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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Abstract

I modelli di malattia complessi richiedono strumenti all'avanguardia in grado di fornire informazioni fisiologicamente e patologicamente rilevanti e fruibili e di svelare processi altrimenti invisibili. Saggi cellulari avanzati che imitano da vicino lo scenario in vivo si stanno affermando come nuovi modi per visualizzare e misurare l'interazione bidirezionale tumore-ospite che influenza la progressione del cancro. Qui descriviamo due protocolli versatili per ricreare co-colture 2D e 3D altamente controllabili in microdispositivi, imitando la complessità del microambiente tumorale (TME), sotto sorveglianza immunologica naturale e indotta dalla terapia. Nella sezione 1, viene fornito un setting sperimentale per monitorare la diafonia tra cellule tumorali aderenti e popolazioni immunitarie fluttuanti, mediante microscopia time-lapse a campo chiaro. Come scenario applicativo, analizziamo gli effetti dei trattamenti antitumorali, come i cosiddetti induttori immunogenici della morte delle cellule tumorali sul reclutamento e l'attivazione delle cellule immunitarie. Nella sezione 2, i microambienti 3D tumorali-immunitari sono assemblati in un layout competitivo. L'infiltrazione immunitaria differenziale viene monitorata mediante istantanee di fluorescenza fino a 72 ore, per valutare strategie terapeutiche combinate. In entrambi i contesti, le fasi di elaborazione delle immagini sono illustrate per estrarre una pletora di parametri delle cellule immunitarie (ad esempio, migrazione e interazione delle cellule immunitarie, risposta agli agenti terapeutici). Questi metodi semplici e potenti possono essere ulteriormente adattati per simulare la complessità della TME che comprende l'eterogeneità e la plasticità dei sottotipi di cancro, cellule stromali e immunitarie, nonché le loro reciproche interazioni come motori dell'evoluzione del cancro. La conformità di queste tecnologie in rapida evoluzione con l'imaging ad alto contenuto di cellule vive può portare alla generazione di grandi set di dati informativi, portando nuove sfide. In effetti, il triangolo "co-colture/microscopia/analisi avanzata dei dati" stabilisce il percorso verso una precisa parametrizzazione del problema che può aiutare protocolli terapeutici su misura. Prevediamo che la futura integrazione dell'on-a-chip immune al cancro con l'intelligenza artificiale per l'elaborazione ad alto rendimento rappresenterà un grande passo avanti nello sfruttare le capacità come strumenti predittivi e preclinici per l'oncologia di precisione e personalizzata.

Introduction

L'evoluzione di diverse branche della medicina come discipline sperimentali è dipesa dalla capacità di manipolare la popolazione cellulare e le funzioni degli organi in condizioni controllate1. Tale capacità ha le sue radici nella disponibilità di modelli misurabili in grado di ricapitolare i processi che avvengono nel nostro corpo.

Nell'era dell'immunoterapia e del profilo genomico unicellulare 2, la biologia del cancro deve trarre vantaggio dai modelli emergenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato 2,3.

Il microambiente tumorale4 (TME) è un tessuto complesso in cui le cellule tumorali interagiscono continuamente e co-evolvono dinamicamente con le altre componenti cellulari (cellule immunitarie, stromali ed endoteliali) e non cellulari (matrice extracellulare, ECM). La natura dinamica di questo complesso paesaggio determina se le cellule immunitarie giocano come amiche o nemiche delle cellule maligne, influenzando così fortemente sia la progressione della malattia che la risposta alla terapia. Al giorno d'oggi, grandi sforzi da parte di onco-immunologi, bioinformatici ed esperti di biologia dei sistemi stanno convergendo per affrontare il significato clinico dell'eterogeneità del cancro 5,6, sia nello spazio (cioè in regioni tumorali distinte) che nel tempo (cioè in fasi distinte di progressione tumorale)5,6, e per caratterizzare il cancro e il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie a livello di singola cellula. Come esempio di questa sinergia, tecniche avanzate di visione artificiale sono ora utilizzate di routine per la mappatura spaziale degli infiltrati immunitari nei campioni istologici 7,8.

Sul fronte dei modelli sperimentali, collegando gli studi sugli animali e i metodi tradizionali in vitro, i progressi nella microfluidica e nelle tecniche di co-coltura danno accesso a diverse classi di modelli cellulari microingegnerizzati come organoidi, sistemi microfisiologici 9,10,11 (MPS) e organi-on-chip12,13,14 (OOC). Condividono il tratto comune di ingrandire la visione "d'insieme" degli ecosistemi cellulari e di espandere il potenziale in vitro per controllare i fattori microambientali sfruttando al contempo la microscopia ad alto contenuto15 e gli approcci di elaborazione delle immagini.

Al giorno d'oggi, i sistemi MPS e OOC all'avanguardia hanno iniziato a includere aspetti immunologici , incorporando diversi sottotipi di cellule immunitarie in tessuti e co-colture esistenti, in modo da esplorare e misurare una varietà di processi come malattie infiammatorie, guarigione delle ferite, immunità mucosale e risposta alle tossine o prodotti alimentari quotidiani16. I modelli TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, anch'essi integrati con microvasi perfusibili 18,19,20,21, sono stati sviluppati per studiare le interazioni dipendenti dal tipo di cellula, le perturbazioni fisiche e chimiche e l'attività citotossica di linfociti infiltranti22, nonché agenti immunomodulatori clinicamente rilevanti23.

Qui, forniamo protocolli versatili, che vanno dal caricamento delle cellule nei chip agli strumenti di elaborazione delle immagini, per sfruttare co-colture microfluidiche avanzate tumore-immune in impostazioni 2D (sezione 1) e 3D (sezione 2)16, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico24 e la visualizzazione delle funzioni cellulari. Ciò si ottiene mantenendo la facilità d'uso e la flessibilità sia nella gestione dei campioni che nell'analisi dei dati, sfruttando il software freeware delle Fiji e le sue cassette degli attrezzi25,26.

Il dispositivo microfluidico, descritto nella sezione 1, è progettato per eseguire co-colture 2D di cancro aderente e cellule immunitarie galleggianti. Questa piattaforma è stata validata per la misurazione in vitro del comportamento delle cellule immunitarie in presenza di mutazioni genetiche27 e/o immunodeficienze28. Qui, illustriamo i passaggi per tracciare le cellule immunitarie nelle immagini time-lapse in campo chiaro, sfruttando un metodo semi-automatico basato su Trackmate (un plugin implementato nel software Fiji). Questa procedura consente l'estrazione di descrittori cinematici della migrazione immunitaria 29 e della risposta (cioè dei tempi di interazione) alle cellule tumorali bersaglio, trattate o meno con induttori di morte cellulare immunogenica27.

È importante sottolineare che questi parametri, estratti da immagini di serie temporali, possono essere elaborati con macchinari matematici avanzati. Come esempio della potenzialità di questo approccio, i nostri gruppi hanno recentemente pubblicato un'analisi basata su metodi matematici dai processi stocastici e dalla meccanica statistica per modellare le proprietà della rete cellulare e fornire una descrizione parametrizzata del comportamento delle cellule immunitarie (cioè, camminata casuale distorta o non correlata, movimento altamente o non coordinato30,31).

L'impostazione 3D, fornita nella seconda sezione, si basa su un protocollo di co-coltura per ricreare TME immunocompetenti più complesse incorporate in due regioni di gel con diverse combinazioni di tipi cellulari e farmaci in modo competitivo. Qui, vengono descritte le fasi di elaborazione delle immagini per misurare, in diversi punti temporali, l'infiltrazione di cellule immunitarie colorate in cellule di melanoma umano A375M coltivate all'interno di Matrigel, per valutare le combinazioni di agenti antitumorali32. A375M, una linea cellulare derivata da A375P caratterizzata da un fenotipo altamente metastatico, è stata scelta per valutare la loro capacità metastatica in presenza di cellule immunitarie32.

I modelli descritti possono essere pienamente compatibili con diverse fonti cellulari (linee cellulari murine e umane immortalizzate o primarie, organoidi, xenotrapianti, tra gli altri). In recenti studi del nostro laboratorio, combinando la microscopia video ad alto contenuto con l'analisi delle immagini, il layout 3D competitivo è stato applicato per indagare: i) una risposta immunitaria antitumorale (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC) e sezionare il ruolo dei fibroblasti nella resistenza alla terapia con trastuzumab in modelli on-chip di carcinoma mammario HER2+ 33; ii) l'azione delle cellule mieloidi (cioè dei macrofagi associati al cancro) nei meccanismi di evasione tumorale e di reclutamento delle cellule T34; iii) l'efficacia di regimi immunoterapeutici, specificamente basati su cellule dendritiche (IFN-DC) condizionate da interferone α, coltivate con cellule tumorali del colon trattate con farmaci in matrici di collagene, e la valutazione del movimento efficiente e dei successivi eventi di fagocitosi35; iv) la migrazione chemiotattica di eosinofili derivati dal midollo osseo verso cellule di melanoma trattate o non trattate con IL-3336.

Questi modelli avanzati potrebbero servire come finestre di osservazione per comprendere il ruolo del contesto immunitario nelle metastasi del cancro e nei meccanismi di resistenza, ma sono necessari sforzi per tradurre i risultati nelle cliniche, colmando il divario con la ricerca di base37.

Come scenario emergente, sfruttare la potenza della microscopia automatizzata ad alto contenuto accoppiata all'uso di microsistemi più fisiologicamente rilevanti sta aprendo nuove potenziali sfide per la gestione, l'elaborazione e l'interpretazione di centinaia, e persino migliaia, di gigabyte di dati multiparametrici, che possono essere generati da una singola campagna sperimentale. Ciò implica un collegamento diretto degli esperimenti OOC con algoritmi basati sull'intelligenza artificiale 38,39,40,41,42 (AI) sia per l'analisi automatizzata avanzata, sia per la generazione di funzionalità che possono alimentare a loro volta modelli in silico di interazione cancro-immunità 43, con nuove entusiasmanti applicazioni all'orizzonte, come lo sviluppo di saggi predittivi di screening farmacologico 44.

Un flusso di sforzi in continua espansione è focalizzato sulla progettazione di modelli di malattia congiuntamente all'ottimizzazione delle strategie per implementare gli schermi di perturbazione su larga scala con letture multi-omiche a cella singola. Ciò aiuterà senza dubbio lo sviluppo e, si spera, l'implementazione clinica, accompagnata da un adeguato grado di standardizzazione del metodo, di un approccio sistematico onco-immunology-on-a-chip per ottenere nuove informazioni sui disturbi immunitari e sui meccanismi di diffusione del cancro.

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Protocol

1. Progettazione di chip per co-colture 2D di cellule aderenti e galleggianti

NOTA: Il layout di co-coltura 2D (Figura 1A-C) è caratterizzato da tre camere (100 μm di altezza) interconnesse da due serie di array di microcanali (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La camera intermedia forma due compartimenti chiusi senza uscita che bloccano le cellule immunitarie fluttuanti che traboccano nel sito del tumore durante la fase di carico 2.5. Questo tipo di dispositivo è utile per misure bidimensionali in tempo reale della motilità a singola cellula (aderente o flottante) e delle interazioni cellula-cellula 16,27,28,30,31. Un tipico studio di migrazione cellulare (condotto da alcune ore a diversi giorni) combina la microscopia a cellule vive con algoritmi di elaborazione delle immagini45, al fine di tradurre le sequenze di immagini acquisite in caratteristiche numeriche25. Sulla base dei modelli migratori, è possibile stimare diversi indicatori biofisici, come lo spostamento e la velocità delle cellule, nonché la durata delle interazioni tra cellule immunitarie e cellule bersaglio24.

  1. Preparazione di cellule tumorali e PBMC
    1. Coltura di cellule tumorali
      NOTA: MDA-MB-231 triplo negativo [recettore dell'estrogeno (ER)-, recettore del progesterone (PR)-, e recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2)-] cellule di adenocarcinoma mammario umano sono coltivate di routine in un terreno di coltura 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 UI mL-1 di penicillina G sale sodico e 100 μg mL-1 di streptomicina solfato (terreno di crescita), in condizioni di coltura standard (37 °C e 5% di CO2).
      1. Per ottimizzare la crescita della coltura cellulare, placcare le cellule MDA-MB-231 in flaconi da 75 cm2 ad una densità di 1 × 106 cellule mL-1 in 12-15 ml di terreno di coltura.
      2. Quando le cellule raggiungono il 75-80% della confluenza, scartare il terreno di crescita, lavare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato preriscaldata (PBS) per rimuovere completamente FBS, quindi staccarle con tripsina preriscaldata (da 1 a 2 minuti a 37 °C).
      3. Aggiungi terreno di crescita per inattivare l'attività enzimatica della tripsina e raccogliere le cellule distaccate. Lavare le celle due volte per 5 minuti a 1.100 x g a temperatura ambiente (RT).
      4. Contare le cellule in un vetrino di conteggio delle cellule mediante il test di esclusione del colorante Trypan Blue e quindi riseminarle per la coltura di mantenimento (per non più di 6 passaggi dallo scongelamento) o per procedure sperimentali.
      5. Per gli esperimenti microfluidici, seminare 1 × 10 6 cellule in piastre a6 pozzetti in 3 ml di terreno di crescita e trattare con 25 μM di doxorubicina (DOXO) o un volume uguale di solvente DOXO (PBS) come controllo.
      6. Da quattro a 6 ore dopo, lavare le cellule trattate con DOXO due volte con PBS preriscaldato per 5 minuti a 1.100 x g a RT.
      7. Contare le cellule di controllo trattate con DOXO e PBS come sopra (vedere punto 1.1.1.5) e impostare la co-coltura con cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in dispositivi microfluidici.
    2. Isolamento PBMC
      1. Raccogliere sangue venoso intero (10 ml circa) da volontari sani in fiale eparinizzate e mescolare delicatamente invertendo il tubo da 2 a 4 volte47.
      2. Diluire il sangue 1:1 con PBS e strato oltre 10 mL di gradiente di densità mezzo Lymphoprep in un tubo da 50 ml.
        NOTA: Assicurarsi di eseguire la stratificazione molto delicatamente e lentamente per lasciare che sangue e Lymphoprep formino due strati distinti.
      3. Tubi da centrifuga per 30 minuti a 400 x g a 4 °C in un secchio estraibile senza freni. Si formeranno quattro strati distinti: (i) plasma nella parte superiore, (ii) uno strato bianco e nuvoloso contenente PBMC, (iii) Lymphoprep e (iv) un pellet di eritrociti e granulociti.
      4. Aspirare delicatamente le PBMC con una pipetta da 2 ml e risospendere immediatamente in terreno di coltura caldo (lo stesso utilizzato al punto 1.1.1) e lavare due volte per 5 minuti a 1.100 x g a RT.
      5. Contare le PBMC pellettate come sopra (vedere il punto 1.1.1.5) e utilizzarle per procedure sperimentali o congelarle per la conservazione a lungo termine.
  2. Placcatura delle celle in chip 2D
    NOTA: i PBMC non sono macchiati in questo protocollo. Per caratterizzare fenotipi specifici on-chip, le sottopopolazioni di cellule immunitarie possono essere isolate mediante selezione di sfere immunomagnetiche, colorate con tracker cellulari fluorescenti, rimescolate con la frazione rimanente non etichettata, e quindi confrontate con cellule tumorali bersaglio, come riportato negli esperimenti on-chip, descritti in Vacchelli et al.27, e in Racioppi et al.34.
    1. Prima di iniziare esperimenti di co-coltura e per facilitare l'aggiunta di reagenti, attivare i chip immagazzinati mediante un trattamento al plasma di ossigeno per alcuni secondi. Riempire immediatamente i serbatoi con acqua deionizzata o PBS per mantenere le superfici PDMS (polidimetilsilossano) idrofile fino alle fasi di placcatura.
      NOTA: PDMS è intrinsecamente idrofobo, che può comportare difficoltà nel funzionamento e nell'intrappolamento di bolle d'aria nei microcanali. Vedere il punto 7 nel file supplementare che fornisce dettagli sull'attivazione del plasma di ossigeno.
    2. Sterilizzare sotto un armadietto UV per 20 minuti, lavare 2-3 volte con PBS fresco e quindi incubare con terreni di coltura per 1 ora. Conservare i trucioli nell'incubatore fino a quando non si eseguono le fasi di placcatura.
    3. Prelevare i supporti in eccesso da tutti e sei i serbatoi. Fare attenzione a evitare di aspirare i media dalle principali camere di coltura.
    4. Applicare lentamente 1 × 105 cellule tumorali risospese in 10-20 μL di terreno di crescita nel serbatoio superiore sinistro e poi nel pozzetto inferiore (Figura 1A, serbatoi 1 e 2). Attendere 5 minuti per consentire alle cellule di aderire nella camera tumorale. Alcune cellule si depositeranno e si attaccheranno nei serbatoi.
      NOTA: inserire la sospensione cellulare accanto alle aperture del canale. Questa procedura viene applicata alle cellule tumorali MDA-MB-231, altre linee richiederanno l'ottimizzazione della densità cellulare. Per migliorare l'attaccamento delle cellule tumorali, è possibile eseguire una funzionalizzazione del rivestimento delle superfici (ad esempio, poli-L-lisina, fibronectina). Si prega di fare riferimento ai protocolli pubblicati in precedenza per le fasi di rivestimento16, 48,49,50.
    5. Sul lato destro pipettare delicatamente 1 × 106 PBMC risospese in 50 μL di terreno di crescita nei pozzetti 3 e 4 (vedi Figura 1A, serbatoi 3 e 4).
      NOTA: Dopo il flusso, PBMC distribuirà nella camera intermedia creando un "fronte", che rappresenta il punto di partenza dell'esperimento.
    6. Riempire tutti e sei i serbatoi con un massimo di 100-150 μL di terreno di coltura. Al microscopio controllare che le cellule siano distribuite correttamente nei compartimenti di coltura come illustrato nella Figura 1D-E. I volumi finali possono variare con le dimensioni dei serbatoi. Regolare i volumi in modo che siano uguali in tutti i pozzi.
    7. Riposizionare i chip nell'incubatore per circa 1 ora per stabilizzare il sistema prima della registrazione time-lapse. Aggiungere terreno fresco ogni 3 giorni, in quanto potrebbe essere soggetto a perdite di evaporazione.
      NOTA: Il sistema è compatibile sia con l'analisi di cellule vive/morte che con il profilo dinamico della secrezione di citochine multiplex da mezzi condizionati. Per le analisi delle chemochine, possono essere accessibili fino a 200-250 μL di aliquote di surnatanti raccogliendo terreni dai due serbatoi di ciascun compartimento. I classici test di profilazione delle citochine ELISA e Luminex richiedono circa 50 μL di surnatanti . Si prega di vedere 51,52 esempi di studi di altri laboratori che eseguono la profilazione delle citochine su modelli OOC.
  3. Acquisizione time-lapse di cellule tumorali e immunitarie non etichettate
    NOTA: In genere, 3 chip sono disposti su un singolo vetrino da microscopio (vedere Figura 1A per chip 2D e Figura 4B per chip 3D). Utilizzando supporti di fase che assegnano 4 vetrini, le co-colture possono essere adatte per essere monitorate mediante microscopia automatizzata ad alto contenuto per analizzare grandi lotti di condizioni sperimentali. I chip possono essere facilmente montati su vetrini con spessore pari a 1 mm o 170 micron (vetrini di copertura in plastica o vetro, multipozzetti a fondo ottico a 6 pozzetti) per immagini confocali ad alta risoluzione.
    1. Registrare serie di immagini in campo chiaro di cellule non etichettate mediante una configurazione di microscopia video dotata di un sistema di incubazione.
      NOTA: Qui i set di dati di serie temporali (finestra temporale: 48 h, frame rate: 2 min) sono stati acquisiti con un microscopio a fluorescenza, dotato di un obiettivo 4x e pixel CMOS 1.3M, ottimizzato per adattarsi a un incubatore di colture cellulari standard.
    2. Riscaldare il microscopio per almeno 2 ore per equilibrare a 37 °C e 5% CO2 prima di iniziare l'acquisizione.
    3. Selezionare la finestra di osservazione centrando l'array di microcanali tra il tumore e il compartimento centrale. Ciò consente di visualizzare le dinamiche di infiltrazione immunitaria e le interazioni all'interno della regione in cui vengono seminate le cellule tumorali.
    4. Regolare l'intensità dell'illuminazione e la messa a fuoco del cancro e delle cellule immunitarie.
    5. Per avviare l'acquisizione time-lapse, ottimizzare il frame rate e la durata del tempo in base all'esperimento e al tipo di cella in studio.
      NOTA: le condizioni di imaging devono essere ottimizzate per evitare un'eccessiva esposizione fotografica, pur mantenendo un buon rapporto segnale/rumore (SNR). Poiché le cellule immunitarie sono molto mobili, il frame rate di acquisizione deve essere sufficientemente elevato per seguire il processo dinamico di interesse e consentire un facile tracciamento53. Dovrebbe essere raggiunto un compromesso tra l'algoritmo di tracciamento, la compatibilità con la dimensione del set di dati risultante e la vitalità, la densità e la motilità delle cellule osservate.
    6. Al termine del time-lapse, utilizzare le funzioni Importa sequenza di immagini e Salva con nome del software ImageJ per convertire il set di dati dei fotogrammi in un file video non compresso a 25 fps.
      NOTA: il file video generato è ora pronto per l'analisi del tracciamento delle celle. Qui, sono state raccolte immagini RGB (1280x1024 pixel) con una risoluzione spaziale di 1,33 μm / pixel. Un filmato della durata di 24 ore (stack da 3,5 GB) di un singolo campo visivo (FOV) è costituito da 720 fotogrammi per ogni condizione.
  4. Analisi dei dati: estrazione semi-automatica di tracce immunitarie non etichettate da parte di Trackmate
    NOTA: Qui, l'analisi della motilità immunitaria nelle immagini time-lapse 2D senza etichetta viene effettuata utilizzando TrackMate54, un toolbox open source disponibile nel pacchetto software Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vengono forniti diversi algoritmi per eseguire il tracciamento automatico di singole particelle55(SPT) di strutture simili a spot. Sono stati applicati in modo efficiente alle immagini fluorescenti, dove gli oggetti sono luminosi su uno sfondo scuro con un alto SNR (cioè punti fluorescenti sub-risoluzione, vescicole di traffico etichettate, nuclei)1,25,56,57,58. SPT si basa principalmente su due fasi sequenziali. In primo luogo, gli oggetti sono localizzati con posizioni identificate in più fotogrammi (segmentazione), come schematizzato inFigura 2. Nella seconda fase (particle linking), i punti rilevati sono collegati su fotogrammi consecutivi per stimare il movimento e ricostruire le loro traiettorie, sotto forma di una traccia (Figura 3). Le caratteristiche numeriche possono essere calcolate da ogni matrice di coordinate X, Y, Z estratta nel tempo. La documentazione estesa è riportata in54così come online (http://imagej.net/TrackMate), seguendo il tutorial Guida introduttiva a TrackMate. L'accuratezza del processo può essere ispezionata immediatamente, gestendo un'interfaccia utente grafica intuitiva (GUI simile a una procedura guidata) che consente agli utenti, in ogni fase, di regolare nuovamente le impostazioni. La parte seguente illustra brevemente come utilizzare Trackmate per l'elaborazione delle immagini e le fasi di quantificazione, applicate alle immagini a luce visibile:
    1. Trascina e rilascia lo stack di video / immagini a tempo pieno sulla barra degli strumenti delle Fiji.
    2. Impostazione dello stack di calibrazione (Figura 2A).
      1. Controllare la dimensionalità e assegnare le proprietà dell'immagine selezionando Immagine> Proprietà. Unità di riempimento delle caselle di lunghezza, Dimensioni pixel e Intervallo fotogramma.
        NOTA: Per eseguire la calibrazione, utilizzare la lunghezza nota dei microcanali (500 μm, Figura 1C) e dividere per la lunghezza misurata corrispondente in pixel. Per le serie temporali 2D, assicuratevi di scambiare il campo Z/T inserendo 1 come z-slice e il numero corretto di fotogrammi del filmato. In caso contrario, gli output quantitativi e i parametri di Trackmate verranno riportati in unità di pixel e intervalli di tempo.
    3. Pre-elaborazione delle immagini.
      1. Per migliorare la corretta discriminazione delle cellule immunitarie da uno sfondo rumoroso, pre-elaborare le immagini in campo chiaro per compensare gli artefatti. Assicurarsi che i set di dati siano costituiti da immagini TIFF a 8 bit (intervallo di luminosità: 0-255).
        NOTA: illuminazione irregolare, basso SNR e contaminazione da piccole particelle di detriti nelle immagini in luce visibile potrebbero compromettere il successo di un processo di tracciamento cellulare. Qui, i set di dati delle serie temporali vengono pre-elaborati tramite la sottrazione dello sfondo, la funzione di regolazione della luminosità/contrasto e la sottrazione dell'immagine locale di una sfocatura gaussiana dalle immagini originali. In ImageJ sono disponibili altri toolkit di analisi per l'elaborazione e la segmentazione di immagini a contrasto di fase o a campo chiaro, tra cui la soglia di gradiente empirico (EGT)59.
    4. Primo pannello di calibrazione (Figura 2A)
      1. Con la pila di immagini selezionata, avvia Trackmate (Plugin>Tracking).  Rivedere/confermare la dimensionalità e la finestra temporale dei dati (ad esempio, larghezza dei pixel e intervallo di fotogrammi).
        NOTA: TrackMate legge automaticamente nella casella delle proprietà dell'immagine per fornire i risultati finali di tracciamento in unità fisiche calibrate (ad esempio, μm e minuti).
      2. Definire una regione di interesse per calcolare l'estrazione delle tracce immunitarie, inserendo manualmente i valori o disegnando un'area chiusa sull'immagine attiva, quindi premendo il pulsante Aggiorna sorgente. Per estrarre i percorsi di migrazione immunitaria globale, selezionare regioni rettangolari rispettivamente sul lato destro dei microcanali (camera centrale, Figura 1E) e a sinistra (camera tumorale, Figura 1D). Per analizzare le interazioni tra cancro e hotspot immunitari, disegna sottoregioni circolari utilizzando gli strumenti ROI (vai a Modifica → selezione → specifica).
        NOTA: Quando si esegue per la prima volta questa cassetta degli attrezzi su una nuova applicazione biologica, dedicare il tempo necessario per ottimizzare le impostazioni per la ricostruzione delle tracce.
        NOTA: Eseguire il tracciamento manuale delle traiettorie delle celle (circa 50-100 celle) per trovare empiricamente la giusta configurazione e successivamente validare come benchmark l'affidabilità dell'estrazione automatica dei movimenti. Inoltre, lavorare inizialmente su un'area più piccola per verificare facilmente l'accuratezza dei parametri scelti.
    5. Fase di rilevamento delle macchie immunitarie (Figura 2B)
      1. Selezionare il rilevatore predefinito Laplacian of Gaussian (LoG). Il rilevatore LoG lavora per trovare oggetti luminosi, simili a blob, tondeggianti e applicando un filtro laplaciano o gaussiano sull'immagine sintonizzata per le dimensioni intermedie dello spot (da 5 a 20 pixel di diametro).
      2. In Diametro blob stimato (in questo caso, 10-13 μm) immettete un valore leggermente superiore alla dimensione dello spot prevista. Aumentare il valore della soglia (qui 1-3 μm) fino a ridurre le macchie di sfondo extra spurie, possibilmente senza rimuovere le caratteristiche dell'oggetto. I rilevamenti al di sotto del valore di soglia (basati su una metrica di qualità) verranno eliminati dall'analisi successiva. Seleziona la casella relativa al filtro mediano e alla localizzazione sub-pixel per migliorare la qualità del rilevamento spot.
      3. Utilizzare il pulsante Anteprima per visualizzare e ispezionare rapidamente le cellule immunitarie identificate sovrapposte alle immagini da cerchi color magenta.
        NOTA: gli errori durante il rilevamento avranno un impatto considerevole sul processo di collegamento. Altri rilevamenti indesiderati possono essere corretti nei menu successivi da filtri definiti dall'utente (ad esempio, per intensità, dimensione o posizione dello spot).
    6. Una volta soddisfatto delle selezioni, premi Avanti.
      NOTA: Queste impostazioni possono variare a seconda della configurazione sperimentale e delle modalità di acquisizione dell'imaging (ad esempio, FOV, ingrandimento dell'obiettivo, immagini in campo chiaro o fluorescenti), del tipo di cellula (cellule aderenti o galleggianti), della motilità lenta o veloce, del tipo di comportamento cellulare (interagente o meno) e della densità bassa/media/alta nell'area di osservazione.
    7. Procedere e saltare il menu Soglia iniziale. Selezionare la finestra Hyperstack Displayer.
    8. Impostare i filtri sul pannello Spot (Figura 2C).
      1. Seleziona: Colore uniforme. I filtri, come mostrato nella Figura 2C, possono essere aggiunti per mantenere i punti etichettati con valori di feature, visualizzati in un istogramma, al di sopra o al di sotto di una soglia reversibile.
    9. Fase di selezione del tracker (Figura 3A). Scegli il Simple LAP tracker, come algoritmo di collegamento delle particelle che richiede tre campi da riempire (in questo caso, "Distanza massima di collegamento": 30-50 μm, "Distanza massima di chiusura del gap": 25-50 μm, "Gap max frame gap": 4-6). Questo rilevatore gestisce gli eventi di chiusura delle lacune, con il calcolo del collegamento dei costi basato esclusivamente sulla rispettiva distanza.
      NOTA: la distanza massima di collegamento consentita limita l'intervallo di ricerca spaziale per i punti di corrispondenza candidati, corrispondente allo spostamento massimo consentito percorso tra due fotogrammi successivi (Figura 3D).
      1. Fornire valori maggiori di spostamento massimo quando si nota la frammentazione di tracce di particelle altamente mobili.
        NOTA: due collegamenti non verranno collegati se il movimento da fotogramma a fotogramma è maggiore del valore di distanza massima specificato. Se i segmenti collegano male due celle diverse, diminuire il valore dello spostamento massimo.
      2. Prova a ricollegare i punti mancanti, variando i valori di "la distanza massima per la chiusura del gap" e "lo spazio massimo del fotogramma".
        NOTA: questi parametri riguardano gli eventi di chiusura degli spazi vuoti in fotogrammi non adiacenti. La scomparsa spot può verificarsi per alcuni fotogrammi (ad esempio, particelle fuori fuoco, celle che escono e nel FOV, errori di segmentazione in un'immagine rumorosa).
        NOTA: per gestire gli eventi di divisione o unione, optare per il linker LAP come rilevatore che introduce penalità della matrice dei costi di collegamento.
    10. Fare clic su Avanti per eseguire il calcolo di rilevamento. Premere Avanti.
    11. Pannello Filtraggio tracce (Figura 3B). Cambia il colore dei percorsi immunitari selezionando, dal menu a tendina, "Track ID" o altre caratteristiche della traccia. A questo punto, scegli facoltativamente di impostare filtri interattivi funzionanti, per migliorare la qualità del risultato e rivedere la procedura.
      NOTA: le macchie spurie derivano dal rumore nell'immagine e dalla perdita di qualità delle caratteristiche. Ciò genererà brevi segmenti mentre le celle di interesse possono essere tracciate su molti fotogrammi.
      1. Per rimuovere i percorsi brevi, prova a filtrare, in base al numero di punti che contengono. Inoltre, ordina le tracce utilizzando una combinazione di opzioni come Spostamento traccia, Durata traccia o Velocità minima/media/massima per escludere tracce false o indesiderate (con meno fotogrammi rispetto alla durata complessiva del time-lapse o che coinvolgono particelle sporche o non in movimento) da ulteriori post-elaborazione.
        NOTA: La scelta dei filtri può variare a seconda dell'applicazione specifica e del sistema biologico.
    12. Esamina tutte le tracce nell'interfaccia Opzioni di visualizzazione, scorri nel tempo e verifica in che modo le tracce accurate corrispondono ai percorsi di migrazione delle celle. Il menu a discesa fornisce codici colore per punti e percorsi per una facile visualizzazione e filtraggio in base a diverse modalità (ad esempio, parametri cinetici, intensità, posizione temporale o spaziale).
      NOTA: per tracciare colture ad alta densità o celle altamente mobili, aumentare il frame rate di acquisizione riducendo al minimo lo spostamento delle cellule percorso in intervalli di tempo consecutivi.
    13. Correzione manuale degli errori di segmentazione e collegamento (Figura 3E).
      1. Per migliorare ulteriormente la qualità dei risultati, modificare manualmente i punti (particelle di detriti, cellule stazionarie) e rimuovere le tracce errate derivanti dai confini tumorali rilevati quando si analizzano i ROI dell'interazione tumore-immunità.
      2. Innanzitutto, selezionate lo strumento TrackMate nella barra degli strumenti di ImageJ. Per eliminare un punto esistente in tutto lo stack, premere Maiusc e creare con il cursore del mouse una maschera ROI sul punto di destinazione (modificato in un cerchio verde), quindi premere il tasto CANC.
      3. Per aggiungere un nuovo punto (in caso di tracce mancanti a causa della scomparsa di spot) premere il tasto A, posizionando il mouse nella posizione puntata. Ripeti il processo di calcolo del collegamento delle tracce dopo questo passaggio.
    14. Quando siete soddisfatti, selezionate Analisi nel pannello Opzioni di visualizzazione per generare tre file di testo (Figura 3C e 3F). La tabella in "Spots in tracks statistics" fornisce le coordinate spaziotemporali delle macchie immunitarie (posizioni X-Y-Z delle cellule etichettate con il frame associato e il numero di traccia). "Links in tracks statistics" e "Track statistics" contengono informazioni relative alle tracce: durata delle tracce, numero di gap o punti rilevati, traccia iniziale e stop-frame, ecc. Salvare ed esportare per ogni set di dati.
      NOTA: quando si fa clic su una riga all'interno delle finestre dei risultati, il rispettivo spot, collegamento o traccia viene attivato all'interno del video time-lapse per l'ispezione visiva. Ripeti i passaggi di filtraggio per selezionare/rimuovere le tracce. Tutti i futuri dati esportati verranno aggiornati. SUGGERIMENTO: I valori di traccia iniziale e stop-frame e traccia la durata possono essere sfruttati per calcolare i tempi di contatto tra cancro e cellule immunitarie durante l'elaborazione dei ROI di interazione.
    15. Premere il pulsante Salva per generare un file XML risultante contenente tutti i valori dei parametri, il percorso delle immagini e le posizioni spot nel tempo. Il comando ''Carica file TrackMate'' (Plugins> Tracking) ripristina l'intera sessione di processo per ogni singolo file di filmato.
    16. Passare all'ultimo pannello della GUI chiamato Seleziona un'azione. Nell'elenco, utilizzare la sovrapposizione di acquisizione> la funzione Execute per produrre un video con tracce sovrapposte. SUGGERIMENTO: l'opzione "Traccia N-spot vs tempo" può essere utilizzata per calcolare la densità spaziale delle cellule immunitarie in un ROI (Figura 6B, pannello di destra).
    17. Analisi post-elaborazione e statistiche di migrazione
      1. Analizza i dati posizionali grezzi direttamente in Trackmate o esporta i dati per calcolare i parametri cinetici completi29 (ad esempio, lunghezza totale della traiettoria, distanza euclidea, rapporto di confinamento, spostamento quadratico medio56, velocità media o istantanea della pista, coefficiente di arresto, distribuzione degli angoli di migrazione, indice di migrazione in avanti, velocità media in linea retta) per classificare il comportamento di migrazione delle cellule immunitarie (ad esempio, movimento diretto o diffusivo30, 31) e risposta alle cellule tumorali bersaglio (ad esempio, trattamento vs controllo).
        NOTA: Ulteriori utili plugin come The Chemiotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) forniscono vari grafici (ad esempio, grafici di rose o settori, come illustrato nella Figura 6) e test statistici per l'analisi avanzata e la visualizzazione dei dati sperimentali di migrazione e chemiotassi. La combinazione di algoritmi di tracciamento cellulare e segmentazione cellulare24,25,45 può consentire misurazioni di metriche morfologiche a livello di singola cella (cioè l'area della superficie cellulare, la lunghezza dell'asse maggiore e minore e le proporzioni delle celle).

2. Modello 3D immuno-competente on-chip del cancro in un test competitivo

NOTA: Il design del chip 3D, illustrato nella Figura 4, è costituito da 5 compartimenti principali: uno centrale per l'assunzione di cellule immunitarie fluttuanti, due regioni laterali per incorporare le cellule tumorali in matrici di idrogel (alte 150-250 μm) e camere di perfusione dei media. Le camere immunitarie e tumorali sono collegate da due serie di array ristretti di microcanali (200×12×10 μm3, L×W×H, Figura 4E). Regolarmente micropilastri isosceli trapezoidali distanziati da 100 μm (circa 25-30 interfacce per ogni regione di gel laterale, Figura 4C) funzionano come barriere per confinare la soluzione di gel durante l'iniezione sfruttando l'equilibrio tra tensione superficiale e forze capillari60,61 e collegare le regioni tumorali alle due camere laterali aggiuntive per impostare un'interfaccia gel-liquido (Figura 5). Le caratteristiche dettagliate del test competitivo 3D sono mostrate nella Figura 4. La migrazione preferenziale delle cellule immunitarie verso i due compartimenti idrogel che ospitano cellule tumorali che hanno subito diversi trattamenti può essere monitorata e quantificata. Il particolare layout competitivo può essere applicato per studiare una pletora di diversi fenotipi di biologia del cancro (ad esempio, farmaco-resistente vs aggressivo, primario o metastatico, responder vs non-responder). Inoltre, le regioni incorporate nel gel possono essere facilmente integrate con diverse popolazioni cellulari per ricreare TME più eterogenee, comprese le componenti stromali (fibroblasti, cellule endoteliali)23 o per simulare specifici ambienti immunosoppressivi34 (ad esempio, macrofagi) per sezionare meccanismi di resistenza ai farmaci ed evasione tumorale.
NOTA: La colorazione nucleare e la colorazione attiva delle caspasi, utilizzando kit commerciali per saggi vivi/morti (ad esempio, Thermo Fisher Scientific, reagenti incuciti), possono essere implementati per valutare eventi di morte mitotica o apoptotica, come riportato in Nguyen et al.33.

  1. Preparazione della soluzione di matrice con celle e caricamento nel dispositivo
    NOTA: Nel seguente contesto sperimentale, le due regioni del gel contengono miscele di linee cellulari di melanoma umano A375M, cresciute in soluzione di matrice (ad esempio, Matrigel), esposte ad agenti terapeutici usati in monoterapia o in combinazione. Questa impostazione ci ha permesso di valutare l'efficacia di una combinazione di due farmaci rispetto a singoli in modo competitivo e di quantificare la loro capacità di attrarre PBMC.
    1. Scongelare una scorta di soluzione di matrice (ad esempio, Matrigel) mettendola su ghiaccio in un frigorifero a 4 °C un giorno prima dell'esperimento.
      NOTA: Non esporre il prodotto a più cicli di gelo-scongelamento in quanto diventa "grumoso". Altri protocolli di idrogel sintetici o naturali possono essere adatti per essere utilizzati in questo ambiente. Si prega di fare riferimento a 33,34,35 per la preparazione delle cellule tumorali nelle matrici di collagene.
    2. Risospendere le cellule di melanoma umano A375, colorate con PKH67 Green Fluorescent Cell Linker vivo compatibile in soluzione di matrice (2 mg mL-1). Dove indicato, aggiungere 5-aza-2'-deossicitidina (DAC; 2,5 μM), indicato come DAC, e/o IFN-α2b, indicato come IFN, alle dosi appropriate32.
      NOTA: Abbina il lotto # sulla scheda tecnica della bottiglia della matrice. In base alla concentrazione calcolare il volume di terreno necessario per produrre fino a 2 mg mL-1 Si prega di regolare la concentrazione proteica ottimale e la concentrazione di sospensione delle cellule tumorali in base alla domanda di interesse.
    3. Pipettare su e giù con attenzione per evitare la generazione di bolle. Mantenere il tubo della microcentrifuga sul ghiaccio durante la miscelazione per evitare qualsiasi polimerizzazione indesiderata.
    4. Dopo la sterilizzazione, posizionare i dispositivi sul ghiaccio (utilizzando un secchiello per il ghiaccio e un coperchio) per evitare la solidificazione della soluzione della matrice durante l'intera procedura di caricamento della cella.
    5. Iniettare lentamente le due miscele IFN e DAC/IFN Matrigel/cellule tumorali (2-4 μL) nella porta gel sinistra e destra, rispettivamente con micropipetta da 10 μL utilizzando punte fredde (Figura 5A). Applicare una leggera pressione per spingere la soluzione della matrice da un lato fino a raggiungere quello opposto.
      NOTA: Il volume della soluzione della matrice è stato scelto per evitare il trabocco nei canali adiacenti. Non esercitare una pressione eccessiva sul pipettaggio per evitare che la soluzione fuoriesca nei supporti e nei canali centrali. Se durante il caricamento il percorso del gel è bloccato lungo il canale, provare a inserire la soluzione dall'altro ingresso fino a quando i frontali del gel non si incontrano. Quando si rimuove la micropipetta dagli ingressi, tenere premuto lo stantuffo, altrimenti la pressione negativa aspira la soluzione della matrice.
    6. Porre il dispositivo in un incubatore in posizione verticale a 37 °C e al 5% di CO2 per 30 minuti per consentire la gelificazione della soluzione della matrice (Figura 5B). Maneggiare con trucioli di cura con gel non polimerizzato incorporato per evitare fuoriuscite dal canale del gel.
    7. Nel frattempo, risospendere le PBMC marcate con PKH67 (1x106 cellule) in 10 μL di DMEM completo (mezzo di Eagle modificato di Dulbecco).
    8. Dopo la gelificazione della matrice, riempire i canali dei media con (50-100 μL) la stessa aliquota di terreno di coltura in tutti e sei i serbatoi per evitare l'essiccazione del gel nei trucioli. Conservare in incubatrice fino alla semina della sospensione delle cellule immunitarie.
      NOTA: Controllare al microscopio la corretta ed omogenea distribuzione delle cellule tumorali nel gel e l'integrità delle barriere in gel polimerizzato. Regioni gelificate parzialmente o non uniformi o bolle nella miscela portano al flusso prematuro di PBMC nei canali di gel media al punto di partenza dell'esperimento a causa delle fluttuazioni iniziali della pressione.
    9. Aspirare il fluido dai sei pozzetti e posizionare la punta vicino all'ingresso di un canale multimediale per iniettare delicatamente con sospensione cellulare PBMC a pressione moderata. La sequenza temporale di caricamento è illustrata nella Figura 5C:
      1. PBMC in mezzo da 10 μL nel pozzetto centrale superiore.
      2. 50-100 μL di mezzo in ciascuno dei quattro pozzetti di canali laterali.
      3. 40-90 μL di terreno nel pozzo centrale superiore.
      4. 50-100 μL di mezzo nel pozzo centrale inferiore.
    10. Assicurarsi al microscopio che la distribuzione delle PBMC rimanga confinata nella camera centrale dopo la fase di carico. (Figura 7A).
      NOTA: Se non è ottimale, regolare la concentrazione se necessario e ripetere le fasi di semina, utilizzando trucioli incontaminati. Quando si calcolano i volumi per le condizioni sperimentali pianificate, fare riferimento a un numero eccessivo di chip (15-20%) per tenere conto di potenziali errori e aggiustamenti. I volumi e le concentrazioni devono essere ottimizzati in base all'applicazione specifica.
    11. Posizionare i dispositivi assemblati su una superficie piana nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 per la successiva acquisizione di immagini a fluorescenza. Maneggiare con chip di cura dopo aver caricato le cellule immunitarie che galleggiano.
      NOTA: compensare le perdite per evaporazione dei volumi nei serbatoi sostituendo i fluidi ogni 2-3 giorni. Per la profilazione delle chemochine, è possibile aspirare fino a 100 μL da ciascuno dei due pozzetti dei compartimenti di coltura, fare riferimento al punto 2.7, al punto 1.
  2. Conteggio automatico delle PBMC reclutate in immagini fluorescenti a canale singolo in ImageJ
    NOTA: I metodi classici di immunofluorescenza per l'imaging confocale ad alta risoluzione possono essere applicati alle operazioni su chip come misurazioni degli endpoint. La procedura di colorazione di base prevede la fissazione su chip cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame anticorpale, la colorazione dei nuclei con fasi di lavaggio intermedie. Le cellule immunitarie non marcate infiltrate in regioni di gel 3D con microambienti tumorali incorporati possono essere fissate nei punti temporali desiderati e colorate per marcatori di espressione di attivazione / esaurimento / maturazione (ad esempio, per le cellule CD8, monitoraggio dei marcatori CD69, CD95, PD1, TIM3). In Parlato et al.35, la fagocitosi delle cellule apoptotiche SW620 è stata valutata mediante microscopia confocale, utilizzando dispositivi montati su vetrini di copertura spessi 170 μm. Gli IFN-DC sono stati colorati aggiungendo aliquote HLA-DR-FITC Ab anti-umane su chip.
    Per calcolare l'estensione delle cellule immunitarie vive infiltrate colorate con fluorescenza sfidate con segnali competitivi, viene impostato un flusso di lavoro comune per l'analisi delle immagini come segue (Figura 7D-G):
    1. Acquisire, in specifici endpoint temporali, microfotografie di contrasto di fase e di fluorescenza dei canali rosso/verde delle regioni gel sinistro e destro contenenti cellule tumorali rispettivamente esposte a regimi farmacologici singoli o a combinazioni di regimi farmacologici.
      NOTA: Qui le immagini sono state catturate da un microscopio a fluorescenza EVOS-FL dopo il carico cellulare (0 h), dopo 48 ore e dopo 72 ore di incubazione (Figura 7A-B). Un ingrandimento 4x-10x è stato utilizzato per acquisire la camera centrale, gli array di microcanali e i due canali laterali giustapposti contenenti A375 più IFN e A375 più DAC / IFN.
      1. Quando si eseguono operazioni di acquisizione, considerare i parametri da misurare ed evitare la saturazione delle caratteristiche da contare. I risultati ottimali della segmentazione dipendono dalla natura delle immagini acquisite, a causa della variabilità dei campioni biologici stessi, della qualità della colorazione e delle tecniche di microscopia utilizzate per applicazioni orientate all'utente.
    2. Caricare i dati a canale singolo a fluorescenza (in questo caso rosso = PBMC), nelle Fiji trascinandoli nella finestra principale (Figura 7D). Duplicare l'immagine per evitare di sovrascrivere i dati grezzi durante la selezione dei filtri di pre-elaborazione fino alla segmentazione finale.
      1. Se l'immagine è un'immagine a colori (RGB), premi Immagine > digitare 8 o 16 bit per convertirla in scala di grigi. Verifica che Modifica opzioni > > conversionis sia impostato per la scalabilità durante la conversione.
    3. Pre-elaborazione dei dati grezzi tramite la pulizia del rumore e degli artefatti.
      1. Vai al menu Elabora > sottrai sfondo applicando l'algoritmo della palla rotolante per correggere il rumore di fondo irregolare con grandi variazioni spaziali di intensità. Impostare il raggio almeno sulla dimensione della particella di primo piano più grande. Selezionare la casella Anteprima per la procedura di prova ed errore per ottenere risultati ottimali. Valori troppo piccoli possono rimuovere erroneamente le strutture di interesse.
      2. Nel comando Luminosità e contrasto trascinate i cursori Minimo/Massimo per modificare l'intervallo di intensità nell'istogramma. Sposta il cursore Massimo verso sinistra per aumentare la luminosità, senza funzioni di sbiadimento. Spostare la diapositiva Minimo verso destra per aumentare il contrasto dell'immagine evitando la scomparsa di elementi meno visibili sullo sfondo. Fare clic su Applica per correggere le modifiche.
    4. Miglioramento dell'immagine.
      1. Passare a Elaborare > filtri e sperimentare con i filtri gaussiani mediani sulle immagini (Figura 7E).
        NOTA: il raggio di prefiltraggio deve essere adattato ai pixel del rumore dell'immagine. Il filtro mediano non lineare sostituisce il valore dei pixel con il valore mediano dei vicini, per ridurre il rumore sale e pepe. "Gaussian Blur" viene utilizzato per uniformare un'immagine digitale, sostituendo i pixel con una media ponderata dei pixel circostanti. I pesi provengono dalla distribuzione di probabilità gaussiana, quindi i pixel più vicini sono più influenti.
      2. Vai facoltativamente a Elabora > matematica > gamma con la casella Anteprima selezionata per aumentare il contrasto.
        NOTA: le intensità impostate nel pannello B&C sono scalate tra i due limiti minimo e massimo. Valori < 1,0 accentuano le differenze tra basse intensità mentre valori > 1,0 accentuano le differenze tra alte intensità. La correzione gamma è funzionale per trovare un intervallo di visualizzazione, mostrando gli oggetti più deboli senza saturare i più luminosi.
    5. Creazione di una maschera immagine binaria.
      1. Vai a Immagine > regola > soglia. Il metodo più semplice utilizzato per determinare le soglie si basa sull'analisi istografica dei livelli di intensità, come mostrato nella Figura 7F. Nel menu a discesa, gioca con diversi metodi di soglia globale (nel nostro caso, viene applicato Otsu).
      2. Scorrere manualmente o digitare un intervallo noto di intensità di pixel nei pannelli dell'istogramma, osservare il cambiamento del motivo rosso che si sovrappone all'immagine che assomiglia principalmente all'area della cella reale. Il pulsante Ripristina rimuove la sovrapposizione. Una volta soddisfatto, fai clic su Applica per generare una versione binaria dell'immagine. Selezionare Elabora > Opzioni > binarie per controllare la modalità di visualizzazione delle immagini con soglia e il modo in cui gli oggetti vengono identificati dall'analizzatore di particelle.
    6. Utilizzare il comando di menu Processo/Binario/Spartiacque Particelle per dividere parzialmente sovrapposte o unite durante la soglia. Watershed può spesso tagliarli accuratamente aggiungendo una linea spessa 1 pixel. Esegui operazioni morfologiche come le operazioni di dilatazione o erosione per aumentare o rimuovere pixel da pixel sotto o sovrasaturati.
      NOTA: Per ulteriori informazioni, vedere la sezione Comandi di menu o fare riferimento a MorphoLibJ, una libreria integrata basata sulla morfologia matematica per elaborare dati binari.
    7. Descrizione quantitativa delle caratteristiche dell'immagine.
      1. Una volta ottenuto un riconoscimento soddisfacente degli oggetti, aprire Particle Analyzer da Analyze > Analyze Particles. Le particelle possono essere escluse in base alla loro dimensione e circolarità, espresse in pixel o in un'unità di misura calibrata (controllare la scala corretta relativa alle impostazioni del microscopio in Proprietà > immagine). Per includere tutto, mantenere il valore predefinito di 0-Infinito e l'intervallo predefinito di circolarità a 0,00 - 1,00 (0 = linea retta, 1 = cerchio perfetto).
      2. Per filtrare piccoli pixel "rumore" o caratteristiche di non interesse, impostare l'intervallo minimo e massimo. Selezionare le opzioni Includi fori, Mostra, Contorno e Visualizza risultati nel campo della finestra. L'opzione Escludi sui bordi eliminerà le particelle rilevate sui bordi dell'immagine. Aggiungi a Manager aggiunge la selezione ottenuta al gestore ROI per ulteriori analisi mantenendo le informazioni sulla posizione della particella.
        NOTA: Nel "ROI Manager", è possibile correggere la segmentazione automatica dell'output registrato (unire celle divise, dividere celle unite). Selezionare, utilizzando gli strumenti di selezione nella barra degli strumenti delle Fiji, i ROI all'interno di entrambe le regioni del gel in cui sono incorporate le cellule tumorali per stimare l'infiltrazione immunitaria.
    8. Esportare i valori ottenuti in un foglio di calcolo per eseguire analisi statistiche come illustrato nella Figura 7G. "Risultati" elenca una tabella di dati relativi alle proprietà delle particelle numerate identificate. "Riepilogo" apre una finestra con il nome dell'immagine, i conteggi totali e altre informazioni per l'intera immagine.
      1. Vai a Analizza > imposta misurazioni per includere un'ampia gamma di parametri.
    9. Registrare facoltativamente una macro (selezionando Plug-in > Macro > Record) per automatizzare il flusso di lavoro di elaborazione e risparmiare tempo nell'analisi su set di dati di grandi dimensioni.
      1. Utilizzare la stessa routine di elaborazione per analizzare il canale di fluorescenza verde nelle stesse regioni per analizzare i cambiamenti morfologici delle cellule tumorali nelle regioni 3D16

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Representative Results

L'infiltrazione immunitaria tumorale è un parametro della risposta antitumorale dell'ospite. I tumori sono eterogenei nella composizione, densità, posizione e stato funzionale dei leucociti infiltranti le cui interazioni con le cellule tumorali possono essere alla base di informazioni clinicamente rilevanti per prevedere il decorso della malattia e la risposta alla terapia. In questo senso, le tecnologie microfluidiche potrebbero essere utilizzate come strumenti complementari e privilegiati in vitro per esplorare il contesto immunitario dei tumori, nonché per monitorare la risposta alle terapie antitumorali. L'accoppiamento del saggio microfluidico, dell'imaging delle cellule vive e del software di tracciamento può stabilire metodi di quantificazione affidabili per quantificare come le cellule immunitarie regolano il loro modello di migrazione in diversi contesti. In questo capitolo, abbiamo riportato i passaggi per la creazione di co-colture 2D o 3D versatili di cellule tumorali immunitarie e bersaglio in dispositivi microfluidici ad hoc realizzati con procedure litografiche molli standard. Nella Sezione 1 sono stati impiegati dispositivi microfluidici per consentire contatti chimici e fisici tra popolazioni aderenti (cellule tumorali MDA-MB-231) e non aderenti (PBMC). Alcuni agenti chemioterapici (ad esempio, antracicline tra gli altri) possono indurre l'apoptosi "immunogenica" delle cellule maligne, migliorando così la loro visibilità in ospiti immunocompetenti. La morte delle cellule immunogeniche del cancro (ICD) è caratterizzata dal rilascio di segnali legati alla membrana e solubili forniti dalle cellule morenti che funzionano come allarmine per le cellule immunitarie. Per fornire una convalida quantitativa della risposta ICD, utilizziamo i dati raccolti nella piattaforma microfluidica in cui i leucociti possono muoversi attraverso ponti di microcanali opportunamente costruiti verso le loro cellule bersaglio. Le registrazioni time-lapse sono state eseguite dopo aver co-caricato PBMC, da donatori sani (WT, wild type), con cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231 pretrattate o meno con l'antraciclina DOXO. Le microfotografie sono state generate ogni 2 minuti, per due intervalli di tempo successivi di 24 e 48 ore. (Esemplare Filmato S1 di intervallo 0-24 h). L'analisi di tracciamento dei singoli PBMC sfidati con cellule tumorali morenti (trattate con DOXO) o vive (trattate con PBS) è stata effettuata utilizzando il plug-in Trackmate, come visto in Figura 6A (pannello di sinistra). I valori di chemiotassi e i grafici di migrazione rilevanti sono stati generati automaticamente utilizzando Chemiotassi e Migration Tool, come descritto in dettaglio in62. Le traiettorie cellulari sono state tutte estrapolate a (x, y) = 0 al tempo 24 h. I risultati hanno indicato un diverso profilo migratorio delle cellule immunitarie quando co-caricate con cellule di cancro al seno esposte a DOXO o PBS. Quando le PBMC si sono confrontate con cellule tumorali apoptotiche, hanno attraversato i microcanali verso le cellule morenti / morte (ma non per vivere le cellule non trattate). Grafici di migrazione X/Y di ragni e rose, presentati nel pannello di sinistra Figura 6B-C, sono stati mappati e confrontati per evidenziare l'impatto degli agenti induttori immunogenici sulle differenze nelle dinamiche immunitarie. I grafici di Rose dimostrano che i PBMC sono migrati principalmente in quasi tutte le direzioni nell'esperimento di controllo, solo una frazione trascurabile è guidata verso l'alto il gradiente generato dalla proliferazione delle cellule tumorali. Al contrario, i percorsi delle singole cellule evidenziano un forte movimento di bias lungo la direzione delle cellule di cancro al seno apoptotico (direzione x negativa). Per valutare la migrazione diretta delle cellule immunitarie verso cellule tumorali trattate con DOXO o PBS, vengono calcolati diversi parametri chemiotassi, tra cui: a) il centro di massa (punto medio spaziale di tutti gli endpoint); b) la direzionalità; c) l'indice di migrazione in avanti (cioè lo spostamento medio delle cellule in una direzione di interesse che significa verso il sito tumorale bersaglio, nel nostro caso). Questi ultimi valori rappresentano una misura dell'efficienza di una cellula a migrare nella direzione dati stimoli chemiotattici. Dopo aver raggiunto la camera sinistra, una frazione di leucociti con una densità crescente nell'arco di 24-48 ore ha mostrato contatti a lungo termine (>60 min) con MDA-MB-231 trattati con DOXO. Le PBMC non riescono a migrare massicciamente e a impegnarsi in tali interazioni a lungo termine e persistenti con cellule tumorali vive (come dimostrato da microfotografie rappresentative di PBMC in avvicinamento in Figura 6A, giusto). Per quantificare le differenze nell'interazione tumore-immune, la regione tumorale è stata delineata con un cerchio fisso di diametro compreso tra 20 e 80 micron, chiamato "hotspot". La quantificazione e l'analisi dei FOV rappresentativi sono mostrate in Grafico 6 (Pannello di destra, B-C).

Nella Sezione 2 è stato descritto un nuovo modello tumorale immuno-competente 3D per quantificare il reclutamento di cellule immunitarie in risposta a combinazioni anti-cancro di farmaci epigenetici32 (DAC/IFN vs IFN da solo), consentendo il confronto simultaneo di due diverse condizioni di trattamento delle cellule di melanoma A375. Pertanto, le cellule di melanoma A375M, marcate con colorante fluorescente verde PKH67, sono state incorporate nelle matrici Matrigel in presenza di DAC e / o IFN in ciascuna camera del gel, mentre le PBMC marcate in rosso PKH26 sono state distribuite omogeneamente nella camera fluidica centrale nel punto di partenza (Figura 7A). Abbiamo confrontato simultaneamente le due masse tumorali in matrici 3D per la loro capacità di attrarre PBMC. A 48 e 72 ore, le PBMC sono guidate massicciamente nei microcanali di destra, come osservato nella Figura 7B.

È stato chiaramente osservato un posizionamento preferenziale delle PBMC verso la matrice di gel contenente il sito del melanoma trattato con DAC / IFN, piuttosto che trattato con IFN, mentre lo scarso tasso di migrazione era visibile verso le cellule A375 esposte a un singolo trattamento (lato chip sinistro). L'impostazione competitiva è applicabile per studiare una pletora di diversi fenotipi di biologia del cancro (ad esempio, resistente ai farmaci vs aggressivo, primario o metastatico (ad esempio, cellule di melanoma A375P vs A375M) e responder vs non-responder). Le camere gel possono essere costituite da co-colture complesse di cellule maligne e cellule multiple associate a tumori non cancerose, come cellule endoteliali, cellule immunitarie e fibroblasti33 per caratterizzare le risposte farmacologiche a livello di TME. Gli eventi di mitosi e morte apoptotica delle cellule tumorali possono essere monitorati mediante colorazione con coloranti vivi33. Le procedure di immunocolorazione su dispositivi microfluidici 3D potrebbero essere adattate per valutare gli stati di attivazione delle cellule immunitarie infiltrate nei siti tumorali mediante microscopia confocale35. In questo senso, questi sistemi microfluidici 3D possono imitare strutture tumorali complesse e interazioni multicellulari e quindi sono piattaforme preziose per test preclinici di farmaci più affidabili.

Figure 1
Figura 1. Planimetria del dispositivo microfluidico per l'assemblaggio di co-colture 2D tumore-immuni. (A) Microfotografia reale di 3 chip assemblati in un unico vetrino da microscopio. I serbatoi sono numerati in base alla sequenza di carico e sono codificati a colori come le corrispondenti camere di coltura elencate nella legenda. Scalebar, 6 mm. (B) CAD 3D di chip costituito da tre aree principali di coltura cellulare collegate da microsolchi. C) Dettagli del ponte di microsolchi stretti, che mostrano le dimensioni adattate alle cellule tumorali e alle dimensioni delle PBMC. D-E) La microfotografia in luce visibile è stata acquisita prima dell'inizio del time-lapse, mostrando la distribuzione delle cellule tumorali e delle PBMC rispettivamente nella camera sinistra e nella camera intermedia. Scalebar, 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Pipeline di analisi trackmate per la localizzazione di punti immunitari in immagini di serie temporali. A) Pannello superiore: schermata del menu di calibrazione dell'immagine Trackmate. Pannello inferiore: Fiji "Image properties menu" per impostare il tempo e le unità spaziali. B) Pannello superiore: Screenshot del menu "Rilevamento punti" di Trackmate. Pannello inferiore: immagine di output con applicati diversi valori di "Soglia". C) Pannello superiore: Screenshot del menu "Spot filtering" di Trackmate che illustra alcuni filtri. Pannello inferiore: immagine time-lapse esemplare, raffigurante macchie immunitarie filtrate per posizione lungo X nella camera intermedia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Pipeline di analisi Trackmate per la ricostruzione di tracce immunitarie in sequenze di immagini di serie temporali. A-C) Schermate dei menu di Trackmate per la creazione di tracce, il filtraggio delle tracce e per l'esportazione dei dati finali. D) Esempi di tracce generate in immagini time-lapse pre-elaborate che variano le impostazioni del rilevatore di collegamento. E) Esempio di false tracce e collegamenti errati derivati dalla rilevazione dei bordi delle cellule tumorali. F) Le tracce sono evidenziate in verde selezionando le righe nel file .txt dei risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Panoramica schematica per chip 3D immunocompetenti tumor-on. A) Esempio di master in silicio microstrutturato. I francobolli per PDMS sono stati modellati in resistenza negativa SU-8 in una struttura per camere bianche dotata di e-beam e litografia ottica. B) Le repliche PDMS sono state fabbricate con metodi standard di litografia morbida. L'unità centrale ha le camere colorate come quelle disegnate nel rendering 3D del chip, raffigurate nel pannello D. C) Microscopia elettronica a scansione (SEM) vista ingrandita della schiera di micropilastri adatti per l'intrappolamento della soluzione di idrogel. D)CAD 3D che mostra le camere, collegate da microscanalature e pozzetti di carico. Le caselle tratteggiate sono riferite alle fotografie SEM dei dettagli (pannello C ed E). E) Fotografia SEM di microsolchi di collegamento alti 10 μm. F) Layout CAD 2D raffigurante le dimensioni delle microstrutture. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Flusso di lavoro schematico delle principali fasi del protocollo di caricamento per l'assemblaggio di co-colture 3D. A) Pannello superiore: Schemi della fase di iniezione della soluzione di Matrigel in ciascuna regione laterale del gel. Pannello inferiore: fotografia reale del chip che mostra l'avanzamento frontale del gel lungo il canale durante la fase di caricamento. B) Schemi della fase di polimerizzazione Matrigel. Pannello inferiore: vista microscopica a contrasto di fase dell'interfaccia gel-aria formata dopo la fase di gelificazione. Scalebar, 100 μm. C)Pannello superiore: disegno, raffigurante il caricamento di celle e supporti con volumi esemplari utilizzati nel protocollo. Pannello inferiore: viene mostrata un'immagine a contrasto di fase 4X della co-cultura assemblata a 0h. Scalebar, 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6. Analisi dei profili migratori e del comportamento di interazione della PBMC verso la camera tumorale morente/viva nella finestra temporale di 24-48 h. Pannello di sinistra. A) Screenshot di immagini time-lapse pre-elaborate sovrapposte a tracce colorate immuni, estratte da Trackmate. Le vie immunitarie sono ottenute da un singolo FOV nelle condizioni sperimentali indicate nell'intervallo da 24 a 48 ore nella camera intermedia. B-C) Tracce di migrazione rappresentative e grafici di rose di PBMC coltivate nelle due diverse condizioni (n = 1550 PBMC rispetto a cellule tumorali trattate con DOXO, DOXO+ o n = 1434 PBMC rispetto a cellule tumorali di controllo, DOXO-). Ogni linea all'interno dei grafici x-y rappresenta una singola traiettoria PBMC e ogni cerchio rappresenta la posizione finale di una singola cella rispetto alla posizione iniziale. I punti iniziali vengono impostati su (0,0) utilizzando una trasformazione di coordinate. Le coordinate e lo spostamento del centro di massa della migrazione cellulare sono visualizzati nelle condizioni sperimentali indicate. Le coordinate del centro di massa e lo spostamento (calcolati come distanza euclidea media per le componenti X e Y) forniscono un'indicazione della direzione media in cui il gruppo di cellule ha viaggiato principalmente e della grandezza del movimento complessivo delle cellule nei gruppi di condizioni. Le linee blu e verdi contrassegnano rispettivamente le singole tracce in base al valore di distanza euclidea maggiore/minore di un valore di soglia (100 μm). D) Schema di dati numerici estratti da una traccia cellulare. E-F) Box & Whiskers plot raffigurante rispettivamente la direzionalità (p<0,0001 Unpaired t test con correzione di Welch) e FMI (p<0,0001 Unpaired t test con correzione di Welch). La linea orizzontale nelle caselle rappresenta i valori mediani. I valori FMI sono la media per tutte le tracce di celle in ciascun gruppo di condizioni. Pannello di destra. A) Screenshot dei ROI estratti da Trackmate che mostrano interazioni differenziali tra PBMC e cellule tumorali trattate con DOXO o PBS. B) Densità temporale delle PBMC intorno alle cellule tumorali MDA-MB-231 trattate con DOXO o di controllo. Numero di PBMC presenti nel ROI selezionato intorno alle cellule tumorali per ciascuna condizione. I valori riportati sono la media su 9 ROI selezionati da un singolo FOV time-lapse. I punti caldi del cancro sono definiti in un ROI (80 μm di diametro). Viene visualizzata la mappa di calore della densità corrispondente. I punti rappresentano il numero medio di cellule calcolato su 9 punti caldi del cancro in punti temporali indicati. C) Distribuzione dei tempi (min) di contatti per ciascun gruppo sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Reclutamento preferenziale di PBMC in risposta a combinazioni di farmaci DAC più IFN in un modello competitivo di melanoma 3D immuno-competente su chip. A) Distribuzione di PBMC inizialmente caricate nella camera centrale dei dispositivi microfluidici. Le microfotografie vengono acquisite dal microscopio a fluorescenza EVOS-FL durante l'intervallo 0-72 h. La fluorescenza rossa (cellule marcate con PKH67) rappresenta le PBMC di donatori sani. Le cellule di melanoma umano marcate con PKH67 (verde) incorporate in Matrigel contenenti trattamenti a combinazione singola o doppia sono state placcate in camere laterali. B) Celle A375 più IFN a sinistra contro A375 più DAC/IFN a destra. Le immagini a fluorescenza sono state mostrate a 72 ore di co-coltura. La scatola gialla fuori produzione mostra visibilmente un reclutamento massiccio nell'A375 più lato DAC / IFN. C) PBMC conta in quattro diversi ROI dalle camere IFN rispetto alle camere DAC + IFN. Gli istogrammi rappresentano la conta cellulare +/- S.D.; heatmap enumerato i valori di ciascun ROI. Scalebars, 200 μm. D-G) Schemi delle fasi di segmentazione e quantificazione di PBMC infiltrate in matrici gel applicate a immagini di fluorescenza a canale singolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare. Protocollo di microfabbricazione Clicca qui per scaricare questo file.

Film supplementare 1. Sequenze time-lapse in una co-coltura on-chip 2D tumore-immune al tumore. Le microfotografie sono state acquisite ogni 2 minuti, in un intervallo di tempo di 0-24 ore per mezzo di un microscopio compatto posto in un incubatore di coltura cellulare standard. Pannello di sinistra. Filmato di PBMC da donatori sani (WT, wild type), placcato con MDA-MB-231 cellule di controllo del cancro al seno. Pannello di destra. Filmato di una massiccia migrazione di PBMCs WT verso la camera del chip dove vengono caricate le cellule tumorali trattate con MDA-MB-231 DOXO. Il layout del chip 2D è descritto in dettaglio nella sezione 1 del protocollo e mostrato nella Figura 1. Clicca qui per scaricare questo film.

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Discussion

I metodi descritti cercano di progettare un approccio generale per ricapitolare, con grado modulabile di complessità, due aspetti significativi nel campo dell'onco-immunologia, che possono beneficiare dell'adozione di modelli in vitro più rilevanti. Il primo riguarda il lato della popolazione di cellule tumorali, dove affrontare le caratteristiche delle singole cellule può portare a una migliore descrizione dell'eterogeneità e del significato biologico e clinico correlato tra cui resistenza alla terapia, propensione alle metastasi, cellule staminali e grado di differenziazione. L'altro lato della storia è rappresentato dalla TME, che comprende componenti non cancerose (cellule immunitarie e stromali, vasi sanguigni) e paesaggio chimico/fisico (costituenti della ECM, chemochine e altri fattori solubili rilasciati) che possono influenzare profondamente sia le caratteristiche della malattia che la risposta individuale alla terapia63, in particolare all'immunoterapia. Vale la pena notare che l'esportazione dell'approccio descritto ad altri campi di ricerca richiede una profonda comprensione dei limiti e delle sfide portate dallo sviluppo e dall'adozione di nuovi modelli.

Citando una massima applicata nella modellazione ingegneristica ("modella il problema non il sistema"), deve essere ottimizzato il numero minimo di componenti (cellulari, fisici e chimici) e le condizioni necessarie per rendere il proprio modello su chip biologicamente rilevante e stabile durante l'intero esperimento. Ogni combinazione di tipi di cellule/ambiente microambientale/sperimentale deve, quindi, essere accuratamente scelta, valutata e continuamente monitorata lungo singoli esperimenti e da una sessione all'altra. Questi controlli includono, come menzionato nelle sezioni del protocollo, un controllo rigoroso di parametri come i volumi nei dispositivi microfluidici che possono essere modificati da condizioni di umidità o riscaldamento da fonti di illuminazione, possibili movimenti e non planarità degli stadi che causano derive di liquidi incontrollati, ma anche alcune verifiche finali dello stato cellulare, della vitalità e della caratterizzazione fenotipica. Un passaggio critico riguarda la decisione di utilizzare sistemi di perfusione per creare strutture vascolarizzate, o per la somministrazione di farmaci on-chip33, poiché ciò può influenzare gli esperimenti in termini di complessità crescente, durata della coltura cellulare e modulazione dei fattori chimici in presenza di cellule galleggianti come quelle immunitarie.

Di seguito riassumiamo le principali criticità e rilevanti riscontrate nei setting sperimentali e nella letteratura più recente.

ECM e definizione del panorama chimico
La TME è profondamente influenzata anche dalle proprietà meccaniche 64,65 dei dintorni63, 66. Per questo motivo, la scelta della matrice colturale è fondamentale, soprattutto quando si ha a che fare con cellule immunitarie che, in determinate condizioni, potrebbero rispondere ai segnali rilasciati dalla matrice stessa. Nel prossimo futuro sono attesi importanti progressi anche dalla progettazione e dallo sviluppo di nuovi materiali e idrogel (caratterizzati da diversa rigidità, porosità, presenza di fattori solubili, tra gli altri parametri) che stanno abilitando una ECM sempre più raffinata e controllabile, imitando le specificità di diversi tessuti oggi, diversi pazienti domani. D'altra parte è anche fondamentale monitorare i cambiamenti indotti dalle diverse popolazioni cellulari nella ECM e definire strategie per includere queste informazioni nelle analisi dinamiche e fenotipiche.

Gestione dei dati
Il percorso verso l'implementazione di tecniche on-chip tumorali in un flusso di lavoro clinico beneficerà di un enorme lavoro sperimentale che si sta svolgendo lungo diverse direzioni. I modelli organ-on-chip, come molte tecniche in vitro, sono funzionali, almeno potenzialmente, per eseguire misurazioni ad alto rendimento/alto contenuto. La parallelizzazione delle condizioni sperimentali, inclusi i controlli positivi e negativi, e delle repliche tecnico/biologiche è resa possibile dall'integrazione di più chip sulla stessa piastra. L'aumento del throughput quantitativo svolge un ruolo cruciale nella traduzione e nella convalida di questi sistemi nella pipeline di screening rapido di farmaci o geni per le immunoterapie. In effetti, diverse aziende hanno già sviluppato piattaforme in un formato multi-pozzo e diversi approcci di imaging sono in fase di test per consentire il monitoraggio di un numero elevato di dispositivi contemporaneamente14. Nei protocolli sopra descritti, abbiamo utilizzato vetrini da microscopio che allocano fino a 3 chip, con la possibilità di visualizzare fino a 12 condizioni sperimentali in parallelo, utilizzando un vassoio multi-vetrino standard per microscopio. Questa configurazione è compatibile con il pipettaggio manuale e adatta per regolazioni personalizzate eseguite nel nostro impianto di microfabbricazione. Al contrario, quando è necessaria una forte parallelizzazione (più test e controlli di screening), sono necessarie ottimizzazioni di setup per impostare un livello più elevato di automazione (ad esempio, l'uso di robot di pipettaggio, multipozzetti in plastica).

Quando si progettano esperimenti, è necessario tenere conto di un compromesso tra risoluzione spaziale e temporale.

L'enorme quantità di dati, prodotta dalla microscopia ad alto contenuto, costituisce un fattore limitante in termini di archiviazione, trasferimento e analisi. Questi problemi vengono affrontati con approcci computazionali che implementano strumenti di apprendimento automatico e risorse hardware / software, che possono favorire la possibilità futura di collegare esperimenti on-chip / in-silico67,68 nella scelta delle strategie terapeutiche, e che rappresenta un'opportunità ambiziosa ma non differibile.

Oltre l'imaging a fluorescenza
La marcatura a fluorescenza, mediante coloranti o geni reporter, per la sua elevata specificità, rappresenta senza dubbio il metodo gold standard per identificare diverse popolazioni cellulari in condizioni di co-coltura e per risolvere proprietà molecolari con elevato SNR. Nei modelli OOC questo approccio è comunemente usato come riferimento e in particolare in microambienti tumorali su chip eterogenei, può essere utile per caratterizzare il fenotipo delle cellule immunitarie infiltrate e interagenti.

Tuttavia, vi è una crescente evidenza che gli effetti indotti da fluorofori, laboriose procedure di colorazione e routine di illuminazione devono essere monitorati e ridotti al minimo69 perché possono influenzare profondamente il comportamento e lo stato cellulare70,71. Questo rischio sembra particolarmente vero per i sistemi fragili, come le cellule immunitarie72,73. Le reazioni fototossiche possono introdurre limitazioni nella definizione dell'acquisizione della finestra temporale di cellule vive quando monitorate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Inoltre, la ricchezza nella varietà delle sottopopolazioni immunitarie rende impossibile discriminare tra loro solo con la colorazione fluorescente, considerando il numero limitato di filtri comunemente disponibili sui microscopi.

Per affrontare questo problema, da un punto di vista strumentale, nuove tecniche di microscopia label free74 come holographic56 o hyperspectral microscopy57 stanno ora apparendo sul palco. Promettono strategie avanzate di classificazione dei processi cellulari oltre la fluorescenza e possono essere particolarmente utili per lo studio di campioni sensibili. Dal punto di vista dell'analisi dei dati, approcci computazionali avanzati, basati su algoritmi di deep learning75 (addestrati da dataset di immagini a fluorescenza), aprono le porte per eseguire la cosiddetta "etichettatura in silico"76,77. Sono stati applicati con successo per prevedere marcatori fluorescenti da immagini in campo chiaro78, generando immagini etichettate, senza colorare le cellule, aumentando così il potere informativo della microscopia a campo chiaro. Questa strategia può anche essere utile per risparmiare tempo e canali di fluorescenza per altri marcatori. Crediamo che la comunità OOC trarrà beneficio da queste nuove tecniche che consentono uno studio meno invasivo dell'interazione delle popolazioni cellulari.

Analisi dei dati
I meccanismi di interazione tra cellule tumorali immunitarie e cellule tumorali bersaglio possono essere studiati attraverso il tracciamento dei movimenti cellulari28,79. Gli esperimenti di monitoraggio time-lapse in co-colture complesse ed eterogenee sono estremamente preziosi per estrarre modelli di migrazione cellulare, cambiamenti morfologici e di stato e informazioni complete sul lignaggio. L'esecuzione di analisi manuali è praticamente fattibile solo per brevi sequenze con poche celle, ma non per esperimenti sistematici ad alto rendimento. Di conseguenza, lo sviluppo di strumenti computazionali per il tracciamento cellulare, completamente o parzialmente automatizzati, è un campo di ricerca vitale nell'analisi delle immagini24. In genere, il tracciamento cellulare convenzionale richiede una frequenza relativamente elevata di campionamento e risoluzione spaziale per eseguire correttamente le attività di segmentazione, che possono essere difficili in molte condizioni sperimentali. Per localizzare le celle, sono disponibili strumenti di segmentazione e tracciamento ad accesso aperto (ad esempio, il software ImageJ22) come presentato in questo protocollo o in un software proprietario dedicato. In studi su larga scala, abbiamo applicato un software proprietario chiamato Cell Hunter16,31, sviluppato dall'Università di Tor Vergata a Roma, per distinguere in modo completamente automatico il cancro e le cellule immunitarie in contesti multi-popolazione. Soluzioni su misura basate sull'apprendimento automatico e sugli approcci di rete neurale 80,81,82 stanno iniziando ad essere implementate oggi nei pacchetti software di microscopia 83, dal miglioramento dell'SNR alla gestione dei parametri di acquisizione critici o alle fasi di segmentazione. L'apprendimento automatico può essere sfruttato per riconoscere modelli cellulari comuni (ad esempio, stili di movimento) al fine di caratterizzare la risposta biologica rispetto a fattori microambientali.

In Comes et al.41, è stata applicata un'architettura di rete neurale convoluzionale di deep learning pre-addestrata per classificare se le cellule tumorali sono o meno esposte a un trattamento farmacologico utilizzando come "marcatore" la motilità delle cellule immunitarie, tracciata dai dati time-lapse di co-colture di cellule di cancro al seno e PBMC in matrici di collagene in microdispositivi, come descritto alpunto 33.

Sviluppo di metodi omici a cellula singola e ontologie
Sottolineiamo la necessità di un'alleanza strategica tra le tecnologie omiche a singola cellula84 (ad esempio, proteomica, metabolomica, genomica) e i metodi on-chip: la caratterizzazione molecolare dettagliata, coniugata alle informazioni dinamiche funzionali, potrebbe migliorare la comprensione dei meccanismi di base e la descrizione clinica. In questo caso nuovi strumenti per collegare i due mondi sono all'inizio85. La prima sfida è quella di implementare approcci omici a singola cellula direttamente sui chip di onco-immunologia22. Inoltre, gli organ-on-chip potrebbero essere sfruttati come piattaforme per testare potenziali bersagli identificati da analisi genomiche e proteomiche86,87. Un secondo strumento di collegamento, che è ancora in gran parte mancante, è un modo strutturato e standardizzato di annotare e memorizzare i risultati del sistema misurato88,89. Ma questo è esattamente ciò di cui abbiamo bisogno in futuro per costruire database sistematici di risultati quantitativi cellulari e caratteristiche misurate, per estrarli, dedurli e correlarli con le informazioni biologiche intrinseche. In una parola, la necessità di standardizzazione e analisi sistematica di set di dati sperimentali eterogenei richiede un quadro ontologico.

Personalizzazione dei modelli
La tecnologia Organs-on-chip è adatta alla personalizzazione12, poiché cellule e tessuti di singoli pazienti (o classi di pazienti) possono essere utilizzati nei dispositivi in condizioni controllate, portando a letture clinicamente rilevanti, utili per informare strategie terapeutiche o di prevenzione. Alcuni esempi stanno iniziando ad apparire nella letteratura90. Naturalmente, per i modelli tumor-on-chip, questa sfida pone diverse questioni tecniche e scientifiche da risolvere36 (come il controllo delle caratteristiche della TME come la concentrazione di ossigeno, i gradienti di citochine, ecc.). È importante sottolineare che la prospettiva di rendere più efficaci le terapie oncologiche e onco-immunologiche riducendo gli effetti dannosi per ciascun paziente è interessante, dal punto di vista della qualità della vita come per l'ottimizzazione delle risorse sanitarie.

In conclusione, è evidente che questo campo è un campo autenticamente interdisciplinare e come tale, richiede un grande sforzo per stabilire un linguaggio comune e obiettivi condivisi tra ricercatori, clinici, industria, ma anche di diverse discipline (ingegneria, biologia, scienza dei dati, medicina, chimica) trovando un buon equilibrio e nuove soluzioni91.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare. AS è sostenuto dalla Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) e dal Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS e FM sono sostenuti dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) n. 21366 a G.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

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References

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De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

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