Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescerende lækage assay til at undersøge membranen destabilisering af Cell-gennemtrængende peptid

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/62028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

Summary

Fluorescenslækageanalysen er en simpel metode, der gør det muligt at undersøge peptid / membraninteraktioner for at forstå deres involvering i flere biologiske processer og især evnen til cellegennemtrængende peptider for at forstyrre fosfolipider bilayers under en direkte cellulær translokationsproces.

Abstract

Cellegennemtrængende peptider (CPPs) defineres som bærere, der er i stand til at krydse plasmamembranen og overføre en last til celler. Et af de vigtigste fælles træk, der kræves for denne aktivitet, skyldes samspillet mellem HLPs med plasmamembranen (lipider) og især med komponenter i den ekstracellulære matrix af membranen selv (heparansulfat). Faktisk er lipid-bilayere uafhængigt af den direkte translokation eller den endokyoseafhængige internalisering involveret i internaliseringsprocessen både på plasmamembranniveau og på intracellulær trafikniveau (endosomale vesikler). I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver de forskellige trin i en stor unilamellar vesikler (LUVs) formulering, rensning, karakterisering og anvendelse i fluorescenslækageanalyse for at opdage mulig CPP-membran destabilisering / interaktion og for at adressere deres rolle i internaliseringsmekanismen. LUVs med en lipid sammensætning afspejler plasmamembran indhold genereres for at indkapsle både en fluorescerende farvestof og en quencher. Tilsætning af peptider i ekstravesicular medium og induktion af peptid-membran interaktioner på LUVs kan således fremkalde i en dosis-afhængig måde en betydelig stigning i fluorescens afslører en lækage. Eksempler er forsynet her med den nyligt udviklede tryptofan (W) - og arginin (R)-rige amphipatiske peptider (WRAPs), som viste en hurtig og effektiv siRNA levering i forskellige cellelinjer. Endelig diskuteres arten af disse interaktioner og affiniteten for lipider for at forstå og forbedre membrantranslokationen og / eller den endosomale flugt.

Introduction

Efter deres opdagelse i halvfemserne, celle-gennemtrængende peptider (CPPs) blev udviklet til at fremme en effektiv cellulær levering af laster gennem plasmamembranen1,2. CPC'er er normalt korte peptider, generelt 8 til 30 aminosyrer, der har en bred vifte af oprindelse. De blev først defineret som "direkte translocating" luftfartsselskaber, hvilket betyder, at de var i stand til at krydse plasmamembranen og overføre en last til celler uafhængigt af enhver endocytotisk vej hverken energibehov eller receptor involvering. Yderligere undersøgelser viste imidlertid , at disse første observationer hovedsagelig kom fra overvurdering af fluorescens på grund af den eksperimentelle artefakt og/eller fikseringsprotokoller ved hjælp af methanol3. I dag er det almindeligt accepteret, at CPP-optagelse finder sted ved både endokytose og energiuafhængig translokation4,5,6,7 afhængigt af forskellige parametre såsom lastens art, den anvendte forbindelse mellem CPP og last, den undersøgte cellelinje osv.

CAP'er kan anvendes som transfectionmidler i henhold til to strategier, der enten involverer en kemisk forbindelse (kovalent strategi) eller elektrostatiske/hydrofobiske interaktioner (ikke-kovalent strategi) mellem CPP og dets last8,9,10,11. Selv om begge strategier har vist deres effektivitet i celleoverførsel af flere laster, forståelsen af mekanismen for internalisering af CPPs er stadig under kontroverser, og balancen mellem endokytose veje eller direkte penetration er stadig vanskeligt at måle12,13. Selv om der findes et sæt eksperimentelle værktøjer og strategier til klart at håndtere inddragelsen af endoytiske processer, synes den direkte translokation imidlertid vanskeligere at karakterisere, da det indebærer mere diskrete interaktioner med plasmamembrankomponenter. Biologiske membraner består normalt af mange komponenter, fra fosfolipider til membranproteiner, som kan variere afhængigt af celletypen og / eller miljøet (stressforhold, celledeling osv.). Denne mangfoldighed af sammensætning, og dermed fraværet af en universel cellulær membran model ikke muliggør undersøgelser på en enkelt måde. Men for at omgå disse begrænsninger trin-for-trin tilgange blev udviklet med kunstige membran eller membran ekstrakter. Fra små unilamellar vesikler til monolayer tilgange, hver model var klart relevant at besvare specifikke spørgsmål14,15. Blandt dem udgør store unilamellar vesikler (LUVs) en passende membran efterligne model til at studere peptid / membran interaktioner som et centralt punkt i internaliseringsprocessen.

I den forbindelse beskriver følgende protokol undersøgelsen af virkningerne af peptider og peptid/membraninteraktioner på LUVs-integritet gennem overvågning af både et anionisk fluorescerende farvestof og dets tilsvarende polykationiske quencher indkapslet i liposomer. Dette værktøj bruges til at studere CPP/membraninteraktioner for at forstå, om de er i stand til at udføre en direkte membrantranslokation. Selvom det normalt anvendes til at sammenligne forskellige membran-interagerende peptider, denne LUV fluorescens lækage assay kunne også bruges til at undersøge både CPPs-last konjugere (kovalent strategi) og CPP: fragt komplekser (ikke-kovalent strategi).

Den nuværende protokol vil derfor først blive eksemplificeret med den nyligt udviklede tryptofan (W) - og arginin (R)-rige amphipatiske Peptider (WRAP)16. WRAP er i stand til at danne peptidbaserede nanopartikler til hurtigt og effektivt at levere små forstyrrende RNA (siRNA) i flere cellelinjer16. Fluorescenslækageegenskaberne for WRAP peptid alene eller siRNA-loaded WRAP-baserede nanopartikler blev overvåget for at karakterisere deres mekanisme for cellulær internalisering. Vi viste, at deres internaliseringsmekanisme hovedsagelig involverede direkte translokation7. I et andet eksempel blev WRAP peptid kovalent konjugeret til protein / protein interfererende peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 og dens evne til at destabilisere membraner blev sammenlignet i en fluorescens lækage assay til iCAL36 koblet til Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), en anden CPP.

Endelig vil metodens fordele og begrænsninger blive drøftet både ud fra et teknologisk synspunkt og med hensyn til biologisk relevans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af store Unilamellar Vesikler (LUVs)

  1. Forbered LUVs til deres brug som cellemembran efterligner for fluorescens lækage assay.
  2. Bland med en Hamilton glas sprøjte fosphatidylcholin (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) og kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ved molarforholdet 4:4:2. Lipidopløsningen er fremstillet ved hjælp af en lageropløsning af hver lipid, der er opløset i en methanol/chloroform (3/1; volumen/volumen) opløsningsmiddel ved 25 mg/mL i en 25 mL glas rundbundet kolbe. Lipidopløsningen er baseret på 4 μmol DOPC, 4 μmol SM og 2 μmol Chol og opnås ved hjælp af lageropløsning ved at blande henholdsvis 126 μL, 117 μL og 31 μL.
    FORSIGTIG: Methanol er et giftigt og brændbart opløsningsmiddel, og kloroform er giftigt og kræftfremkaldende. Begge skal håndteres med den passende beskyttelse under en hætte.
  3. Methanol/chloroform fordampes ved hjælp af en roterende fordamper under vakuum i løbet af 45-60 min ved 60 °C, indtil der er dannet en tørret lipidfilm.
  4. Forbered to lager HEPES buffer løsninger. Hepes buffer 1 forberedes ved at blande 20 mM HEPES (238,3 g/mol) og 75 mM NaCl (58,44 g/mol) og pH justeres til 7,4. Forbered HEPES buffer 2 ved at blande 20 mM HEPES og 145 mM NaCl og juster pH til 7,4. HEPES buffere kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
    BEMÆRK: Det anbefales at kontrollere operativsystemet af buffere ved hjælp af et osmometer.
  5. Forbered lipidhydreringsopløsning ved opløsning af membran uigennemtrængelig fluorescerende farvestof-quencher par, 8-aminonaphthalen-1, 3, 6-trisulfonsyre, disodiumsalt ved 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) og p-xylen-bispyridiniumbromid ved 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) i HEPES bufferopløsning. Blanding af ANTS med DPX fører til en gulfarvet opløsning. For at opnå koncentrationerne på 12,5 mM ANTS og 45 mM DPX opløses henholdsvis 21,4 mg og 76 mg i 4 mL HEPES buffer 1.
    BEMÆRK: Lipidhydreringsopløsning kan opbevares i 2 uger ved 4 °C ved at pakke røret ind med aluminiumsfolie.
  6. Rekonstitueret multilamellar vesikler (MLV) ved at genoplive den tørrede lipid film med 1 mL af lipid hydrering opløsning og ved hvirvle indtil opløsning af den tørrede lipid film. Sørg for, at opløsningen er helt opløses som små lipid aggregater vil have en negativ indvirkning på de foregående trin. Kontroller også væggen i glaskolben med runde bund for at sikre, at der ikke er nogen resterende lipidfilm.
    BEMÆRK: Opløsningen vises opalescent og lysegul efter solubiliseringen.
  7. Underlægge vesikler til fem fryse / optø cyklusser for at opnå unilamellar vesikler. Udfør hver cyklus ved at sætte glasset rundtbundskolbe i 30 s i flydende nitrogen til frysning af trin og derefter efterlade den i et vandbad i 2 minutter til optøningstrin.
    BEMÆRK: Badevandets temperatur skal være 5-10 °C højere end lipidernes smeltetemperatur.
  8. Forbered lipid ekstruder ved at indsætte to filter understøtter foreløbig befugtet med HEPES buffer i hver polytetrafluoroethylen (PTFE) ekstruder stykke placeret i metal ekstruder beholderen.
  9. Sæt en HEPES befugtet polycarbonatmembran (0,1 μm pore størrelse, 25 mm diameter) på toppen af et filterstøtte.
  10. Saml de to metal ekstrudere dunke og skrue dem.
  11. Placer den samlede ekstruder i holderen, og indfør en 1 mL-sprøjte i det relevante hul i ekstremiteten af hvert polytetrafluoroethylenekstruderstykke. Ekstrudering svarer til passagen af den væske, der er testet fra den ene sprøjte til den anden gennem polycarbonatmembranen.
  12. Test ekstruderen med 1 mL HEPES-buffer lastet i en af 1 mL-sprøjten for at sikre, at der ikke er lækager eller problemer.
  13. Udskift 1 mL HEPES-bufferen med MLV-prøven.
  14. Ekstrudering ved at overføre MLV-prøven fra den ene sprøjte til den anden gennem polycarbonatmembranen mindst 21 gange for at opnå ensartede LUV'er af samme størrelse.
    BEMÆRK: Ekstrudering skal udføres ved en temperatur, der er højere end lipidblandingens smeltetemperatur.

2. Rensning af LUV'er

  1. Forbered en kolonnerensning for at fjerne ikke-indkapslet ANTS og DPX overskydende.
  2. Indfør krydsbundet dextrangel (G-50) ophængt i vandigt medium med 0,01% NaN3 (65 g/mol) i en flydende kromatografisøjle (Luer Lock, Ikke-jakke, 1,0 cm x 20 cm, sengevolumen 16 mL) op til 1 cm under toppen af kolonnens farveløse del.
  3. Åbn hanen og lad væsken flyde for at afregne den krydsforbundne dextrangel.
  4. Vask kolonnen ved at stikke af med 20 mL HEPES buffer 2, og kassér kolonnens outputflow.
  5. Luk hanen, når den døde mængde opløsningsmiddel over kolonnen er minimeret (<100 μL), men tilstrækkelig til at undgå tørring af den krydsforbundne dextrangel.
  6. Placer de frisk ekstruderede LUVs (gul) på kolonnen og lad dem komme ind i den krydsforbundne dextran gel.
  7. Føj kontinuerligt HEPES buffer 2 til kolonnen for at udføre LUV-rensningen.
  8. Eluter ca. 2 mL HEPES buffer 2 (glem ikke regelmæssigt at fylde toppen af kolonnen for at undgå at tørre den krydsforbundne dextrangel): Den frie gule ANTS og DPX-opløsning migrerer langsommere end liposomer.
  9. Begynd at opsamle rensede LUV'er i rør (1,5 mL).
  10. Overhold dråberne af eluent fra kolonnen, og når de bliver opalescent, indeholder de liposomer. Skift røret for at gendanne den LUV-holdige brøk.
  11. Elute indtil dråberne ikke længere er opalescent (~ 1 mL). Derefter elute en anden 0,5 mL i en separat brøk og derefter stoppe eluting.
    BEMÆRK: Standarder er nu tilgængelige i en bred vifte af molekylvægte, som kits eller individuelle molekylvægte til kalibrering af ellutionsvolumen af LUVs.
  12. Pak rørene med LUVs i aluminiumsfolie for at undgå blegning af fluorescensfarvet.
  13. Vask kolonnen med 20 mL HEPES buffer 2.
  14. LUV'erne kan derefter opbevares i en uge ved 4 °C.
    BEMÆRK: Da LUV-stabiliteten kan afhænge af LUV-koncentration og -sammensætning samt af ionisk styrke, bør LUV'ernes størrelse styres ved hjælp af et dynamisk lysspredningsinstrument (DLS) (se afsnit 4). Karakterisering af LUV-størrelse og homogenitet) før hver test.

3. Kvantificering af koncentrationen af LUV'er

  1. Anslå LUV koncentration ved en fosfolipid kvantificering kit, som gør det muligt at evaluere cholin koncentration19. Denne analyse kan anvendes, når fosfolipider med cholin indeholdende polarhoved er betydelig (>50% af LUVs).
  2. Farvereagensen forberedes ved at opløse 18 mg kromsubstrat i 3 mL buffer.
  3. Læg en polystyren cuvette, 10 x 10 x 45 mm, med 3 mL farve reagens.
  4. Brug det rene farvegens som tom tilstand (Tom). Der tilsættes 20 μL LUV-prøve (test) eller 20 μL standardopløsning med kendt cholinkoncentration (Standard).
  5. Bland godt og inkuber i 5 min ved 37 °C alle betingelser (Blank, Test og Standard).
  6. Testprøvens og standardopløsningens absorbans (optisk tæthed, OD) med den tomme opløsning som kontrol ved 600 nm med et spektrofotometer.
  7. Kontroller od-værdierne, som gør det muligt at anslå lipidkoncentrationen af LUV'erne, C[LUV], i cholinækvivalent sammenlignet med standarden for kendt koncentration.
  8. Udfør beregningen ved hjælp af følgende ligning:
    C[LUV] (mol / l) = (OD-prøve / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
    BEMÆRK: Phospholipid quantification kit forudsat en Cholin Chlorid (139,6 mg/l) standardopløsning ved 54 mg/dL svarende til molarkoncentration af C[Standard] = 3,87 mmol/L. OD Prøve og OD Standard er absorbanser målt ved 600 nm for LUV og Cholin løsninger, henholdsvis.

4. Karakterisering af LUV-størrelse og homogenitet

  1. Udfør en måling ved hjælp af et DLS-instrument for at bestemme LUV-størrelsen (i nm) og pdi -indekset (polydispersity index).
  2. Programmer den relevante "standardoperationsprocedure" (SOP) ved at angive opløsningsmidlets/bufferens viskositet og det anvendte cuvette.
  3. Placer 500 μL af LUV-opløsningen i en polystyren halvmikro-cuvette.
  4. Sæt polystyren semi-mikro-cuvette i et DLS-instrument.
  5. Ved stuetemperatur måles størrelsesfordelingen med hensyn til middelstørrelse (Z-gennemsnit) af partikelfordelingen og homogeniteten (polydispersitetsindeks, PdI).
  6. Alle resultater opnås fra to uafhængige målinger udført hver i tre gentagne cyklusser.
    BEMÆRK: Standardværdier for LUV'er vil være en gennemsnitlig størrelse på 137 ± 7 nm med en PDI på 0,149 ± 0,041.

5. Forberedelse af peptidopløsninger

  1. Forbered en lageropløsning af peptid, som skal analyseres til lækageanalysen.
  2. Peptidpulver (>95 % renhed) opløses i rent vand (f.eks. 1 mg peptid i 500 μL rent vand).
    BEMÆRK: Det anbefales at fortynde peptider i rent vand og undgå dimethylsulfoxid (DMSO) opløses, hvilket kan fremkalde artefakter (f.eks. membranpermeabilisering20).
  3. Vortex peptidopløsningen til 5 s.
  4. Soniker peptidopløsningen i et vand sonikeringsbad i 5 min og derefter centrifuge i 5 min ved 12.225 x g. Saml supernatanten til koncentrationsbestemmelse.
  5. Mål absorbansen ved 280 nm af tre uafhængige peptid fortyndinger og derefter beregne peptid koncentration ved hjælp af sin molar udryddelse koefficient ε (afhængigt af tryptofan og tyrosin indhold i peptid sekvens) og Beer-Lambert regel.
    BEMÆRK: Hvis peptid indeholder tryptofan og tyrosin, beregnes molarudryddelseskoefficienten ε på grundlag af Tryptofan ε = 5.690 M-1cm-1 og tyrosin ε = 1.280 M-1cm-1. Hvis peptidsekvensen ikke indeholder tryptofan eller tyrosin, kan der udføres anden farvemetrisk analyse for at måle koncentrationen (f.eks. BCA eller Bradford).
  6. Peptidopløsningen fortyndes i rent vand til en endelig opløsning på 100 μM og opbevares ved 4 °C.
    BEMÆRK: Ved rent vand forekommer der ingen nedbrydning af peptid under 4 °C-opbevaringen. Peptidkoncentrationen skal dog måles hver anden uge for at sikre, at der ikke forekommer vandfordampning.

6. Fluorescens lækage assay

  1. Fluorescenslækageanalyse måles på et spektrfluorometer ved stuetemperatur. Excitation og emission bølgelængde er fastsat på Ex = 360 nm ± 3 nm og Em = 530 nm ± 5 nm, henholdsvis.
  2. Fortynd LUV'er i 1 mL HEPES buffer 2 til en endelig koncentration på 100 μM i en kvarts fluorescens cuvette. Tilsæt en magnetisk omrører for at homogenisere opløsningen under eksperimentet.
  3. Mål LUVs alene i løbet af de første 100 s, mellem t = 0 s og t = 99 s for at få adgang til baggrunden fluorescens.
    BEMÆRK: LUV'er alene kan også måles under hele forsøget (15 min) for at få adgang til baggrundslyscence og potentielle lækager.
  4. Derefter måles lækage som en stigning i fluorescensintensiteten ved tilsætning af aliquots af peptidopløsning i de næste 900 s (15 min). Denne protokol udføres for hver koncentration af peptid, der testes fra 0,1 μM til 2,5 μM.
  5. Endelig blev 100% fluorescens opnået ved at opløse LUV'erne ved tilsætning af 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v), hvilket resulterede i den helt uudslukkede sonde mellem t = 1.000 s og t = 1.100 s.

7. Kvantificering af lækagen

  1. Undertrykke værdier opnået efter t = 1.090 s for at holde det samme antal point for hver testet tilstand.
  2. Beregn den minimale fluorescens, Fmin, ved at gøre gennemsnittet på 50 point mellem t = 0 s og t = 49 s (LUVs alene).
  3. Beregn den maksimale fluorescens, Fmax, ved at gøre gennemsnittet på 50 point mellem t = 1.041 s og t = 1.090 s (LUVs med Triton X-100).
  4. Beregn lækageprocenten (%Lækage) på hvert tidspunkt (t = x) i henhold til følgende ligning:
    %Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin)/ (Fmax - Fmin)x 100
  5. Beregne den gennemsnitlige og standardafvigelse for værdier, der er opnået med forskellige LUV-præparater (n ≥ 2) for samme betingelse.
  6. Plotte lækageprocenten % Leak(t=x)i tidsfunktionen(r).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Princippet om fluorescenslækageanalysen er vist i figur 1. I detaljer behandles store unilamellar vesikler (LUVs), der indkapsler et fluorescerende farvestof og en quencher (intet fluorescenssignal) med biomolekylet af interesse. På grund af peptidens interaktion med lipidmembraner, hvilket kan indebære membran permeabilitet, reorganisering eller endda brud, frigives fluorescensfarven og quencher fra LUVs. Efterfølgende fortyndinger i bufferen resulterer i et øget fluorescenssignal.

Selv om denne ordning viser en test med frie peptider, fordelen ved systemet ligger i evnen til også at teste last-konjugerede peptider, peptid-baserede nanopartikler eller andre biopolymers, som mistænkes for at destabilisere lipid membraner. Selv om en foreløbig optimering af protokollen, især med hensyn til de testede molekyler er påkrævet, denne fluorescens lækage assay kan udvides til et stort udvalg af membran-interagerende komponenter. I denne protokol viser vi nogle resultater opnået med CPPs og deres komplekse (ikke-kovalente strategi) eller konjugerede (kovalente strategi) former. Følgende eksempler indebærer WRAP alene samt siRNA-loaded WRAP-baserede nanopartikler og to forskellige peptid-konjugates (WRAP-iCAL3617 og Penetratin-iCAL36).

Med hensyn til ikke-kovalent strategi vises fluorescenslækageanalyse med peptider og med deres tilsvarende siRNA-lastede nanopartikler i nærværelse af LUV'er i figur 2. Vesiklerne består af en blanding af DOPC/SM/Chol (4:4:2), der afspejler plasmamembranen som beskrevet i Konate et al.21, og bruges normalt til direkte at vurdere muligheden for lipid bilayer interaktion og /eller transduktionsegenskaber af frie WRAP- og WRAP-baserede nanopartikler7. I mangel af peptider observeres der ingen lækage (baseline i de første 100 s). Tilsætning af gratis WRAP på LUVs fremkalder en betydelig stigning i fluorescens afslører en vigtig LUV lækage og ANTS frigivelse. Efter 15 min opnås en lækage på 67,8% ± 0,4% sammenlignet med Triton-tilstanden (positiv kontrol) ved den anvendte koncentration (2,5 μM) af WRAP peptid. Det skal her bemærkes, at flere forskellige koncentrationer også er blevet testet og afsløret en dosisafhængig fluorescensforøgelse, svarende til en dosisafhængig LUV-lækage7. I modsætning hertil, når WRAP samles i samme koncentration med siRNA til at danne peptid-baserede nanopartikler, lækagen er 1,5 gange svagere (40,5% ± 0,5%) i forhold til den frie peptid (Figur 2). Lignende lækageværdier er blevet rapporteret for RICK peptid (60%) eller RICK:siRNA nanopartikler (28%)22. Forskellen i værdier mellem fri peptid i forhold til nanopartikler kan forklares ved, at når de er involveret i nanopartiklerne, er en væsentlig del af peptid involveret i direkte interaktioner med siRNA, hvilket reducerer peptidtilgængeligheden for interaktioner med lipider.

Med hensyn til den kovalente strategi er analyser af fluorescenslækage med CPP-konjugates i nærværelse af LUV'er vist i figur 3. Med samme LUV-sammensætning [DOPC/SM/Chol (4:4:2)] anvendes to konjugerede peptider: WRAP-iCAL36 og Penetratin-iCAL36. Som tidligere bemærket observeres der ingen lækage i mangel af peptider. 15 min efter injektion af 2,5 μM penetratin-iCAL36 påvises der ingen signifikant fluorescensforøgelse (2,3 % ± 0,7 %), mens en tilsætning på 2,5 μM WRAP-iCAL36 fremkalder en nettolækage karakteriseret ved meget stærkt fluorescenssignal (85,8 % ± 11,1 %)17. Disse observationer tyder på, at for nogle peptider, eller konjugere, ingen fluorescens lækage kan forekomme, tyder på ingen peptid / membran interaktioner eller ingen lipid bilayer forstyrrelse. Dette er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater , der viser , at Penetratin samt Tat ikke var i stand til at destabilisere membraner23,24,25. Det skal fremhæves, at membran destabilisering egenskaber af en CPP kan ændre sig afhængigt af koblet last26.

Selv om WRAP-iCAL36 forårsagede en stærk lækage, afslører yderligere undersøgelser ikke specifik cellulær internalisering, hvilket indikerer, at disse konjugates forblev inde i lipids-bilayeren i plasmamembranen17. I modsætning til WRAP nanopartiklerne antager vi, at WRAP-cargo konjugaten er i stand til at destabilisere LUV-membranen ved at holde sig mellem lipidkæderne eller ved at danne porer.

Disse resultater tyder på, at fluorescenslækageanalysen kan afsløre nogle CSP'ers evne til at udvikle peptid /membraninteraktioner, hvilket kan føre til en mere eller mindre udtalt membranpermeabilitet. Desuden kan disse interaktioner forekomme uanset strategien for levering af laster (nanopartikler versus konjugates). Omvendt diskriminerer denne metode ikke, om et CPP, som ikke fremkalder fluorescenslækage, stadig kan interagere med lipidernes bilayer eller biologiske membran. Denne form for adfærd kræver yderligere tilgange såsom zeta-potentielle målinger, FRET mellem peptid og membran, eller tryptofan fluorescens eksperimenter for at nævne kun et par eksempler.

Figure 1
Figur 1: Princippet om fluorescenslækageanalysen. LUVs blev lastet med et fluorescerende farvestof (ANTS) i hvid og dens tilsvarende quencher (DPX) i grå. I mangel af peptider (i rødt) blev der ikke observeret fluorescenssignal, fordi ANTS fluorescens blev slukket af DPX. Tilsætning af peptider på LUVs induceret membran permeabilitet og den efterfølgende frigivelse af både ANTS og DPX resulterer i en betydelig stigning i ANTS fluorescens (gul). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fluorescenslækageanalyse med gratis WRAP- og WRAP:siRNA nanopartikler. Peptid alene og siRNA-loaded nanopartikler blev anvendt på LUVs ved peptidkoncentrationen på 2,5 μM. WRAP-baserede nanopartikler blev formuleret ved et peptid:siRNA molarforhold på 20 (R 20) som beskrevet i Konate et al.7,16. Sorte pile viser injektioner af peptid (nanopartikler) og Triton X-100, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fluorescenslækageanalyse med WRAP-iCAL36 og Penetratin-iCAL36 konjugerer. Konjugates blev anvendt på LUVs i koncentration af 2,5 μM. Sorte pile viser injektioner af peptid og Triton X-100, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede fluorescens lækage assay er en enkel og hurtig metode til at løse membran destabilisering af celle-gennemtrængende peptid. Let at gøre, det giver også mulighed for en indirekte sammenligning mellem forskellige membran-interagerende peptider eller andre membran-interagerende molekyler. Med hensyn til kritiske trin i protokollen, da denne analyse giver relative værdier mellem baseline (LUVs alene) og maksimal fluorescens frigivelse (Triton tilstand), vi normalt evaluere koncentrationen af LUVs ved hjælp af fosfolipid kvantificering kit, som kun anslår cholin bidrag luvs. Det er dog også muligt at medtage en mere præcis måling af LUV-koncentrationen ved at bestemme det samlede fosforindhold ved syrefordøjelse som beskrevet af Rouser og kolleger27 eller af Bartlett28 eller ved colorimetric metode ved hjælp af ammonium ferrothiocyanat kompleksning fosfolipider29. I vores hænder har det ikke indflydelse på den relative kvantificering af lækage og på sammenligningen mellem membran-interagerende peptider.

Med hensyn til anvendelsen af LUV'er bør man også bemærke, at det er vigtigt at kontrollere luv-basislinjen alene for at kontrollere, om de er anvendelige, og om de allerede viser lækager (karakteriseret ved en kontinuerlig stigning i fluorescens). På samme måde er det vigtigt at måle den maksimale fluorescensfrigivelse efter hver peptidinkubation for at sikre, at der ikke blev registreret falske negative resultater på grund af en uønsket slukningsproces (f.eks. peptid /farveslukning).

Generelt er LUVs ifølge DLS-karakterisering ret stabile i 1 uge og bør ikke vise en for høj fluorescensbaggrund. I denne forbindelse er rensning af ANTS/DPX-lastede liposomer ved gelfiltrering også et centralt punkt, da det muliggør dannelse af LUV'er uden at have resterende fluorescens, der kan bidrage til baggrunden eller producere fluorescensovervurdering. Derudover anbefales det på det kraftigste at kalibrere protokollen ved at inkludere en specifik positiv kontrol, der altid kan give den samme lækageprocent. Dette udgør en intern kontrol gennem de forskellige målinger, hvilket kan styrke karakteriseringen af LUV'erne for hver test og øge statistikkerne.

Selv om fluorescens lækage assay kan give en hurtig sammenligning i membran-destabilisering af CPC'er, det er dog begrænset i fortolkningen af peptid-membran interaktioner, da nogle peptider er i stand til at interagere med lipid bilayer uden at fremkalde nogen membran forstyrrelse eller lækage. For disse peptider anbefales det stærkt at anvende yderligere eksperimenter med specifikke fluorescensmarkører, der muliggør FRET30.

Det skal også bemærkes, at andre fluorescensfarve/quencherpar (f.eks. TB3+/DPA31)kan anvendes. Begge metoder har deres ulemper: Terbium (III) er ikke særlig opløseligt i vand og kan ikke anvendes i nærværelse af fosfat, mens ANTS-dæmpningen ikke er en lineær funktion af DPX-koncentrationen. Desuden kan andre selvlukkende materialer såsom 70 mM Calcein opløsning32 eller dextran-PTS33 håndteres afhængigt af membranfejl fremkaldt af den analyserede peptid eller forbindelse.

Endelig er den største fordel ved denne fluorescenslækageanalyse evnen til at teste et væld af potentielle membran interagerende molekyler samt forskellige membransammensætninger, såsom endosomal membran efterligner [f.eks dioleoylphosphatidylcholin (DOPC)/dioleoyl-fospha-tidylethanolamin (DOPE)/fosfatylinositol fra sojabønne (PI)/bis(monooleoylglglycero) fosfat (LBPA) ved et molarforhold på 5:2:1:2]34 , mitokondriemembran efterligner [f.eks. 46,5% DOPC, 28,5% fosfatylethanolamin (PE), 9% fosfatylinositol (PI), 9% fosfattidylserin (PS) og 7% cardiolipin (CL)35 eller enhver anden ønsket lipid bilayer sammensætning. Man skal dog først sikre stabiliteten af vesiklerne (ingen LUV-fusion, sammenlægning eller nedbør, ingen lipidisk, der falder ud af suspension, ingen negativ membrankrumning osv.) med en konstant middelstørrelse tæt på 100 nm under forsøg og opbevaring.

Derudover er fordelen ved denne metode sammenlignet med ekstraherede membraner (røde blodlegemer, mitokondrier osv.) brugen af rensede velkaraktererede lipider i mangel af proteiner. Kontrollen af lipid bilayer sammensætning (plasma, endosomal, eller mitokondriemembran) gør det også muligt at indsætte specifikke membran proteiner (protonpumpe). Desuden giver evnen til at kontrollere både LUVs interne og eksterne miljøer mulighed for en klar fortolkning af membranforstyrrelse / lækage. Sammenlignet med sort-lipid membran eksperimenter36, som også kan visualisere membran permeabilization begivenheder, denne lækage protokol giver en mere enkel screening metode til membran-aktive peptider.

Afslutningsvis favoriserer denne enkle metode en hurtig identifikation af stærke peptid / membraninteraktioner, der fører til membran destabilisering. Det kan anvendes til at undersøge mekanismen for internalisering af CPC'er og i en mere generel tilgang af "membranaktive peptider" såsom fusiogenic eller antimikrobielle peptider.

Generelt er karakteriseringen af hovedruten, der bruges af CPC'er til at nå cytoplasmaet, meget kompleks og kræver flere forskellige tilgange, fra biofysik til cellulær biologi. For eksempel afslørede undersøgelsen af WRAP internalisering en balance mellem forskellige mekanismer til at komme ind i cellerne (endodometri versus direkte translokation) og fluorescenslækage assay, forbundet med andre metoder, har bidraget til at støtte en direkte penetration proces7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Emilie Josse for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af fonden "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" og "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mL glass round-bottom flask Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) Invitrogen A350 Protect from light 
Chloroform  Sigma-Aldrich 288306
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) Avanti Polar 850375P Protect from air
Extruder Avanti Polar 610000
Fluorimeter PTI Serlabo
50 µL glass syringe Hamilton 705N
HEPES Sigma-Aldrich H3375
LabAssay Phospholipid  WAKO  296-63801
liquid chromatography column Sigma-Aldrich
Methanol Carlo Erba 414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) Whatman 800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm Grener Bio-One 614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS Fisher Scientific FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) Invitrogen X1525 Protect from light 
quartz fluorescence cuvette Hellma 109.004F-QS
rotavapor system  Heidolph Z334898
Sephadex G-50 resin Amersham 17-0042-01
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Sodium chlorid (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sonicator bath USC300T VWR 142-6001
Sphingomyelin Avanti Polar 860062P Protect from air
Triton X-100  Eromedex 2000-B
Zetaziser NanoZS  Malvern ZEN3500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
  3. Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
  4. Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
  5. Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  6. Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
  7. Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
  8. Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
  9. Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
  10. Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
  11. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  12. Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
  13. Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
  14. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
  15. Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
  16. Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
  17. Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
  18. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
  19. Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
  20. Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
  21. Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
  22. Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
  23. Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
  24. Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
  25. Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
  26. Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
  27. Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
  28. Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
  29. Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
  30. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
  31. Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
  32. Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
  33. van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
  34. Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
  35. Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
  36. Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).

Tags

Biokemi Udgave 166 cellegennemtrængende peptider membran fosfolipider interaktion fluorescens lækage
Fluorescerende lækage assay til at undersøge membranen destabilisering af Cell-gennemtrængende peptid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konate, K., Seisel, Q., Vivès,… More

Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (166), e62028, doi:10.3791/62028 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter