المورفولوجية والحالة ومعلومات النسب الشاملة. إن إجراء التحليل اليدوي ممكن عمليا فقط للتسلسلات القصيرة التي تحتوي على عدد قليل من الخلايا ولكن ليس للتجارب المنهجية عالية الإنتاجية. وبالتالي ، فإن تطوير أدوات حسابية لتتبع الخلايا ، سواء كانت مؤتمتة كليا أو جزئيا ، هو مجال حيوي للبحث في تحليل الصور24. عادة ما يتطلب تتبع الخلايا التقليدي ترددا عاليا نسبيا لأخذ العينات والدقة المكانية لأداء مهام التجزئة بشكل صحيح ، والتي يمكن أن تكون صعبة في العديد من الظروف التجريبية. لتوطين الخلايا ، هناك أدوات تجزئة وتتبع مفتوحة الوصول متاحة (على سبيل المثال ، برنامج ImageJ22) كما هو موضح في هذا البروتوكول أو برنامج احتكاري مخصص. في دراسات واسعة النطاق ، قمنا بتطبيق برنامج احتكاري يسمى Cell Hunter16,31 ، طورته جامعة Tor Vergata في روما ، للتمييز بطريقة تلقائية بالكامل بين السرطان والخلايا المناعية في سياق متعدد السكان. بدأ تنفيذ الحلول المصممة خصيصا القائمة على التعلم الآلي ونهج الشبكة العصبية80،81،82 اليوم في حزم برامج الفحص المجهري 83 ، من تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى إدارة معلمات الاستحواذ الحرجة أو خطوات التجزئة. يمكن استغلال التعلم الآلي للتعرف على الأنماط الخلوية الشائعة (مثل أنماط الحركة) من أجل توصيف الاستجابة البيولوجية فيما يتعلق بالعوامل البيئية الدقيقة.

في Comes et al.41 ، تم تطبيق بنية الشبكة العصبية التلافيفية للتعلم العميق المدربة مسبقا لتصنيف ما إذا كانت الخلايا السرطانية تتعرض أو لا تتعرض لعلاج دوائي باستخدام "علامة" لحركة الخلايا المناعية ، يتم تتبعها من بيانات الفاصل الزمني للمزارع المشتركة لخلايا سرطان الثدي و PBMCs في مصفوفات الكولاجين في الأجهزة الدقيقة ، كما هو موضح في33.

طرق omics أحادية الخلية وتطوير الأنطولوجيات
نشير إلى الحاجة إلى تحالف استراتيجي بين تقنيات omics أحادية الخلية84 (على سبيل المثال ، البروتينات ، الأيض ، علم الجينوم) والطرق على الرقاقة: التوصيف الجزيئي التفصيلي ، المقترن بالمعلومات الديناميكية الوظيفية يمكن أن يعزز فهم الآليات الأساسية والوصف السريري. في هذه الحالة ، تكون الأدوات الجديدة لربط العالمين في بدايتها85. التحدي الأول هو تنفيذ مناهج omics أحادية الخلية مباشرة على رقائق علم المناعةالسرطانية 22. علاوة على ذلك ، يمكن استغلال الأعضاء على الرقائق كمنصات لاختبار الأهداف المحتملة التي حددها علم الجينوم وتحليلات البروتينات86,87. أداة الربط الثانية ، التي لا تزال مفقودة إلى حد كبير ، هي طريقة منظمة وموحدة لشرح وتخزين نتائج النظامالمقاسة 88,89. ولكن هذا هو بالضبط ما نحتاجه في المستقبل لبناء قواعد بيانات منهجية للنتائج الكمية الخلوية والخصائص المقاسة ، لاستخراجها واستنتاجها وربطها بالمعلومات البيولوجية المتأصلة. باختصار ، تتطلب الحاجة إلى التوحيد القياسي والتحليل المنهجي لمجموعات البيانات التجريبية غير المتجانسة إطارا للأنطولوجيا.

تخصيص النماذج
تقنية الأعضاء على الرقاقة مناسبة للتخصيص12 ، حيث يمكن استخدام الخلايا والأنسجة من مريض واحد (أو فئات من المرضى) في الأجهزة في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، مما يؤدي إلى قراءات ذات صلة سريريا ، مفيدة لإبلاغ الاستراتيجيات العلاجية أو الوقائية. بدأت بعض الأمثلة تظهر في الأدب90. بالطبع ، بالنسبة لنماذج الورم على الرقاقة ، يطرح هذا التحدي العديد من الأسئلة الفنية والعلمية التي يجب حلها36 (مثل التحكم في خصائص TME مثل تركيز الأكسجين ، وتدرجات السيتوكين ، وما إلى ذلك). الأهم من ذلك ، أن احتمال جعل علاجات الأورام والأورام المناعية أكثر فعالية مع تقليل الآثار الضارة لكل مريض أمر جذاب ، من منظور جودة الحياة كما هو الحال بالنسبة لتحسين موارد الرعاية الصحية.

في الختام ، من الواضح أن هذا المجال متعدد التخصصات بشكل أصيل ، وعلى هذا النحو ، يتطلب جهدا كبيرا في إنشاء لغة مشتركة وأهداف مشتركة بين الباحث والأطباء والصناعة ، ولكن أيضا من مختلف التخصصات (الهندسة ، علم الأحياء ، علوم البيانات ، الطب ، الكيمياء) إيجاد توازن جيد وحلول جديدة91.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه. يتم دعم AS من قبل المؤسسة الإيطالية ل Ricerca sul Cancro (AIRC ، Start-Up 2016 # 18418) و Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). يتم دعم GS و FM من قبل الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC) رقم 21366 إلى GS.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282 (2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235 (2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639 (2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737 (2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450 (2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093 (2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664 (2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985 (2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789 (2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014 (2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16 (2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 170 ، الأعضاء على الرقاقة ، مناعة الورم ، الحديث المتبادل المناعي للسرطان ، البيئة المكروية للورم ، النسيج المناعي ، الديناميات والتفاعلات الخلوية ، الورم على الرقاقة ذات الكفاءة المناعية الدقيقة ، علم الأورام المناعي ، تتبع الخلايا
نماذج الاستزراع المشترك للموائع الدقيقة لتشريح الاستجابة المناعية في البيئات الدقيقة للورم في المختبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Ninno, A., Bertani, F. R.,… More

De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter