Summary
I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.
Abstract
I modelli murini svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull'aritmia e consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi, tra cui l'alterata funzione dei canali ionici e la manipolazione del calcio. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti atriali o ventricolari di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp o per esplorare anomalie di manipolazione del calcio. Tuttavia, la resa limitata di cardiomiociti di alta qualità ottenuti dagli attuali protocolli di isolamento non consente entrambe le misurazioni nello stesso topo. Questo articolo descrive un metodo per isolare miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, per successive misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L da un animale. Si ottengono cuori di topo e l'aorta viene rapidamente incannulata per rimuovere il sangue. I cuori vengono quindi inizialmente perfusi con una soluzione priva di calcio (37 °C) per dissociare il tessuto a livello dei dischi intercalati e successivamente con una soluzione enzimatica contenente poco calcio per distruggere la matrice extracellulare (37 °C). Il cuore digerito viene successivamente sezionato in atri e ventricoli. I campioni di tessuto vengono tagliati in piccoli pezzi e sciolti mediante pipettaggio accurato su e giù. La digestione enzimatica viene interrotta e le cellule vengono gradualmente reintrodotte alle concentrazioni fisiologiche di calcio. Dopo il caricamento con un indicatore fluorescente Ca2+, i cardiomiociti isolati vengono preparati per la misurazione simultanea di correnti di calcio e transitori. Inoltre, vengono discusse le insidie dell'isolamento e vengono forniti protocolli patch-clamp e tracce rappresentative di correnti di calcio di tipo L con misurazioni simultanee dei transitori di calcio in miociti murini atriali e ventricolari isolati come descritto sopra.
Introduction
Le aritmie cardiache sono comuni e rappresentano una delle principali sfide sanitarie attuali poiché colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Le aritmie sono associate ad elevata morbilità e mortalità 1,2 e rappresentano la causa sottostante della maggior parte delle morti cardiache improvvise3. Le opzioni di trattamento aggiornate hanno migliorato la sopravvivenza dei pazienti, ma sono ancora principalmente trattamenti sintomatici piuttosto che mirati ai meccanismi sottostanti. Pertanto, questi trattamenti hanno un'efficacia limitata e possono spesso causare gravi effetti collaterali 4,5,6. Un miglioramento delle attuali opzioni di trattamento richiede una comprensione della fisiopatologia sottostante, creando la necessità di modelli adatti da studiare. I piccoli modelli animali - e in particolare i modelli murini - svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull'aritmia in quanto consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi, ad esempio l'impatto genetico sull'elettrofisiologia cellulare, la funzione dei canali ionici o la manipolazione del calcio 7,8.
A tale scopo sono necessari cardiomiociti atriali e ventricolari isolati di quantità e vitalità sufficienti. Un ampio spettro di diversi approcci di isolamento per ottenere miociti atriali e ventricolari è stato precedentemente descritto 9,10,11,12,13 e alcuni gruppi hanno presentato dati da misurazioni simultanee di transitori di calcio indotti da corrente di tipo L e transitori di calcio indotti da corrente atriale 14 o ventricolare 15 cardiomiociti murini. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non sono disponibili dati sulle misurazioni atriali e ventricolari di un animale. I ricercatori si concentrano su un'ampia varietà di argomenti che vanno dall'elettrofisiologia alla proteomica, studi funzionali come contrattilità cellulare o interazioni proteiche, funzione mitocondriale o genetica - tutti che necessitano di cardiomiociti isolati. Molti dei protocolli pubblicati non sono stati quindi sviluppati specificamente per gli studi sui patch morb, portando a rese limitate e qualità delle celle insufficiente per gli studi sui patch morb. Pertanto, le misurazioni simultanee di patch clamp e transitori di calcio di cellule atriali e ventricolari isolate da un animale non possono essere eseguite con protocolli stabiliti.
L'isolamento dei miociti murini, specialmente atriali, per gli esperimenti di patch clamp rimane impegnativo. Questo articolo fornisce un metodo semplice e veloce per l'isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, che consente successivamente misurazioni simultanee sia della corrente netta di membrana che dei transitori di calcio indotti dalla corrente da un animale. Questo articolo elabora un protocollo per l'isolamento di miociti atriali e ventricolari derivati da topi wild type e topi portatori di mutazioni genetiche. Questo protocollo può essere utilizzato sia per i topi maschi che per le femmine. L'isolamento dei miociti, le immagini e i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati ottenuti da topi selvatici tipo C57Bl/6 all'età di 6 (± 1) mesi. Tuttavia, questo protocollo è stato utilizzato con successo per topi di varie età che vanno da 2 a 24 mesi con genotipi diversi. La Figura 1 mostra la configurazione dell'isolamento e un primo piano di un cuore cannulato durante la perfusione enzimatica.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Lower Saxony Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) e sono state condotte in conformità con tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere degli animali.
1. Predisposizioni
- Preparare 1 L di tampone di perfusione 10x (Tabella 1), 500 mL di tampone di perfusione 1x (Tabella 2), 50 mL di tampone di digestione (Tabella 3), 10 mL di tampone di arresto (Tabella 4), 1 L di soluzione di Tyrode (Tabella 5), 10 mL di ciascuna soluzione di fase di calcio (Soluzione di Tyrode con glucosio e la rispettiva quantità di calcio come indicato), 1 L di soluzione 4-AP (Tabella 5), 100 mL di soluzione per pipetta (Tabella 6) e 5 ml di acido pluronico secondo le ricette fornite.
NOTA: Le soluzioni da bagno (Tyrode e soluzione 4-AP) possono essere preparate (senza glucosio) in anticipo e conservate a +4 °C, il glucosio viene aggiunto il giorno sperimentale. La soluzione di pipetta può essere conservata a -20 °C, l'indicatore di calcio viene aggiunto il giorno sperimentale e la soluzione viene quindi conservata su ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Il tampone di perfusione 10x può essere conservato a temperatura ambiente, il tampone di perfusione 1x, il tampone di digestione e il tampone di arresto devono essere preparati al momento il giorno sperimentale. - Accendere il bagno d'acqua e la pompa a rulli.
- Apparecchio Langendorff di preriempimento con tampone di perfusione; Assicurati che sia privo di aria.
- Preparare la cannula aortica fissandola sotto il microscopio a dissezione, collegare con una siringa da 1 mL riempita con tampone di perfusione e aria pulita risciacquando la cannula.
NOTA: È fondamentale evitare qualsiasi aria all'interno del sistema di perfusione, poiché ciò influenzerà direttamente la perfusione coronarica e quindi l'efficacia della digestione. Una trappola a bolle potrebbe essere aggiunta alla configurazione, se necessario, per evitare in modo sicuro qualsiasi intrappolamento d'aria. - Preparare le piastre di Petri con sufficiente tampone di perfusione per la raccolta degli organi e la microscopia (il tampone dovrebbe coprire saldamente l'intero organo, pochi millilitri – a seconda delle dimensioni della capsula di Petri utilizzata – dovrebbero essere sufficienti).
- Preparare 3 piastre di Petri con tampone di digestione per la dissociazione tissutale e la microscopia, il tampone deve coprire l'organo per la dissezione al microscopio all'interno della rispettiva capsula di Petri, la quantità dipende dalla dimensione della capsula di Petri utilizzata. Per la dissociazione utilizzare 3 ml per il tessuto ventricolare e 1,5 ml per il tessuto atriale.
2. Prelievo di organi
- Iniettare nel mouse 0,1 mL di eparina (1.000 U/mL) i.p. utilizzando una siringa da 1 mL con una cannula da 27 G e attendere 5-10 minuti.
- Posizionare il topo in una camera di induzione insieme a un piccolo tessuto imbevuto di circa 500 μL di isoflurano. L'animale non deve essere in contatto con il tessuto. Per evitare ciò, è possibile utilizzare una cassetta di plastica per incorporare biopsia per coprire il tessuto. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, controllare il riflesso del pizzico del dito del piede e non appena non è più presente, eutanasia rapidamente il topo per lussazione cervicale.
- Posizionare il mouse su una piattaforma sul dorso (ad esempio, su polistirolo coperto con un tovagliolo di carta) e fissare le zampe verso il basso con cannule per tenerlo in posizione.
- Rimuovere la pelliccia e la pelle che copre il torace e parte dell'addome con un taglio netto dal giugulo verso la sinfisi e aprire l'addome proprio sotto lo xifoide senza ferire alcuna struttura d'organo usando le forbici. Sollevare lo sterno con una pinza chirurgica e tagliare il diaframma con le forbici lungo il bordo delle costole, quindi tagliare le costole nella linea ascellare mediale e rimuovere la gabbia toracica per esporre il cuore.
- Rimuovere con attenzione il pericardio con una pinza smussata e rimuovere rapidamente il cuore sollevandolo con una pinza smussata dal basso e tagliando i grandi vasi con un singolo taglio usando le forbici.
- Mettere il cuore in tampone di perfusione a temperatura ambiente e cannulare l'aorta con un ago smussato al microscopio il più rapidamente possibile.
NOTA: Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare e tessuto adiposo attaccato all'organo senza perdere troppo tempo su di esso. Durante l'incannulamento, assicurarsi che l'estremità dell'ago non si estenda attraverso la valvola aortica, poiché ciò comprometterà i risultati impedendo ai tamponi di entrare nelle arterie coronarie. - Legare saldamente il cuore con un pezzo di seta suturatrice all'ago e scollegare dalla siringa.
NOTA: L'intera procedura dall'ottenimento del cuore (il momento in cui i grandi vasi vengono tagliati) fino alla sutura dell'aorta all'ago dovrebbe richiedere il minor tempo possibile. Si raccomanda di non impiegare più di 90-180 s dalla rimozione del cuore fino all'inizio della perfusione.
3. Digestione enzimatica
- Dopo l'incannulamento aortico, collegare immediatamente il cuore cannulato all'apparato Langendorff evitando che l'aria entri nel sistema.
NOTA: Può essere utile avere una goccia sospesa di tampone di perfusione nella parte inferiore dell'apparecchio Langendorff e una goccia di tampone di perfusione posizionata sulla parte superiore dell'ago per evitare che l'aria entri nel sistema. - Perfondere il cuore con tampone di perfusione per 1 minuto ad una temperatura di esattamente 37 °C e una velocità di perfusione di esattamente 4 mL/min.
NOTA: Per avere una temperatura di 37 °C sulla punta dell'ago di perfusione, la temperatura del bagno d'acqua deve essere impostata leggermente al di sopra di circa 40 °C. Questo dovrebbe essere testato regolarmente misurando la temperatura sulla punta di perfusione. - Commutare la perfusione in tampone di digestione e perfondere per esattamente 9 minuti ad una temperatura di esattamente 37 °C e una velocità di perfusione di esattamente 4 mL/min.
- Trasferire il cuore digerito in una capsula di Petri con abbastanza tampone di digestione per mantenerlo completamente coperto. Quindi sezionare attentamente gli atri e i ventricoli al microscopio.
- Trasferire gli atri in una capsula di Petri con 1,5 ml di tampone di digestione e i ventricoli in un'altra capsula di Petri con 3 ml di tampone di digestione.
- Dissezione atriale
- Con attenzione, ma senza perdita di tempo, separare gli atri in piccoli pezzi usando una pinza smussata.
- Sciogliere il tessuto con attenzione su e giù utilizzando una punta da 1.000 μL, che è stata precedentemente tagliata per allargare l'apertura della punta.
- Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto (1,5 mL) mediante pipettaggio accurato sul lato del tubo per terminare la reazione.
- Passare con cautela tutti i 3 ml di soluzioni cellulari/tissutali attraverso una rete di nylon da 200 μm per rimuovere i restanti pezzi di tessuto più grandi che non sono stati completamente digeriti.
NOTA: Una digestione di successo non lascerà quasi nessun pezzo solido.
- Dissezione ventricolare
- Tritare rapidamente il tessuto ventricolare in piccoli pezzi usando forbici da dissezione e pipetta su e giù per dissolvere. Utilizzare un'altra punta per pipetta da 1.000 μL per il pipettaggio su e giù, può essere accorciata per allargare l'apertura.
- Trasferire la cellula/soluzione tissutale in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto (3 ml) mediante pipettaggio accurato sul lato del tubo per terminare la reazione.
- Passare con cautela tutti i 6 ml di soluzione cellulare/tissutale attraverso una rete di nylon da 200 μm per rimuovere i pezzi di tessuto più grandi che non sono stati completamente digeriti.
NOTA: Una digestione di successo non lascerà quasi nessun pezzo solido.
- Lasciare entrambi i tubi (sospensione di cellule atriali e ventricolari) sul banco a temperatura ambiente per 6 minuti per sedimentare.
- Centrifugare entrambi i tubi da 15 ml a 5 x g per 2 minuti.
4. Reintroduzione del calcio
NOTA: I seguenti passaggi sono identici sia per le cellule atriali che per quelle ventricolari (se non diversamente specificato) e vengono eseguiti a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode senza calcio.
- Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
- Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
- Eliminare il surnatante e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 100 μM.
- Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
- Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
- Eliminare il surnatante e risospendere accuratamente il pellet in 10 mL di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 400 μM.
- Lasciare le cellule per 8 minuti per la sedimentazione.
- Centrifugare a 5 x g per 1 minuto (solo cellule atriali, la sedimentazione è sufficiente per le cellule ventricolari).
- Scartare il surnatante e risospendere con cautela il pellet in 1 mL (atriale)/ 5 mL (ventricolare) di soluzione di Tyrode con concentrazione di calcio di 1 mM.
5. Carico di miociti con indicatore di calcio fluorescente Fluo-3 AM
NOTA: A causa della sensibilità alla luce dell'indicatore fluorescente di calcio, i seguenti passaggi devono essere eseguiti protetti dalla luce (ad esempio, coprendo i tubi con un foglio di alluminio).
- Preparare la soluzione madre di Fluo-3 AM aggiungendo 44 μL di F-127 pluronico al 20% in DMSO anidro a 50 μg di Fluo-3AM (può essere conservato a -20 °C al riparo dalla luce).
- Aggiungere 10 μL di soluzione madre Fluo-3 AM a 1 mL di sospensione cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Centrifugare a 5 x g per 1 min.
- Scartare il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica e risospendere il pellet in una quantità ragionevole di soluzione di bagno per ottenere una buona concentrazione di lavoro (1-5 ml di soluzione di bagno a seconda della densità cellulare).
- Lasciare agire per 30 minuti per la deesterificazione prima di iniziare con gli esperimenti.
6. Misurazioni simultanee di patch-clamp e transitori di Ca2+ epifluorescenti come descritto in precedenza16
NOTA: Le misurazioni dei morsetti patch non sono l'argomento di questo articolo, il lettore interessato può essere rimandato alle principali pubblicazioni che forniscono descrizioni approfondite di questo metodo 17,18,19,20,21,22. Tuttavia, per una migliore comprensione generale, viene fornito un riassunto su un protocollo per misurare le correnti di calcio di tipo L insieme ai transitori di calcio indotti dalla corrente.
- Trasferire i miociti in una camera cellulare e superfondere con soluzione di bagno a 37 °C.
- Bloccare le correnti di potassio aggiungendo 4-amminopiridina e cloruro di bario alla soluzione del bagno come indicato nella Tabella 5.
- Assicurarsi che i microelettrodi borosilicati abbiano una resistenza della punta di 2-5 MΩ riempiti con soluzione di pipetta (Tabella 6).
- Impostare le misure per consentire la registrazione simultanea di segnali elettrici ed epifluorescenza allo stesso tempo. La modalità di morsetto di tensione viene utilizzata per misurare la corrente Ca2+ di tipo L con un protocollo che mantiene la cella a -80 mV e un impulso di rampa di 600 ms a -40 mV per inattivare la corrente veloce Na+, seguita da un impulso di prova di 100 ms a +10 mV a 0,5 Hz (Figura 2).
- Utilizzare l'eccitazione a 488 nm, la luce emessa a <520 nm per rilevare e convertire in [Ca2+]I assumendo
Dove kd = costante di dissociazione di Fluo-3 (864 nM), F = fluorescenza Fluo-3; Fmax = fluorescenza satura di Ca2+ ottenuta alla fine di ogni esperimento19.
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Representative Results
La resa di isolamento viene determinata dopo la reintroduzione del calcio pipettando 10 μL di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio. Più di 100 cellule vitali, a forma di bastoncello, non contraenti/10 μL per l'isolamento delle cellule atriali e più di 1.000 cellule vitali, a forma di bastoncello, non contraenti/10 μL per l'isolamento delle cellule ventricolari sono considerate come resa sufficiente e sono comunemente ottenute utilizzando questo protocollo. Le cellule atriali ottenute con questo protocollo hanno mostrato una varietà di diversi tipi di cellule contenenti cellule del sistema di conduzione cardiaca, in particolare il nodo del seno, nonché diversi miociti dall'atrio destro e sinistro e dalle appendici atriali. Poiché queste regioni non sono sezionate separatamente, il risultato sono varie morfologie cellulari. Tutte le celle atriali sono piccole, con capacità cellulari che vanno da circa 35 pF a 100 pF, alcune sono più filiformi di altre. Il pannello A della Figura 3 mostra una cellula tipica del miocardio atriale caricata con colorante sensibile al calcio, pronta per le misurazioni ottenute con questo protocollo. I miociti ventricolari sono più a forma di bastoncino e più grandi con capacità cellulari che vanno da 100 a circa 400 pF, il pannello B della Figura 3 mostra una tipica cellula ventricolare del miocardio funzionante caricata con colorante sensibile al calcio, pronta per le misurazioni ottenute con questo protocollo. La Figura 4 mostra esempi rappresentativi di misurazioni della corrente di calcio di tipo L con transitori citosolici simultanei di calcio da un miocita atriale (pannello B e C) e un miocita ventricolare (pannello E e F).
Figura 1: Apparato di Langendorff. (A) Fotografia della configurazione di isolamento con vista dello scambiatore di calore progettato su misura e della camera cardiaca incamiciata. (B) Primo piano della camera cardiaca rivestita con cuore cannulato in posizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Protocollo di stimolazione. Protocollo di tensione-clamp (0,5 Hz) utilizzato per misurare la corrente totale netta di membrana (IM), che riflette prevalentemente la corrente Ca 2+ di tipo L e iltransitorio Ca 2+ indotto dalla corrente Ca2+. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Cardiomiociti murini isolati. (A) Un esempio di cardiomiocita atriale caricato con Fluo-3, pronto per esperimenti patch-mord. (B) Un esempio di cardiomiocita ventricolare caricato con Fluo-3, pronto per esperimenti patch-clamp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Registrazioni rappresentative. (A) Protocollo di morsetto di tensione (0,5 Hz). (B) Corrente netta totale di membrana (IM), che riflette prevalentemente la corrente Ca2+ di tipo L in un miocita atriale murino. (C) La corrente Ca 2+ di tipo L ha innescato il transitorio Ca2+ in un miocita atriale murino. (D) protocollo tension-clamp (0,5 Hz). (E) Corrente netta totale di membrana (IM), che riflette prevalentemente la corrente Ca2+ di tipo L in un miocita ventricolare murino. (F) La corrente Ca 2+ di tipo L ha innescato il transitorio Ca2+ in un miocita ventricolare murino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Concentrazione finale (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| Kcl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tabella 1: tampone di perfusione 10x (1.000 ml).
| Concentrazione finale (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-butanedione monoxima | 10 |
| Glucosio | 5.5 |
| Buffer di perfusione 10x | 50 ml |
| doppio distillato H2 O (18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tabella 2: 1x tampone di perfusione (500 ml).
| Concentrazione finale | |
| Collagenasi di tipo II | ~600 U/ml |
| CaCl2 | 40 μM |
| 1x buffer di perfusione | 50 ml |
Tabella 3: Tampone di digestione (50 ml).
| Concentrazione finale | |
| Siero di vitello bovino | 10% |
| CaCl2 | 12,5 μM |
| 1x buffer di perfusione | 10 ml |
Tabella 4: Tampone di arresto (10 ml).
| Concentrazione finale (mM) | ||
| Tira | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glucosio | 10 | 10 |
| Kcl | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| Probenecid | 2 | 2 |
| 4-amminopiridina | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| ph | 7,35 regolato con 1 M NaOH a temperatura ambiente | 7,35 regolato con 1 M NaOH a temperatura ambiente |
Tabella 5: Soluzioni per il bagno.
| Concentrazione finale (mM) | |
| DL-aspartat K+-sale | 92 |
| Kcl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosina 5′-trifosfato tris sale | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| ph | 7,20 regolato con 1 M KOH a temperatura ambiente |
Tabella 6: Soluzione per pipette.
| Problema osservato | Possibile motivo | Soluzione |
| Bassa resa cellulare, pezzi di tessuto lasciati | Sottodigestione | Aumentare il tempo di digestione in incrementi di 15 secondi |
| Bassa resa cellulare, pezzi di tessuto lasciati | Sottodigestione | Aumentare la quantità di collagenasi in incrementi di 50 U/ml |
| mix di cellule sovra e sottodigerite, pezzi di tessuto lasciati | Nessuna perfusione coronarica | Assicurarsi di non inserire la cannula aortica nel ventricolo |
| mix di cellule sovra e sottodigerite, pezzi di tessuto lasciati | Bolle d'aria | Assicurarsi di non inserire aria nel sistema di perfusione |
| Bassa qualità complessiva delle celle | Tempo ischemico troppo lungo | Diminuire il tempo ischemico, considerare metodi alternativi per mantenere la circolazione il più a lungo possibile |
Tabella 7: Problemi comuni e come risolverli.
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Discussion
Questo articolo fornisce un modo semplice e funzionale per ottenere miociti atriali e ventricolari di alta qualità dallo stesso topo per studi patch-clamp con registrazioni simultanee di transitori di calcio. La qualità dei dati ottenuti dipende fortemente dalla qualità dell'isolamento cellulare. Come accennato in precedenza, molti metodi per isolare cardiomiociti murini sono stati descritti in precedenza 9,10,11,12. Le cellule isolate sono utilizzate per varie analisi che vanno dagli esperimenti di patch clamp agli studi di contrattilità, studi morfologici, proteomica, ricerca sulla funzione mitocondriale e molti altri. Ogni singolo scopo richiede celle isolate ottimizzate in modo diverso. A causa di ciò, nessuno dei protocolli ha portato a isolamenti di alta qualità adatti per esperimenti patch-clamp con misurazione simultanea delle proprietà di manipolazione del calcio dei miociti atriali e ventricolari da un topo. Per cambiare questo, l'adattamento di numerosi protocolli descritti prima ha portato allo sviluppo di questo protocollo. Alcuni passaggi sono meccanicamente impegnativi, alcuni devono essere eseguiti in modo specifico e alcuni sono semplicemente cruciali per la qualità dell'isolamento. Questi passaggi saranno discussi di seguito.
La resa e la qualità dell'isolamento cellulare diminuiscono con l'età animale, probabilmente a causa dell'aumento della fibrosi tissutale 11,23,24 che rende necessari aggiustamenti individuali del tempo di digestione e della quantità enzimatica. Più vecchio è un animale, più tessuto fibrotico è prevedibile. I tempi di digestione indicati e le quantità enzimatiche sono un buon punto di partenza per topi sani di dimensioni normali all'età di 6 mesi, ma avranno bisogno di adattamento alle esigenze individuali. Si consiglia di applicare più enzimi e tempi di digestione più lunghi quando si utilizzano topi anziani o topi transgenici che favoriscono la fibrosi. Come il lavoro precedente ha sottolineato, l'incannulamento rapido e privo di aria e la perfusione immediata del cuore sono assolutamente fondamentali per una buona qualità cellulare11. Si raccomanda di non impiegare più di 90-180 secondi dall'ottenimento del cuore e metterlo in tampone di perfusione a temperatura ambiente per iniziare la perfusione - più veloce, meglio è. È utile installare tutte le attrezzature necessarie in una stanza per evitare lunghe distanze. Se si desidera un ulteriore accorciamento dell'intervallo ischemico, è possibile utilizzare un altro metodo di narcosi e successiva eutanasia. Anestetizzare completamente l'animale come descritto sopra, applicare una quantità sufficiente di fentanil (o un farmaco analgesico equivalente in conformità con le linee guida per il benessere degli animali) i.p. e spostare l'animale su una piattaforma con un vaporizzatore di isoflurano e una maschera per anestesia adatta ai topi, fornendo un flusso costante di isoflurano e ossigeno. Successivamente procedere come descritto sopra. Poiché l'animale ha una circolazione normale fino a quando i grandi vasi non vengono scollegati con un singolo taglio, questo metodo ridurrà significativamente il tempo di assenza di flusso e può quindi migliorare la qualità dell'isolamento, se necessario.
Dopo aver raccolto il cuore, è fondamentale posizionare la cannula aortica alla giusta profondità per garantire la perfusione coronarica. È quindi necessario tagliare l'aorta in corrispondenza dell'arco aortico o dell'aorta discendente quando si preleva il cuore per lasciare almeno 5 mm dell'aorta per l'incannulamento permettendo di legare la seta suturatrice distale dalle arterie coronarie ma prima dei primi rami laterali aortici.
Durante il processo di isolamento, sono necessari più trasferimenti di cellule e il pipettaggio con piccole punte di pipette causerà un elevato stress di taglio alle cellule. Le possibili soluzioni per ridurre lo sforzo di taglio sono il pipettaggio lento e attento, nonché il taglio delle punte delle pipette di alcuni millimetri con un angolo di 45° per allargare l'apertura della punta. Un'ulteriore riduzione dello sforzo di taglio può essere ottenuta fondendo le punte delle pipette tagliate per ammorbidire i bordi. La resa di isolamento dell'isolamento ventricolare di solito è così elevata che la riduzione dello stress di taglio non è obbligatoria. A seconda del proprio obiettivo individuale, può anche essere più utile esporre le cellule ventricolari allo stress di taglio per selezionare le cellule più "adatte". Tuttavia, per l'isolamento atriale questa procedura è fondamentale, poiché le cellule atriali sono particolarmente vulnerabili dopo la digestione. Ogni volta che si aggiungono soluzioni, si raccomanda di evitare il pipettaggio direttamente sulle celle, ma piuttosto di cercare di pipettare lentamente la parete del tubo.
La scelta della collagenasi influenzerà significativamente i risultati dell'isolamento. Poiché non ci sono solo differenze nei preparati enzimatici, ma anche una variazione rilevante da lotto a lotto nell'attività enzimatica, la titolazione della quantità di collagenasi e il tempo di digestione sono necessari quando si inizia a lavorare con un nuovo lotto di enzimi o un nuovo ceppo di topi. Tuttavia, la quantità e il tempo indicati nelle tabelle sopra segnano un buon punto di partenza per l'ottimizzazione individuale9. La maggior parte delle aziende fornisce piccoli campioni enzimatici per testare i singoli lotti, il che rende la selezione dei lotti molto più conveniente.
Transienti di calcio con ampiezze tipiche e normale decadimento monofasico possono essere ottenuti se le cellule sono isolate senza l'uso di EGTA25 come precedentemente descritto da Voigt et al.9,16. Questo protocollo, quindi, utilizza basse concentrazioni di calcio ed evita EGTA durante il processo di isolamento. Per proteggere le cellule dal fenomeno del paradosso Ca 2+ 26, il calcio viene reintrodotto gradualmente e lentamente fino a raggiungere una concentrazione finale di 1 mM. A causa delle maggiori concentrazioni intracellulari di sodio, i cardiomiociti dei roditori sono particolarmente inclini al sovraccarico di calcio e la reintroduzione lenta e graduale è cruciale27. La necessità di soluzioni prive di calcio rappresenta uno dei principali limiti di tutti gli isolamenti cardiomiocitari di roditori a base di Langendorff. La reintroduzione del calcio porta sempre ad una significativa perdita di cellule vitali. La reintroduzione lenta e graduale, come qui descritta, porta tuttavia a una resa sufficiente con una buona qualità per ottenere misurazioni affidabili da ciascun animale.
È importante valutare la resa e la qualità delle cellule subito dopo la reintroduzione del calcio. Sebbene la valutazione finale avvenga durante la patch delle cellule isolate, si può già giudicare la quantità e la qualità delle cellule dando un'occhiata al microscopio prima di caricare le cellule con colorante sensibile al calcio. Le cellule di buona qualità sono chiaramente a forma di bastoncello, hanno una membrana omogenea e non si contraggono. La contrazione è un segno di bassa qualità cellulare in quanto indica una perdita di integrità della membrana e potrebbe essere causata da sovradigestione o applicazione di elevato stress di taglio. Un altro segno di sovradigestione è – oltre a molte ombre cellulari in relazione alle cellule vitali – una membrana dall'aspetto eccessivamente bello che è stata ripulita da molte proteine di superficie ed è estremamente vulnerabile quando si cerca di avvicinarsi alla cellula con la punta della pipetta per la formazione delle foche. Cellule esemplari sane e di buona qualità sono mostrate nella Figura 3. (Pannello A: miocita atriale, Pannello B: miocita ventricolare). Gli isolamenti con alti rendimenti possono portare a cellule immuni alla formazione di sigilli e viceversa. Alla fine, il test di qualità definitivo, indipendentemente dall'aspetto e dalla resa delle cellule, è la risposta a una semplice domanda: "È possibile eseguire le misurazioni desiderate con risultati di alta qualità nelle celle isolate di ogni isolamento?". Il protocollo fornito sopra rende possibile una risposta positiva.
Molti protocolli di isolamento utilizzano l'agente disaccoppiante Blebbistatin per ottenere rese più elevate e cellule di migliore qualità. Questo protocollo evita volutamente la blebbistatina, prendendo in considerazione le prove pubblicate della sua influenza sull'elettrofisiologia cardiaca28,29 negli esperimenti di mappatura ottica. L'uso di agenti disaccoppianti negli studi elettrofisiologici deve essere trattato con cautela e deve essere limitato alle circostanze in cui il disaccoppiamento è obbligatorio.
Le cellule ottenute con questo protocollo possono essere utilizzate per circa sei ore dopo il caricamento con Fluo-3 con cellule atriali più vulnerabili al tempo. Di conseguenza, si raccomanda di studiare le cellule atriali prima delle cellule ventricolari se lo stesso ricercatore le elabora.
Una limitazione di questo protocollo, come per la maggior parte dei protocolli di isolamento basati su Langendorff, è che è tecnicamente difficile. Chiaramente, i cuori di topo sono piccoli e tutti gli aspetti tecnici richiedono molto esercizio. Ciò significa che un ricercatore esperto otterrà risultati migliori. Alcuni protocolli utilizzano una pressione costante per perfondere il cuore. Ciò ha il vantaggio che a causa della digestione e della perdita consecutiva di resistenza tissutale la perfusione accelererà, e questo aiuta a definire il tempo di digestione ottimale, tuttavia l'accelerazione può danneggiare il tessuto e diminuire significativamente la qualità cellulare. In un approccio a flusso costante come quello utilizzato qui, non ci sono chiari parametri di riferimento per i tempi di digestione e spesso può essere difficile fermare la digestione in un momento ottimale, il che segna una limitazione rilevante. Un'altra limitazione è che in questo protocollo le cellule isolate sono state testate solo per l'idoneità agli esperimenti sopra descritti. È probabile che queste cellule possano essere utilizzate anche per analisi diverse, ma questo deve ancora essere dimostrato. Un primo passo in quella direzione è stato l'uso di queste celle per visualizzare i potenziali d'azione caricandoli con VF2.1CI, un colorante sensibile alla tensione recentemente derivato con cinetica superiore ai coloranti sensibili alla tensione precedentemente utilizzati secondo un protocollo pubblicato da Seibertz et al.30. Per facilitare la risoluzione dei problemi, la tabella 7 mostra i problemi comuni di isolamento e come affrontarli.
Nel loro insieme, il protocollo di isolamento descritto offre un approccio di lavoro all'isolamento simultaneo di cardiomiociti atriali e ventricolari murini, consentendo al ricercatore di ottenere un fenotipo elettrofisiologico atriale e ventricolare di un singolo topo. Ciò rimuove gli ostacoli statistici posti dai precedenti protocolli di isolamento che isolano solo le cellule atriali o ventricolari ad alta qualità e aiuta a ridurre il numero di animali necessari per uno studio specifico. Ciò può essere particolarmente importante se interventi come ad esempio l'impianto di minipompe osmotiche riempite con agenti costosi fanno parte degli esperimenti e possono essere un fattore vitale nelle considerazioni sul benessere degli animali.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits e D. Schüttler; VO1568/3-1, progetto IRTG1816 e SFB1002 A13 a N. Voigt), Fondazione tedesca per la ricerca nell'ambito della strategia di eccellenza tedesca (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss e N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), l'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) e la Fondazione Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
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