Summary
Musmodeller gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes. För detta ändamål är högkvalitativa kardiomyocyter nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar. Här beskrivs en metod för att isolera murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som möjliggör samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ.
Abstract
Musmodeller spelar en avgörande roll i arytmiforskning och gör det möjligt att studera viktiga mekanismer för arytmogenes, inklusive förändrad jonkanalfunktion och kalciumhantering. För detta ändamål är förmaks- eller ventrikulära kardiomyocyter av hög kvalitet nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar eller för att utforska kalciumhanteringsavvikelser. Det begränsade utbytet av högkvalitativa kardiomyocyter erhållna med nuvarande isoleringsprotokoll tillåter emellertid inte båda mätningarna i samma mus. Denna artikel beskriver en metod för att isolera högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, för efterföljande samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ från ett djur. Mushjärtan erhålls, och aortan kanyleras snabbt för att avlägsna blod. Hjärtan perfuseras sedan initialt med en kalciumfri lösning (37 °C) för att dissociera vävnaden vid nivån av interkalerade skivor och därefter med en enzymlösning som innehåller lite kalcium för att störa extracellulär matris (37 °C). Det smälta hjärtat dissekeras därefter i atria och ventriklar. Vävnadsprover hackas i små bitar och löses upp genom att försiktigt pipettera upp och ner. Den enzymatiska nedbrytningen stoppas och cellerna återinförs stegvis till fysiologiska kalciumkoncentrationer. Efter belastning med en fluorescerande Ca2+-indikator prepareras isolerade kardiomyocyter för samtidig mätning av kalciumströmmar och transienter. Dessutom diskuteras isoleringsfallgropar och patch-clamp-protokoll och representativa spår av kalciumströmmar av L-typ med samtidiga kalciumövergående mätningar i förmaks- och ventrikulära murina myocyter isolerade enligt beskrivningen ovan tillhandahålls.
Introduction
Hjärtarytmier är vanliga och en av de nuvarande stora utmaningarna inom hälso- och sjukvården eftersom de påverkar miljontals människor världen över. Arytmier är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet 1,2 och utgör den bakomliggande orsaken till majoriteten av plötsliga hjärtdödsfall3. Uppdaterade behandlingsalternativ har förbättrat patienternas överlevnad men är fortfarande främst symptomatiska behandlingar snarare än inriktade på de underliggande mekanismerna. Således har dessa behandlingar begränsad effekt och kan ofta orsaka allvarliga biverkningar 4,5,6. En förbättring av nuvarande behandlingsalternativ kräver insikt i den underliggande patofysiologin, vilket skapar behov av lämpliga modeller att studera. Små djurmodeller - och specifikt musmodeller - spelar en avgörande roll i arytmiforskning eftersom de gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes, till exempel den genetiska påverkan på cellulär elektrofysiologi, jonkanalfunktion eller kalciumhantering 7,8.
För detta ändamål krävs isolerade förmaks- och ventrikulära kardiomyocyter med tillräcklig mängd och livskraft. Ett brett spektrum av olika isoleringsmetoder för att erhålla förmaks- och ventrikulära myocyter har tidigare beskrivits 9,10,11,12,13 och vissa grupper har presenterat data från samtidiga mätningar av ström av L-typ och kalciumströminducerade kalciumtransienter från antingen förmak 14 eller ventrikulär 15 murina kardiomyocyter. Men så vitt vi vet finns det inga data tillgängliga om förmaks- och ventrikulära mätningar från ett djur. Forskare fokuserar på ett brett spektrum av ämnen som sträcker sig från elektrofysiologi till proteomik, funktionella studier som cellkontraktilitet eller proteininteraktioner, mitokondriell funktion eller genetik - allt i behov av isolerade kardiomyocyter. Många av de publicerade protokollen har därför inte utvecklats specifikt för patch clamp-studier, vilket leder till begränsade utbyten och otillräcklig cellkvalitet för patch clamp-studier. Således kan samtidiga lappklämmor och kalciumtransienta mätningar av förmaks- och ventrikulära celler isolerade från ett djur inte utföras med etablerade protokoll.
Isolering av murina - särskilt förmaksmyocyter för patchklämma experiment är fortfarande utmanande. Denna artikel ger en enkel och snabb metod för isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som därefter möjliggör samtidiga mätningar av både nettomembranström och ströminducerade kalciumtransienter från ett djur. Denna artikel utarbetar ett protokoll för isolering av förmaks- och ventrikulära myocyter härrörande från vilda möss och möss som bär genetiska mutationer. Detta protokoll kan användas för både manliga och kvinnliga möss. Myocytisoleringen, bilderna och representativa resultat som beskrivs nedan erhölls från möss av vildtyp C57Bl/6 vid 6 (± 1) månaders ålder. Ändå har detta protokoll framgångsrikt använts för möss i olika åldrar från 2 till 24 månader med olika genotyper. Figur 1 visar isoleringsinställningen och en närbild av ett kanylerat hjärta under enzymperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Niedersachsens djurgranskningsnämnd (LAVES, AZ-18/2900) och genomfördes i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för djurskydd.
1. Förhandsbestämmelser
- Bered 1 liter 10x perfusionsbuffert (tabell 1), 500 ml 1x perfusionsbuffert (tabell 2), 50 ml rötningsbuffert (tabell 3), 10 ml stoppbuffert (tabell 4), 1 liter Tyrode-lösning (tabell 5), 10 ml av varje kalciumstegslösning (Tyrode-lösning med glukos och respektive mängd kalcium enligt anvisningarna), 1 liter 4-AP-lösning (tabell 5), 100 ml pipettlösning (tabell 6) och 5 ml pluronsyra enligt de medföljande recepten.
OBS: Badlösningar (Tyrode och 4-AP-lösning) kan framställas (utan glukos) i förväg och lagras vid +4 ° C, glukos tillsätts på experimentdagen. Pipettlösningen kan förvaras vid -20 °C, kalciumindikatorn tillsätts på försöksdagen och lösningen lagras sedan på is tills vidare användning. 10x perfusionsbuffert kan förvaras vid rumstemperatur, 1x perfusionsbuffert, matsmältningsbuffert och stoppbuffert bör nyberedas på experimentdagen. - Slå på vattenbadet och rullpumpen.
- Förfyll Langendorff-apparaten med perfusionsbuffert; Se till att den är luftfri.
- Förbered aortakanyl genom att fixera den under dissektionsmikroskopet, anslut med en 1 ml spruta fylld med perfusionsbuffert och klar luft genom att skölja kanylen.
OBS: Det är viktigt att undvika luft inuti perfusionssystemet, eftersom detta direkt påverkar koronar perfusion och därmed matsmältningseffektiviteten. En bubbelfälla kan läggas till i installationen om det behövs för att på ett säkert sätt undvika luftfångst. - Förbered petriskålar med tillräcklig perfusionsbuffert för organuppsamling och mikroskopi (bufferten ska säkert täcka hela organet, några milliliter - beroende på den använda petriskålens storlek - bör räcka).
- Förbered 3 petriskålar med matsmältningsbuffert för vävnadsdissociation och mikroskopi, bufferten ska täcka organet för dissektion under mikroskopet inom respektive petriskål, mängden beror på den använda petriskålstorleken. För dissociationen använd 3 ml för ventrikulär vävnad och 1,5 ml för förmaksvävnad.
2. Organskörd
- Injicera mus med 0,1 ml heparin (1 000 E/ml) i.p. med en 1 ml spruta med en 27 G kanyl och vänta i 5-10 min.
- Placera musen i en induktionskammare tillsammans med en liten vävnad indränkt i cirka 500 μl isofluran. Djuren ska inte vara i kontakt med vävnaden. För att undvika det kan man använda en plastbiopsi-inbäddningskassett för att täcka vävnaden. När djuret är helt bedövat, kontrollera om tånypreflexen är och så snart det inte är närvarande, avliva musen snabbt genom cervikal dislokation.
- Placera musen på en plattform på ryggen (t.ex. på frigolit täckt med en pappershandduk) och fixera tassarna med kanyler för att hålla den på plats.
- Ta bort päls och hud som täcker bröstet och en del av buken med ett tydligt snitt från jugulum mot symfys och öppna buken precis under xiphoid utan att skada någon organstruktur med sax. Lyft bröstbenet med kirurgiska pincett och skär membranet med sax längs revbenskanten, skär sedan revbenen i medial axillär linje och ta bort bröstkorgen för att exponera hjärtat.
- Ta försiktigt bort perikardiet med trubbiga pincett och ta snabbt bort hjärtat genom att lyfta det med trubbiga pincett underifrån och genom att klippa de stora kärlen med ett enda snitt med sax.
- Sätt hjärtat i rumstemperaturperfusionsbuffert och cannulate aortan med en trubbig ändnål under mikroskopet så snabbt som möjligt.
OBS: Ta bort eventuell lungvävnad och fettvävnad som är fäst vid organet utan att förlora för mycket tid på det. När du kanylerar, se till att nålens ände inte sträcker sig genom aortaklaffen, eftersom detta kommer att försämra resultaten genom att förhindra buffertar från att komma in i kranskärlen. - Bind hjärtat med en bit suturerande silke ordentligt till nålen och koppla bort från sprutan.
OBS: Hela proceduren från att få hjärtat (det ögonblick då de stora kärlen skärs) tills suturering av aortan till nålen bör ta så lite tid som möjligt. Det rekommenderas att inte ta längre tid än 90-180 s från att ta bort hjärtat tills perfusion börjar.
3. Enzymatisk matsmältning
- Efter aortakanulering, anslut omedelbart det kanylerade hjärtat till Langendorff-apparaten och undvik att luft kommer in i systemet.
OBS: Det kan hjälpa att ha en hängande droppe perfusionsbuffert längst ner på Langendorff-apparaten samt en droppe perfusionsbuffert som sitter på toppen av nålen för att undvika att luft kommer in i systemet. - Perfusera hjärtat med perfusionsbuffert i 1 min vid en temperatur på exakt 37 °C och en perfusionshastighet på exakt 4 ml/min.
OBS: För att ha en temperatur på 37 °C vid perfusionsnålens spets måste temperaturen i vattenbadet ställas in något över ca 40 °C. Detta bör testas regelbundet genom att mäta temperaturen vid perfusionsspetsen. - Byt perfusion till digestionsbuffert och perfusera i exakt 9 minuter vid en temperatur på exakt 37 °C och en perfusionshastighet på exakt 4 ml/min.
- Överför det smälta hjärtat till en petriskål med tillräckligt med matsmältningsbuffert för att hålla det helt täckt. Dissekera sedan försiktigt atrierna och ventriklerna under mikroskopet.
- Överför förmaken till en petriskål med 1,5 ml matsmältningsbuffert och ventriklarna till en annan petriskål med 3 ml matsmältningsbuffert.
- Förmaksdissektion
- Försiktigt, men utan förlust av tid, dra isär förmaken i små bitar med trubbiga pincett.
- Lös upp vävnaden genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 1 000 μL pipettspets, som tidigare har skurits för att vidga spetsöppningen.
- Överför lösningen till ett 15 ml centrifugrör och tillsätt motsvarande mängd stoppbuffert (1,5 ml) genom att försiktigt pipettera ner vid sidan av röret för att avsluta reaktionen.
- För försiktigt alla 3 ml cell-/vävnadslösningar genom ett 200 μm nylonnät för att avlägsna återstående större vävnadsbitar som inte har smälts fullständigt.
OBS: En lyckad matsmältning lämnar nästan inga fasta bitar.
- Ventrikulär dissektion
- Hacka snabbt den ventrikulära vävnaden i små bitar med dissektionssax och pipett upp och ner för att lösa upp. Använd ytterligare 1 000 μL pipettspets för pipettering upp och ner, den kan förkortas för att bredda öppningen.
- Överför cell/vävnadslösning till ett 15 ml centrifugrör och tillsätt motsvarande mängd stoppbuffert (3 ml) genom att försiktigt pipettera ner vid sidan av röret för att avsluta reaktionen.
- För försiktigt alla 6 ml cell-/vävnadslösning genom ett 200 μm nylonnät för att avlägsna större vävnadsbitar som inte har smälts fullständigt.
OBS: En lyckad matsmältning lämnar nästan inga fasta bitar.
- Lämna båda rören (förmaks- och ventrikulär cellsuspension) på bänken vid rumstemperatur i 6 minuter för att sedimentera.
- Centrifugera båda 15 ml rören vid 5 x g i 2 minuter.
4. Återinförande av kalcium
OBS: Följande steg är identiska för både förmaks- och ventrikulära celler (om inte annat anges) och utförs vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten med en Pasteurpipett av plast och suspendera försiktigt pelleten i 10 ml kalciumfri Tyrode-lösning.
- Lämna cellerna i 8 minuter för sedimentering.
- Centrifugera vid 5 x g i 1 min (endast förmaksceller, sedimentering räcker för ventrikulära celler).
- Kassera supernatanten och suspendera försiktigt pelleten i 10 ml Tyrode-lösning med 100 μM kalciumkoncentration.
- Lämna cellerna i 8 minuter för sedimentering.
- Centrifugera vid 5 x g i 1 min (endast förmaksceller, sedimentering räcker för ventrikulära celler).
- Kassera supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i 10 ml Tyrode-lösning med 400 μM kalciumkoncentration.
- Lämna cellerna i 8 minuter för sedimentering.
- Centrifugera vid 5 x g i 1 min (endast förmaksceller, sedimentering räcker för ventrikulära celler).
- Kassera supernatanten och suspendera försiktigt pelleten igen i 1 ml (förmak)/5 ml (ventrikulär) Tyrodelösning med 1 mM kalciumkoncentration.
5. Laddning av myocyter med fluorescerande kalciumindikator Fluo-3 AM
OBS: På grund av ljuskänsligheten hos den fluorescerande kalciumindikatorn bör följande steg utföras skyddade mot ljus (t.ex. genom att täcka rör med aluminiumfolie).
- Bered stamlösning av Fluo-3 AM genom att tillsätta 44 μl 20 % pluronic F-127 i vattenfri DMSO till 50 μg Fluo-3AM (kan förvaras vid -20 °C skyddad från ljus).
- Tillsätt 10 μl stamlösning av Fluo-3 AM till 1 ml cellsuspension och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus.
- Centrifugera vid 5 x g i 1 min.
- Kassera supernatanten med en plastpasteurpipett och suspendera pelleten i en rimlig mängd badlösning för att få en god arbetskoncentration (1-5 ml badlösning beroende på celldensiteten).
- Låt stå i 30 minuter för avestering innan du börjar med experiment.
6. Samtidiga patchklämmor och epifluorescerande Ca2+-transienta mätningar enligt tidigare beskrivits16
OBS: Patchklämmätningar är inte ämnet för denna artikel, den intresserade läsaren kan hänvisas till större publikationer som ger djupgående beskrivningar av denna metod 17,18,19,20,21,22. För en bättre övergripande förståelse tillhandahålls dock en sammanfattning av ett protokoll för att mäta kalciumströmmar av L-typ tillsammans med ströminducerade kalciumtransienter.
- Överför myocyter till en cellkammare och översmält med badlösning vid 37 °C.
- Blockera kaliumströmmar genom tillsats av 4-aminopyridin och bariumklorid till badlösningen enligt tabell 5.
- Se till att borosilikatmikroelektroder har ett spetsmotstånd på 2-5 MΩ fyllt med pipettlösning (tabell 6).
- Ställ in mätningar för att möjliggöra samtidig inspelning av både elektriska signaler och epifluorescens samtidigt. Spänningsklämläge används för att mäta L-typ Ca2+-ström med ett protokoll som håller cellen vid -80 mV och en 600 ms ramppuls till -40 mV för att inaktivera den snabba Na+-strömmen, följt av en 100 ms testpuls till +10 mV vid 0,5 Hz (figur 2).
- Använd excitation vid 488 nm, utsänt ljus vid <520 nm för att detekteras och konvertera till [Ca2+]I förutsatt att
Där kd = dissociationskonstanten för Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-fluorescens; Fmax = Ca2+-mättad fluorescens erhållen vid slutet av varje experiment19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringsutbytet bestäms efter återinsättning av kalcium genom pipettering av 10 μl cellsuspension på ett objektglas. Mer än 100 livskraftiga, stavformade, icke-kontraherande celler/10 μL för isolering av förmaksceller och mer än 1 000 livskraftiga, stavformade, icke-kontraherande celler/10 μL för ventrikulär cellisolering anses vara tillräckligt utbyte och erhålls vanligen med användning av detta protokoll. Förmaksceller erhållna med detta protokoll visade en mängd olika celltyper innehållande celler i hjärtledningssystemet, särskilt sinusnoden, liksom olika myocyter från höger och vänster förmak samt förmaksbilagorna. Eftersom dessa regioner inte dissekeras separat är olika cellmorfologier resultatet. Alla förmaksceller är små, med cellkapacitanser som sträcker sig från cirka 35 pF-100 pF, vissa är mer filiforma än andra. Figur 3 panel A visar en typisk cell från förmaksarbetande myokardium laddad med kalciumkänsligt färgämne, redo för mätningar erhållna med detta protokoll. Ventrikulära myocyter är mer stavformade och större med cellkapacitanser som sträcker sig från 100 till cirka 400 pF, Figur 3 panel B visar en typisk ventrikulär cell från arbetsmyokardiet laddat med kalciumkänsligt färgämne, redo för mätningar erhållna med detta protokoll. Figur 4 visar representativa exempel på kalciumströmmätningar av L-typ med samtidiga cytosoliska kalciumtransienter från en förmaksmyocyt (panel B och C) och en ventrikulär myocyt (panel E och F).
Figur 1: Langendorff-apparaten. (A) Fotografi av isoleringsinställningen med tanke på den specialdesignade värmeväxlaren och mantlad hjärtkammare. (B) Närbild av mantlad hjärtkammare med kanylerat hjärta på plats. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Stimuleringsprotokoll. Spänningsklämprotokoll (0,5 Hz) som används för att mäta total nettomembranström (IM), främst reflekterande L-typ Ca 2+ ström och Ca 2+ ströminducerad Ca 2+ transient. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Isolerade murina kardiomyocyter. (A) Ett exempel på en förmakskardiomyocyt laddad med Fluo-3, redo för patch-clamp-experiment. (B) Ett exempel på en ventrikulär kardiomyocyt laddad med Fluo-3, redo för patch-clamp-experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa inspelningar. (A) Spänningsklämprotokoll (0,5 Hz). (B) Total nettomembranström (IM), främst reflekterande L-typ Ca2+ ström i en murin förmaksmyocyt. (C) L-typ Ca 2+ strömutlöst Ca2+ övergående i en murin förmaksmyocyt. (D) spänningsklämprotokoll (0,5 Hz). (E) Total nettomembranström (IM), främst reflekterande L-typ Ca2+ ström i en murin ventrikulär myocyt. (F) L-typ Ca 2+ strömutlöst Ca2+ övergående i en murin ventrikulär myocyt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Slutlig koncentration (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na2HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tabell 1: 10x perfusionsbuffert (1 000 ml).
| Slutlig koncentration (mM) | |
| NaHCO3 Annonser | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-Butandionmonoxim | 10 |
| Glukos | 5.5 |
| 10x perfusionsbuffert | 50 ml |
| dubbeldestillerad H 2O (18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tabell 2: 1x perfusionsbuffert (500 ml).
| Slutlig koncentration | |
| Kollagenas typ II | ~600 E/ml |
| CaCl2 | 40 μM |
| 1x perfusionsbuffert | 50 ml |
Tabell 3: Digestionsbuffert (50 ml).
| Slutlig koncentration | |
| Bovint kalvserum | 10% |
| CaCl2 | 12,5 μM |
| 1x perfusionsbuffert | 10 ml |
Tabell 4: Stoppbuffert (10 ml).
| Slutlig koncentration (mM) | ||
| Tyrode | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glukos | 10 | 10 |
| KCl | 4 | 4 |
| MgCl x6H2O | 1 | 1 |
| Probenecid | 2 | 2 |
| 4-aminopyridin | 5 | |
| BaCl2 Annonser | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| pH | 7,35 justerat med 1 M NaOH vid rumstemperatur | 7,35 justerat med 1 M NaOH vid rumstemperatur |
Tabell 5: Badlösningar.
| Slutlig koncentration (mM) | |
| DL-aspartat K+-salt | 92 |
| KCl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosin 5′-trifosfat tris salt | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| pH | 7.20 justerat med 1 M KOH vid rumstemperatur |
Tabell 6: Pipettlösning.
| Problem observerat | Möjlig orsak | Lösning |
| Lågt cellutbyte, vävnadsbitar kvar | Underdigestion | Öka matsmältningstiden i steg om 15 sekunder |
| Lågt cellutbyte, vävnadsbitar kvar | Underdigestion | Öka kollagenasmängden i steg om 50 E/ml |
| blandning av över- och undersmälta celler, vävnadsbitar kvar | Ingen koronar perfusion | Se till att inte sätta in aortakanyl i ventrikeln |
| blandning av över- och undersmälta celler, vävnadsbitar kvar | Luftbubblor | Se till att inte föra in luft i perfusionssystemet |
| Låg total cellkvalitet | Ischemisk tid för lång | Minska ischemisk tid, överväga alternativa metoder för att upprätthålla cirkulationen så länge som möjligt |
Tabell 7: Vanliga problem och hur man löser dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel ger ett enkelt och funktionellt sätt att erhålla högkvalitativa förmaks- och ventrikulära myocyter från samma mus för patch-clamp-studier med samtidiga kalciumövergående inspelningar. Kvaliteten på de erhållna data beror i hög grad på kvaliteten på cellisoleringen. Som nämnts ovan har många metoder för att isolera murina kardiomyocyter beskrivits tidigare 9,10,11,12. De isolerade cellerna används för olika analyser, allt från lappklämsexperiment till kontraktilitetsstudier, morfologiska studier, proteomik, mitokondriell funktionsforskning och många fler. Varje enskilt syfte kräver isolerade celler optimerade på olika sätt. På grund av detta ledde inget av protokollen till högkvalitativa isoleringar lämpliga för patch-clamp-experiment med samtidig mätning av kalciumhanteringsegenskaper hos förmaks- och ventrikulära myocyter från en mus. För att ändra detta resulterade anpassningen av många protokoll som beskrivits tidigare i utvecklingen av detta protokoll. Vissa steg är mekaniskt utmanande, vissa ska göras på ett specifikt sätt och vissa är helt enkelt avgörande för isoleringskvaliteten. Dessa steg kommer att diskuteras nedan.
Utbytet och kvaliteten på cellisoleringen minskar med djurens ålder, möjligen på grund av ökad vävnadsfibros 11,23,24 vilket gör individuella justeringar av matsmältningstid och enzymmängd nödvändiga. Ju äldre ett djur är, desto mer fibrotisk vävnad kan förväntas. De angivna matsmältningstiderna och enzymmängderna är en bra utgångspunkt för normalstora, friska möss vid 6 månaders ålder, men kommer att behöva anpassas till individuella behov. Det föreslås att applicera mer enzym och längre matsmältningstider när man använder äldre möss eller transgena möss som gynnar fibros. Som tidigare arbete har betonat är snabb och luftfri kanylering samt omedelbar perfusion av hjärtat absolut avgörande för god cellkvalitet11. Det rekommenderas att inte ta längre tid än 90-180 sekunder från att få hjärtat och sätta det i rumstemperatur perfusionsbuffert till start av perfusion - ju snabbare, desto bättre. Det är bra att ställa in all nödvändig utrustning i ett rum för att undvika långa avstånd. Om ytterligare förkortning av det ischemiska intervallet önskas är det möjligt att använda en annan metod för narkos och efterföljande eutanaisering. Söva djuret helt enligt beskrivningen ovan, applicera en tillräcklig mängd fentanyl (eller motsvarande smärtstillande läkemedel i enlighet med dina riktlinjer för djurskydd) i.p. och flytta djuret till en plattform med en isofluranförångare och en anestesimask lämplig för möss, vilket ger konstant isofluran och syreflöde. Fortsätt sedan enligt beskrivningen ovan. Eftersom djuret har en normal cirkulation tills de stora kärlen kopplas bort med ett enda snitt, kommer denna metod att minska tiden utan flöde avsevärt och kan därmed förbättra isoleringskvaliteten om det behövs.
Efter skörd av hjärtat är det viktigt att placera aortakanylen på rätt djup för att säkerställa koronar perfusion. Det är därför nödvändigt att skära aortan vid aortabågen eller vid den nedstigande aortan när hjärtat avlägsnas för att lämna minst 5 mm av aortan för kanylering som gör det möjligt att binda den suturerande silkedistalen från kransartärerna men före de första aorta-sidogrenarna.
Under isoleringsprocessen är flera cellöverföringar nödvändiga och pipettering med små pipettspetsar kommer att orsaka hög skjuvspänning på cellerna. Möjliga lösningar för att minska skjuvspänningen är att pipettera långsamt och försiktigt, samt att skära pipettspetsarna med några millimeter i 45° vinkel för att bredda spetsöppningen. Ytterligare minskning av skjuvspänningen kan uppnås genom att smälta de skurna pipettspetsarna för att mjuka upp kanterna. Isoleringsutbytet för den ventrikulära isoleringen är vanligtvis så högt att skjuvspänningsreducering inte är obligatorisk. Beroende på ens individuella mål kan det till och med vara mer användbart att exponera ventrikulära celler för skjuvspänning för att välja de "starkaste" cellerna. Men för förmaksisolering är denna procedur kritisk, eftersom förmaksceller är särskilt sårbara efter matsmältningen. När du lägger till lösningar rekommenderas att du undviker pipettering direkt på cellerna, utan snarare försöker pipettera långsamt vid rörväggen.
Valet av kollagenas kommer att påverka isoleringsresultaten avsevärt. Eftersom det inte bara finns skillnader i enzympreparat utan också en relevant variation från sats till sats i enzymaktivitet, är titrering av kollagenasmängd och matsmältningstid nödvändig när man börjar arbeta med en ny sats enzym eller en ny stam av möss. Den mängd och tid som anges i tabellerna ovan markerar dock en bra utgångspunkt för individuell optimering9. De flesta företag tillhandahåller små enzymprover för att testa enskilda satser, vilket gör batchvalet mycket bekvämare.
Kalciumtransienter med typiska amplituder och normalt monofasiskt sönderfall kan erhållas om celler isoleras utan användning av EGTA25 som tidigare beskrivits av Voigt et al.9,16. Detta protokoll använder därför låga kalciumkoncentrationer och undviker EGTA under isoleringsprocessen. För att skydda cellerna från Ca 2+ paradoxfenomenet26 återinförs kalcium stegvis och långsamt tills en slutlig koncentration på 1 mM. På grund av högre intracellulära natriumkoncentrationer är gnagarkardiomyocyter särskilt benägna att kalciumöverbelastning och långsam och stegvis återintroduktion är avgörande27. Behovet av kalciumfria lösningar utgör en av de största begränsningarna för alla Langendorff-baserade kardiomyocytisoleringar på gnagare. Återintroduktion av kalcium leder alltid till en betydande förlust av livskraftiga celler. Långsam och stegvis återintroduktion som beskrivs här leder dock till tillräcklig avkastning med god kvalitet för att få mätningar från varje djur på ett tillförlitligt sätt.
Det är viktigt att bedöma cellutbyte och kvalitet direkt efter återintroduktion av kalcium. Även om den slutliga utvärderingen sker när man lappar de isolerade cellerna, kan man redan bedöma cellkvantitet och kvalitet genom att titta under mikroskopet innan man laddar celler med kalciumkänsligt färgämne. Celler av god kvalitet är tydligt stavformade, har ett homogent membran och är icke-kontraherande. Kontraktion är ett tecken på låg cellkvalitet eftersom det indikerar en förlust av membranintegritet och kan orsakas av översmältning eller applicering av hög skjuvspänning. Ett annat tecken på övermatsmältning är – förutom många cellskuggor i förhållande till livskraftiga celler – ett alltför snyggt membran som rensats från många ytproteiner och är extremt sårbart när man försöker närma sig cellen med pipettspetsen för tätningsbildning. Exempel på friska celler av god kvalitet visas i figur 3. (Panel A: förmaksmyocyt, Panel B: ventrikulär myocyt). Isolering med höga utbyten kan leda till celler som är immuna mot tätningsbildning och vice versa. I slutändan är det ultimata kvalitetstestet oavsett cellens utseende och avkastning svaret på en enkel fråga: "Är det möjligt att utföra de önskade mätningarna med högkvalitativa resultat i de isolerade cellerna i varje isolering?". Protokollet ovan möjliggör ett positivt svar.
Många isoleringsprotokoll använder frikopplingsmedlet Blebbistatin för att få högre utbyten och celler av bättre kvalitet. Detta protokoll undviker avsiktligt Blebbistatin, med hänsyn till de publicerade bevisen för dess inflytande på hjärtelektrofysiologi28,29 i optiska kartläggningsexperiment. Användning av frikopplingsmedel i elektrofysiologiska studier måste behandlas med försiktighet och bör begränsas till omständigheter där frånkoppling är obligatorisk.
Celler erhållna med detta protokoll kan användas i ungefär sex timmar efter laddning med Fluo-3 med förmaksceller som är mer sårbara för tid. Följaktligen rekommenderas att studera förmaksceller före ventrikulära celler om samma forskare behandlar dem.
En begränsning med detta protokoll - som gäller för de flesta Langendorff-baserade isoleringsprotokoll - är att det är tekniskt svårt. Det är uppenbart att mushjärtan är små, och alla tekniska aspekter kräver mycket träning. Detta innebär att en erfaren forskare kommer att få bättre resultat. Vissa protokoll använder ett konstant tryck för att perfusera hjärtat. Detta har fördelen att perfusionen på grund av matsmältning och på varandra följande förlust av vävnadsresistens kommer att accelerera, och detta hjälper till att definiera den optimala matsmältningstiden, men accelerationen kan skada vävnaden och minska cellkvaliteten avsevärt. I en metod med konstant flöde som används här finns det inga tydliga riktmärken för uppslutningstider och det kan ofta vara svårt att stoppa matsmältningen vid en optimal tidpunkt, vilket markerar en relevant begränsning. En annan begränsning är att isolerade celler i detta protokoll endast testades för lämplighet för de ovan beskrivna experimenten. Det är troligt att dessa celler också kan användas för olika analyser, men detta måste fortfarande bevisas. Ett första steg i den riktningen var användningen av dessa celler för att visualisera åtgärdspotentialer genom att ladda dem med VF2.1CI, ett nyligen härlett spänningskänslighetsfärgämne med överlägsen kinetik till tidigare använda spänningskänsliga färgämnen enligt ett protokoll publicerat av Seibertz et al.30. För att underlätta felsökning visar tabell 7 vanliga isoleringsproblem och hur du närmar dig dem.
Sammantaget erbjuder det beskrivna isoleringsprotokollet ett arbetssätt för samtidig isolering av murina förmaks- och ventrikulära kardiomyocyter, vilket gör det möjligt för forskaren att erhålla en förmaks- och ventrikulär elektrofysiologisk fenotyp av en enda mus. Detta avlägsnar statistiska hinder som orsakas av tidigare isoleringsprotokoll som endast isolerar antingen förmaks- eller ventrikulära celler i hög kvalitet och bidrar till att minska antalet djur som behövs för en specifik studie. Detta kan vara särskilt viktigt om ingrepp som till exempel implantation av osmotiska minipumpar fyllda med dyra medel ingår i experimenten och det kan vara en viktig faktor i djurskyddshänsyn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program i vaskulär medicin (PRIME), MA 2186/14-1 till P. Tomsits och D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 och SFB1002 projekt A13 till N. Voigt), tyska forskningsstiftelsen under Tysklands excellensstrategi (EXC 2067/1- 390729940 till N. Voigt), tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss och N. Voigt; 81Z0600206 till S. Kääb), Coronastiftelsen (S199/10079/2019 till S. Clauss), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss) och Else-Kröner-Fresenius Foundation (EKFS 2016_A20 till N. Voigt). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptberedningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D.
- Schüttler, D., et al.
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
