Mikrofluidiske cokulturmodeller til dissekering af immunresponset i in vitro tumormikromiljøer

Summary

I en tid med immunterapi og enkeltcellegenomisk profilering kræver kræftbiologi nye in vitro- og beregningsværktøjer til undersøgelse af tumor-immungrænsefladen i en ordentlig rumlig tidsmæssig sammenhæng. Vi beskriver protokoller til udnyttelse af tumorimmune mikrofluidiske co-kulturer i 2D- og 3D-indstillinger, kompatible med dynamisk, multiparametrisk overvågning af cellulære funktioner.

Abstract

Komplekse sygdomsmodeller kræver banebrydende værktøjer, der er i stand til at levere fysiologisk og patologisk relevant, handlingsrettet indsigt og afsløre ellers usynlige processer. Avancerede celleanalyser, der nøje efterligner in vivo-landskaber, etablerer sig som nye måder at visualisere og måle det tovejs tumor-værtssamspil, der påvirker udviklingen af kræft. Her beskriver vi to alsidige protokoller til at genskabe meget kontrollerbare 2D- og 3D-cokulturer i mikroenheder, der efterligner kompleksiteten af tumormikromiljøet (TME) under naturlig og terapiinduceret immunovervågning. I afsnit 1 tilvejebringes en eksperimentel indstilling til overvågning af krydstale mellem vedhængende tumorceller og flydende immunpopulationer ved lys felt time-lapse mikroskopi. Som et applikativt scenarie analyserer vi virkningerne af kræftbehandlinger, såsom de såkaldte immunogene kræftcelledødsinducere på rekruttering og aktivering af immunceller. I afsnit 2 samles 3D-tumorimmune mikromiljøer i et konkurrencedygtigt layout. Differentiel immuninfiltration overvåges af fluorescenssnapshots op til 72 timer for at evaluere kombinationsterapeutiske strategier. I begge indstillinger illustreres billedbehandlingstrin for at udtrække en overflod af immuncelleparametre (f.eks. Immuncellemigration og interaktion, respons på terapeutiske midler). Disse enkle og kraftfulde metoder kan yderligere skræddersys til at simulere kompleksiteten af TME, der omfatter heterogeniteten og plasticiteten af kræft-, stromale og immuncelleundertyper samt deres gensidige interaktioner som drivkræfter for kræftudvikling. Overensstemmelsen af disse hurtigt udviklende teknologier med levende cellebilleder med højt indhold kan føre til generering af store informative datasæt, hvilket medfører nye udfordringer. Faktisk sætter trekanten '' co-kulturer / mikroskopi / avanceret dataanalyse "vejen mod en præcis problemparametrisering, der kan hjælpe skræddersyede terapeutiske protokoller. Vi forventer, at fremtidig integration af kræftimmun on-a-chip med kunstig intelligens til behandling med høj kapacitet vil synergisere et stort skridt fremad i at udnytte mulighederne som prædiktive og prækliniske værktøjer til præcision og personlig onkologi.

Introduction

Udviklingen af forskellige grene af medicin som eksperimentelle discipliner har været afhængig af evnen til at manipulere cellepopulationer og organfunktioner under kontrollerede forhold¹. En sådan evne har sine rødder i tilgængeligheden af målbare modeller, der er i stand til at rekapitulere processer, der sker i vores krop.

I en tid med immunterapi og enkeltcellegenomisk profilering 2 skal kræftbiologi drage fordel af nye in vitro- og beregningsmodeller til undersøgelse af tumor-immungrænsefladen i en ordentlig rumlig tidsmæssig sammenhæng ^2,3.

Tumormikromiljøet⁴ (TME) er et komplekst væv, hvor kræftceller kontinuerligt interagerer og dynamisk udvikler sig sammen med de andre cellulære (immun-, stromale og endotelceller) og ikke-cellulære (den ekstracellulære matrix, ECM) komponenter. Den dynamiske natur af dette komplekse landskab dikterer, om immunceller spiller som venner eller fjender af ondartede celler, hvilket stærkt påvirker både sygdomsprogression og respons på terapi. I dag konvergerer store bestræbelser fra oncoimmunologer, bioinformatikere og systembiologiske eksperter for at adressere den kliniske betydning af kræftheterogenitet 5,6, enten i rummet (dvs. i forskellige tumorale regioner) og tid (dvs. ved forskellige tumorprogressionsstadier)^5,6 og for at karakterisere kræft- og immuncellefænotype og funktion på enkeltcelleniveau. Som et eksempel på denne synergi anvendes avancerede computersynsteknikker nu rutinemæssigt til rumlig kortlægning af immuninfiltrat i histologiske prøver ^7,8.

På forsiden af eksperimentelle modeller, brobyggende dyreforsøg og traditionelle in vitro-metoder giver fremskridt inden for mikrofluidik og co-kulturteknikker adgang til forskellige klasser af mikrokonstruerede cellulære modeller såsom organoider, mikrofysiologiske systemer 9,10,11 (MPS) og organer-on-chip^12,13,14 (OOC). De deler det fælles træk at zoome ind i det 'store billede' af de cellulære økosystemer og udvide in vitro-potentialet til at kontrollere mikromiljøfaktorer, samtidig med at de udnytter mikroskopi med højt indhold¹⁵ og billedbehandlingsmetoder.

I dag er state-of-the-art- MPS- og OOC-systemer begyndt at omfatte immunologiske aspekter , der inkorporerer forskellige undertyper af immunceller i eksisterende vævs- og cokulturer for at udforske og måle en række processer som inflammatoriske sygdomme, sårheling, slimhindeimmunitet og respons på toksiner eller daglige fødevarer¹⁶. TME-on-a-chip-modeller 10,11,12,13,14,15,16,17, også integreret med perfusable mikrofartøjer 18,19,20,21, er blevet udviklet til at undersøge celletypeafhængige interaktioner, fysiske og kemiske forstyrrelser og cytotoksisk aktivitet af infiltrerende lymfocytter²² såvel som klinisk relevante immunmodulerende midler²³.

Her leverer vi alsidige protokoller, der spænder fra indlæsning af celler i chips til billedbehandlingsværktøjer, til udnyttelse af avancerede tumorimmune mikrofluidiske cokulturer i 2D (sektion 1) og 3D (sektion 2) indstillinger¹⁶, kompatibel med dynamisk, multiparametrisk^{24-overvågning} og visualisering af cellulære funktioner. Dette opnås ved at opretholde brugervenlighed og fleksibilitet både i prøvestyring og dataanalyse, idet man drager fordel af Fiji freeware-software og dens værktøjskasser^25,26.

Den mikrofluidiske enhed, der er beskrevet i afsnit 1, er designet til at udføre 2D-cokulturer af vedhængende kræft og flydende immunceller. Denne platform blev valideret til in vitro-måling af immuncelleadfærd i nærvær af genetiske mutationer²⁷ og/eller immundefekter²⁸. Her illustrerer vi trin til sporing af immunceller i time-lapse bright-field-billeder ved at udnytte en halvautomatisk metode baseret på Trackmate (et plugin implementeret i Fiji-software). Denne procedure muliggør ekstraktion af kinematiske deskriptorer for immunmigration ²⁹ og respons (dvs. interaktionstider) for at målrette kræftceller, behandlet eller ej med immunogene celledødsinduktorer²⁷.

Det er vigtigt, at disse parametre, ekstraheret fra tidsseriebilleder, kan behandles med avancerede matematiske maskiner. Som et eksempel på potentialet i denne tilgang offentliggjorde vores grupper for nylig en analyse baseret på matematiske metoder fra stokastiske processer og statistisk mekanik til modellering af cellulære netværksegenskaber og giver en parametrisk beskrivelse af immuncelleadfærd (dvs. forudindtaget eller ukorreleret tilfældig gang, stærkt eller ikke koordineret bevægelse^30,31).

3D-indstillingen, der er angivet i andet afsnit, er baseret på en co-kulturprotokol for at genskabe mere komplekse immunkompetente TME'er indlejret i to gelregioner med forskellige kombinationer af celletyper og lægemidler på en konkurrencedygtig måde. Her beskrives billedbehandlingstrin for på forskellige tidspunkter at måle infiltrationen af farvede immunceller i humane A375M-melanomceller dyrket i Matrigel for at evaluere antitumormiddelkombinationer³². A375M-linje, en A375P-afledt cellelinje karakteriseret ved en meget metastatisk fænotype, blev valgt til at evaluere deres metastatiske evne i nærvær af immunceller³².

De beskrevne modeller kan være fuldt kompatible med forskellige cellekilder (murin og humane udødeliggjorte eller primære cellelinjer, organoider, xenotransplantater, blandt de andre). I nylige undersøgelser af vores laboratorium blev det konkurrencedygtige 3D-layout anvendt til at undersøge: i) et antitumoralt (antistofafhængigt cellemedieret cytotoksicitet, ADCC) immunrespons og dissekere fibroblasters rolle i resistens over for trastuzumab-terapi i HER2⁺ brystkræft on-chip-modeller³³; ii) virkningen af myeloide celler (dvs. kræftassocierede makrofager) i mekanismer for tumorunddragelse og rekruttering af T-celler³⁴; iii) effekten af immunterapeutiske regimer, specifikt baseret på interferon-α-konditionerede dendritiske celler (IFN-DC'er), dyrket med lægemiddelbehandlede tyktarmskræftceller i kollagenmatricer, og til at evaluere effektiv bevægelse og de efterfølgende fagocytosehændelser³⁵; iv) den kemotaktiske migration af knoglemarvsafledte eosinofiler mod IL-33-behandlede eller ubehandlede melanomceller³⁶.

Disse avancerede modeller kunne tjene som observationsvinduer til forståelse af immunkontekstens rolle i kræftmetastaser og resistensmekanismer, men der kræves en indsats for at oversætte resultaterne til klinikkerne og lukke hullet med grundforskning³⁷.

Som et nyt scenarie åbner udnyttelse af kraften i automatiseret mikroskopi med højt indhold kombineret med brugen af mere fysiologisk relevante mikrosystemer nye potentielle udfordringer for håndtering, behandling og fortolkning af hundreder og endda tusinder af gigabyte multiparametriske data, som kan genereres fra en enkelt eksperimentel kampagne. Dette indebærer en direkte forbindelse mellem OOC-eksperimenter med kunstig intelligens 38,39,40,41,42 (AI)-baserede algoritmer både til avanceret automatiseret analyse og generering af funktioner, der igen kan føde i silico-modeller af kræftimmun samspil 43, med spændende nye applikationer i horisonten^, såsom udvikling af prædiktive lægemiddelscreeningsassays ⁴⁴.

En stadigt voksende strøm af indsatser er fokuseret på design af sygdomsmodeller sammen med optimering af strategier til implementering af de store forstyrrelsesskærme med enkeltcelle multi-omics-aflæsninger. Dette vil utvivlsomt bidrage til udviklingen og forhåbentlig den kliniske gennemførelse, ledsaget af en passende grad af metodestandardisering, af en systematisk onco-immunology-on-a-chip-tilgang for at få ny indsigt i immunsygdomme og kræftspredningsmekanismer.

Protocol

1. Chipdesign til klæbende og flydende celler 2D-co-kulturer

BEMÆRK: 2D-samkulturlayoutet (figur 1A-C) er kendetegnet ved tre kamre (100 μm høje) forbundet med to sæt mikrokanalarrays (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H). Det mellemliggende kammer danner to lukkede blindgyderum, som blokerer flydende immunceller, der flyder over i tumorstedet under indlæsningstrin 2.5. Denne enhedstype er nyttig til todimensionelle målinger i realtid af enkeltcelle (enten klæbende eller flydende) motilitet og af celle-celleinteraktioner 16,27,28,30,31. En typisk cellemigrationsundersøgelse (udført fra flere timer til flere dage) kombinerer levende cellemikroskopi med billedbehandlingsalgoritmer⁴⁵ for at oversætte de erhvervede billedsekvenser til numeriske træk²⁵. Baseret på migrationsmønstrene kan flere biofysiske indikatorer estimeres, såsom cellernes forskydning og hastighed samt varigheden af immuncelle- og målcelleinteraktioner²⁴.

1. Forberedelse af kræft- og PBMC-celler
   1. Kræftcellekultur
      BEMÆRK: MDA-MB-231 triple-negative [østrogenreceptor (ER)-, progesteronreceptor (PR)-, og human epidermal vækstfaktorreceptor 2 (HER2)-] humane brystadenokarcinomceller dyrkes rutinemæssigt i et Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE ml-1 penicillin G natriumsalt og 100 μg ^ml-1 streptomycinsulfat (vækstmedium), under standarddyrkningsbetingelser (37 °C og 5 % CO₂).
      1. For at optimere cellekulturvækst plades MDA-MB-231-celler i 75 cm² kolber med en densitet på 1 × 10⁶ celler ^ml-1 i 12 til 15 ml vækstmedium.
      2. Når cellerne når 75-80% af sammenløbet, kasseres vækstmediet, vaskes celler med forvarmet fosfatbufret saltvand (PBS) for fuldstændigt at fjerne FBS og løsnes derefter med forvarmet trypsin (1 til 2 minutter ved 37 °C).
      3. Tilsæt vækstmedium for at inaktivere trypsin enzymatisk aktivitet og indsamle løsrevne celler. Cellerne vaskes to gange i 5 minutter ved 1.100 x g ved stuetemperatur (RT).
      4. Tæl celler i et celletællingsglas ved hjælp af Trypan Blue-farvestofudelukkelsestest, og såg dem derefter igen enten til vedligeholdelseskultur (højst 6 passager fra optøning) eller til eksperimentelle procedurer.
      5. Til mikrofluidiske eksperimenter sås 1 × 10 6 celler i 6-brøndsplader i 3 ml vækstmedium og behandles enten med 25 μM doxorubicin (DOXO) eller et tilsvarende volumen DOXO opløsningsmiddel (PBS) som kontrol.
      6. Fire til 6 timer efter vaskes DOXO-behandlede celler to gange med forvarmet PBS i 5 minutter ved 1.100 x g ved RT.
      7. Tæl DOXO-behandlede og PBS-behandlede kontrolceller som ovenfor (se trin 1.1.1.5), og indstil co-kulturen med mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) i mikrofluidiske enheder.
   2. PBMC-isolering
      1. Opsaml venøst fuldblod (ca. 10 ml) fra raske frivillige i hepariniserede hætteglas og bland forsigtigt ved at vende røret 2 til 4 gange⁴⁷.
      2. Fortynd blod 1:1 med PBS og lag over 10 ml densitetsgradientmedium lymfoprep i et 50 ml rør.
         BEMÆRK: Sørg for at udføre lagdelingen meget forsigtigt og langsomt for at lade blod og lymfoprep danne to forskellige lag.
      3. Centrifugeringsslangerne opbevares i 30 minutter ved 400 x g ved 4 °C i en udsvingsspand uden bremser. Fire forskellige lag dannes: (i) plasma øverst, (ii) et hvidt og uklart lag indeholdende PBMC'er, (iii) lymfoprep og (iv) en pellet af erytrocytter og granulocytter.
      4. PBMC'er suges forsigtigt med en 2 ml pipette og resuspenderes straks i varmt vækstmedium (samme anvendes i trin 1.1.1) og vaskes to gange i 5 minutter ved 1.100 x g ved RT.
      5. Pelleterede PBMC'er tælles som ovenfor (se trin 1.1.1.5) og anvendes enten til forsøgsprocedurer eller fryses til langtidsopbevaring.
2. Plating cellerne i 2D-chips
   BEMÆRK: PBMC'er er ikke plettet i denne protokol. For at karakterisere specifikke fænotyper on-chip kan immuncelleunderpopulationer isoleres ved immunomagnetisk perlevalg, farvet med fluorescerende cellesporere, blandes igen med den umærkede resterende fraktion og dermed konfronteres med målkræftceller, som rapporteret i on-chip-eksperimenterne, beskrevet i Vacchelli et ^al.27 og i Racioppi et ^al.34.
   1. Før du starter samkultureksperimenter og for at lette tilsætningen af reagenser, aktiveres lagrede chips ved en iltplasmabehandling i nogle få sekunder. Fyld straks reservoirerne med deioniseret vand eller PBS for at holde PDMS (polydimethylsiloxan) overflader hydrofile indtil pletteringstrin.
      BEMÆRK: PDMS er iboende hydrofob, hvilket kan resultere i vanskeligheder med drift og i indfangning af luftbobler i mikrokanaler. Se trin 7 i den supplerende fil med oplysninger om aktivering af iltplasma.
   2. Steriliser under et UV-skab i 20 minutter, vask 2-3 gange med frisk PBS, og inkuber derefter med kulturmedier i 1 time. Opbevar chips i inkubatoren, indtil du udfører pletteringstrin.
   3. Træk overskydende medier ud af alle seks reservoirer. Pas på at undgå at suge medier op fra de vigtigste kulturkamre.
   4. Påfør langsomt 1 × 10⁵ kræftceller resuspenderet i 10-20 μL vækstmedium i det øverste venstre reservoir og derefter i det nederste hul (figur 1A, reservoir 1 og 2). Vent 5 minutter for at lade cellerne klæbe ind i tumorkammeret. Nogle celler vil slå sig ned og fastgøre i reservoirerne.
      BEMÆRK: Indsæt cellulær suspension ved siden af kanalåbningerne. Denne procedure anvendes på MDA-MB-231 kræftceller, andre linjer kræver optimering af celletæthed. For at forbedre kræftcellevedhæftning kan der udføres en belægningsfunktionalisering af overflader (f.eks. Poly-L-lysin, fibronectin). Se tidligere offentliggjorte protokoller for belægningstrin¹⁶, ^48,49,50.
   5. På højre side pipetteres forsigtigt 1 × 10⁶ PBMC'er opslæmmet i 50 μL vækstmedium i hul 3 og 4 (se figur 1A, reservoir 3 og 4).
      BEMÆRK: Efter strømning fordeles PBMC i mellemkammeret og skaber en "front", som repræsenterer eksperimentets udgangspunkt.
   6. Fyld alle seks reservoirer med op til 100-150 μL vækstmedium. Under et mikroskop kontrolleres, at cellerne har fordelt sig korrekt i kulturrummene som vist i figur 1D-E. Endelige volumener kan variere med reservoirernes størrelse. Juster lydstyrken til at være ens i alle brønde.
   7. Placer chipsene tilbage i inkubatoren i ca. 1 time for at stabilisere systemet inden time-lapse-optagelse. Tilsæt frisk medium hver 3. dag, da det kan blive udsat for fordampningstab.
      BEMÆRK: Systemet er kompatibelt med både live/dead-cell analyse og dynamisk multiplex cytokinsekretion profilering fra konditionerede medier. Til kemokinanalyser kan der være adgang til op til 200-250 μL delprøver af supernatanter ved at opsamle medier fra de to beholdere i hvert rum. Klassiske ELISA- og Luminex-cytokinprofileringsassays kræver ca. 50 μL supernatanter. Se ^51,52 eksempler på undersøgelser af andre laboratorier, der udfører cytokinprofilering på OOC-modeller.
3. Time-lapse erhvervelse af umærkede kræft- og immunceller
   BEMÆRK: Typisk er 3 chips arrangeret på et enkelt mikroskopglas (se figur 1A for 2D-chip og figur 4B for 3D-chip). Ved hjælp af sceneholdere, der tildeler 4 dias, kan co-kulturer være egnede til at blive overvåget ved automatiseret mikroskopi med højt indhold til at analysere store partier af eksperimentelle forhold. Chips kan let monteres på dias med tykkelse svarende til 1 mm eller 170 mikron (plast- eller glasdæksler, 6-brønds optiske bund-multibrønde) til konfokal billeddannelse i høj opløsning.
   1. Optag lysfeltbilledserier af umærkede celler ved hjælp af en videomikroskopiopsætning udstyret med et inkubationssystem.
      BEMÆRK: Her blev tidsseriedatasæt (tidsvindue: 48 timer, billedhastighed: 2 min) erhvervet med et fluorescensmikroskop, udstyret med et 4x mål og CMOS 1,3 mio. pixels, optimeret til at passe ind i en standard cellekulturinkubator.
   2. Mikroskopet opvarmes i mindst 2 timer for at ekvilibrere til 37 °C og 5% CO₂, inden erhvervelsen påbegyndes.
   3. Vælg observationsvinduet ved at centrere mikrokanalarrayet mellem tumoren og det centrale rum. Dette gør det muligt at visualisere dynamikken i immuninfiltration og interaktionerne inden for det område, hvor kræftceller er podet.
   4. Juster belysningsintensiteten og fokus for kræft og immunceller.
   5. For at starte time-lapse-erhvervelse skal du optimere billedhastighed og tidsvarighed i henhold til eksperiment og celletype, der undersøges.
      BEMÆRK: Billedforholdene skal optimeres for at undgå overdreven fotoeksponering, samtidig med at der opretholdes et godt signal-støj-forhold (SNR). Da immunceller er meget bevægelige, skal erhvervelsesbilledhastigheden være tilstrækkelig høj til at følge den dynamiske interesseproces og muliggøre nem sporing⁵³. Der bør opnås et kompromis mellem sporingsalgoritmen, kompatibiliteten med størrelsen af det resulterende datasæt og levedygtigheden, densiteten og motiliteten af observerede celler.
   6. I slutningen af timelapsen skal du bruge funktionen Import Image Sequence og Save as fra ImageJ-softwaren til at konvertere rammedatasættet i en ukomprimeret videofil med 25 fps.
      BEMÆRK: Den genererede videofil er nu klar til cellesporingsanalyse. Her blev RGB-billeder (1280x1024 pixels) indsamlet med en rumlig opløsning på 1,33 μm/pixel. En film af 24 timers varighed (3,5 GB stak) af et enkelt synsfelt (FOV) består af 720 billeder for hver tilstand.
4. Dataanalyse: Halvautomatisk ekstraktion af umærkede immunspor af Trackmate
   BEMÆRK: Her udføres immunmotilitetsanalyse i 2D umærkede time-lapse-billeder ved hjælp af TrackMate⁵⁴, en open source-værktøjskasse, der er tilgængelig i Fiji/ImageJ-softwarepakken (https://imagej.nih.gov/ij/). Flere algoritmer leveres til at udføre automatiseret enkeltpartikelsporing⁵⁵(SPT) af pletlignende strukturer. De er blevet anvendt effektivt på fluorescerende billeder, hvor objekter er lyse over en mørk baggrund med høj SNR (dvs. fluorescerende pletter med underopløsning, mærkede trafikvesikler, kerner)^{1,25,56,57,58}. SPT er hovedsageligt baseret på to sekventielle trin. For det første lokaliseres objekter med identificerede positioner i flere rammer (segmentering), som skematiseret iFigur 2. I anden fase (partikelbinding) er detekterede pletter forbundet over på hinanden følgende billeder for at estimere bevægelse og rekonstruere deres baner i form af et spor (Figur 3). Numeriske funktioner kan beregnes ud fra hvert ekstraheret X-, Y- og Z-koordinatarray over tid. Udvidet dokumentation rapporteres i⁵⁴samt online (http://imagej.net/TrackMate) efter selvstudiet Kom godt i gang med TrackMate. Nøjagtigheden af processen kan inspiceres med det samme og håndtere en intuitiv grafisk brugergrænseflade (guidelignende GUI), der gør det muligt for brugerne på hvert trin at justere indstillingerne. Følgende del viser kort, hvordan du bruger Trackmate til billedbehandlings- og kvantificeringstrin, anvendt på billeder i synligt lys:
   1. Træk og slip fuldtids video / billedstakken på Fiji-værktøjslinjen.
   2. Opsætning af kalibreringsstak (figur 2A).
      1. Kontroller dimensionaliteten, og tildel billedegenskaberne ved at vælge Egenskaber for > Billede. Felterne Udfyld længdeenhed, pixeldimensioner og rammeinterval.
         BEMÆRK: For at udføre kalibreringen skal du bruge den kendte længde af mikrokanalerne (500 μm, figur 1C) og dividere med den tilsvarende målte længde i pixels. For 2D-tidsserier skal du sørge for at bytte Z/T-feltet og indtaste 1 som z-udsnit og det korrekte antal filmbilleder. Hvis det ikke opnås, rapporteres Trackmate kvantitative output og parametre i pixelenheder og tidsrammer.
   3. Forbehandling af billeder.
      1. For at forbedre den korrekte diskrimination af immunceller fra en støjende baggrund skal du forbehandle lysfeltbilleder for at kompensere artefakter. Sørg for, at datasæt består af 8-bit TIFF-billeder (lysstyrkeområde: 0-255).
         BEMÆRK: Ujævn belysning, lav SNR og forurening med små snavspartikler i billeder i synligt lys kan kompromittere succesen med en cellesporingsproces. Her forbehandles tidsseriedatasæt gennem baggrundssubtraktion, lysstyrke-/kontrastjusteringsfunktion og ved lokal billedsubtraktion af en gaussisk sløring fra originale billeder. Der findes andre forskellige analyseværktøjer i ImageJ til behandling og segmentering af fasekontrast- eller lysfeltbilleder, herunder EGT-59 (Empirical Gradient Threshold)⁵⁹.
   4. Første kalibreringspanel (figur 2A)
      1. Når billedstakken er valgt, skal du starte Trackmate (Plugins>Tracking).  Revidere/bekræft dimensionaliteten og det tidsmæssige vindue for data (dvs. pixelbredde og rammeinterval).
         BEMÆRK: TrackMate læser automatisk i billedegenskabsboksen for at give de endelige sporingsresultater i kalibrerede fysiske enheder (dvs. μm og minutter).
      2. Definer et område af interesse for at beregne udtrækningen af immunspor ved manuelt at indsætte værdier eller ved at tegne et lukket område over det aktive billede og derefter trykke på knappen Opdater kilde. For at udtrække globale immunmigrationsveje skal du vælge rektangulære regioner henholdsvis på højre side af mikrokanaler (centralt kammer, figur 1E) og til venstre (tumorkammer, figur 1D). Hvis du vil analysere interaktioner mellem kræft og immunhotspots, skal du tegne cirkulære underområder ved hjælp af værktøjer til investeringsafkast (gå til Rediger → valg → Specificer).
         BEMÆRK: Når du kører denne værktøjskasse for første gang på en ny biologisk applikation, skal du bruge den nødvendige tid på at optimere indstillingerne til rekonstruktion af sporene.
         BEMÆRK: Udfør manuel sporing af cellebanerne (ca. 50-100 celler) for empirisk at finde den rigtige konfiguration og derefter validere pålideligheden af automatisk ekstraktion af bevægelser som benchmark. Derudover skal du først arbejde på et mindre område for nemt at kontrollere nøjagtigheden af de valgte parametre.
   5. Trin til påvisning af immunpletter (figur 2B)
      1. Vælg standard Laplacian of Gaussian (LoG) detektor. LoG-detektoren arbejder for at finde lyse, bloblignende, runde objekter og anvende et Laplacian of Gaussian-filter på billedet, der er indstillet til mellemliggende spotstørrelser (5 til 20 pixels i diameter).
      2. I Anslået blobdiameter (her 10-13 μm) skal du angive en værdi, der er lidt større end den forventede staffagestørrelse. Forøg tærskelværdien (her 1-3 μm), indtil ekstra falske baggrundspunkter reduceres, muligvis uden at fjerne objektfunktionerne. Registreringer under tærskelværdien (baseret på kvalitetsmålinger) kasseres fra efterfølgende analyse. Markér afkrydsningsfeltet for medianfilteret og subpixellokaliseringen for at forbedre kvaliteten af spotregistreringen.
      3. Brug knappen Eksempel til at se og hurtigt inspicere identificerede immunceller, der er overlejret på billederne af magentafarvede cirkler.
         BEMÆRK: Fejl under registreringen vil have en betydelig indflydelse på sammenkædningsprocessen. Andre uønskede registreringer kan korrigeres i de efterfølgende menuer ved hjælp af brugerdefinerede filtre (dvs. efter spotintensitet, størrelse eller position).
   6. Når du er tilfreds med valg, skal du trykke på Næste.
      BEMÆRK: Disse indstillinger kan variere afhængigt af eksperimentelle opsætnings- og erhvervelsesbilleddannelsesmetoder (f.eks. FOV, objektiv forstørrelse, lysfelt- eller fluorescerende billeder), celletype (klæbende eller flydende celler), fra langsom eller hurtig bevægelighed, slags cellulær adfærd (interagerer eller ej) og lav / medium / høj densitet i observationsområdet.
   7. Fortsæt og spring over menuen Indledende tærskel. Vælg vinduet Hyperstack Displayer.
   8. Indstil filtre på panelet Staffagepletter (figur 2C).
      1. Vælg: Ensartet farve. Filtre, som vist i figur 2C, kan tilføjes for at bevare mærkede pletter med funktionsværdier, der vises i et histogram, over eller under en reversibel tærskel.
   9. Trin til valg af tracker (figur 3A). Vælg Simple LAP-trackeren, som partikelbindingsalgoritme, der beder om tre felter, der skal udfyldes (i dette tilfælde "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Denne detektor styrer gap-lukningshændelser, hvor omkostningskoblingsberegning udelukkende er baseret på deres respektive afstand.
      BEMÆRK: Den maksimalt tilladte linkafstand begrænser det rumlige søgeområde for kandidatmatchende pletter, svarende til den maksimalt tilladte forskydning, der tilbagelægges mellem to efterfølgende billeder (figur 3D).
      1. Giv større værdier af maksimal forskydning, når fragmenteringen af spor af stærkt bevægelige partikler bemærkes.
         BEMÆRK: To led forbindes ikke, hvis ramme-til-ramme-bevægelsen er større end den givne maksimale afstandsværdi. Hvis segmenter bygger dårligt bro mellem to forskellige celler, skal du reducere værdien af maksimal forskydning.
      2. Prøv at tilslutte manglende pletter igen ved at variere værdierne for "den maksimale afstand for lukning af mellemrum" og "det maksimale rammegab".
         BEMÆRK: Disse parametre omhandler gap-lukningshændelser i ikke-tilstødende rammer. Pletforsvinden kan forekomme for nogle billeder (dvs. partikler ude af fokus, celler, der udelades og i FOV, segmenteringsfejl i et støjende billede).
         BEMÆRK: For at håndtere opdeling eller fletning af begivenheder skal du vælge LAP-linker som detektor, der introducerer sammenkædningsomkostningsmatrixstraffe.
   10. Klik på Næste for at køre sporingsberegningen. Tryk på Næste.
   11. Panelet Filtrering af spor (figur 3B). Skift farven på immunstier, der vælger "Track ID" eller andre sporfunktioner i rullemenuen. På dette tidspunkt skal du vælge valgfrit at indstille interaktive filtre funktionelle, for at forbedre kvaliteten af resultatet og gennemgå proceduren igen.
       BEMÆRK: Falske pletter opstår som følge af støj i billedet og tab af funktionskvalitet. Dette genererer korte segmenter, mens celler af interesse kan spores over mange rammer.
       1. Hvis du vil fjerne korte kurver, skal du prøve at filtrere ud baseret på antallet af pletter, de indeholder. Derudover kan du sortere spor ved hjælp af en kombination af indstillinger såsom sporforskydning, sporvarighed eller minimal/middelværdi/maksimalhastighed for at udelukke falske eller uønskede spor (med færre billeder med hensyn til den samlede varighed af tidsforløb eller involverer snavsede eller ikke bevægelige partikler) fra yderligere efterbehandling.
          BEMÆRK: Valget af filtre kan variere afhængigt af den specifikke anvendelse og det biologiske system.
   12. Undersøg alle spor i grænsefladen Visningsindstillinger, rul gennem tiden, og kontroller, hvor nøjagtige spor matcher celleoverførselsstier. Rullemenuen indeholder farvekoder for pletter og stier for nem visualisering og filtrering efter flere modaliteter (f.eks. kinetiske parametre, intensitet, tidsmæssig eller rumlig position).
       BEMÆRK: For at spore kulturer med høj densitet eller celler med høj bevægelse skal du øge anskaffelsesbilledhastigheden, hvilket minimerer celleforskydning, der er rejst i på hinanden følgende tidsintervaller.
   13. Manuel korrektion af segmenterings- og sammenkædningsfejl (figur 3E).
       1. For yderligere at forbedre kvaliteten af resultaterne skal du redigere manuelt pletter (snavspartikler, stationære celler) og fjerne fejlagtige spor, der stammer fra detekterede tumorgrænser, når du analyserer ROI'er for tumor-immuninteraktion.
       2. Vælg først TrackMate-værktøjet på værktøjslinjen ImageJ. For at fjerne et eksisterende sted i hele stakken skal du trykke på skift og oprette med musemarkøren en ROI-maske over målstedet (redigeret i en grøn cirkel) og derefter trykke på DEL-tasten.
       3. For at tilføje et nyt sted (i tilfælde af manglende spor på grund af pletter forsvinder) skal du trykke på A-tasten og lægge musen på det spidse sted. Gentag beregningsprocessen for sporsammenkædning efter dette trin.
   14. Når du er tilfreds, skal du vælge Analyse i panelet Visningsindstillinger for at generere tre tekstfiler (figur 3C og 3F). Tabellen i "Spots in tracks statistics" giver de spatiotemporale koordinater for immunpletter (X-Y-Z-positioner af cellerne mærket med den tilknyttede ramme og spornummer). "Links i sporstatistik" og "Sporstatistik" indeholder oplysninger om sporene: sporvarigheder, antal registrerede huller eller pletter, sporstart- og stopramme osv. Gem og eksportér for hvert datasæt.
       BEMÆRK: Når du klikker på en række i resultatvinduerne, aktiveres det respektive punkt, link eller spor i time-lapse-videoen til visuel inspektion. Gentag filtreringstrinnene for at vælge/fjerne spor. Alle fremtidige eksporterede data opdateres. TIP: Spor initial- og stopramme- og sporvarighedsværdier kan udnyttes til at beregne tider for kontakt mellem kræft og immunceller ved behandling af ROI'er for interaktion.
   15. Tryk på knappen Gem for at generere en resulterende XML-fil, der indeholder alle parameterværdierne, stien til billeder og staffagepositioner i tide. Kommandoen '' Indlæs TrackMate-fil '' (Plugins> Tracking) gendanner hele processessionen for hver filmfil individuelt.
   16. Gå til det sidste panel i GUI'en kaldet Vælg en handling. På listen skal du bruge Captureoverlay > Execute-funktionen til at producere en video med overlejrede spor. TIP: "Plot N-spots vs time" mulighed kan bruges til at beregne den rumlige tæthed af immunceller i en ROI (figur 6B, højre panel).
   17. Efterbehandlingsanalyse og migrationsstatistik
       1. Analysér de rå positionsdata direkte i Trackmate, eller eksporter data for at beregne omfattende kinetiske parametre²⁹ (dvs. total banelængde, euklidisk afstand, indeslutningsforhold, middelkvadreret forskydning⁵⁶, gennemsnitlig eller øjeblikkelig sporhastighed, arrestkoefficient, fordeling af migrationsvinkler, fremadgående migrationsindeks, gennemsnitlig lineær hastighed) for at klassificere immuncellemigrationsadfærd (f.eks. rettet eller diffusiv bevægelse^{30, 31}) og respons på målkræftceller (f.eks. behandlet vs. kontrol).
          BEMÆRK: Yderligere nyttige plugins såsom Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) giver forskellige grafer (f.eks. Rose eller sektorplot, som vist i figur 6) og statistiske tests til avanceret analyse og visualisering af eksperimentelle migrations- og kemotaksedata. Ved at kombinere cellesporing og cellesegmenteringsalgoritmer^{kan 24,25,45} muliggøre målinger af morfologiske målinger på enkeltcelleniveau (dvs. celleoverfladeareal^, hoved- og molakselængde og cellestørrelsesforhold).

2. 3D immunkompetent cancer on-chip model i et konkurrencedygtigt assay

BEMÆRK: 3D-chipdesignet, afbildet ifigur 4, består af 5 hovedrum: et centralt til det flydende immuncelleindtag, to sideregioner til indlejring af tumorceller i  hydrogelmatricer (150-250 μm høje) og medieperfusionskamre. Immun- og tumorkamre er forbundet med to sæt smalle arrays af mikrokanaler (200×12×10 μm³, L×W×H, figur 4E). Regelmæssigt arbejder 100 μm-adskilte trapezformede ligebenede mikrosøjler (ca. 25-30 grænseflader for hver sidegelregion, figur 4C) som barrierer for at begrænse gelopløsning under injektion og udnytte balancen mellem overfladespænding og kapillærkræfter^60,61 og forbinde tumorregioner til de to laterale yderligere mediekamre for at indstille en gel-væske-grænseflade (figur 5). De detaljerede funktioner i 3D-konkurrenceanalysen er vist i figur 4. Præferencemigration af immunceller mod de to hydrogelrum, der er vært for tumorceller, der har gennemgået forskellige behandlinger, kan overvåges og kvantificeres. Det særlige konkurrencedygtige layout kan anvendes til at undersøge en overflod af forskellige kræftbiologiske fænotyper (f.eks. lægemiddelresistente vs aggressive, primære eller metastatiske, respondenter vs ikke-respondere). Derudover kan gelindlejrede regioner let integreres med forskellige cellepopulationer for at genskabe mere heterogene TME'er, herunder stromale komponenter (fibroblaster, endotelceller)²³ eller for at simulere specifikke immunsuppressive miljøer³⁴ (f.eks. makrofager) til dissekering af mekanismer for lægemiddelresistens og tumorunddragelse.
BEMÆRK: Nuklear og aktiv caspasefarvning ved hjælp af kommercielle sæt til levende / døde assays (f.eks. Thermo Fisher Scientific, Incucyte reagenser) kan implementeres til vurdering af mitotiske eller apoptotiske dødshændelser, som rapporteret i Nguyen et ^al.33.

1. Fremstilling af matrixopløsning med celler og indlæsning i enheden
   BEMÆRK: I følgende eksperimentelle indstilling indeholder de to gelregioner blandinger af humane A375M melanomcellelinjer, dyrket i matrixopløsning (f.eks. Matrigel), udsat for terapeutiske midler, der anvendes som monoterapi eller i kombination. Denne indstilling gjorde det muligt for os at evaluere effektiviteten af en kombination af to lægemidler i forhold til enkelte lægemidler på en konkurrencedygtig måde og kvantificere deres evne til at tiltrække PBMC'er.
   1. Optø et lager af matrixopløsning (f.eks. Matrigel) ved at lægge det på is i et køleskab på 4 °C dagen før forsøget.
      BEMÆRK: Udsæt ikke produktet for flere fryse-optøningscyklusser, da det bliver "klumpet". Andre syntetiske eller naturlige hydrogelprotokoller kan være egnede til brug i denne indstilling. Der henvises til ^33,34,35 til fremstilling af kræftceller i kollagenmatricer.
   2. A375 humane melanomceller, farvet med levende kompatible PKH67 Green Fluorescent Cell Linker i matrixopløsning (2 mg ^ml-1), resuspenderes. Hvis det er indiceret, tilsættes 5-aza-2'-deoxycytidin (DAC; 2,5 μM), benævnt DAC, og/eller IFN-α2b, benævnt IFN, i de korrekte doser³².
      BEMÆRK: Match Lot # på matrixflaskespecifikationsarket. Baseret på koncentrationen beregnes det volumen medium, der er nødvendigt for at fremstille op til 2 mg ^ml-1 Juster den optimale proteinkoncentration og kræftcellesuspensionskoncentration i overensstemmelse med din ansøgning af interesse.
   3. Pipette forsigtigt op og ned for at undgå dannelse af bobler. Hold mikrocentrifugerøret på is under blanding for at forhindre uønsket polymerisation.
   4. Efter sterilisering skal du placere enhederne på is (ved hjælp af en isspand og låg) for at undgå matrixopløsningsstørkning under hele proceduren for cellebelastning.
   5. Injicer langsomt de to IFN og DAC/IFN Matrigel/tumorcelleblandinger (2-4 μL) i henholdsvis venstre og højre gelport med 10 μL mikropipette ved hjælp af kolde spidser (figur 5A). Påfør let tryk for at skubbe matrixopløsningen fra den ene side, indtil den når den modsatte.
      BEMÆRK: Volumenet af matrixopløsning blev valgt for at undgå overløb i tilstødende kanaler. Udøv ikke for stort pipetteringstryk for at forhindre, at opløsningen lækker ind i mediet og de centrale kanaler. Hvis gelbanen under ilægning blokeres langs kanalen, skal du prøve at indsætte opløsningen fra det andet indløb, indtil gelfronterne mødes. Når du fjerner mikropipetten fra indløbene, skal du holde stemplet, ellers vil undertrykket aspirere matrixopløsningen.
   6. Anordningen anbringes i opretstående stilling i opretstående stilling ved 37 °C og 5 % CO₂ i 30 minutter for at muliggøre gelering af matrixopløsningen (figur 5B). Håndter med plejechips med indlejret upolymeriseret gel for at forhindre lækage ud af gelkanalen.
   7. I mellemtiden resuspenderes PKH67-mærkede PBMC'er (1x10⁶ celler) i 10 μL komplet DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle's medium).
   8. Efter matrixgelering fyldes mediekanalerne med (50-100 μL) den samme prøve dyrkningsmedium i alle seks reservoirer for at forhindre geltørring i chipsene. Opbevares i inkubator indtil såning af immuncellesuspension.
      BEMÆRK: Kontroller under et mikroskop den korrekte og homogene fordeling af tumorceller i gelen og integriteten af de polymeriserede gelbarrierer. Delvist eller ikke ensartede gelerede områder eller bobler i blandingen fører til for tidlig strømning af PBMC'er i gelmediekanaler ved eksperimentets begyndelsespunkt på grund af trykindledende udsving.
   9. Opsug medier fra de seks huller, og placer spidsen nær indgangen til en mediekanal for at injicere forsigtigt med PBMC-cellesuspension med moderat tryk. Den tidsmæssige belastningssekvens er vist i figur 5C:
      1. PBMC'er i 10 μL medium ind i den øvre centrale brønd.
      2. 50-100 μL medium i hver af fire brønde af laterale kanaler.
      3. 40-90 μL medium ind i den øvre centrale brønd.
      4. 50-100 μL medium ind i den nedre centrale brønd.
   10. Sørg under et mikroskop for, at PBMC-fordelingen forbliver begrænset i det centrale kammer efter påfyldningstrinnet. (Figur 7A).
       BEMÆRK: Hvis det ikke er optimalt, skal du justere koncentrationen om nødvendigt og gentage såningstrinnene ved hjælp af uberørte chips. Ved beregning af volumener for de planlagte eksperimentelle betingelser henvises til et overskydende antal chips (15-20%) for at tage højde for potentielle fejl og justeringer. Volumener og koncentrationer bør optimeres i henhold til den specifikke anvendelse.
   11. Anbring samlede enheder på en plan overflade i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO₂ til efterfølgende fluorescensbilleddannelse. Håndter med plejechips efter ilægning af immunceller, der flyder.
       BEMÆRK: Kompenser fordampningstab af volumener i reservoirer ved at udskifte medier hver 2-3 dage. For kemokinprofilering kan op til 100 μL fra hver af to huller i kulturrum aspireres, se trin 2.7 i trin 1.
2. Automatisk optælling af rekrutterede PBMC'er i enkeltkanals fluorescerende billeder i ImageJ
   BEMÆRK: Klassiske metoder til immunfluorescens til konfokal billeddannelse med høj opløsning kan anvendes til on-chip-operationer som slutpunktsmålinger. Den grundlæggende farvningsprocedure involverer celle on-chip-fiksering, permeabilisering, blokering, antistofbinding, farvning af kerner med vasketrin imellem. Umærkede immunceller infiltreret i 3D-geler regioner med indlejrede kræftmikromiljøer kan fastgøres på ønskede tidspunkter og farves til ekspressionsmarkører for aktivering / udmattelse / modning (f.eks. For CD8-celler, overvågning af CD69, CD95, PD1, TIM3 markører). I Parlato et al.³⁵blev fagocytose af SW620 apoptotiske celler evalueret ved konfokal mikroskopi ved hjælp af enheder monteret på 170 μm tykke dæksedler. IFN-DC'er blev farvet og tilføjede on-chip anti-human HLA-DR-FITC Ab aliquots.
   For at beregne omfanget af infiltrerede fluorescerende farvede levende immunceller, der udfordres med konkurrencedygtige signaler, indstilles en fælles billedanalysearbejdsgang som følger (Figur 7D-G):
   1. Erhverv, på bestemte tidspunkter endepunkter, fasekontrast og røde/grønne kanaler fluorescens mikrofotografier af venstre og højre gelregion indeholdende tumorceller henholdsvis udsat for enkelte eller kombinationer af farmakologiske regimer.
      BEMÆRK: Her blev billeder taget med et EVOS-FL-fluorescensmikroskop efter cellebelastning (0 timer), efter 48 timer og efter 72 timers inkubation (figur 7A-B). En 4x-10x forstørrelse blev brugt til at erhverve det centrale kammer, mikrokanalarrayerne og de to sidesidekanaler, der indeholdt A375 plus IFN og A375 plus DAC / IFN.
      1. Når du udfører anskaffelsesoperationer, skal du overveje parametrene til måling og undgå mætning af funktioner, der skal tælles. Optimale segmenteringsresultater afhænger af arten af de erhvervede billeder på grund af variabilitet i selve de biologiske prøver, farvningskvalitet og de mikroskopiteknikker, der anvendes til brugerorienterede applikationer.
   2. Indlæs fluorescensenkeltkanaldata (i dette tilfælde rød = PBMC'er) i Fiji ved at trække dem ind i hovedvinduet (figur 7D). Dupliker billedet for at undgå at overskrive rådataene under valget af forbehandlingsfiltre indtil den endelige segmentering.
      1. Hvis billedet er et farvebillede (RGB), skal du trykke på Billede > Type 8 eller 16-bit for at konvertere til gråtoner. Kontrollér, at Rediger > indstillinger > konverteringers er indstillet til skalering ved konvertering.
   3. Forbehandling af rådata via oprydning af støj og artefakter.
      1. Gå til menuen Behandl > Træk baggrund ved at anvende rullekuglealgoritmen til at korrigere ujævn støjbaggrund med store rumlige variationer af intensiteter. Indstil radius til mindst størrelsen af den største forgrundspartikel. Vælg feltet Eksempel for prøve- og fejlprocedure for at give optimale resultater. For små værdier kan forkert fjerne strukturer af interesse.
      2. I kommandoen Lysstyrke og kontrast skal du trække skydekontrollerne Minimum/maksimum for at ændre intensitetsområdet i histogrammet. Skift skyderen Maksimum til venstre for at øge lysstyrken uden udvaskningsfunktioner. Flyt sliden Minimum til højre for at øge kontrasten i billedet, så mindre synlige træk i baggrunden ikke forsvinder. Klik på Anvend for at rette ændringer.
   4. Billedforbedring.
      1. Gå til Behandl > filtre, og eksperimenter med Median, Gaussian-filtre på billeder (figur 7E).
         BEMÆRK: Forfiltreringsradius skal tilpasses billedstøjpixels. Det ikke-lineære medianfilter erstatter pixelværdien med medianværdien for naboer for at reducere salt- og peberstøj. "Gaussisk sløring" bruges til at udjævne et digitalt billede ved at erstatte pixels med et vægtet gennemsnit af omgivende pixels. Vægtene kommer fra den gaussiske sandsynlighedsfordeling, så de nærmeste pixels er mere indflydelsesrige.
      2. Gå eventuelt til Behandl > Math > Gamma med afkrydsningsfeltet Eksempel for at øge kontrasten.
         BEMÆRK: Intensiteter, der er indstillet i B&C-panelet, skaleres mellem de to min- og max-grænser. Værdier < 1,0 fremhæver forskelle mellem lave intensiteter, mens værdier > 1,0 fremhæver forskelle mellem høje intensiteter. Gammakorrektion er funktionel til at finde et displayområde, der viser de svageste objekter uden at mætte de lyseste.
   5. Oprettelse af en binær billedmaske.
      1. Gå til Billede > justere > tærskel. Den mest enkle metode til bestemmelse af tærskler er afhængig af histogramanalyse af intensitetsniveauer, som vist i figur 7F. I drop-menuen skal du lege med forskellige globale tærskelmetoder (i vores tilfælde anvendes Otsu).
      2. Rul manuelt, eller skriv et kendt interval af pixelintensiteter i histogrampanelerne, observer ændringen af det røde mønster, der ligger over billedet, som mest ligner det faktiske celleområde. Knappen Nulstil fjerner overlejringen. Når du er tilfreds, skal du klikke på Anvend for at generere en binær version af billedet. Kontroller Process > Binary > Options for at styre, hvordan tærskelbilleder vises, og hvordan objekter identificeres af partikelanalysatoren.
   6. Brug menukommandoen Behandl/binær/vandskelspartikler til at opdele delvist overlappende eller flettede under tærsklen. Vandskel kan ofte nøjagtigt skære dem fra hinanden ved at tilføje en 1-pixel tyk linje. Udfør morfologiske operationer såsom spile- eller eroderingsoperationer for enten at vokse eller fjerne pixels fra under eller overmættede pixels.
      BEMÆRK: For mere information se afsnittet Menukommandoer eller se MorphoLibJ, et integreret bibliotek baseret på matematisk morfologi til behandling af binære data.
   7. Beskrivelse af kvantitativ billedfunktion.
      1. Når du har opnået tilfredsstillende objektgenkendelse, skal du åbne partikelanalysatoren fra Analyser > Analyser partikler. Partikler kan udelukkes ved deres størrelse og cirkularitet, udtrykt i pixels eller i en kalibreret måleenhed (kontroller den korrekte skala i forhold til mikroskopindstillinger under Image > Properties). For at inkludere alt skal du holde standardområdet 0-Uendelig og cirkularitet på 0,00 - 1,00 (0 = lige linje, 1 = perfekt cirkel).
      2. For at filtrere små "støj" pixels eller funktioner uden interesse skal du indstille minimums- og maksimumsområdet. Marker indstillingerne Inkluder huller, Vis, Omrids og Vis resultater i vinduesfeltet. Udeluk på kanter kasserer partikler, der er registreret på billedets kanter. Tilføj til Manager tilføjer det opnåede valg til ROI-lederen til yderligere analyse og holder partiklens positionsoplysninger.
         BEMÆRK: I "ROI Manager" er det muligt at korrigere automatisk segmenteringsregistreret output (flette splitceller, opdele flettede celler). Vælg, ved hjælp af markeringsværktøjer i Fiji Toolbar, ROI'er inden for begge gelområder, hvor kræftceller er indlejret for at estimere immuninfiltration.
   8. Eksporter de opnåede værdier til et regneark for at udføre statistisk analyse som vist i figur 7G. "Resultater" viser en datatabel i forhold til identificerede nummererede skitserede partikelegenskaber. "Opsummer" åbner et vindue med navnet på billedet, det samlede antal og andre oplysninger for hele billedet.
      1. Gå til Analysér > Indstil målinger for at inkludere en lang række parametre.
   9. Optag eventuelt en makro (ved at vælge Plug-ins > Makroer > Record) for at automatisere behandlingsarbejdsprocessen og spare tid på analyse af store datasæt.
      1. Brug den samme behandlingsrutine til at analysere grøn fluorescenskanal i de samme regioner til analyse af morfologiske ændringer af tumorceller i 3D-regioner¹⁶

Representative Results

Tumorimmuninfiltration er en parameter for værtsantitumorresponsen. Tumorer er heterogene i sammensætningen, densiteten, placeringen og den funktionelle tilstand af infiltrerende leukocytter, som interaktioner med kræftceller kan ligge til grund for klinisk relevant information til forudsigelse af sygdomsforløb og respons på terapi. I denne forstand kan mikrofluidiske teknologier anvendes som komplementære og privilegerede in vitro-værktøjer til at udforske tumorers immunkontekst samt til at overvåge responsen på kræftbehandlinger. Koblingen af det mikrofluidiske assay, levende cellebilleddannelse og sporingssoftware kan etablere pålidelige kvantificeringsmetoder til at kvantificere, hvordan immunceller justerer deres migrationsmønster i forskellige sammenhænge. I dette kapitel har vi rapporteret trin til opsætning af alsidige 2D- eller 3D-cokulturer af immun- og målkræftceller i ad hoc-mikrofluidiske enheder realiseret ved standard blød-litografiske procedurer. I afsnit 1 blev mikrofluidiske enheder anvendt til at muliggøre kemiske og fysiske kontakter mellem adhærente (MDA-MB-231 kræftceller) og ikke-adhærente (PBMC'er) populationer. Nogle kemoterapeutiske midler (fx antracykliner blandt de andre) kan inducere "immunogen" apoptose af maligne celler og dermed øge deres synlighed hos immunkompetente værter. Cancer immunogen celledød (ICD) er karakteriseret ved frigivelse af membranbundne og opløselige signaler leveret af døende celler, der fungerer som alarminer for immunceller. For at give en kvantitativ validering af ICD-respons anvender vi data indsamlet i den mikrofluidiske platform, hvor leukocytter kan bevæge sig gennem passende byggede mikrokanalbroer mod deres målceller. Time-lapse-optagelser blev udført efter co-loading PBMC'er fra raske donorer (WT, vildtype) med humane MDA-MB-231 brystkræftceller forbehandlet eller ej med antracyklinen DOXO. Mikrofotografier blev genereret hvert 2. minut i to på hinanden følgende tidsintervaller på 24 og 48 timer. (Eksemplarisk Film S1 med 0-24 timers interval). Sporingsanalyse af individuelle PBMC'er udfordret med døende (DOXO-behandlede) eller levende (PBS-behandlede) kræftceller blev udført ved hjælp af Trackmate plug-in, som det ses i Figur 6A (venstre panel). Relevante kemotakseværdier og overførselsplots blev automatisk genereret ved hjælp af Chemotaxis and Migration Tool, som beskrevet i⁶². Cellebanerne blev alle ekstrapoleret til (x, y) = 0 på tidspunktet 24 timer. Resultaterne indikerede en anden migrationsprofil af immuncellerne, når de blev fyldt sammen med brystkræftceller udsat for DOXO eller PBS. Når PBMC'er blev konfronteret med apoptotiske kræftceller, krydsede de mikrokanaler mod døende / døde celler (men ikke for at leve ubehandlede celler). Migration X/Y edderkoppe- og rosenplot, præsenteret i venstre panel Figur 6B-C, blev kortlagt og sammenlignet for at fremhæve virkningen af immunogene induktorer på forskelle i immundynamik. Rosenplotter viser, at PBMC'er hovedsageligt migrerede i næsten alle retninger i kontroleksperimentet, kun en ubetydelig brøkdel styres op ad gradienten genereret af prolifererende kræftceller. Omvendt fremhæver de enkelte cellers stier en stærk biasbevægelse langs retningen af apoptotiske brystkræftceller (negativ x-retning). For at evaluere rettet immuncellemigration mod DOXO-behandlede eller PBS-behandlede kræftceller beregnes flere kemotakseparametre, herunder: a) massecentret (rumligt gennemsnitspunkt for alle endepunkter); b) retningsbestemthed c) det fremadrettede migrationsindeks (dvs. den gennemsnitlige celleforskydning i en interesseretning, hvilket betyder mod måltumorstedet, i vores tilfælde). Sidstnævnte værdier repræsenterer en måling af effektiviteten af en celle til at migrere i den givne kemotaktiske stimuli. Efter at have nået det venstre kammer udviste en brøkdel af leukocytter med en stigende densitet over 24-48 timer langvarige (>60 min) kontakter med DOXO-behandlede MDA-MB-231. PBMC'er undlader massivt at migrere og engagere sig i sådanne langsigtede og vedvarende interaktioner med levende kræftceller (som vist ved repræsentative mikrofotografier af nærliggende PBMC'er i Figur 6A, højre). For at kvantificere forskelle i tumorimmun samspil blev tumorregionen afgrænset med en fast cirkel med diameter på 20-80 mikron, kaldet "hotspot". Kvantificeringen og analysen fra repræsentative synsvidder er vist i Figur 6 (Højre panel, B-C).

I afsnit 2 blev en ny 3D immunkompetent tumormodel beskrevet for at kvantificere rekrutteringen af immunceller som reaktion på kræftkombinationer af epigenetiske lægemidler³² (DAC / IFN vs IFN alene), hvilket muliggør sammenligning af to forskellige behandlingsbetingelser for A375 melanomceller samtidigt. Således blev A375M melanomceller, mærket med PKH67 grønt fluorescerende farvestof, indlejret i Matrigel matricer i nærværelse af DAC og / eller IFN i hvert gelkammer, mens PKH26 rødmærkede PBMC'er blev fordelt homogent i det centrale fluidiske kammer ved udgangspunktet (figur 7A). Vi sammenlignede samtidig de to tumormasser i 3D-matricer for deres evne til at tiltrække PBMC'er. Ved 48 og 72 timer ledes PBMC'er massivt ind i mikrokanalerne i højre side, som observeret i figur 7B.

En præference homing af PBMC'er mod gelmatrixen indeholdende DAC / IFN-behandlet, snarere end IFN-behandlet, melanomsted blev tydeligt observeret, mens dårlig migrationshastighed var synlig mod A375-celler udsat for enkelt behandling (venstre chipside). Den konkurrencedygtige indstilling er anvendelig til at undersøge en overflod af forskellige kræftbiologiske fænotyper (f.eks. Lægemiddelresistente vs aggressive, primære eller metastatiske (f.eks. A375P vs A375M melanomceller) og respondenter vs ikke-respondenter). Gelkamre kan bestå af komplekse co-kulturer af maligne celler og flere ikke-cancerøse tumorassocierede celler, såsom endotelceller, immunceller og fibroblaster³³ for at karakterisere lægemiddelresponser på TME-niveau. Hændelser af mitose og apoptotisk død af kræftceller kan overvåges ved farvning med levende farvestoffer³³. Immunfarvningsprocedurer på 3D-mikrofluidiske enheder kan tilpasses til at evaluere tilstande af aktivering af infiltrerede immunceller i tumorsteder ved konfokal mikroskopi³⁵. I denne forstand kan disse 3D-mikrofluidiske systemer efterligne komplekse tumorstrukturer og multicellulære interaktioner og er derfor værdifulde platforme til mere pålidelig præklinisk lægemiddeltestning.

Figur 1. Planimetry af den mikrofluidiske enhed til samling af 2D tumorimmun co-kulturer. (A) Ægte mikrofotografi af 3 chips samlet i et enkelt mikroskopglas. Reservoirerne er nummereret afhængigt af belastningssekvensen og er farvekodede som de tilsvarende kulturkamre, der er anført i forklaringen. Skalastang, 6 mm. (B) 3D CAD chip bestående af tre hovedcellekulturområder forbundet med mikroriller. C) Detaljer om den smalle mikrorillebro, der viser dimensionerne skræddersyet til kræftceller og PBMCs størrelse. D-E) Mikrofotografi i synligt lys blev erhvervet før begyndelsen af time-lapse, der viser fordelingen af kræftceller og PBMC'er i henholdsvis venstre og mellemkammeret. Skalastang, 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Trackmate-analysepipeline til lokalisering af immunpletter i tidsseriebilleder. A) Øverste panel: Skærmbillede af menuen Trackmate-billedkalibrering. Nederste panel: Fiji "Billedegenskabsmenu" for at indstille tid og rumlige enheder. B) Øverste panel: Skærmbillede af Trackmate "Spots detection" menu. Nederste panel: Outputbillede med anvendte forskellige værdier af "Tærskel". C) Øverste panel: Skærmbillede af Trackmate "Spotfiltrering" -menu, der illustrerer nogle filtre. Nederste panel: Eksemplarisk time-lapse-billede, der viser immunpletter filtreret efter position langs X i mellemkammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3. Trackmate Analysis pipeline til rekonstruktion af immunspor i tidsseriebilledsekvenser. A-C) Skærmbilleder af Trackmate-menuer til sporopbygning, sporfiltrering og til eksport af endelige data. D) Eksempler på genererede spor i forbehandlede time-lapse-billeder, der varierer indstillingerne for linkdetektoren. E) Eksempel på falske spor og dårlige links afledt af påvisning af tumorcellegrænser. F) Spor fremhæves med grønt ved at vælge rækker i filen .txt af resultater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4. Skematisk oversigt over 3D immunkompetente tumor-on chips. A) Eksempel på en mikrostruktureret siliciummaster. Frimærker til PDMS blev mønstret i SU-8 negativ modstand i et renrum udstyret med e-stråle og optisk litografi. B) PDMS-replikaer blev fremstillet ved standard soft-litografi metoder. Den centrale enhed har kamrene farvet som dem, der er tegnet i 3D-gengivelse af chippen, afbildet i panelet D. C) Scanning elektronmikroskopi (SEM) forstørret billede af rækken af mikrosøjler, der er egnet til indfangning af hydrogelopløsning. D)3D CAD, der viser kamrene, forbundet med mikroriller og læssebrøndene. Stiplede kasser henvises til SEM-fotografier af detaljer (panel C og E). E) SEM-fotografi af 10 μm høje forbundne mikroriller. F) 2D CAD-layout, der viser dimensionerne af mikrostrukturer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5. Skematisk arbejdsgang for hovedindlæsningsprotokoltrin til samling af 3D-co-kulturer. A) Overpanel: Skemaer over injektionstrin af Matrigel opløsning i hver gel side region. Nederste panel: Ægte fotografi af chippen, der viser gelfrontens fremskridt langs kanalen under indlæsningstrinnet. B) Skemaer over Matrigel polymerisationstrin. Nederste panel: Fasekontrastmikroskopisk billede af gel-luft-grænsefladen dannet efter geleringstrinnet. Skalastang, 100 μm. C)Overpanel: Tegning, der viser indlæsning af celler og medier med eksemplariske volumener, der anvendes i protokollen. Nederste panel: Der vises et 4X fasekontrastbillede af den samlede samkultur ved 0h. Skalastang, 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Analyse af migrationsprofiler og interaktionsadfærd af PBMC mod døende / levende tumorkammer i tidsvinduet 24-48 timer. Venstre panel. A) Skærmbilleder af time-lapse forbehandlede billeder overlejret med immunfarvede spor, ekstraheret af Trackmate. Immunbanerne opnås ved en enkelt FOV under de angivne eksperimentelle betingelser i intervallet 24 til 48 timer i mellemkammeret. B-C) Repræsentative migrationsspor og rosenplots af PBMC'er dyrket under de to forskellige betingelser (n = 1550 PBMC'er versus DOXO-behandlede kræftceller, DOXO+ eller n = 1434 PBMC'er versus kontrolkræftceller, DOXO-). Hver linje inde i x-y-plots viser en enkelt PBMC-bane, og hver cirkel repræsenterer den endelige position af en enkelt celle i forhold til startpositionen. Startpunkter indstilles til (0,0) ved hjælp af en koordinattransformation. Koordinaterne og forskydningen af centrum for massemassen af cellemigration vises under de angivne eksperimentelle betingelser. Centrum af massekoordinater og forskydning (beregnet som gennemsnitlig euklidisk afstand for X- og Y-komponenterne) giver indikation af den gennemsnitlige retning, som gruppen af celler primært rejste i, og størrelsen af den samlede cellebevægelse i tilstandsgrupper. Henholdsvis blå og grønne linjer markerer individuelle spor med euklidisk afstandsværdi, der er større/mindre end en tærskelværdi (100 μm). D) Skema med numeriske data ekstraheret af et cellespor. E-F) Box & Whiskers plot, der viser henholdsvis retningsbestemthed (p<0,0001 Uparret t test med Welchs korrektion) og FMI (s<0,0001 Uparret t test med Welchs korrektion). Den vandrette linje i bokse repræsenterer medianværdier. FMI-værdierne er gennemsnittet for alle cellespor i hver tilstandsgruppe. Højre panel. A) Skærmbilleder af Trackmate-ekstraherede ROI'er, der viser differentielle interaktioner mellem PBMC'er og DOXO- eller PBS-behandlede kræftceller. B) Tidstæthed af PBMC'er omkring DOXO-behandlede eller kontrol-MDA-MB-231 kræftceller. Antal PBMC'er til stede i udvalgte ROI omkring kræftceller for hver tilstand. De rapporterede værdier er gennemsnittet over 9 udvalgte investeringsafkast fra en enkelt tidsforløbs-FOV. Kræfthotspots er defineret i en ROI (80 μm i diameter). Tilsvarende tæthedsvarmekort vises. Prikker repræsenterer gennemsnitligt antal celler beregnet over 9 kræfthotspots på angivne tidspunkter. C) Fordeling af tider (min) af kontakter for hver forsøgsgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7. Præferencerekruttering af PBMC'er som reaktion på DAC plus IFN-lægemiddelkombinationer i en konkurrencedygtig 3D-immunkompetent melanom på chip-model. A) Distribution af oprindeligt indlæste PBMC'er i det centrale kammer af mikrofluidiske enheder. Mikrofotografier erhverves af EVOS-FL fluorescensmikroskop i løbet af 0-72 timers interval. Rød fluorescens (PKH67-mærkede celler) repræsenterer PBMC'er fra raske donorer. PKH67-mærkede (grønne) humane melanomceller indlejret i Matrigel indeholdende enkelt- eller dobbeltkombinationsbehandlinger blev belagt i laterale kamre. B) A375-celler plus IFN til venstre versus A375 plus DAC/IFN til højre. Fluorescensbilleder blev vist ved 72 timers samkultur. Udgået gul boks viser synligt massiv rekruttering i A375 plus DAC/IFN-siden. C) PBMC tæller i fire forskellige ROI'er fra IFN-kamre vs DAC+IFN-kamre. Histogrammer repræsenterer celletal +/- S.D.; heatmap opregnede værdier fra hvert investeringsafkast. Skalastænger, 200 μm. D-G) Skemaer over segmenterings- og kvantificeringstrin for infiltrerede PBMC'er i gelmatricer anvendt på enkeltkanals fluorescensbilleder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil. Mikrofabrikationsprotokol Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 1. Time-lapses sekvenser i en 2D tumor-immun on-chip co-kultur. Mikrofotografier blev erhvervet hvert 2. minut i et tidsinterval på 0-24 timer ved hjælp af et kompakt mikroskop anbragt i en standard cellekulturinkubator. Venstre panel. Film af PBMC'er fra raske donorer (WT, vildtype), belagt med MDA-MB-231 kontrol brystkræftceller. Højre panel. Film af en massiv migration af PBMC'er WT mod chipkammeret, hvor MDA-MB-231 DOXO-behandlede kræftceller er lastet. 2D-chiplayout er beskrevet detaljeret i afsnit 1 i protokollen og vist i figur 1. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

De beskrevne metoder forsøger at designe en generel tilgang til med modulerbar grad af kompleksitet at rekapitulere to væsentlige aspekter inden for onkoimmunologi, som kan drage fordel af vedtagelsen af mere relevante in vitro-modeller. Den første involverer tumorcellepopulationssiden, hvor tackling af enkeltcellekarakteristika kan føre til en bedre beskrivelse af heterogenitet og korreleret biologisk og klinisk betydning, herunder resistens over for terapi, propension mod metastase, stamcelle og differentieringsgrad. Den anden side af historien er repræsenteret af TME, herunder ikke-cancerøse komponenter (immun- og stromale celler, blodkar) og kemisk / fysisk landskab (ECM-bestanddele, kemokiner og andre opløselige faktorer frigivet), der dybt kan forme både sygdommens egenskaber og individets respons på terapi⁶³, især immunterapi. Det er værd at bemærke, at eksport af den beskrevne tilgang til andre forskningsområder kræver en dyb forståelse af begrænsninger og udfordringer som følge af udvikling og vedtagelse af nye modeller.

Med henvisning til en maksime, der anvendes i teknisk modellering ("model problemet, ikke systemet"), skal den optimeres, hvilket er det mindste antal (cellulære, fysiske og kemiske) komponenter og betingelser, der er nødvendige for at gøre egen on-chip-model biologisk relevant og stabil under hele eksperimentet. Hver kombination af celletyper / mikromiljø / eksperimentel indstilling skal således vælges nøjagtigt, evalueres og overvåges kontinuerligt langs enkelte eksperimenter og fra session til session. Disse kontroller omfatter, som nævnt i protokolafsnittene, streng kontrol af parametre som volumener i de mikrofluidiske enheder, der kan ændres af fugtighedsforhold eller opvarmning fra belysningskilder, mulige bevægelser og ikke-planaritet af trin, der forårsager ukontrolleret væskedrift, men også en vis slutpunktsverifikation af celletilstand, levedygtighed og fænotypisk karakterisering. Et kritisk skridt vedrører beslutningen om at bruge perfusionssystemer til at skabe vaskulariserede (lignende) strukturer eller til on-chip drug delivery³³, da dette kan påvirke eksperimenterne med hensyn til stigende kompleksitet, cellekulturvarighed og modulering af de kemiske faktorer i nærvær af flydende celler som de immune.

I det følgende opsummerer vi de vigtigste kritiske og relevante spørgsmål, der findes i de eksperimentelle indstillinger og i den nyeste litteratur.

ECM og definition af kemisk landskab
TME påvirkes også dybt af omgivelsernes mekaniske 64,65 egenskaber^{63, 66}. Af denne grund er valget af dyrkningsmatrixen grundlæggende, især når man beskæftiger sig med immunceller, der under visse betingelser kan reagere på signaler frigivet af selve matrixen. Relevante fremskridt forventes i den næste fremtid også fra design og udvikling af nye materialer og hydrogeler (kendetegnet ved forskellig stivhed, porøsitet, tilstedeværelse af opløselige faktorer, blandt de andre parametre), der muliggør en stadig mere raffineret og kontrollerbar ECM, der efterligner specificiteter af forskellige væv i dag, forskellige patienter i morgen. På den anden side er det også afgørende at overvåge de ændringer, der induceres af de forskellige cellepopulationer i ECM og definere strategier for at inkludere disse oplysninger i dynamiske og fænotypiske analyser.

Datastyring
Vejen mod implementering af tumor on-chip teknikker i en klinisk arbejdsgang vil drage fordel af et enormt eksperimentelt arbejde, der finder sted i flere retninger. Organ-on-chip-modeller, som mange in vitro-teknikker, er funktionelle, i det mindste potentielt, til at udføre målinger med høj gennemstrømning / højt indhold. Parallelisering af eksperimentelle betingelser, herunder positive og negative kontroller, og teknisk/biologiske replikater muliggøres ved at integrere flere chips på samme plade. Stigningen i den kvantitative gennemstrømning spiller en afgørende rolle i oversættelsen og valideringen af disse systemer i hurtig lægemiddel- eller genscreeningspipeline til immunterapier. Flere virksomheder har faktisk allerede udviklet platforme i et multibrøndformat, og forskellige billedbehandlingsmetoder testes for at muliggøre overvågning af et stort antal enheder samtidigt¹⁴. I de ovenfor beskrevne protokoller brugte vi mikroskopdias, der tildelte op til 3 chips, med mulighed for at visualisere op til 12 eksperimentelle betingelser parallelt ved hjælp af en standard mikroskop multi-slide bakke. Denne opsætning er kompatibel med håndpipettering og velegnet til specialorienterede justeringer udført i vores mikrofabrikationsanlæg. Tværtimod, når en stærk parallelisering er nødvendig (flere screeningstest og kontroller), kræves opsætningsoptimeringer for at indstille et højere automatiseringsniveau (dvs. brug af pipetteringsrobotter, plastbrønde).

Ved design af eksperimenter skal der tages hensyn til en afvejning mellem rumlig og tidsmæssig opløsning.

Den enorme mængde data, der produceres ved mikroskopi med højt indhold, udgør en begrænsende faktor med hensyn til lagring, overførsel og analyse. Disse spørgsmål behandles med beregningsmetoder, der implementerer maskinlæringsværktøjer og hardware / softwareressourcer, hvilket kan fremme den fremtidige mulighed for at forbinde on-chip / in-silico-eksperimenter^67,68 ved valg af terapeutiske strategier, og det repræsenterer en ambitiøs^, men alligevel ikke-udskydelig mulighed.

Ud over fluorescensbilleddannelse
Fluorescensmærkning ved hjælp af farvestoffer eller reportergener repræsenterer på grund af sin høje specificitet utvivlsomt guldstandardmetoden til at identificere forskellige cellepopulationer under co-kulturbetingelser og til at løse molekylære egenskaber med høj SNR. I OOC-modeller anvendes denne tilgang almindeligvis som reference, og især i heterogene tumor-on-chip-mikromiljøer kan det være værdifuldt at karakterisere fænotypen af immunceller, der infiltreres og interagerer.

Ikke desto mindre er der stigende beviser for, at effekter induceret af fluoroforer, besværlige farvningsprocedurer og belysningsrutiner skal overvåges og minimeres⁶⁹, fordi det dybt kan påvirke celleadfærd og tilstand^70,71. Denne risiko synes især at gælde for skrøbelige systemer, såsom immunceller^72,73. Fototoksiske reaktioner kan indføre begrænsninger i definitionen af momentalvindueserhvervelse af levende celler, når de overvåges ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Desuden gør rigdommen i de mange forskellige immununderpopulationer det umuligt kun at diskriminere mellem dem ved fluorescerende farvning i betragtning af det begrænsede antal filtre, der almindeligvis er tilgængelige på mikroskoper.

For at løse dette problem, fra et instrumentelt synspunkt, vises nye etiketfri⁷⁴ mikroskopiteknikker såsom holografisk⁵⁶ eller hyperspektral mikroskopi⁵⁷ nu på scenen. De lover avancerede cellulære procesklassificeringsstrategier ud over fluorescens og kan være særligt værdifulde til undersøgelse af følsomme prøver. Fra et dataanalysesynspunkt er avancerede beregningsmetoder, baseret på deep learning-algoritmer⁷⁵ (trænet af datasæt med fluorescensbilleder), døråbnere til at udføre den såkaldte "in silico-mærkning"^76,77. De er med succes blevet anvendt til at forudsige fluorescerende markører fra lysfeltbilleder⁷⁸, der genererer mærkede billeder uden farvning af celler, hvilket øger informativ effekt af lysfeltmikroskopi. Denne strategi kan også være nyttig til at spare tid og fluorescenskanaler for andre markører. Vi mener, at OOC-samfundet vil drage fordel af disse nye teknikker, der muliggør en mindre invasiv undersøgelse af cellepopulationers interaktion.

Analyse af data
Mekanismer for interaktioner mellem immun- og målcancerceller kan undersøges ved sporing af cellebevægelser ^28,79. Time-lapse tracking eksperimenter i komplekse og heterogene co-kulturer er ekstremt værdifulde til at udtrække cellemigrationsmønstre, morfologiske og tilstandsændringer og omfattende afstamningsinformation. Udførelse af manuel analyse er praktisk talt kun mulig for korte sekvenser med få celler, men ikke for systematiske eksperimenter med høj kapacitet. Udviklingen af beregningsværktøjer til cellesporing, enten helt eller delvist automatiseret, er derfor et vigtigt forskningsområde inden for billedanalyse²⁴. Typisk kræver konventionel cellesporing relativt høj prøveudtagningsfrekvens og rumlig opløsning for korrekt at udføre segmenteringsopgaver, hvilket kan være udfordrende under mange eksperimentelle forhold. For at lokalisere celler er der tilgængelige segmenterings- og sporingsværktøjer med åben adgang (f.eks. ImageJ-software²²) som præsenteret i denne protokol eller dedikeret proprietær software. I store undersøgelser anvendte vi en proprietær software kaldet Cell Hunter^16,31, udviklet af University of Tor Vergata i Rom^, til at skelne på en fuldautomatisk måde kræft og immunceller i multipopulationskontekst. Skræddersyede løsninger baseret på maskinlæring og neurale netværkstilgange 80,81,82 begynder i dag at blive implementeret i mikroskopi-softwarepakker ^83, fra forbedring af SNR til styring af kritiske anskaffelsesparametre eller segmenteringstrin. Maskinindlæring kan udnyttes til at genkende almindelige cellulære mønstre (f.eks. Bevægelsesstile) for at karakterisere det biologiske respons med hensyn til mikromiljømæssige faktorer.

I Comes et ^al.41 blev en forududdannet Deep Learning Convolutional Neural Network-arkitektur anvendt til at klassificere, om kræftceller udsættes for en lægemiddelbehandling eller ej ved at bruge immuncellernes bevægelighed som en "markør", sporet fra time-lapse-data om co-kulturer af brystkræftceller og PBMC'er i kollagenmatricer i mikroenheder, som beskrevet i³³.

Udvikling af enkeltcellede omics-metoder og ontologier
Vi påpeger behovet for en strategisk alliance mellem encellede omics-teknologier⁸⁴ (f.eks. proteomics, metabolomics, genomics) og on-chip-metoder: den molekylære detaljerede karakterisering, konjugeret med funktionel dynamisk information, kunne forbedre forståelsen af grundlæggende mekanismer og klinisk beskrivelse. I dette tilfælde er nye instrumenter til at forbinde de to verdener ved deres begyndelse⁸⁵. Den første udfordring er at implementere enkeltcellede omics-tilgange direkte på onco-immunologichips²². Desuden kan organ-on-chips udnyttes som platforme til at teste potentielle mål identificeret ved genomforskning og proteomikanalyse^86,87. Et andet linkværktøj, som stadig stort set mangler, er en struktureret, standardiseret måde at annotere og lagre målte systemresultater^88,89. Men det er præcis, hvad vi har brug for i fremtiden for at opbygge systematiske databaser over cellulære kvantitative resultater og målte egenskaber, for at udvinde, udlede og korrelere dem med den iboende biologiske information. Kort sagt kræver behovet for standardisering og systematisk analyse af heterogene eksperimentelle datasæt en ontologiramme.

Tilpasning af modeller
Organ-on-chip-teknologi er velegnet til personalisering¹², da celler og væv fra enkelte patienter (eller klasser af patienter) kan bruges i enhederne under kontrollerede forhold, hvilket fører til klinisk relevante aflæsninger, der er nyttige til at informere terapeutiske eller forebyggelsesstrategier. Nogle eksempler begynder at dukke op i litteraturen⁹⁰. For tumor-on-chip-modeller stiller denne udfordring naturligvis flere tekniske og videnskabelige spørgsmål, der skal løses³⁶ (som TME-egenskabskontrol såsom iltkoncentration, cytokingradienter osv.). Det er vigtigt, at udsigten til at gøre onkologiske og onkoimmunologiske terapier mere effektive og samtidig reducere skadelige virkninger for hver patient er attraktiv ud fra et livskvalitetsperspektiv som for optimering af sundhedsressourcer.

Afslutningsvis er det tydeligt, at dette felt er autentisk tværfagligt og som sådan kræver en stor indsats for at etablere et fælles sprog og fælles mål mellem forskere, klinikere, industri, men også fra forskellige discipliner (teknik, biologi, datalogi, medicin, kemi) at finde god balance og nye løsninger⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator