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Biology

सीए2 + क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम करंट के एक साथ माप के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स का अलगाव

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61964
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2, *1,2,3, *4,5,6
1Department of Medicine I, University Hospital Munich, Campus Großhadern, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 2Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 4Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Göttingen, 5Partner Site Göttingen, DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 6Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Göttingen
* These authors contributed equally

Summary

माउस मॉडल अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। इस उद्देश्य के लिए, पैच-क्लैंप माप करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स आवश्यक हैं। यहां, प्रतिगामी एंजाइम-आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने की एक विधि, जो कैल्शियम-क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम प्रवाह के एक साथ माप की अनुमति देती है, का वर्णन किया गया है।

Abstract

माउस मॉडल अतालता अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और परिवर्तित आयन चैनल फ़ंक्शन और कैल्शियम हैंडलिंग सहित अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। इस उद्देश्य के लिए, पैच-क्लैंप माप करने या कैल्शियम हैंडलिंग असामान्यताओं का पता लगाने के लिए उच्च गुणवत्ता के एट्रियल या वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स आवश्यक हैं। हालांकि, वर्तमान अलगाव प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स की सीमित उपज एक ही माउस में दोनों मापों की अनुमति नहीं देती है। यह लेख प्रतिगामी एंजाइम-आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने की एक विधि का वर्णन करता है, जो एक जानवर से कैल्शियम क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम प्रवाह के बाद के माप के लिए है। माउस दिल प्राप्त किए जाते हैं, और रक्त को हटाने के लिए महाधमनी को तेजी से प्रवेशित किया जाता है। फिर दिल को शुरू में कैल्शियम-मुक्त समाधान (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ जोड़ा जाता है ताकि ऊतक को इंटरकैलेटेड डिस्क के स्तर पर अलग किया जा सके और बाद में बाह्य मैट्रिक्स (37 डिग्री सेल्सियस) को बाधित करने के लिए थोड़ा कैल्शियम युक्त एंजाइम समाधान के साथ। पचे हुए दिल को बाद में एट्रिया और वेंट्रिकल्स में विच्छेदित किया जाता है। ऊतक के नमूनों को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है और सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके भंग कर दिया जाता है। एंजाइमेटिक पाचन बंद हो जाता है, और कोशिकाओं को शारीरिक कैल्शियम सांद्रता में चरणबद्ध रूप से पुन: पेश किया जाता है। फ्लोरोसेंट सीए2 + -संकेतक के साथ लोड होने के बाद, पृथक कार्डियोमायोसाइट्स कैल्शियम धाराओं और क्षणिकों के एक साथ माप के लिए तैयार किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, अलगाव के नुकसान पर चर्चा की जाती है और पैच-क्लैंप प्रोटोकॉल और ऊपर वर्णित एट्रियल और वेंट्रिकुलर मुराइन मायोसाइट्स में एक साथ कैल्शियम क्षणिक माप के साथ एल-टाइप कैल्शियम धाराओं के प्रतिनिधि निशान प्रदान किए जाते हैं।

Introduction

कार्डियक अतालता आम है और वर्तमान प्रमुख स्वास्थ्य चुनौतियों में से एक है क्योंकि वे दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं। अतालता उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 से जुड़ी हुई है और अचानककार्डियक मौतों के बहुमत के लिए अंतर्निहित कारण का प्रतिनिधित्व करती है। अप टू डेट उपचार विकल्पों ने रोगी के अस्तित्व में सुधार किया है, लेकिन अभी भी अंतर्निहित तंत्र को लक्षित करने के बजाय मुख्य रूप से रोगसूचक उपचार हैं। इस प्रकार, इन उपचारों में सीमित प्रभावकारिता होती है और अक्सर गंभीर दुष्प्रभाव 4,5,6 हो सकते हैं। वर्तमान उपचार विकल्पों में सुधार के लिए अंतर्निहित पैथोफिज़ियोलॉजी में अंतर्दृष्टि की आवश्यकता होती है, जिससे अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मॉडल की आवश्यकता होती है। छोटे पशु मॉडल - और विशेष रूप से माउस मॉडल - अतालता अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे अरिदमोजेनेसिस के प्रमुख तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आयन चैनल फ़ंक्शन या कैल्शियम हैंडलिंग 7,8 पर आनुवंशिक प्रभाव।

इस उद्देश्य के लिए, पर्याप्त मात्रा और व्यवहार्यता के पृथक एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए विभिन्न अलगाव दृष्टिकोणों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम पहले 9,10,11,12,13 वर्णित किया गया है और कुछ समूहों ने एट्रियल 14 या वेंट्रिकुलर 15 से एल-टाइप करंट और कैल्शियम वर्तमान प्रेरित कैल्शियम ट्रांसिएंट्स के एक साथ माप से डेटा प्रस्तुत किया है। मुराइन कार्डियोमायोसाइट्स। हालांकि, हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के लिए एक जानवर से एट्रियल और वेंट्रिकुलर माप का कोई डेटा उपलब्ध नहीं है। शोधकर्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से लेकर प्रोटिओमिक्स तक विभिन्न प्रकार के विषयों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, सेल कॉन्ट्रैक्टिलिटी या प्रोटीन इंटरैक्शन, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन, या जेनेटिक्स के रूप में कार्यात्मक अध्ययन - सभी को पृथक कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। इस प्रकार प्रकाशित प्रोटोकॉल में से कई को विशेष रूप से पैच क्लैंप अध्ययन के लिए विकसित नहीं किया गया है, जिससे पैच क्लैंप अध्ययन के लिए सीमित पैदावार और अपर्याप्त सेल गुणवत्ता होती है। इस प्रकार, एक जानवर से अलग एट्रियल और वेंट्रिकुलर कोशिकाओं के एक साथ पैच क्लैंप और कैल्शियम क्षणिक माप स्थापित प्रोटोकॉल के साथ नहीं किए जा सकते हैं।

पैच क्लैंप प्रयोगों के लिए मुराइन - विशेष रूप से एट्रियल - मायोसाइट्स का अलगाव चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यह लेख प्रतिगामी एंजाइम आधारित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव के माध्यम से उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक सरल और तेज़ विधि प्रदान करता है, जो बाद में एक जानवर से शुद्ध झिल्ली प्रवाह और वर्तमान प्रेरित कैल्शियम क्षणिकदोनों के एक साथ माप की अनुमति देता है। यह लेख जंगली प्रकार के चूहों और आनुवंशिक उत्परिवर्तन वाले चूहों से प्राप्त एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल को विस्तृत करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग नर और मादा चूहों के लिए समान रूप से किया जा सकता है। नीचे वर्णित मायोसाइट अलगाव, चित्र और प्रतिनिधि परिणाम 6 (± 1) महीने की उम्र में जंगली प्रकार सी 57बीएल / 6 चूहों से प्राप्त किए गए थे। फिर भी, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न जीनोटाइप के साथ 2 से 24 महीने तक की विभिन्न उम्र में चूहों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। चित्रा 1 एंजाइम छिड़काव के दौरान अलगाव सेटअप और एक कैनुलाटेड दिल के क्लोज-अप को दर्शाता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को लोअर सैक्सोनी पशु समीक्षा बोर्ड (एलएवीईएस, एजेड -18/2900) द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. पूर्वव्यवस्था

  1. 10x छिड़काव बफर का 1 लीटर (तालिका 1), 1x छिड़काव बफर का 500 मिलीलीटर (तालिका 2), 50 मिलीलीटर पाचन बफर (तालिका 3), 10 मिलीलीटर स्टॉप बफर (तालिका 4), 1 लीटर टायरोड समाधान (तालिका 5), प्रत्येक कैल्शियम चरण समाधान का 10 मिलीलीटर (ग्लूकोज के साथ टाइरोड समाधान और संकेत के अनुसार कैल्शियम की संबंधित मात्रा) तैयार करें। प्रदान किए गए व्यंजनों के अनुसार 4-एपी समाधान का 1 एल (तालिका 5), पिपेट समाधान का 100 एमएल (तालिका 6) और 5 एमएल प्लूरोनिक एसिड।
    नोट: स्नान समाधान (टाइरोड और 4-एपी समाधान) अग्रिम में (ग्लूकोज के बिना) तैयार किया जा सकता है और +4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, प्रयोगात्मक दिन में ग्लूकोज जोड़ा जाता है। पिपेट समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, कैल्शियम संकेतक प्रयोगात्मक दिन पर जोड़ा जाता है और समाधान फिर आगे के उपयोग तक बर्फ पर संग्रहीत किया जाता है। 10x छिड़काव बफर को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है, 1x छिड़काव बफर, पाचन बफर और स्टॉपिंग बफर प्रयोगात्मक दिन पर ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
  2. पानी स्नान और रोलर पंप चालू करें।
  3. छिड़काव बफर के साथ प्रीफिल लैंगेंडॉर्फ उपकरण; सुनिश्चित करें कि यह हवा मुक्त है।
  4. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत इसे ठीक करके महाधमनी प्रवेशनी तैयार करें, कैनुला को धोकर छिड़काव बफर और स्पष्ट हवा से भरे 1 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें।
    नोट: छिड़काव प्रणाली के अंदर किसी भी हवा से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह सीधे कोरोनरी छिड़काव को प्रभावित करेगा और इस प्रकार पाचन प्रभावशीलता। यदि आवश्यक हो, तो सेटअप में एक बुलबुला जाल जोड़ा जा सकता है, ताकि किसी भी एयर ट्रैपिंग से सुरक्षित रूप से बचा जा सके।
  5. अंग संग्रह और माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त छिड़काव बफर के साथ पेट्री व्यंजन तैयार करें (बफर को पूरे अंग को सुरक्षित रूप से कवर करना चाहिए, कुछ मिलीलीटर - उपयोग किए गए पेट्री डिश आकार के आधार पर - पर्याप्त होना चाहिए)।
  6. ऊतक पृथक्करण और माइक्रोस्कोपी के लिए पाचन बफर के साथ 3 पेट्री व्यंजन तैयार करें, बफर को संबंधित पेट्री डिश के भीतर माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन के लिए अंग को कवर करना चाहिए, मात्रा उपयोग किए गए पेट्री डिश आकार पर निर्भर करती है। पृथक्करण के लिए वेंट्रिकुलर ऊतक के लिए 3 एमएल और एट्रियल ऊतक के लिए 1.5 एमएल का उपयोग करें।

2. अंग फसल

  1. 0.1 एमएल हेपरिन (1,000 यू / एमएल) के साथ माउस इंजेक्ट करें यानी 27 ग्राम कैनुला के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  2. माउस को एक प्रेरण कक्ष में रखें, साथ ही लगभग 500 μL आइसोफ्लुरेन में भिगोए गए एक छोटे ऊतक के साथ। जानवर को ऊतक के संपर्क में नहीं होना चाहिए। इससे बचने के लिए, ऊतक को कवर करने के लिए प्लास्टिक बायोप्सी-एम्बेडिंग कैसेट का उपयोग किया जा सकता है। एक बार जब जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज हो जाता है, तो पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की जांच करें और जैसे ही यह अब मौजूद न हो, जल्दी से गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
  3. माउस को उसकी पीठ पर एक मंच पर रखें (उदाहरण के लिए, स्टायरोफोम पर पेपर टॉवल से ढका हुआ) और इसे पकड़ने के लिए पंजे को कैनुला के साथ ठीक करें।
  4. छाती और पेट के हिस्से को कवर करने वाले फर और त्वचा को जुगुलम से सिम्फिसिस की ओर एक स्पष्ट कट के साथ हटा दें और कैंची का उपयोग करके किसी भी अंग संरचना को घायल किए बिना पेट को एक्जिफॉइड के ठीक नीचे खोलें। सर्जिकल बल के साथ उरोस्थि उठाएं और पसलियों के किनारे कैंची से डायाफ्राम को काटें, फिर पसलियों को मेडियल एक्सिलरी लाइन में काटें और दिल को उजागर करने के लिए पसली के पिंजरे को हटा दें।
  5. कुंद बल का उपयोग करके पेरिकार्डियम को सावधानीपूर्वक निकालें और दिल को नीचे से कुंद बल के साथ उठाकर और कैंची का उपयोग करके एक ही कट के साथ बड़े जहाजों को काटकर जल्दी से हटा दें।
  6. दिल को कमरे के तापमान छिड़काव बफर में रखें और जितनी जल्दी हो सके माइक्रोस्कोप के नीचे एक कुंद अंत सुई के साथ महाधमनी को प्रवेशनी करें।
    नोट: उस पर बहुत अधिक समय खोए बिना अंग से जुड़े किसी भी फेफड़े के ऊतक और फैटी ऊतक को हटा दें। कैनुलाइंग करते समय, सुनिश्चित करें कि सुई का अंत महाधमनी वाल्व के माध्यम से विस्तारित नहीं होता है, क्योंकि यह बफर को कोरोनरी धमनियों में प्रवेश करने से रोककर परिणामों को खराब कर देगा।
  7. सुई से मजबूती से रेशम के टुकड़े के साथ दिल को बांधें और सिरिंज से डिस्कनेक्ट करें।
    नोट: हृदय प्राप्त करने से लेकर महाधमनी को सुई तक पहुंचाने तक की पूरी प्रक्रिया (जिस क्षण बड़ी वाहिकाओं को काट दिया जाता है) में जितना संभव हो उतना कम समय लगना चाहिए। छिड़काव की शुरुआत तक दिल को हटाने से 90-180 सेकंड से अधिक समय नहीं लेने की सिफारिश की जाती है।

3. एंजाइमेटिक पाचन

  1. महाधमनी प्रवेशनी के बाद, सिस्टम में प्रवेश करने वाली किसी भी हवा से बचने के लिए तुरंत कैनुलाटेड दिल को लैंगेंडॉर्फ तंत्र से कनेक्ट करें।
    नोट: सिस्टम में प्रवेश करने वाली किसी भी हवा से बचने के लिए यह लैंगेंडॉर्फ तंत्र के तल पर छिड़काव बफर की एक लटकती हुई बूंद के साथ-साथ सुई के शीर्ष पर बैठे छिड़काव बफर की एक बूंद रखने में मदद कर सकता है।
  2. ठीक 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 1 मिनट के लिए छिड़काव बफर के साथ दिल को गर्म करें और ठीक 4 एमएल / मिनट की छिड़काव दर लें।
    नोट: छिड़काव सुई की नोक पर 37 डिग्री सेल्सियस का तापमान रखने के लिए, पानी के स्नान का तापमान लगभग 40 डिग्री सेल्सियस से थोड़ा ऊपर सेट करना होगा। छिड़काव नोक पर तापमान को मापकर नियमित रूप से इसका परीक्षण किया जाना चाहिए।
  3. ठीक 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान और ठीक 4 एमएल / मिनट की छिड़काव दर पर ठीक 9 मिनट के लिए पाचन बफर और परफ्यूज पर छिड़काव स्विच करें।
  4. पचे हुए दिल को पूरी तरह से कवर रखने के लिए पर्याप्त पाचन बफर के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। फिर माइक्रोस्कोप के नीचे अटरिया और वेंट्रिकल्स को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें।
  5. एट्रिया को 1.5 एमएल पाचन बफर के साथ एक पेट्री डिश में और वेंट्रिकल्स को 3 एमएल पाचन बफर के साथ एक अन्य पेट्री-डिश में स्थानांतरित करें।
  6. एट्रियल विच्छेदन।
    1. सावधानी से, लेकिन समय की हानि के बिना, एट्रिया को कुंद बल का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में खींचें।
    2. 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके ऊतक को भंग करें, जिसे पहले टिप खोलने को चौड़ा करने के लिए काटा गया है।
    3. समाधान को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए ट्यूब के किनारे पर सावधानीपूर्वक पाइप करके स्टॉप बफर (1.5 एमएल) की बराबर मात्रा जोड़ें।
    4. शेष बड़े ऊतक टुकड़ों को हटाने के लिए 200 μm नायलॉन जाल के माध्यम से सेल / ऊतक-समाधानों के सभी 3 मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक पारित करें जो पूरी तरह से पच नहीं पाए हैं।
      नोट: एक सफल पाचन लगभग कोई ठोस हिस्सा नहीं छोड़ेगा।
  7. वेंट्रिकुलर विच्छेदन।
    1. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके वेंट्रिकुलर ऊतक को जल्दी से छोटे टुकड़ों में काट लें और घुलने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे करें। ऊपर और नीचे पाइपिंग के लिए एक और 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करें, इसे खोलने को चौड़ा करने के लिए छोटा किया जा सकता है।
    2. ऊतक-समाधान को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए ट्यूब के किनारे पर सावधानीपूर्वक पाइप िंग करके स्टॉप बफर (3 एमएल) की बराबर मात्रा जोड़ें।
    3. बड़े ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए 200 μm नायलॉन जाल के माध्यम से सेल / ऊतक-समाधान के सभी 6 मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक पारित करें जो पूरी तरह से पच नहीं पाए हैं।
      नोट: एक सफल पाचन लगभग कोई ठोस हिस्सा नहीं छोड़ेगा।
  8. दोनों ट्यूबों (एट्रियल और वेंट्रिकुलर सेल सस्पेंशन) को 6 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर छोड़ दें।
  9. 2 मिनट के लिए 5 x g पर दोनों 15 mL ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।

4. कैल्शियम पुन: परिचय

नोट: निम्नलिखित चरण एट्रियल और वेंट्रिकुलर कोशिकाओं (जब तक अन्यथा उल्लेख न किया गया हो) दोनों के लिए समान हैं और कमरे के तापमान पर किए जाते हैं।

  1. प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और कैल्शियम मुक्त टाइरोड समाधान के 10 एमएल में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  2. अवसादन के लिए कोशिकाओं को 8 मिनट के लिए छोड़ दें।
  3. 1 मिनट के लिए 5 x g पर सेंट्रीफ्यूज (केवल एट्रियल कोशिकाएं, अवसादन वेंट्रिकुलर कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है)।
  4. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 100 μM कैल्शियम सांद्रता के साथ टायरोड समाधान के 10 मिलीलीटर में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  5. अवसादन के लिए कोशिकाओं को 8 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. 1 मिनट के लिए 5 x g पर सेंट्रीफ्यूज (केवल एट्रियल कोशिकाएं, अवसादन वेंट्रिकुलर कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है)।
  7. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 400 μM कैल्शियम सांद्रता के साथ टायरोड समाधान के 10 मिलीलीटर में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  8. अवसादन के लिए कोशिकाओं को 8 मिनट के लिए छोड़ दें।
  9. 1 मिनट के लिए 5 x g पर सेंट्रीफ्यूज (केवल एट्रियल कोशिकाएं, अवसादन वेंट्रिकुलर कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है)।
  10. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 1 मिलीलीटर कैल्शियम सांद्रता के साथ टायरोड समाधान के 1 एमएल (एट्रियल)/5 एमएल (वेंट्रिकुलर) में गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।

5. फ्लोरोसेंट कैल्शियम-संकेतक फ्लुओ -3 एएम के साथ मायोसाइट्स का लोडिंग।

नोट: फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक की प्रकाश संवेदनशीलता के कारण, निम्नलिखित चरणों को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करके)।

  1. निर्जल डीएमएसओ में 20% प्लूरोनिक एफ -127 के 44 μL को फ्लुओ -3 AM के 50 μg में जोड़कर फ्लुओ -3 एएम स्टॉक समाधान तैयार करें (प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है)।
  2. 1 एमएल सेल सस्पेंशन में 10 μL Fluo-3 AM स्टॉक घोल जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 1 मिनट के लिए 5 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और एक अच्छी कामकाजी एकाग्रता (सेल घनत्व के आधार पर 1-5 एमएल स्नान समाधान) प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में स्नान समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. प्रयोगों के साथ शुरू करने से पहले डी-एस्टरीफिकेशन के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दें।

6. एक साथ पैच-क्लैंप और एपिफ्लोरोसेंट सीए2 + -क्षणिक माप जैसा कि पहले वर्णितहै 16

नोट: पैच क्लैंप माप इस लेख का विषय नहीं हैं, इच्छुक पाठक को इस विधि 17,18,19,20,21,22 के गहन विवरण प्रदान करने वाले प्रमुख प्रकाशनों को संदर्भित किया जा सकता है। फिर भी, बेहतर समग्र समझ के लिए, वर्तमान प्रेरित कैल्शियम क्षणिकों के साथ एल-प्रकार कैल्शियम धाराओं को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पर एक सारांश प्रदान किया गया है।

  1. मायोसाइट्स को एक सेल कक्ष में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर स्नान समाधान के साथ सुपरफ्यूज करें।
  2. तालिका 5 में दर्शाए अनुसार स्नान समाधान में 4-एमिनोपाइरिडिन और बेरियम क्लोराइड जोड़कर पोटेशियम धाराओं को अवरुद्ध करें।
  3. सुनिश्चित करें कि बोरोसिलिकेट माइक्रोइलेक्ट्रोड में पिपेट समाधान से भरे 2-5 एमक्यू का टिप प्रतिरोध है (तालिका 6)।
  4. एक ही समय में विद्युत संकेतों और एपिफ्लोरेसेंस दोनों की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देने के लिए माप सेटअप करें। वोल्टेज क्लैंप मोड का उपयोग एल-टाइप सीए 2 + -करंट को मापने के लिए किया जाता है, जिसमें सेल को -80 एमवी पर और 600 एमएस रैंप-पल्स को -40 एमवी तक रखने के लिए तेज एनए + -करंट को निष्क्रिय करने के लिए किया जाता है, इसके बाद 0.5 हर्ट्ज पर 100 एमएस टेस्ट-पल्स से +10 एमवी तक होता है (चित्रा 2)।
  5. 488 एनएम पर उत्तेजना का उपयोग करें, <520 एनएम पर उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने और [सीए2 +] आई में परिवर्तित करने के लिए।
    Equation 1
    जहां केडी = फ्लुओ -3 (864 एनएम) का पृथक्करण स्थिरांक, एफ = फ्लुओ -3 प्रतिदीप्ति; एफमैक्स = सीए2 + -संतृप्त प्रतिदीप्ति प्रत्येक प्रयोग के अंत में प्राप्त19।

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Representative Results

एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल निलंबन के 10 μL पाइपिंग द्वारा कैल्शियम पुन: परिचय के बाद अलगाव उपज निर्धारित की जाती है। एट्रियल सेल अलगाव के लिए 100 से अधिक व्यवहार्य, रॉड के आकार की, गैर-अनुबंधित कोशिकाएं / 10 μL और वेंट्रिकुलर सेल अलगाव के लिए 1,000 से अधिक व्यवहार्य, रॉड के आकार की, गैर-अनुबंधित कोशिकाएं / 10 μL को पर्याप्त उपज माना जाता है और आमतौर पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एट्रियल कोशिकाओं ने हृदय चालन प्रणाली, विशेष रूप से साइनस नोड की कोशिकाओं के साथ-साथ दाएं और बाएं आलिंद के साथ-साथ एट्रियल उपांगों से विभिन्न मायोसाइट्स युक्त विभिन्न सेल प्रकारों को दिखाया। चूंकि इन क्षेत्रों को अलग से विच्छेदित नहीं किया जाता है, इसलिए विभिन्न कोशिका आकृति विज्ञान परिणाम हैं। सभी एट्रियल कोशिकाएं छोटी होती हैं, जिनमें सेल धारिता लगभग 35 पीएच - 100 पीएच से होती है, कुछ दूसरों की तुलना में अधिक फिलीफॉर्म होते हैं। चित्रा 3 पैनल ए कैल्शियम संवेदनशील डाई से भरे एट्रियल वर्किंग मायोकार्डियम से एक विशिष्ट सेल दिखाता है, जो इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त माप के लिए तैयार है। वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स 100 से लगभग 400 पीएच तक की सेल कैपेसिटेंस के साथ अधिक रॉड के आकार और बड़े होते हैं, चित्रा 3 पैनल बी कैल्शियम संवेदनशील डाई से भरे हुए मायोकार्डियम से एक विशिष्ट वेंट्रिकुलर सेल दिखाता है, जो इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त माप के लिए तैयार है। चित्रा 4 एक एट्रियल मायोसाइट (पैनल बी और सी) और एक वेंट्रिकुलर मायोसाइट (पैनल ई और एफ) से एक साथ साइटोसोलिक कैल्शियम क्षणिक के साथ एल-प्रकार कैल्शियम वर्तमान माप के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है।

Figure 1
चित्र 1: लैंगेंडॉर्फ-उपकरण। (ए) कस्टम डिज़ाइन किए गए हीट एक्सचेंजर और जैकेट ्ड हार्ट चैंबर के दृश्य के साथ अलगाव सेटअप की तस्वीर। (बी) कैनुलाटेड हार्ट के साथ जैकेट वाले हार्ट चैंबर को बंद करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उत्तेजना प्रोटोकॉल। वोल्टेज-क्लैंप प्रोटोकॉल (0.5 हर्ट्ज) का उपयोग कुल शुद्ध झिल्ली प्रवाह(आईएम) को मापने के लिए किया जाता है, जो मुख्य रूप से एल-टाइप सीए 2 + वर्तमान और सीए 2 + वर्तमान प्रेरित सीए 2 + क्षणिक को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पृथक मुराइन कार्डियोमायोसाइट्स। (ए) फ्लुओ -3 से भरे एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स का एक उदाहरण, पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए तैयार। (बी) फ्लुओ -3 से भरे वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स का एक उदाहरण, पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए तैयार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। (ए) वोल्टेज-क्लैंप प्रोटोकॉल (0.5 हर्ट्ज)। (बी) कुल शुद्ध झिल्ली प्रवाह(आईएम), मुख्य रूप से एक मुराइन एट्रियल मायोसाइट में एल-टाइप सीए2 + धारा को दर्शाता है। (सी) एल-टाइप सीए 2 + करंट ने म्यूरिन एट्रियल मायोसाइट में सीए2 + क्षणिक को ट्रिगर किया। (डी) वोल्टेज-क्लैंप प्रोटोकॉल (0.5 हर्ट्ज)। (ई) कुल शुद्ध झिल्ली प्रवाह(आईएम), मुख्य रूप से एक मुराइन वेंट्रिकुलर मायोसाइट में एल-टाइप सीए2 + प्रवाह को दर्शाता है। (एफ) एल-टाइप सीए 2 + करंट ने एक मुराइन वेंट्रिकुलर मायोसाइट में सीए2 + क्षणिक को ट्रिगर किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंतिम एकाग्रता (mM)
NaCl 120.4
KCl 14.7
KH2PO4 0.6
Na2HPO4 x 2H2O 0.6
MgSO4 x 7H2O 1.2
HEPES 10

तालिका 1: 10x छिड़काव बफर (1,000 एमएल)।

अंतिम एकाग्रता (mM)
NaHCO3 4.6
टॉरिन 30
2,3-ब्यूटानेडियोन मोनोक्सीम 10
ग्लूकोज़ 5.5
10x छिड़काव बफर 50 मिलीलीटर
डबल डिस्टिल्ड एच2 ओ (18,2 एम-सेमी)। 500 मिलीलीटर

तालिका 2: 1x छिड़काव बफर (500 एमएल)।

अंतिम एकाग्रता
कोलेजनेस टाइप II ~ 600 यू /
CaCl2 40 μM
1x छिड़काव बफर 50 मिलीलीटर

तालिका 3: पाचन बफर (50 एमएल)।

अंतिम एकाग्रता
गोजातीय बछड़ा सीरम 10%
CaCl2 12.5 μM
1x छिड़काव बफर 10 मिलीलीटर

तालिका 4: बफर (10 एमएल) स्टॉप करें।

अंतिम एकाग्रता (mM)
टाइरोड। 4-AP
NaCl 140 140
HEPES 10 10
ग्लूकोज़ 10 10
KCl 4 4
MgCl x 6H2O 1 1
Probenecid 2 2
4-एमिनोपाइरिडिन 5
BaCl2 0.1
CaCl2 1 1
पीएच 7.35 कमरे के तापमान पर 1 M NaOH के साथ समायोजित 7.35 कमरे के तापमान पर 1 M NaOH के साथ समायोजित

तालिका 5: स्नान समाधान।

अंतिम एकाग्रता (mM)
डीएल-एस्पार्टेट के +-नमक 92
KCl 48
Na2ATP 5
EGTA 0.02
गुआनोसिन 5'-ट्राइफॉस्फेट ट्रिस नमक 0.1
HEPES 10
फ्लुओ-3 0.1
पीएच 7.20 कमरे के तापमान पर 1 M KOH के साथ समायोजित

तालिका 6: पिपेट समाधान।

देखी गई समस्या संभावित कारण घोल
कम सेल उपज, ऊतक के टुकड़े बचे हुए अंडरडाइजेशन 15 सेकंड में पाचन समय बढ़ाएं
कम सेल उपज, ऊतक के टुकड़े बचे हुए अंडरडाइजेशन 50 यू / एमएल चरणों में कोलेजनेज की मात्रा बढ़ाएं
अधिक और कम पचने वाली कोशिकाओं का मिश्रण, ऊतक के टुकड़े बचे हुए हैं। कोई कोरोनरी छिड़काव नहीं सुनिश्चित करें कि वेंट्रिकल में महाधमनी प्रवेशनी न डालें।
अधिक और कम पचने वाली कोशिकाओं का मिश्रण, ऊतक के टुकड़े बचे हुए हैं। हवा के बुलबुले सुनिश्चित करें कि छिड़काव प्रणाली में कोई हवा न डालें।
कम समग्र सेल गुणवत्ता इस्केमिक समय बहुत लंबा इस्केमिक समय को कम करें, परिसंचरण को यथासंभव लंबे समय तक बनाए रखने के लिए वैकल्पिक तरीकों पर विचार करें।

तालिका 7: सामान्य समस्याएं और उन्हें कैसे हल किया जाए।

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Discussion

यह लेख एक साथ कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के साथ पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए एक ही माउस से उच्च गुणवत्ता वाले एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स प्राप्त करने का एक आसान और कार्यात्मक तरीका प्रदान करता है। प्राप्त डेटा की गुणवत्ता अत्यधिक सेल अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, म्यूरिन कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के कई तरीकों को पहले 9,10,11,12 वर्णित किया गया है। पृथक कोशिकाओं का उपयोग पैच क्लैंप प्रयोगों से लेकर अनुबंध अध्ययन, रूपात्मक अध्ययन, प्रोटिओमिक्स, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन अनुसंधान और कई अन्य विश्लेषणों के लिए किया जाता है। प्रत्येक व्यक्तिगत उद्देश्य के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को अलग-अलग अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। इसके कारण, किसी भी प्रोटोकॉल ने एक माउस से एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के कैल्शियम हैंडलिंग गुणों के एक साथ माप के साथ पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले अलगाव का नेतृत्व नहीं किया। इसे बदलने के लिए, पहले वर्णित कई प्रोटोकॉल के अनुकूलन के परिणामस्वरूप इस प्रोटोकॉल का विकास हुआ। कुछ कदम यांत्रिक रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, कुछ को एक विशिष्ट तरीके से किया जाना है और कुछ अलगाव की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन चरणों पर नीचे चर्चा की जाएगी।

पशु आयु के साथ कोशिका अलगाव की उपज और गुणवत्ता कम हो जाती है, संभवतः ऊतक फाइब्रोसिस 11,23,24 में वृद्धि के कारण पाचन समय और एंजाइम की मात्रा के व्यक्तिगत समायोजन आवश्यक हो जाते हैं। एक जानवर जितना पुराना होता है, उतना ही अधिक फाइब्रोटिक ऊतक की उम्मीद की जाती है। संकेतित पाचन समय और एंजाइम की मात्रा 6 महीने की उम्र में सामान्य आकार, स्वस्थ चूहों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। फाइब्रोसिस के पक्ष में पुराने चूहों या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते समय अधिक एंजाइम और लंबे समय तक पाचन समय लागू करने का सुझाव दिया जाता है। जैसा कि पिछले काम ने जोर दिया है, तेजी से और वायु-मुक्त प्रवेशनी के साथ-साथ दिल का तत्काल छिड़काव अच्छीसेल गुणवत्ता के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है। यह सिफारिश की जाती है कि हृदय को प्राप्त करने से 90-180 सेकंड से अधिक समय न लें और इसे छिड़काव की शुरुआत के लिए कमरे के तापमान छिड़काव बफर में रखें - जितनी तेज़, बेहतर हो। लंबी दूरी से बचने के लिए एक कमरे में सभी आवश्यक उपकरण स्थापित करना सहायक होता है। यदि इस्केमिक अंतराल को और छोटा करना वांछित है, तो नार्कोसिस और बाद में यूथेनाइजेशन की एक और विधि का उपयोग करना संभव है। ऊपर वर्णित के रूप में जानवर को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज करें, पर्याप्त मात्रा में फेंटेनाइल (या पशु कल्याण के लिए आपके दिशानिर्देशों के अनुसार एक समकक्ष एनाल्जेसिक दवा) लागू करें और जानवर को एक आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र और चूहों के लिए उपयुक्त एनेस्थीसिया मास्क के साथ एक मंच पर ले जाएं, जो निरंतर आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन प्रवाह प्रदान करता है। बाद में ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। चूंकि जानवर का एक सामान्य परिसंचरण होता है जब तक कि बड़े जहाजों को एक ही कट से डिस्कनेक्ट नहीं किया जाता है, यह विधि नो-फ्लो समय को काफी कम कर देगी और इस प्रकार यदि आवश्यक हो तो अलगाव की गुणवत्ता में सुधार कर सकती है।

हृदय की कटाई के बाद, कोरोनरी छिड़काव को सुरक्षित करने के लिए महाधमनी प्रवेशनी को सही गहराई पर रखना महत्वपूर्ण है। इसलिए, महाधमनी आर्क पर या वंशज महाधमनी पर महाधमनी को काटना आवश्यक है, जब हृदय को प्रवेशनी के लिए कम से कम 5 मिमी महाधमनी छोड़ने के लिए महाधमनी को हटा दिया जाता है, जिससे कोरोनरी धमनियों से रेशम डिस्टल को बांधने की अनुमति मिलती है, लेकिन पहली महाधमनी साइड-शाखाओं से पहले।

अलगाव प्रक्रिया के दौरान, कई सेल स्थानांतरण आवश्यक हैं और छोटे पिपेट युक्तियों के साथ पाइपिंग कोशिकाओं को उच्च कतरनी तनाव का कारण बनेगी। कतरनी तनाव को कम करने के संभावित समाधान धीरे-धीरे और सावधानी से पाइप िंग कर रहे हैं, साथ ही टिप ओपनिंग को चौड़ा करने के लिए 45 डिग्री कोण में कुछ मिलीमीटर तक पिपेट टिप्स काट रहे हैं। किनारों को नरम करने के लिए कटे हुए पिपेट युक्तियों को पिघलाकर कतरनी तनाव में और कमी प्राप्त की जा सकती है। वेंट्रिकुलर अलगाव की अलगाव उपज आमतौर पर इतनी अधिक होती है कि कतरनी तनाव में कमी अनिवार्य नहीं है। किसी के व्यक्तिगत लक्ष्य के आधार पर, 'सबसे फिट' कोशिकाओं का चयन करने के लिए वेंट्रिकुलर कोशिकाओं को कतरनी तनाव में उजागर करना और भी उपयोगी हो सकता है। हालांकि, एट्रियल अलगाव के लिए यह प्रक्रिया महत्वपूर्ण है, क्योंकि पाचन के बाद एट्रियल कोशिकाएं विशेष रूप से कमजोर होती हैं। जब भी समाधान जोड़ते हैं, तो कोशिकाओं पर सीधे पाइप िंग से बचने की सिफारिश की जाती है, बल्कि ट्यूब की दीवार पर धीरे-धीरे पाइप करने की कोशिश की जाती है।

कोलेजनेस की पसंद अलगाव परिणामों को काफी प्रभावित करेगी। चूंकि न केवल एंजाइम की तैयारी में अंतर हैं, बल्कि एंजाइम गतिविधि में एक प्रासंगिक बैच-टू-बैच भिन्नता भी है, एंजाइम के नए बैच या चूहों के एक नए तनाव के साथ काम करना शुरू करते समय कोलेजनेस राशि और पाचन समय का अनुमापन आवश्यक है। हालांकि, ऊपर दी गई तालिकाओं में इंगित मात्रा और समय व्यक्तिगत अनुकूलन9 के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु चिह्नित करते हैं। अधिकांश कंपनियां व्यक्तिगत बैचों का परीक्षण करने के लिए छोटे एंजाइम नमूने प्रदान करती हैं, जो बैच चयन को अधिक सुविधाजनक बनाती हैं।

विशिष्ट आयामों और सामान्य मोनोफैसिक क्षय के साथ कैल्शियम क्षणिक प्राप्त किया जा सकता है यदि कोशिकाओं को ईजीटीए25 के उपयोग के बिना अलग किया जाता है जैसा कि पहले वोइट एट अल .9,16 द्वारा वर्णित है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल कम कैल्शियम सांद्रता का उपयोग करता है और अलगाव प्रक्रिया के दौरान ईजीटीए से बचता है। सीए2 + विरोधाभास घटना26 से कोशिकाओं की रक्षा के लिए, कैल्शियम को चरणबद्ध रूप से और धीरे-धीरे 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता तक पुन: पेश किया जाता है। उच्च इंट्रासेल्युलर सोडियम सांद्रता के कारण, कृंतक कार्डियोमायोसाइट्स विशेष रूप से कैल्शियम अधिभार से ग्रस्त होते हैं और धीमी गति से और चरणबद्ध पुन:परिचय महत्वपूर्ण होता है। कैल्शियम मुक्त समाधानों की आवश्यकता सभी लैंगेंडॉर्फ-आधारित कृंतक कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव की प्रमुख सीमाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करती है। कैल्शियम पुन: परिचय हमेशा व्यवहार्य कोशिकाओं के महत्वपूर्ण नुकसान की ओर जाता है। धीमी और चरणबद्ध पुन: परिचय जैसा कि यहां वर्णित है, फिर भी, प्रत्येक जानवर से विश्वसनीय रूप से माप प्राप्त करने के लिए अच्छी गुणवत्ता के साथ पर्याप्त उपज की ओर जाता है।

कैल्शियम पुन: परिचय के ठीक बाद सेल उपज और गुणवत्ता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। यद्यपि पृथक कोशिकाओं को पैच करते समय अंतिम मूल्यांकन होता है, कैल्शियम संवेदनशील डाई के साथ कोशिकाओं को लोड करने से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे एक नज़र डालकर सेल की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन किया जा सकता है। अच्छी गुणवत्ता वाली कोशिकाएं स्पष्ट रूप से रॉड के आकार की होती हैं, एक समरूप झिल्ली होती हैं और गैर-संकुचन होती हैं। संकुचन कम सेल गुणवत्ता का संकेत है क्योंकि यह झिल्ली अखंडता के नुकसान को इंगित करता है और अतिपाचन या उच्च कतरनी तनाव के आवेदन के कारण हो सकता है। ओवरडाइजेशन का एक और संकेत है - व्यवहार्य कोशिकाओं के संबंध में कई सेल छाया के अलावा - एक अत्यधिक अच्छी दिखने वाली झिल्ली जो कई सतह प्रोटीनों से साफ हो गई है और जब कोई सील गठन के लिए पिपेट टिप के साथ सेल से संपर्क करने की कोशिश करता है तो बेहद कमजोर होता है। अनुकरणीय स्वस्थ, अच्छी गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को चित्रा 3 में दिखाया गया है। (पैनल ए: एट्रियल मायोसाइट, पैनल बी: वेंट्रिकुलर मायोसाइट)। उच्च पैदावार वाले अलगाव से कोशिकाओं को सील गठन के लिए प्रतिरक्षा हो सकती है और इसके विपरीत। अंत में, सेल लुक और उपज की परवाह किए बिना अंतिम गुणवत्ता परीक्षण, एक सरल प्रश्न का उत्तर है: 'क्या प्रत्येक अलगाव की पृथक कोशिकाओं में उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों के साथ वांछित माप करना संभव है? ऊपर दिया गया प्रोटोकॉल एक सकारात्मक उत्तर संभव बनाता है।

कई अलगाव प्रोटोकॉल उच्च पैदावार और बेहतर गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अनकपलिंग एजेंट ब्लेबिस्टैटिन का उपयोग करते हैं। यह प्रोटोकॉल ऑप्टिकल मैपिंग प्रयोगों में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी28,29 पर इसके प्रभाव के प्रकाशित सबूतों को ध्यान में रखते हुए, जानबूझकर ब्लेबिस्टैटिन से बचता है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों में अनकपलिंग एजेंटों का उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए और उन परिस्थितियों तक सीमित होना चाहिए जहां अनकपलिंग अनिवार्य है।

इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग फ्लुओ -3 के साथ लोड होने के बाद लगभग छह घंटे तक किया जा सकता है, जिसमें एट्रियल कोशिकाएं समय के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं। नतीजतन, वेंट्रिकुलर कोशिकाओं से पहले एट्रियल कोशिकाओं का अध्ययन करने की सिफारिश की जाती है यदि वही शोधकर्ता उन्हें संसाधित करता है।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा - जैसा कि अधिकांश लैंगेंडॉर्फ-आधारित अलगाव प्रोटोकॉल के लिए सच है - यह है कि यह तकनीकी रूप से कठिन है। जाहिर है, माउस दिल छोटे हैं, और सभी तकनीकी पहलुओं को बहुत अधिक व्यायाम की आवश्यकता होती है। इसका मतलब है कि एक अनुभवी शोधकर्ता बेहतर परिणाम प्राप्त करेगा। कुछ प्रोटोकॉल दिल को प्रभावित करने के लिए निरंतर दबाव का उपयोग करते हैं। इसका लाभ यह है कि पाचन और ऊतक प्रतिरोध के लगातार नुकसान के कारण छिड़काव में तेजी आएगी, और यह इष्टतम पाचन समय को परिभाषित करने में मदद करता है, फिर भी त्वरण ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है और सेल की गुणवत्ता को काफी कम कर सकता है। यहां उपयोग किए जाने वाले निरंतर प्रवाह दृष्टिकोण में, पाचन समय के लिए कोई स्पष्ट बेंचमार्क नहीं हैं और अक्सर इष्टतम समय पर पाचन को रोकना कठिन हो सकता है, जो एक प्रासंगिक सीमा को चिह्नित करता है। एक और सीमा यह है कि इस प्रोटोकॉल में पृथक कोशिकाओं को केवल ऊपर वर्णित प्रयोगों के लिए उपयुक्तता के लिए परीक्षण किया गया था। यह संभावना है कि इन कोशिकाओं का उपयोग विभिन्न विश्लेषणों के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन यह अभी भी साबित होना चाहिए। उस दिशा में पहला कदम इस कोशिकाओं का उपयोग VF2.1CI के साथ लोड करके कार्रवाई क्षमता की कल्पना करने के लिए किया गया था, जो हाल ही में व्युत्पन्न वोल्टेज संवेदनशीलता डाई है जिसमें पहले इस्तेमाल किए गए वोल्टेज संवेदनशील रंगों के लिए बेहतर कैनेटीक्स है। समस्या निवारण में मदद करने के लिए, तालिका 7 सामान्य अलगाव समस्याओं और उनसे संपर्क करने के तरीके को दर्शाती है।

एक साथ लिया गया, वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए एक कामकाजी दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिससे शोधकर्ता को एक माउस के एट्रियल और वेंट्रिकुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फेनोटाइप प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। यह पिछले अलगाव प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न सांख्यिकीय बाधाओं को दूर करता है जो केवल उच्च गुणवत्ता पर एट्रियल या वेंट्रिकुलर कोशिकाओं को अलग करता है और एक विशिष्ट अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने में मदद करता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है यदि हस्तक्षेप, उदाहरण के लिए, महंगे एजेंटों से भरे आसमाटिक मिनीपंप का आरोपण प्रयोगों का हिस्सा है, और यह पशु कल्याण विचारों में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा समर्थित था; संवहनी चिकित्सा में क्लिनिशियन वैज्ञानिक कार्यक्रम (प्राइम), एमए 2186/14-1 से पी. टॉमसिट्स और डी. शुटलर; वीओ1568/3-1, आईआरटीजी1816, और एसएफबी1002 प्रोजेक्ट ए13 टू एन वोइट, जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ईएक्ससी 2067/1- एन वोइट के 390729940), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस. क्लॉस और एन. वोइट; 81जेड0600206 से एस. के.के.ए.बी.एस. हेनरिक-एंड-लोटे-मुहलफेनज़ल स्टिफटंग (एस क्लॉस के लिए) और एल्स-क्रोनर-फ्रेसेनियस फाउंडेशन (ईकेएफएस 2016_A20 एन वोइट)। पांडुलिपि तैयार करने में फंड र्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich 31550
27G cannula Servoprax L10220
4-Aminopyridine Sigma-Aldrich A78403
Anhydrous DMSO Sigma-Aldrich D12345
Aortic cannula Radnoti 130163-20
BaCl2 Sigma-Aldrich 342920
blunt surgical forceps Kent Scientific INS650915-4
Bovine Calf Serum Sigma-Aldrich 12133C
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Circulating heated water bath Julabo ME
Collagenase Type II Worthington LS994177
disscetion scissors Kent Scientific INS600124
DL-aspartat K+-salt Sigma-Aldrich A2025
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fluo-3 Invitrogen F3715
Fluo-3 AM Invitrogen F1242
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Guanosine 5′-triphosphate tris salt Sigma-Aldrich G9002
Heating coil Radnoti 158821
Heparin Ratiopharm 25.000 IE/5ml
HEPES Sigma-Aldrich H9136
induction chamber CWE incorporated 13-40020
Isoflurane Cp-pharma 1214
Jacketed heart chamber Radnoti 130160
KCl Merck 1049360250
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
MgCl x 6H2O Sigma-Aldrich M0250
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M9397
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Na2HPO4 x 2H2O Sigma-Aldrich S5136
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
Nylon mesh (200 µm) VWR-Germany 510-9527
pasteur pipette Sigma Aldrich Z331759
petri-dishes Thermo Fisher 150318
Pluronic Acid F-127 Sigma-Aldrich P2443
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
Roller Pump Ismatec ISM597D
surgical forceps Kent Scientific INS650908-4
surgical scissors Kent Scientific INS700540
suturing silk Fine Science Tools NC9416241
syringe Merck Z683531-100EA
Taurin Sigma-Aldrich 86330

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जोव में यह महीना अंक 165 अतालता मुराइन मायोसाइट अलगाव लैंगेंडॉर्फ-छिड़काव एल-प्रकार कैल्शियम वर्तमान कैल्शियम क्षणिक पैच क्लैंप
सीए<sup>2 +</sup> क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम करंट के एक साथ माप के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स का अलगाव
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Tomsits, P., Schüttler, D.,… More

Tomsits, P., Schüttler, D., Kääb, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current. J. Vis. Exp. (165), e61964, doi:10.3791/61964 (2020).

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