Summary
Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.
Abstract
Fare modelleri, aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynar ve değiştirilmiş iyon kanalı fonksiyonu ve kalsiyum kullanımı dahil olmak üzere aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak veya kalsiyum işleme anormalliklerini araştırmak için yüksek kalitede atriyal veya ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Bununla birlikte, mevcut izolasyon protokolleri ile elde edilen yüksek kaliteli kardiyomiyositlerin sınırlı verimi, aynı farede her iki ölçüme de izin vermez. Bu makalede, bir hayvandan kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kalpleri elde edilir ve kanı çıkarmak için aort hızla kanüle edilir. Kalpler daha sonra başlangıçta dokuyu intercalated diskler seviyesinde ayrıştırmak için kalsiyumsuz bir çözelti (37 ° C) ve daha sonra hücre dışı matrisi (37 ° C) bozmak için az miktarda kalsiyum içeren bir enzim çözeltisi ile perfüze edilir. Sindirilen kalp daha sonra atriyum ve ventriküllere diseke edilir. Doku örnekleri küçük parçalar halinde doğranır ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme ile çözülür. Enzimatik sindirim durdurulur ve hücreler fizyolojik kalsiyum konsantrasyonlarına kademeli olarak yeniden verilir. Bir floresan Ca2 + göstergesi ile yüklendikten sonra, kalsiyum akımlarının ve geçicilerinin eşzamanlı ölçümü için izole kardiyomiyositler hazırlanır. Ek olarak, izolasyon tuzakları tartışılmış ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilmiş atriyal ve ventriküler murin miyositlerinde eşzamanlı kalsiyum geçici ölçümleri ile yama-kelepçe protokolleri ve L-tipi kalsiyum akımlarının temsili izleri sağlanmıştır.
Introduction
Kardiyak aritmiler yaygındır ve dünya çapında milyonlarca insanı etkilediği için mevcut en büyük sağlık sorunlarından biridir. Aritmiler yüksek morbidite ve mortaliteile ilişkilidir 1,2 ve ani kardiyak ölümlerin çoğunun altında yatan nedeni oluşturur3. Güncel tedavi seçenekleri hasta sağkalımını iyileştirmiştir, ancak yine de altta yatan mekanizmaları hedeflemek yerine esas olarak semptomatik tedavilerdir. Bu nedenle, bu tedavilerin etkinliği sınırlıdır ve sıklıkla ciddi yan etkilere neden olabilir 4,5,6. Mevcut tedavi seçeneklerinin iyileştirilmesi, altta yatan patofizyolojinin anlaşılmasını gerektirmekte ve çalışmak için uygun modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Küçük hayvan modelleri - ve özellikle fare modelleri - aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır, çünkü aritmogenezin temel mekanizmalarını, örneğin hücresel elektrofizyoloji, iyon kanalı fonksiyonu veya kalsiyum işleme üzerindeki genetik etkiyi incelemeye izin verirler7,8.
Bu amaçla, yeterli miktarda ve canlılıkta izole atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Atriyal ve ventriküler miyositleri elde etmek için farklı izolasyon yaklaşımlarının geniş bir spektrumu daha önce 9,10,11,12,13 olarak tanımlanmıştır ve bazı gruplar atriyal 14 veya ventriküler15'ten L-tipi akım ve kalsiyum akımına bağlı kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerinden elde edilen verileri sunmuştur murin kardiyomiyositler. Bununla birlikte, en iyi bildiğimiz kadarıyla, bir hayvandan elde edilen atriyal ve ventriküler ölçümler hakkında hiçbir veri yoktur. Araştırmacılar, elektrofizyolojiden proteomiklere, hücre kontraktilitesi veya protein etkileşimleri, mitokondriyal fonksiyon veya genetik gibi fonksiyonel çalışmalara kadar çok çeşitli konulara odaklanmaktadır - hepsi izole kardiyomiyositlere ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle yayınlanan protokollerin birçoğu yama kelepçesi çalışmaları için özel olarak geliştirilmemiştir, bu da yama kelepçesi çalışmaları için sınırlı verime ve yetersiz hücre kalitesine yol açmaktadır. Bu nedenle, bir hayvandan izole edilen atriyal ve ventriküler hücrelerin eşzamanlı yama kelepçesi ve kalsiyum geçici ölçümleri, belirlenmiş protokollerle gerçekleştirilemez.
Yama kelepçesi deneyleri için murin - özellikle atriyal - miyositlerin izolasyonu zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için basit ve hızlı bir yöntem sunmaktadır, bu da daha sonra bir hayvandan hem net membran akımının hem de akımın neden olduğu kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerine izin vermektedir. Bu makalede, vahşi tip farelerden ve genetik mutasyonlar taşıyan farelerden türetilen atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için bir protokol detaylandırılmıştır. Bu protokol hem erkek hem de dişi fareler için kullanılabilir. Aşağıda tarif edilen miyosit izolasyonu, görüntüler ve temsili sonuçlar, 6 (± 1) aylıkken vahşi tip C57Bl / 6 farelerden elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, farklı genotiplere sahip 2 ila 24 ay arasında değişen çeşitli yaşlardaki fareler için başarıyla kullanılmıştır. Şekil 1 , enzim perfüzyonu sırasında kanüle olmuş bir kalbin izolasyon kurulumunu ve yakın çekimini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Aşağı Saksonya Hayvan İnceleme Kurulu (LAVES, AZ-18/2900) tarafından onaylanmıştır ve hayvan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Ön düzenlemeler
- 1 L 10x perfüzyon tamponu (Tablo 1), 500 mL 1x perfüzyon tamponu (Tablo 2), 50 mL sindirim tamponu (Tablo 3), 10 mL durdurma tamponu (Tablo 4), 1 L Tiroid çözeltisi (Tablo 5), her kalsiyum adım çözeltisinin 10 mL'si (glikozlu tiroid çözeltisi ve belirtildiği gibi ilgili kalsiyum miktarı), Verilen tariflere göre 1 L 4-AP çözeltisi (Tablo 5), 100 mL pipet çözeltisi (Tablo 6) ve 5 mL pluronik asit.
NOT: Banyo çözeltileri (Tirod ve 4-AP çözeltisi) önceden (glikozsuz) hazırlanabilir ve +4 ° C'de saklanabilir, deney gününde glikoz eklenir. Pipet çözeltisi -20 ° C'de saklanabilir, deney gününde kalsiyum göstergesi eklenir ve çözelti daha sonra bir sonraki kullanıma kadar buz üzerinde saklanır. 10x perfüzyon tamponu oda sıcaklığında saklanabilir, 1x perfüzyon tamponu, sindirim tamponu ve durdurma tamponu deney gününde taze olarak hazırlanmalıdır. - Su banyosunu ve silindir pompasını açın.
- Langendorff aparatını perfüzyon tamponu ile önceden doldurun; Havasız olduğundan emin olun.
- Diseksiyon mikroskobu altında sabitleyerek aort kanülü hazırlayın, perfüzyon tamponu ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga ile bağlayın ve kanülü durulayarak havayı temizleyin.
NOT: Perfüzyon sistemi içindeki herhangi bir havadan kaçınmak çok önemlidir, çünkü bu koroner perfüzyonu ve dolayısıyla sindirim etkinliğini doğrudan etkileyecektir. Herhangi bir hava sıkışmasını güvenli bir şekilde önlemek için gerekirse kuruluma bir kabarcık tuzağı eklenebilir. - Petri kaplarını organ toplama ve mikroskopi için yeterli perfüzyon tamponu ile hazırlayın (tampon tüm organı güvenli bir şekilde örtmeli, kullanılan Petri kabının boyutuna bağlı olarak birkaç mililitre yeterli olmalıdır).
- Doku ayrışması ve mikroskopi için sindirim tamponu ile 3 Petri kabı hazırlayın, tampon ilgili Petri kabı içindeki mikroskop altında diseksiyon için organı kapsamalıdır, miktar kullanılan Petri kabının boyutuna bağlıdır. Dissosiyasyon için ventriküler doku için 3 mL ve atriyal doku için 1.5 mL kullanın.
2. Organ hasadı
- Fareye 0,1 mL heparin (1.000 U/mL) enjekte edin, yani 27 G kanüllü 1 mL şırınga kullanın ve 5-10 dakika bekleyin.
- Fareyi yaklaşık 500 μL izofluran içine batırılmış küçük bir doku ile birlikte bir indüksiyon odasına yerleştirin. Hayvan doku ile temas halinde olmamalıdır. Bunu önlemek için, dokuyu örtmek için plastik bir biyopsi gömme kaseti kullanılabilir. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, ayak parmağı sıkışma refleksini kontrol edin ve artık mevcut olmadığı anda, fareyi servikal çıkıkla hızlı bir şekilde ötenazi yapın.
- Fareyi sırtındaki bir platforma yerleştirin (örneğin, kağıt havluyla kaplı strafor üzerine) ve yerinde tutmak için pençeleri kanüllerle sabitleyin.
- Göğsü ve karnın bir kısmını kaplayan kürk ve deriyi, jugulumdan simfize doğru net bir kesikle çıkarın ve makas kullanarak herhangi bir organ yapısına zarar vermeden karnı ksifoidin hemen altında açın. Sternumu cerrahi forseps ile kaldırın ve diyaframı kaburgaların kenarı boyunca makasla kesin, ardından kaburgaları medial aksiller çizgide kesin ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın.
- Perikardın künt forseps kullanarak dikkatlice çıkarılması ve kalbin aşağıdan künt forseps ile kaldırarak ve büyük damarları makas kullanarak tek bir kesimle keserek kalbi hızlı bir şekilde çıkarın.
- Kalbi oda sıcaklığında perfüzyon tamponuna koyun ve aortu mikroskop altında künt bir uç iğne ile mümkün olduğunca çabuk kanüle edin.
NOT: Organa bağlı akciğer dokusunu ve yağ dokusunu üzerinde fazla zaman kaybetmeden çıkarın. Kanülasyon yaparken, iğnenin ucunun aort kapağı boyunca uzanmadığından emin olun, çünkü bu, tamponların koroner arterlere girmesini önleyerek sonuçları bozacaktır. - Kalbi iğneye sıkıca dikiş ipeği parçası ile bağlayın ve şırıngadan ayırın.
NOT: Kalbin elde edilmesinden (büyük damarların kesildiği an) aortun iğneye dikilmesine kadar tüm prosedür mümkün olduğunca az zaman almalıdır. Perfüzyonun başlamasına kadar kalbin çıkarılmasından 90-180 s'den daha uzun sürmemesi önerilir.
3. Enzimatik sindirim
- Aort kanülasyonundan sonra, kanüllenmiş kalbi derhal Langendorff cihazına bağlayın ve sisteme herhangi bir hava girmesini önleyin.
NOT: Langendorff cihazının alt kısmında asılı bir damla perfüzyon tamponunun yanı sıra sisteme herhangi bir hava girmesini önlemek için iğnenin üstüne oturan bir damla perfüzyon tamponu olması yardımcı olabilir. - Kalbi tam olarak 37 ° C sıcaklıkta ve tam olarak 4 mL / dak perfüzyon hızında 1 dakika perfüzyon tamponu ile perfüze edin.
NOT: Perfüzyon iğnesinin ucunda 37 °C sıcaklığa sahip olmak için, su banyosu sıcaklığının yaklaşık 40 °C'de biraz üzerine ayarlanması gerekir. Bu, perfüzyon ucundaki sıcaklık ölçülerek düzenli olarak test edilmelidir. - Perfüzyonu sindirim tamponuna geçirin ve tam olarak 37 ° C sıcaklıkta ve tam olarak 4 mL / dak perfüzyon hızında tam 9 dakika perfüzyon yapın.
- Sindirilmiş kalbi, tamamen kapalı tutmak için yeterli sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın. Daha sonra atriyum ve ventrikülleri mikroskop altında dikkatlice inceleyin.
- Atriyumu 1,5 mL sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına ve ventrikülleri 3 mL sindirim tamponuna sahip başka bir Petri kabına aktarın.
- Atriyal diseksiyon
- Dikkatlice, ancak zaman kaybı olmadan, atriyumu künt forseps kullanarak küçük parçalara ayırın.
- Daha önce uç açıklığını genişletmek için kesilmiş olan 1.000 μL pipet ucunu kullanarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu çözün.
- Çözeltiyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve reaksiyonu sonlandırmak için tüpün yan tarafına dikkatlice pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu (1,5 mL) ekleyin.
- Tamamen sindirilmemiş kalan daha büyük doku parçalarını çıkarmak için 3 mL'lik hücre/doku solüsyonunun tümünü 200 μm'lik bir naylon ağdan dikkatlice geçirin.
NOT: Başarılı bir sindirim neredeyse hiç katı parça bırakmaz.
- Ventriküler diseksiyon
- Diseksiyon makası ve pipet kullanarak ventrikül dokusunu hızlı bir şekilde küçük parçalara ayırın ve çözünmesi için yukarı ve aşağı çekin. Yukarı ve aşağı pipetleme için başka bir 1.000 μL pipet ucu kullanın, açıklığı genişletmek için kısaltılabilir.
- Hücreyi/doku solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve reaksiyonu sonlandırmak için tüpün yan tarafına dikkatlice pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu (3 mL) ekleyin.
- Tamamen sindirilmemiş daha büyük doku parçalarını çıkarmak için 6 mL'lik hücre/doku solüsyonunun tamamını 200 μm'lik bir naylon ağdan dikkatlice geçirin.
NOT: Başarılı bir sindirim neredeyse hiç katı parça bırakmaz.
- Her iki tüpü de (atriyal ve ventriküler hücre süspansiyonu) yerleşmesi için 6 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgahta bırakın.
- Her iki 15 mL tüpü de 5 x g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
4. Kalsiyumun yeniden tanıtılması
NOT: Aşağıdaki adımlar hem atriyal hem de ventriküler hücreler için aynıdır (aksi belirtilmedikçe) ve oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- Süpernatantı plastik bir Pasteur pipet kullanarak atın ve peleti 10 mL kalsiyumsuz Tirod çözeltisi içinde dikkatlice askıya alın.
- Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.
- 1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).
- Süpernatantı atın ve peleti 100 μM kalsiyum konsantrasyonuna sahip 10 mL Tyrode çözeltisinde dikkatlice askıya alın.
- Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.
- 1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).
- Süpernatantı atın ve peleti 400 μM kalsiyum konsantrasyonuna sahip 10 mL Tyrode çözeltisinde dikkatlice askıya alın.
- Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.
- 1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).
- Süpernatantı atın ve peleti 1 mM kalsiyum konsantrasyonu ile 1 mL (atriyal) / 5 mL (ventriküler) Tiroid çözeltisi içinde dikkatlice askıya alın.
5. Miyositlerin floresan kalsiyum göstergesi Fluo-3 ile yüklenmesi
NOT: Floresan kalsiyum göstergesinin ışığa duyarlılığı nedeniyle, aşağıdaki adımlar ışıktan korunarak gerçekleştirilmelidir (örneğin, tüpleri alüminyum folyo ile kaplayarak).
- 50 μg Fluo-3AM'ye susuz DMSO'da 44 μL% 20 pluronik F-127 ekleyerek Fluo-3 stok çözeltisini hazırlayın (ışıktan korunan -20 ° C'de saklanabilir).
- 1 mL hücre süspansiyonuna 10 μL Fluo-3 stok çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı plastik bir Pasteur pipeti kullanarak atın ve iyi bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için peletleri makul miktarda banyo çözeltisi içinde yeniden askıya alın (hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1-5 mL banyo çözeltisi).
- Deneylere başlamadan önce estersizleştirme için 30 dakika bekletin.
6. Daha önce tarif edildiği gibi eşzamanlı yama-kelepçe ve epifloresan Ca2+-geçici ölçümler16
NOT: Yama kelepçesi ölçümleri bu makalenin konusu değildir, ilgilenen okuyucu bu yöntemin derinlemesine açıklamalarını sağlayan başlıca yayınlara yönlendirilebilir 17,18,19,20,21,22. Bununla birlikte, daha iyi bir genel anlayış için, akımın neden olduğu kalsiyum geçicileri ile birlikte L-tipi kalsiyum akımlarını ölçmek için bir protokol hakkında bir özet verilmiştir.
- Miyositleri bir hücre odasına aktarın ve 37 ° C'de banyo çözeltisi ile süper kaynaştırın.
- Tablo 5'te gösterildiği gibi banyo çözeltisine 4-aminopiridin ve baryum klorür ekleyerek potasyum akımlarını bloke edin.
- Borosilikat mikroelektrotlarının pipet çözeltisi ile doldurulmuş 2-5 MΩ'luk bir uç direncine sahip olduğundan emin olun (Tablo 6).
- Hem elektrik sinyallerinin hem de epifloresanlığın aynı anda kaydedilmesini sağlamak için ölçümleri ayarlayın. Gerilim kelepçesi modu, hücreyi -80 mV'de tutan bir protokol ve hızlı Na + -akımını devre dışı bırakmak için 600 ms rampa darbesini -40 mV'a kadar tutan bir protokolle L tipi Ca 2+ akımını ölçmek için kullanılır, ardından 0,5 Hz'de +10 mV'ye 100 ms test darbesi uygulanır (Şekil 2).
- 488 nm'de uyarma kullanın, <520 nm'de yayılan ışığı algılayın ve [Ca2+]I'ye dönüştürün
Burada kd = Fluo-3'ün (864 nM) ayrışma sabiti, F = Fluo-3 floresansı; Fmax = Her deneyin sonunda elde edilenCa 2+-doymuş floresan19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzolasyon verimi, kalsiyumun yeniden verilmesinden sonra, 10 μL hücre süspansiyonunun bir mikroskop slaydına pipetlenmesiyle belirlenir. Atriyal hücre izolasyonu için 100'den fazla canlı, çubuk şeklinde, büzülmeyen hücre / 10 μL ve ventriküler hücre izolasyonu için 1.000'den fazla canlı, çubuk şeklinde, büzülmeyen hücre / 10 μL yeterli verim olarak kabul edilir ve genellikle bu protokol kullanılarak elde edilir. Bu protokol ile elde edilen atriyal hücreler, başta sinüs düğümü olmak üzere kardiyak iletim sistemi hücrelerinin yanı sıra sağ ve sol atriyumdan farklı miyositlerin yanı sıra atriyal ekleri içeren çeşitli farklı hücre tipleri göstermiştir. Bu bölgeler ayrı ayrı diseke edilmediğinden, çeşitli hücre morfolojileri ortaya çıkar. Tüm atriyal hücreler küçüktür, hücre kapasitansları yaklaşık 35 pF – 100 pF arasında değişir, bazıları diğerlerinden daha filiformdur. Şekil 3 panel A, kalsiyuma duyarlı boya yüklü atriyal çalışan miyokarddan tipik bir hücreyi göstermektedir ve bu protokolle elde edilen ölçümlere hazırdır. Ventriküler miyositler, 100 ila yaklaşık 400 pF arasında değişen hücre kapasitansları ile daha çubuk şeklinde ve daha büyüktür, Şekil 3 panel B, kalsiyuma duyarlı boya ile yüklü çalışan miyokarddan tipik bir ventriküler hücreyi göstermektedir ve bu protokolle elde edilen ölçümlere hazırdır. Şekil 4 , bir atriyal miyositten (panel B ve C) ve bir ventriküler miyositten (panel E ve F) eşzamanlı sitozolik kalsiyum geçicileri ile L-tipi kalsiyum akımı ölçümlerinin temsili örneklerini göstermektedir.
Resim 1: Langendorff cihazı. (A) Özel tasarlanmış ısı eşanjörü ve ceketli kalp haznesi manzaralı izolasyon kurulumunun fotoğrafı. (B) Ceketli kalp odasının kanüllü kalp yerinde olacak şekilde yakın çekimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stimülasyon protokolü. Toplam net membran akımını (IM) ölçmek için kullanılan voltaj-kelepçe protokolü (0,5 Hz), ağırlıklı olarak L tipi Ca 2+ akımını ve Ca2 + akımı kaynaklı Ca2+ geçici olarak yansıtır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole murin kardiyomiyositler. (A) Fluo-3 yüklü bir atriyal kardiyomiyosit örneği, yama-kelepçe deneyleri için hazır. (B) Yama-kelepçe deneylerine hazır, Fluo-3 yüklü bir ventriküler kardiyomiyosit örneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili kayıtlar. (A) Voltaj kelepçesi protokolü (0,5 Hz). (B) Toplam net membran akımı (IM), ağırlıklı olarak bir murin atriyal miyositte L-tipiCa2+ akımını yansıtır. (C) L-tipi Ca2+ akımı, bir murin atriyal miyositte geçici olarak Ca2 + 'yı tetikledi. (D) voltaj kelepçesi protokolü (0,5 Hz). (E) Toplam net membran akımı (IM), ağırlıklı olarak bir murin ventriküler miyositte L-tipi Ca2+ akımını yansıtır. (F) L-tipiCa2 + akımı, bir murin ventriküler miyositte geçici olarak Ca2+ tetikledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Son konsantrasyon (mM) | |
| Arjantin | 120.4 |
| Kartal | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tablo 1: 10x perfüzyon tamponu (1.000 mL).
| Son konsantrasyon (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-Bütandion monoksitim | 10 |
| Glikoz | 5.5 |
| 10x perfüzyon tamponu | 50 ml |
| çift damıtılmışH 2 O (18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tablo 2: 1x perfüzyon tamponu (500 mL).
| Son konsantrasyon | |
| Kollajenaz Tip II | ~600 U/ml |
| CaCl2 | 40 μM |
| 1x perfüzyon tamponu | 50 ml |
Tablo 3: Sindirim tamponu (50 mL).
| Son konsantrasyon | |
| Sığır Buzağı Serumu | 10% |
| CaCl2 | 12,5 μM |
| 1x perfüzyon tamponu | 10 ml |
Tablo 4: Durdurma arabelleği (10 mL).
| Son konsantrasyon (mM) | ||
| Tirod | 4-AP | |
| Arjantin | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glikoz | 10 | 10 |
| Kartal | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| Probenecid | 2 | 2 |
| 4-Aminopiridin | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| Ph | Oda sıcaklığında 1 M NaOH ile ayarlanan 7,35 | Oda sıcaklığında 1 M NaOH ile ayarlanan 7,35 |
Tablo 5: Banyo çözeltileri.
| Son konsantrasyon (mM) | |
| DL-aspartat K+-tuz | 92 |
| Kartal | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosin 5′-trifosfat tris tuzu | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| Ph | 7,20 oda sıcaklığında 1 M KOH ile ayarlanır |
Tablo 6: Pipet çözeltisi.
| Gözlenen sorun | Olası neden | Çözüm |
| Düşük hücre verimi, doku parçaları kaldı | Hazımsızlık | 15 saniyelik artışlarla sindirim süresini artırın |
| Düşük hücre verimi, doku parçaları kaldı | Hazımsızlık | Kollajenaz miktarını 50 U/ml adımlarla artırın |
| aşırı ve az sindirilmiş hücrelerin karışımı, doku parçaları kaldı | Koroner perfüzyon yok | Aort kanülünü ventriküle sokmadığınızdan emin olun |
| aşırı ve az sindirilmiş hücrelerin karışımı, doku parçaları kaldı | Hava kabarcıkları | Perfüzyon sistemine hava sokmadığınızdan emin olun |
| Düşük genel hücre kalitesi | İskemik zaman çok uzun | İskemik zamanı azaltın, dolaşımı mümkün olduğunca uzun süre korumak için alternatif yöntemler düşünün |
Tablo 7: Sık karşılaşılan sorunlar ve bunların nasıl çözüleceği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, eşzamanlı kalsiyum geçici kayıtları ile yama-kelepçe çalışmaları için aynı fareden yüksek kaliteli atriyal ve ventriküler miyositler elde etmenin kolay ve işlevsel bir yolunu sunmaktadır. Elde edilen verilerin kalitesi büyük ölçüde hücre izolasyonunun kalitesine bağlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, murin kardiyomiyositlerini izole etmek için birçok yöntem daha önce 9,10,11,12 olarak tanımlanmıştır. İzole edilen hücreler, yama kelepçesi deneylerinden kontraktilite çalışmalarına, morfolojik çalışmalara, proteomiklere, mitokondriyal fonksiyon araştırmalarına ve daha pek çok şeye kadar çeşitli analizler için kullanılır. Her bir amaç, farklı şekilde optimize edilmiş izole hücreler gerektirir. Bu nedenle, protokollerin hiçbiri, bir fareden atriyal ve ventriküler miyositlerin kalsiyum taşıma özelliklerinin eşzamanlı ölçümü ile yama-kelepçe deneyleri için uygun yüksek kaliteli izolasyonlara yol açmamıştır. Bunu değiştirmek için, daha önce açıklanan çok sayıda protokolün uyarlanması, bu protokolün geliştirilmesine neden oldu. Bazı adımlar mekanik olarak zordur, bazıları belirli bir şekilde yapılmalıdır ve bazıları izolasyon kalitesi için çok önemlidir. Bu adımlar aşağıda tartışılacaktır.
Hücre izolasyonunun verimi ve kalitesi, muhtemelen artmış doku fibrozisi 11,23,24 nedeniyle hayvan yaşı ile azalır, bu da sindirim süresi ve enzim miktarının bireysel olarak ayarlanmasını gerekli kılar. Bir hayvan ne kadar yaşlıysa, o kadar fazla fibrotik doku beklenir. Belirtilen sindirim süreleri ve enzim miktarları, 6 aylıkken normal büyüklükte, sağlıklı fareler için iyi bir başlangıç noktasıdır, ancak bireysel ihtiyaçlara uyum sağlaması gerekecektir. Fibrozu destekleyen yaşlı fareler veya transgenik fareler kullanılırken daha fazla enzim ve daha uzun sindirim süreleri uygulanması önerilmektedir. Önceki çalışmaların vurguladığı gibi, hızlı ve havasız kanülasyon ve kalbin derhal perfüzyonu, iyi hücre kalitesi için kesinlikle kritik öneme sahiptir11. Perfüzyonun başlaması için kalbin elde edilmesinden ve oda sıcaklığında perfüzyon tamponuna konulmasından itibaren 90-180 saniyeden uzun sürmemesi önerilir – ne kadar hızlıysa, o kadar iyidir. Uzun mesafelerden kaçınmak için gerekli tüm ekipmanı tek bir odada kurmak yararlı olacaktır. İskemik aralığın daha da kısaltılması istenirse, başka bir narkoz yöntemi ve ardından ötenazi kullanmak mümkündür. Yukarıda tarif edildiği gibi hayvanı tamamen uyuşturun, yeterli miktarda fentanil (veya hayvan refahı yönergelerinize uygun olarak eşdeğer bir analjezik ilaç) uygulayın ve hayvanı, sürekli izofluran ve oksijen akışı sağlayan, fareler için uygun bir izofluran buharlaştırıcı ve anestezi maskesi içeren bir platforma taşıyın. Daha sonra yukarıda açıklandığı gibi devam edin. Büyük damarlar tek bir kesimle bağlantısı kesilene kadar hayvan normal bir dolaşıma sahip olduğundan, bu yöntem akışsızlık süresini önemli ölçüde azaltacak ve böylece gerekirse izolasyon kalitesini artırabilir.
Kalbi topladıktan sonra, koroner perfüzyonu güvence altına almak için aort kanülünü doğru derinliğe yerleştirmek çok önemlidir. Bu nedenle, kalbi çıkarırken aortun aort arkında veya inen aortta kesilmesi, kanülasyon için aortun en az 5 mm'sini bırakmak, dikiş ipek distalini koroner arterlerden ancak ilk aort yan dallarından önce bağlamak için gereklidir.
İzolasyon işlemi sırasında birden fazla hücre transferi gereklidir ve küçük pipet uçlarıyla pipetleme hücrelerde yüksek kayma stresine neden olur. Kesme gerilimini azaltmak için olası çözümler, yavaş ve dikkatli bir şekilde pipetlemenin yanı sıra uç açıklığını genişletmek için pipet uçlarını 45° açıyla birkaç milimetre kesmektir. Kesme geriliminin daha da azaltılması, kenarları yumuşatmak için kesilmiş pipet uçlarının eritilmesiyle sağlanabilir. Ventriküler izolasyonun izolasyon verimi genellikle o kadar yüksektir ki, kayma stresinin azaltılması zorunlu değildir. Kişinin bireysel hedefine bağlı olarak, 'en uygun' hücreleri seçmek için ventriküler hücreleri kesme stresine maruz bırakmak daha da yararlı olabilir. Bununla birlikte, atriyal izolasyon için bu prosedür kritiktir, çünkü atriyal hücreler sindirimden sonra özellikle savunmasızdır. Çözelti eklerken, doğrudan hücrelere pipetlemeden kaçınmanız, bunun yerine tüp duvarında yavaşça pipetlemeye çalışmanız önerilir.
Kollajenaz seçimi, izolasyon sonuçlarını önemli ölçüde etkileyecektir. Sadece enzim preparatlarında farklılıklar değil, aynı zamanda enzim aktivitesinde ilgili partiden partiye varyasyon olduğundan, yeni bir enzim grubu veya yeni bir fare suşu ile çalışmaya başlarken kollajenaz miktarının ve sindirim süresinin titrasyonu gereklidir. Bununla birlikte, yukarıdaki tablolarda belirtilen miktar ve süre, bireysel optimizasyon 9 için iyi bir başlangıçnoktasıdır. Çoğu şirket, bireysel partileri test etmek için küçük enzim numuneleri sağlar, bu da parti seçimini çok daha kolay hale getirir.
Tipik genliklere ve normal monofazik bozunmaya sahip kalsiyum geçicileri, hücreler Voigt ve ark.9,16 tarafından daha önce tarif edildiği gibi EGTA25 kullanılmadan izole edilirse elde edilebilir. Bu nedenle, bu protokol düşük kalsiyum konsantrasyonları kullanır ve izolasyon işlemi sırasında EGTA'yı önler. HücreleriCa2 + paradoks fenomeni26'dan korumak için, kalsiyum 1 mM'lik son bir konsantrasyona kadar kademeli ve yavaş bir şekilde yeniden verilir. Daha yüksek hücre içi sodyum konsantrasyonları nedeniyle, kemirgen kardiyomiyositleri özellikle kalsiyum aşırı yüküne eğilimlidir ve yavaş ve kademeli olarak yeniden giriş çok önemlidir27. Kalsiyumsuz çözeltilere duyulan ihtiyaç, Langendorff bazlı tüm kemirgen kardiyomiyosit izolasyonlarının en büyük sınırlamalarından birini temsil eder. Kalsiyumun yeniden sokulması her zaman önemli miktarda canlı hücre kaybına yol açar. Bununla birlikte, burada açıklandığı gibi yavaş ve kademeli olarak yeniden giriş, her hayvandan güvenilir bir şekilde ölçüm elde etmek için iyi kalitede yeterli verime yol açar.
Kalsiyumun yeniden verilmesinden hemen sonra hücre verimini ve kalitesini değerlendirmek önemlidir. Her ne kadar son değerlendirme izole edilmiş hücrelere yama yapılırken yapılsa da, hücrelere kalsiyuma duyarlı boya yüklemeden önce mikroskop altına bakarak hücre miktarını ve kalitesini zaten yargılayabilirsiniz. Kaliteli hücreler açıkça çubuk şeklindedir, homojen bir zara sahiptir ve büzülmez. Kasılma, membran bütünlüğünün kaybını gösterdiği için düşük hücre kalitesinin bir işaretidir ve aşırı sindirimden veya yüksek kesme stresinin uygulanmasından kaynaklanabilir. Aşırı hazımsızlığın bir başka işareti de – canlı hücrelerle ilgili birçok hücre gölgesinin yanı sıra – birçok yüzey proteininden temizlenmiş ve mühür oluşumu için pipet ucu ile hücreye yaklaşmaya çalıştığında son derece savunmasız olan aşırı hoş görünümlü bir zardır. Örnek sağlıklı, kaliteli hücreler Şekil 3'te gösterilmiştir. (Panel A: atriyal miyosit, Panel B: ventriküler miyosit). Yüksek verime sahip izolasyonlar, mühür oluşumuna karşı bağışıklık kazanmış hücrelere yol açabilir ve bunun tersi de geçerlidir. Sonuçta, hücre görünümü ve verimi ne olursa olsun, nihai kalite testi, basit bir sorunun cevabıdır: 'Her izolasyonun izole edilmiş hücrelerinde istenen ölçümleri yüksek kaliteli sonuçlarla gerçekleştirmek mümkün müdür?'. Yukarıda verilen protokol olumlu bir cevabı mümkün kılmaktadır.
Birçok izolasyon protokolü, daha yüksek verim ve daha kaliteli hücreler elde etmek için ayırma maddesi Blebbistatin'i kullanır. Bu protokol, optik haritalama deneylerinde kardiyak elektrofizyoloji28,29 üzerindeki etkisinin yayınlanmış kanıtlarını dikkate alarak bilerek Blebbistatin'den kaçınmaktadır. Elektrofizyolojik çalışmalarda ayrıştırıcı ajanların kullanımı dikkatli bir şekilde ele alınmalı ve ayırmanın zorunlu olduğu durumlarla sınırlandırılmalıdır.
Bu protokolle elde edilen hücreler, atriyal hücrelerin zamana karşı daha savunmasız olduğu Fluo-3 ile yüklendikten sonra yaklaşık altı saat boyunca kullanılabilir. Sonuç olarak, aynı araştırmacı onları işlerse, ventriküler hücrelerden önce atriyal hücrelerin incelenmesi önerilir.
Bu protokolün bir sınırlaması - Langendorff tabanlı izolasyon protokollerinin çoğu için geçerli olduğu gibi - teknik olarak zor olmasıdır. Açıkçası, fare kalpleri küçüktür ve tüm teknik yönler çok fazla egzersiz gerektirir. Bu, deneyimli bir araştırmacının daha iyi sonuçlar elde edeceği anlamına gelir. Bazı protokoller kalbi perfüze etmek için sabit bir basınç kullanır. Bu, sindirim ve ardışık doku direnci kaybı nedeniyle perfüzyonun hızlanması avantajına sahiptir ve bu, optimal sindirim süresini tanımlamaya yardımcı olur, ancak hızlanma dokuya zarar verebilir ve hücre kalitesini önemli ölçüde azaltabilir. Burada kullanıldığı gibi sabit bir akış yaklaşımında, sindirim süreleri için net bir kriter yoktur ve sindirimi en uygun zamanda durdurmak genellikle zor olabilir, bu da ilgili bir sınırlamayı işaret eder. Diğer bir sınırlama, bu protokolde izole edilmiş hücrelerin sadece yukarıda açıklanan deneylere uygunluk açısından test edilmiş olmasıdır. Bu hücrelerin farklı analizler için de kullanılabilmesi muhtemeldir, ancak bunun hala kanıtlanması gerekir. Bu yöne doğru atılan ilk adım, bu hücrelerin, Seibertz ve ark.30 tarafından yayınlanan bir protokole göre, daha önce kullanılan voltaja duyarlı boyalara üstün kinetiği olan VF2.1CI ile yükleyerek aksiyon potansiyellerini görselleştirmek için kullanılmasıydı. Sorun gidermeye yardımcı olmak için, Tablo 7'de sık karşılaşılan yalıtım sorunları ve bunlara nasıl yaklaşılacağı gösterilmektedir.
Birlikte ele alındığında, açıklanan izolasyon protokolü, murin atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerin eşzamanlı izolasyonuna yönelik bir çalışma yaklaşımı sunarak, araştırmacının tek bir farenin atriyal ve ventriküler elektrofizyolojik fenotipini elde etmesini sağlar. Bu, sadece atriyal veya ventriküler hücreleri yüksek kalitede izole eden önceki izolasyon protokollerinin oluşturduğu istatistiksel engelleri ortadan kaldırır ve belirli bir çalışma için gereken hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur. Bu, örneğin pahalı ajanlarla doldurulmuş ozmotik mini pompaların implantasyonu gibi müdahaleler deneylerin bir parçasıysa ve hayvan refahı hususlarında hayati bir faktör olabilirse özellikle önemli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG; Vasküler Tıpta Klinisyen Bilim İnsanı Programı (PRIME), P. Tomsits ve D. Schüttler'e MA 2186/14-1; VO1568/3-1, IRTG1816 ve SFB1002 projesi A13'ten N. Voigt'e), Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında Alman Araştırma Vakfı (EXC 2067/1- 390729940'den N. Voigt'e), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss ve N. Voigt'e; 81Z0600206'dan S. Kääb'a), Korona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), Kardiyovasküler Hastalıklar ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Vakfı (S. Clauss'a) ve Else-Kröner-Fresenius Vakfı (EKFS 2016_A20 N. Voigt'e). Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D.
- Schüttler, D., et al.
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
