Summary
형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.
Abstract
세포 관통 펩티드(CpP)는 플라즈마 멤브레인을 교차하고 화물을 세포로 이송할 수 있는 운반체로 정의됩니다. 이 활동에 필요한 주요 일반적인 특징 중 하나는 플라즈마 멤브레인 (지질)과 CPP의 상호 작용및 특히 막 자체의 세포 외 매트릭스 (heparan sulphate)의 구성 요소에서 비롯되었습니다. 실제로, 직접적인 전좌 또는 내분비에 의존하는 내재화와는 별개로, 지질 이중층은 혈장 막의 수준과 세포내 교통(내외 소포)의 수준에서 모두 내화 공정에 관여한다. 이 문서에서는 가능한 CPP 멤브레인 불안정화/상호 작용을 감지하고 내부화 메커니즘에서 자신의 역할을 해결하기 위해 형광 누설 분석에서 큰 단음제 소포(LUV) 제제, 정제, 특성화 및 응용 프로그램의 다른 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 혈장 막 함량을 반영하는 지질 조성물을 가진 루프는 형광염과 담수를 모두 캡슐화하기 위해 생성된다. 루프염증에 대한 펩티드-멤브레인 상호작용의 외과 배지에 펩타이드를 첨가하고 따라서 투여량 의존적 방식으로 유도하여 누설을 드러내는 형광의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙양용 펩타이드(WRAPP)와 함께 다양한 세포주에서 신속하고 효율적인 siRNA 전달을 보여 준 사례가 여기에 제공된다. 마지막으로, 이러한 상호 작용의 본질과 지질에 대한 친화력은 막 전좌 및/또는 내인성 탈출을 이해하고 개선하기 위해 논의됩니다.
Introduction
90년대에 발견된 후, 세포 관통 펩티드(CpP)는 혈장 막1,2를통해 화물의 효율적인 세포 전달을 촉진하기 위해 개발되었다. CpPs는 일반적으로 짧은 펩티드, 일반적으로 8 ~ 30 아미노산, 기원의 다양 한 데. 그(것)들은 처음에 "직접 배분하는" 운반체로 정의되었습니다, 그(것)들이 플라즈마 막을 교차하고 에너지 요구 사항도 수용체 관여도 없는 어떤 내분 통로와 독립적으로 세포로 화물을 전송할 수 있었다는 것을 의미합니다. 그러나, 추가 조사는 이러한 첫 번째 관찰이 주로 실험 동맥 및 /또는 메탄올3을사용하여 고정 프로토콜에 형광 과대 평가에서 온 것으로 나타났다. 요즘CPP 섭취량은 내분세포증과 에너지 독립적인 전좌4,5,6,7 이에 따라 화물의 특성, CPP와 화물 간의 사용 링크, 연구된 세포주 등과 같은 다른 파라미터에 따라 이루어지는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
CPP는 CPP와그 화물8,9,10,11사이의 화학 링크(covalent strategy) 또는 정전기/소수성 상호 작용(비-공유 전략)을 포함하는 두 가지 전략에 따라 경전제로서 사용될 수 있다. 두 전략 모두 여러 화물의 세포 전달에 효율성을 보였지만, CPP에 의한 내산화 메커니즘에 대한 이해는 여전히 논란의 여지가 있으며 내분비 경로 또는 직접 침투 사이의 균형은 여전히12,13을측정하기 어렵다. 일련의 실험 도구와 전략이 내막 프로세스의 개입을 명확하게 해결할 수 있지만, 직접 전좌는 플라즈마 멤브레인 구성 요소와의 보다 이산적인 상호 작용을 의미하기 때문에 특성화하기가 더 어려워 보입니다. 생물학적 막은 일반적으로 세포 유형 및/또는 환경(스트레스 조건, 세포 분열 등)에 따라 달라질 수 있는 인지질에서 막 단백질에 이르기까지 수많은 성분으로 구성됩니다. 이러한 구성의 다양성, 따라서 보편적인 세포막 모델의 부재는 한 가지 방법으로 연구를 가능하게 하지 않는다. 그러나 이러한 한계를 우회하기 위해 단계별 접근법은 인공 막 또는 멤브레인 추출물로 개발되었다. 작은 unilamellar 소포에서 단층 접근법에 이르기까지 모든 모델은 특정 질문에14,15에분명히 답하는 데 관련이 있었습니다. 그 중에서도, 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 내재화 프로세스의 핵심 포인트인 펩티드 /멤브레인 상호 작용을 연구하기 위한 적절한 멤브레인 모방 모델을 구성한다.
이러한 맥락에서, 다음 프로토콜은 음이온 형광염과 리포솜에 캡슐화된 해당 다양양이온 담수의 모니터링을 통해 LUV 무결성에 대한 펩타이드 및 펩타이드/멤브레인 상호 작용의 영향에 대한 조사를 설명합니다. 이 도구는 직접 멤브레인 전좌를 수행 할 수 있는지 여부를 이해하기 위해 CPP / 멤브레인 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 일반적으로 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드를 비교하기 위해 적용되었지만,이 LUV 형광 누설 분석은 CPP-화물 공자 (공유 전략)와 CPP :화물 단지 (비 공유 전략)를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 본 프로토콜은 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙요법 펩타이드(WRAP)16과함께 먼저 예시된다. WRAP은 펩티드 계 나노입자를 형성하여 여러세포주(16)에서소형 간섭 RNA(siRNA)를 신속하고 효율적으로 전달할 수 있다. WRAP 펩티드 단독으로 또는 siRNA-로드 WRAP 계 나노입자의 형광 누설 특성을 모니터링하여 세포 내산화의 메커니즘을 특성화하였다. 우리는 내면화의 그들의 기계장치가 주로 직접 전좌7을관련시키는 것을 보여주었습니다. 두 번째 예에서, WRAP 펩타이드는 단백질/단백질 간섭 펩타이드 iCAL36(WRAP-iCAL36)17에 공유하게 되었고, 그 능력은 형광 누설 분석에서 페네타틴(Penetratin-iCAL36), 또 다른 CPP에 결합하였다.
마지막으로, 방법의 장점과 한계는 기술적 관점에서 생물학적 관련성에 대해 모두 논의될 것입니다.
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Protocol
1. 대형 유니라멜라 소포 준비 (LUV)
- 형광 누출 분석에 대 한 모방 세포 막으로 그들의 사용에 대 한 LUV를 준비.
- 해밀턴 유리 주사기 인스파디딜콜린(DOPC, 786.11 g/mol), 스핑크고미엘린(SM, 760.22 g/mol) 및 콜레스테롤(철, 386.65 g/mol)과 함께 4:4:2의 어금니비와 섞는다. 지질용 액액은 메탄올/클로로폼(3/1; 부피/부피)에서 25mL 유리 원형 플라스크에서 25 mg/mL의 용매로 용해된 각 지질의 스톡 용액으로부터 얻어진다. DOPC의 4μmol, SM의 4 μmol, 2 μmol, 철의 2 μmol를 기준으로, 지질 용액은 각각 126 μL, 117 μL 및 31 μL을 혼합하여 스톡 용액에서 얻어진다.
주의: 메탄올은 독성 및 인화성 용매이며 클로로폼은 독성및 발암성입니다. 둘 다 후드 아래에서 적절한 보호 기능을 처리해야 합니다. - 건조지질막이 형성될 때까지 60°C에서 45-60분 동안 진공 하에서 회전 증발기하에서 메탄올/클로로포형을 증발시킵니다.
- 두 개의 주식 HEPES 버퍼 솔루션을 준비합니다. 20m HEPES(238.3g/mol)와 75m MM NaCl(58.44g/mol)을 혼합하여 HEPES 버퍼 1을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 20m HEPES 및 145m NaCl을 혼합하여 HEPES 버퍼 2를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. HEPES 버퍼는 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
참고: 진동계를 사용하여 버퍼의 진동을 확인하는 것이 좋습니다. - 막 불투과성 형광염염수 커플을 용해시켜 지질 수분 공급 용액을 준비하고, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic 산, 디나트륨 소금 12.5 mM (개미, 427.33 g/mol) 및 P 자일렌 바이스파이리디늄 브로마이드 45 mM (DPX, 422.16 g/mol) HEPES 완충액용. 개미와 DPX를 혼합하면 노란색 용액이 나타납니다. 12.5mM의 ANTS와 45mM의 농도를 달성하기 위해, HEPES 버퍼 1의 4mL에서 각각 21.4 mg 및 76 mg을 용해한다.
참고: 지질 수분 용액은 튜브를 알루미늄 호일로 래핑하여 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다. - 지질 수분 공급 액액의 1mL로 건조지질필름을 재보습하고 건조지질필름의 용해될 때까지 소용돌이를 통해 다발성지질제(MLV)를 재구성한다. 작은 지질 응집체가 이전 단계에 부정적인 영향을 미치므로 용액이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 또한 유리 원형 플라스크의 벽을 확인하여 남은 지질 필름이 없는지 확인하십시오.
참고: 용해도 가루 후 용액이 오팔레스센트와 밝은 노란색으로 나타납니다. - 단알라멜라 소포를 얻기 위해 5개의 동결/해동 사이클로 소포를 가치. 유리 원형 바닥 플라스크를 액체 질소에 30초 동안 넣고 해동 스텝을 위해 2분 동안 수조에 방치하여 각 주기를 수행합니다.
참고: 목욕물의 온도는 지질의 용융 온도보다 5-10°C 높아야 합니다. - 금속 압출기 캐니스터에 배치된 각 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 압출기 조각에 HEPES 버퍼로 예비 가습을 지원하는 2개의 필터를 삽입하여 지질 압출기 준비.
- HEPES 가습 폴리카보네이트 멤브레인(0.1 μm 모공 크기, 직경 25mm)을 하나의 필터 지지대 위에 놓습니다.
- 두 개의 금속 압출기 캐니스터를 조립하고 나사.
- 조립된 압출자를 홀더에 놓고 각 폴리테트라플루오로틸렌 압출기 조각의 사지에 적절한 구멍에 1mL 주사기를 넣습니다. 압출은 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기로 테스트된 액체의 통과에 해당한다.
- 압출기를 1mL 주사기 중 하나에 로드한 HEPES 버퍼 1mL로 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 발생하지 않도록 합니다.
- 1mL HEPES 버퍼를 MLV 샘플로 바꿉니까.
- 동일한 크기의 균일한 LUV를 얻기 위해 적어도 21회 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기에서 다른 주사기로 MLV 샘플을 전달하여 압출을 수행합니다.
참고: 압출은 지질 혼합물의 용융 온도보다 높은 온도에서 수행되어야 합니다.
2. 루브의 정화
- 캡슐화되지 않은 개미및 DPX 초과를 제거하기 위해 컬럼 정화를 준비합니다.
- 액체 크로마토그래피 컬럼(Luer Lock, Non-jacketed, 1.0cm x 20cm, 침대 볼륨 16mL)에서 0.01% NaN 3(65g/mol)로 수성 배지에서 재장매된 크로스 링크 덱스펜 젤(G-50)을 열의 무색 부분의 상단 아래 1cm까지 소개합니다.
- 탭을 열고 액체 흐름이 교차 연결된 dextran 젤을 해결하도록 합니다.
- HEPES 버퍼 2의 20mL로 용례하여 컬럼을 세척하고 열의 출력 흐름을 폐기합니다.
- 열 위의 용매의 죽은 부피가 최소화되면 탭을 닫지만(<100 μL) 교차 연결된 dextran 젤의 건조를 피하기에 충분합니다.
- 새로 압출된 LUV(노란색)를 기둥에 놓고 교차 연결된 덱스펜 젤에 들어갑니다.
- LUV 정제를 수행하기 위해 지속적으로 열에 HEPES 버퍼 2를 추가합니다.
- ELute 약 2 mL의 HEPES 버퍼 2 (정기적으로 교차 연결된 dextran 젤 건조를 피하기 위해 컬럼의 상단을 채우는 것을 잊지 마세요): 무료 노란색 ANTS 및 DPX 용액은 리포솜보다 느리게 마이그레이션됩니다.
- 튜브(1.5mL)에서 정제된 LUV를 수집하기 시작합니다.
- 기둥에서 용출방울을 관찰하고 오팔레인이 될 때, 그들은 리포솜을 포함합니다. 튜브를 변경하여 LUV 함유 분수를 복구합니다.
- 방울이 더 이상 오팔레이트(~1mL)가 될 때까지 엘루트. 그 후, 별도의 분획에 또 다른 0.5 mL을 엘테한 다음 발례를 중지합니다.
참고: 표준은 이제 LUV의 용출 량을 보정하기 위해 키트 또는 개별 분자량으로 광범위한 분자량에서 사용할 수 있습니다. - 형광 염료의 표백을 피하기 위해 알루미늄 호일에 LUV로 튜브를 감쌉니까.
- 20mL HEPES 버퍼 2로 컬럼을 세척합니다.
- 그런 다음 LUV를 4°C에서 일주일 동안 저장할 수 있습니다.
참고: LUV 안정성은 LUV 농도 및 컴포지션뿐만 아니라 이온 강도에 따라 달라질 수 있기 때문에 동적 광 산란(DLS) 계측기(섹션 4 참조)를 사용하여 LUV의 크기를 제어해야 합니다. 각 테스트 전에 LUV 크기 및 균질성의 특성화.
3. LUV의 농도 를 정량화
- 콜린농도(19)의평가를 가능하게 하는 인지질 정량화 키트에 의한 LUV 농도추정. 이 분석법은 극지 헤드를 포함하는 콜린을 가진 인지질이 상당할 때 적용될 수 있습니다 (>50% LUV의).
- 제공된 완충제의 3mL에서 염색체 기판 18 mg을 용해하여 색 시약을 준비합니다.
- 폴리스티렌 큐벳, 10 x 10 x 45mm, 3mL의 컬러 시약을 로드합니다.
- 순수한 색상 시약을 빈 상태(공백)로 사용합니다. 알려진 콜린 농도(표준)의 표준 용액의 LUV 샘플(Test) 또는 20 μL의 20 μL을 추가합니다.
- 잘 섞고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오 모든 조건 (공백, 테스트 및 표준).
- 스펙트로포토미터를 사용하여 600 nm의 제어로서 빈 용액을 사용하여 테스트 샘플 및 표준 용액의 흡광도(광학 밀도, OD)를 측정합니다.
- 알려진 농도의 표준에 비해 콜린에 상응하는 LUV, C[LUV]의 지질 농도를 추정할 수 있는 OD 값을 확인합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 계산을 수행합니다.
C[LUV] (mol/l) = (OD 샘플/OD 표준) x C[표준] (mol/l)
참고: 인지질 정량화 키트는 C[표준]= 3.87mmol/L. OD 샘플 및 OD 표준의 어금니 농도에 해당하는 54 mg/dL에서 콜린 염화물(139.6 mg/l) 표준 용액을 제공하였다.
4. LUV 크기와 균일성의 특성화
- LUV 크기(nm) 및 다분산 지수(PdI)를 결정하기 위해 DLS 계측기를 사용하여 측정을 수행합니다.
- 용매/버퍼 및 사용된 큐벳의 점도를 표시하여 적절한 "표준 작동 절차"(SOP)를 프로그래밍합니다.
- 폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳에 LUV 용액의 500 μL을 배치합니다.
- 폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳을 DLS 기기에 삽입합니다.
- 실온에서 입자 분포의 평균 크기(Z-평균) 및 균질성(다분산지수, PdI)의 크기 분포를 측정합니다.
- 모든 결과는 세 번의 반복사이클에서 각각 수행되는 두 개의 독립적인 측정에서 얻어진다.
참고: LUV의 표준 값은 137± 7nm의 평균 크기로, PdI는 0.149 ± 0.041입니다.
5. 펩타이드 솔루션 준비
- 누설 분석에 대해 분석해야 하는 펩타이드의 스톡 용액을 준비한다.
- 퓨어 워터(예: 500 μL 순수 수의 1 mg 펩타이드)에 펩타이드 분말(>95% 순도)을 용해하십시오.
참고: 순수한 물에 펩티드를 희석시키고 디메틸 설옥화물(DMSO) 용용화를 방지하여 유물(예를 들어 막 과미빌라이징20)을유도하는 것이 좋습니다. - 5s용 펩타이드 용액을 소용돌이시다.
- 펩타이드 용액을 5분 간 초음파 처리한 다음 원심분리기는 12,225 x g에서5분 동안 초음파 처리합니다. 농도 측정을 위해 상체를 수집합니다.
- 3개의 독립적인 펩티드 희석제의 280nm에서 흡광도를 측정한 다음, 어금니 소멸 계수 ε(펩티드 서열의 트립토판 및 티로신 함량에 따라 다름)과 비어-램버트 규칙을 사용하여 펩티드 농도를 계산한다.
참고: 펩타이드가 트립토판과 티로신을 포함하는 경우, 어금니 소멸 계수 ε 트립토판 ε 기초하여 계산됩니다 = 5,690 M-1cm-1cm 및 티로신 ε = 1,280 M-1cm-1. 펩티드 서열에 트립토판 또는 티로신이 포함되어 있지 않으면 다른 색분석 분석이 농도(예를 들어, BCA 또는 브래드포드)를 측정하기 위해 수행될 수 있다. - 펩티드 용액을 순수 한 물로 희석하여 100 μM의 최종 용액으로 희석하고 4 °C에 저장하십시오.
참고: 순수한 물에서는 4°C 저장 중에 펩티드 분해가 발생하지 않습니다. 그러나, 펩티드 농도는 물 증발이 발생하지 않도록 2주마다 측정되어야 한다.
6. 형광 누출 분석
- 형광 누설 분석법은 실온에서 분광성계에서 측정됩니다. 흥분 및 방출 파장은 Ex = 360 nm ± 3 nm 및 Em = 530 nm ± 5 nm로 고정됩니다.
- 1 mL HEPES 버퍼 2에서 석영 형광 큐벳에서 100 μM의 최종 농도로 LUV를 희석하십시오. 실험 중에 용액을 균질화하기 위해 자기 교반기를 추가합니다.
- 배경 형광에 액세스하기 위해 t = 0 s와 t = 99 s 사이의 첫 100 s 동안 혼자 LUV를 측정합니다.
참고: 배경 형광 및 잠재적 누출에 액세스하기 위해 전체 실험(15분) 중에 LUV만 측정할 수 있습니다. - 그 후, 다음 900s(15분)에 대한 펩타이드 용액의 알리쿼트 첨가 시 형광 강도의 증가로 누설을 측정한다. 이 프로토콜은 0.1 μM에서 2.5 μM로 테스트된 펩티드의 각 농도에 대해 수행됩니다.
- 마지막으로, 트리톤 X-100(0.1%, v/v)의 1μL을 추가하여 LUV를 용해시킴으로써 100% 형광을 달성하여 t = 1,000s 및 t = 1,100s 사이의 완전히 압축되지 않은 프로브를 생성하였다.
7. 누출의 정량화
- 각 테스트된 조건에 대해 동일한 수의 점을 유지하기 위해 t = 1,090s 후에 얻은 값을 억제합니다.
- t = 0 s와 t = 49 s (혼자 LUV) 사이의 50 점의 평균을 만들어 최소한의 형광, Fmin을계산합니다.
- t = 1,041s와 t = 1,090 s (트리톤 X-100의 LUV) 사이의 평균 50 점을 만들어 최대 형광, F최대를계산합니다.
- 다음 방정식에 따라 각 시점(t = x)에서 누설 비율(%누출)을 계산합니다.
%누출(t =x) = (F(t = x) - F분) / (F최대 - F분)x 100 - 동일한 조건에 대해 다른 LUV 준비(n ≥ 2)로 얻은 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
- 누설 비율,%누설(t=x)시간 함수를 플롯합니다.
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Representative Results
형광 누설 분석의 원리는 도 1에도시된다. 구체적으로, 형광염과 담수(형광 신호 없음)를 캡슐화하는 대형 유니라멜라 소포(LUV)는 관심있는 생체 분자로 처리된다. 막 투과성, 재구성 또는 파열을 암시할 수 있는 지질 막과의 펩타이드의 상호 작용으로 인해 형광염과 담종은 LUV에서 방출됩니다. 버퍼의 후속 희석으로 인해 형광 신호가 증가합니다.
이 계획은 무료 펩타이드로 테스트를 표시하지만, 시스템의 장점은 또한 지질 막을 불안정하게 하는 것으로 의심되는 화물-공주 펩티드 펩티드, 펩티드 기반 나노 입자 또는 기타 바이오 폴리머를 테스트할 수 있는 능력에 있다. 특히 테스트된 분자와 관련하여 프로토콜의 예비 최적화가 필요하지만, 이 형광 누설 분석은 막 상호 작용 성분의 거대한 다양성으로 확장될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 CpP 및 복잡한(비공유 전략) 또는 공주(공유 전략) 형태로 얻은 몇 가지 결과를 보여줍니다. 다음 예제는 랩 단독으로 뿐만 아니라 siRNA 로드 WRAP 기반 나노 입자 및 두 개의 다른 펩티드-컨쥬게이트(WRAP-iCAL3617 및 페네타틴-iCAL36)를 암시한다.
비공유 전략에 관해서는, 형광 누설 분석체와 펩티드및 해당 siRNA 로드 나노입자와 함께 LUV의 존재에 따라 도 2에표시된다. 상기 소포는 코네이트외(21)에 기재된 바와 같이 플라즈마 멤브레인을 반영하는 DOPC/SM/Chol(4:4:2)의 혼합물로 구성되며, 일반적으로 무료 WRAP 및 WRAP 기반 나노입자7의지질 이중층 상호작용 및/또는 트랜스듀션 특성의 가능성을 직접 평가하는 데 사용된다. 펩티드가 없는 경우 누출이 관찰되지 않습니다(처음 100s 동안 기준선). LUV에 무료 WRAP을 첨가하여 중요한 LUV 누설 및 ANTS 방출을 드러내는 형광의 상당한 증가를 유도합니다. 15분 후, 릴튼 상태(양성 제어)에 비해 0.4% ± 67.8%의 누설이 랩 펩티드의 중고 농도(2.5 μM)에서 얻어진다. 여기에 주목해야 여러 가지 다른 농도도 테스트 및 복용량 의존 형광 증가를 밝혀, 복용량 의존 LUV 누설에 해당7. 대조적으로, WRAP이 펩타이드 계 나노입자를 형성하기 위해 siRNA와 동일한 농도로 조립될 때, 누설은 자유 펩타이드(그림2)에비해 1.5배 약하다(40.5% ± 0.5%)이다. RICK 펩티드(60%) 또는 RICK:siRNA 나노입자(28%)22에대해 유사한 누설값이 보고되었다. 나노 입자에 비해 자유 펩티드 사이의 값의 차이는 나노 입자에 종사 할 때, 펩티드의 상당 부분이 siRNA와의 직접 상호 작용에 관여하여 지질과의 상호 작용을위한 펩티드 가용성을 감소시키는 사실에 의해 설명 될 수 있습니다.
공유 전략과 관련하여, LUV의 존재시 CPP-컨쥬게이트와 형광 누설 액약은 도 3에도시된다. 동일한 LUV 조성물 [DOPC/SM/Chol(4:4:2)]을 사용하면 랩-iCAL36 및 페네타틴-iCAL36의 두 개의 컨쥬게이션 펩타이드가 적용됩니다. 이전에 발견 한 바와 같이, 펩티드의 부재에서 누출이 관찰되지 않습니다. 페네타틴-iCAL36의 2.5μM을 주입한 후 15분, 큰 형광 증가가 감지되지 않음(2.3% ± 0.7%) 반면, WRAP-iCAL36의 2.5 μM을 첨가하면 매우 강한 형광 신호(85.8%±11.1%)를특징으로 하는 순 누설을 유도한다. 이러한 관측은 일부 펩티드 또는 컨쥬게이트의 경우 형광 누출이 발생하지 않을 수 있음을 나타내며, 이는 펩타이드/멤브레인 상호 작용이나 지질 이중층 장애가 없음을 시사합니다. 이는 이전에 발표된 결과에 따라 페네타틴뿐만 아니라 Tat가 멤브레인(23,24,25)을불안정하게 할 수 없었다는 것을 보여준다. CPP의 멤브레인 불안정 특성이 결합된화물(26)에따라 변경될 수 있음을 강조해야 한다.
더욱이, WRAP-iCAL36은 강한 누설을 일으켰지만, 추가 연구는 특정 세포 내재화를 밝히지 않으며, 이러한 컨쥬게이트가 혈장막(17)의지질 이중층 내부에 남아 있음을 나타낸다. WRAP 나노 입자와는 달리, 우리는 WRAP 화물 컨쥬게이트가 지질 사슬 사이 또는 모공을 형성하여 LUV 멤브레인을 불안정하게 할 수 있다고 가정합니다.
이러한 결과는 형광 누설 분석이 펩티드 /멤브레인 상호 작용을 개발하는 일부 CPP의 능력을 드러낼 수 있음을 나타내며, 이는 다소 뚜렷한 막 투과성으로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 이러한 상호 작용은 화물 전달의 전략에 관계없이 발생할 수 있습니다 (나노 입자 대 컨쥬게이트). 반대로, 이 방법은 어떤 형광 누설을 유도하지 않는 CPP가 여전히 지질의 이중층 또는 생물학적 막과 상호 작용할 수 있는지 여부를 차별하지 않습니다. 이러한 종류의 거동은 제타 전위 측정, 펩타이드와 멤브레인 사이의 FRET 또는 트립토판 형광 실험과 같은 추가 접근법이 필요합니다.
그림 1: 형광 누설 분석의 원리. 루프크는 백색형염료(ANTS)와 해당 대기중(DPX)을 회색으로 적재하였다. 펩타이드(빨간색)가 없는 경우, 개미홍색이 DPX에 의해 담금질되었기 때문에 형광 신호가 관찰되지 않았다. LUV에 펩타이드를 첨가하여 막 투과성 및 개미및 DPX의 후속 방출을 통해 개미(ANTS 형광(yellow)의 현저한 증가를 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 무료 WRAP 및 WRAP : siRNA 나노 입자와 형광 누설 분석. 펩타이드 단독으로 및 siRNA-로드 나노입자는 2.5 μM의 펩티드 농도에서 LUV에 적용되었다. WRAP 계 나노입자는 코네이트등7,16에기재된 바와 같이 펩티드:siRNA 어금니비 20(R 20)으로 제조하였다. 검은 화살은 각각 펩티드 (나노 입자)와 트리톤 X-100의 주사를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: WRAP-iCAL36 및 Penetratin-iCAL36 컨쥬게이트를 가진 형광 누설 분석. 공수는 2.5 μM의 농도로 LUV에 적용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 형광 누설 분석법은 세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 해결하는 간단하고 빠른 방법입니다. 쉽게 할 수 있으며, 또한 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드 또는 다른 멤브레인 상호 작용 분자 사이의 간접적인 비교를 가능하게합니다. 이 분석이 기준선(LUV 단독으로)과 최대 형광 방출(Triton 조건) 사이의 상대적 값을 제공하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계에 대해서는 일반적으로 LUV의 콜린 기여도를 추정하는 인지질 정량화 키트를 사용하여 LUV의 농도를 평가합니다. 그러나, 루우저 및동료(27)에 의해 설명된 산성 소화에 의한 총 인 함량을 결정하거나 바틀렛(28)에 의해 또는 암모늄 ferrothiocyanate 복합인인지질(29)을 이용한 색인식 방법에 의해 LUV 농도의 보다 정확한 측정을 포함할 수도 있다. 우리의 손에, 그것은 누출의 상대적 정량화와 멤브레인 상호 작용 펩티드 사이의 비교에 영향을 미치지 않습니다.
LUV의 사용에 관해서는, 하나는 또한 그들이 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 혼자 LUV의 기준선 상태를 제어하는 중요성을 주의해야한다 그들은 이미 누출을 보여주는 경우 (형광의 지속적인 증가를 특징으로). 같은 방법으로, 원치 않는 담금질 공정(예를 들어, 펩타이드/염료 담금질)으로 인해 거짓 음수 결과가 기록되지 않았는지 확인하기 위해 각 펩티드 인큐베이션 후 최대 형광 방출을 측정하는 것이 중요하다.
일반적으로 DLS 특성화에 따르면 LUV는 1 주 동안 매우 안정적이며 너무 높은 형광 배경을 표시해서는 안됩니다. 이러한 맥락에서, 젤 여과에 의한 ANTS/DPX 적재 리포솜의 정제는 배경에 기여하거나 형광 과대 평가를 생성할 수 있는 잔류 형광없이 LUV의 형성을 가능하게 하기 때문에 핵심포인트이다. 또한 항상 동일한 누설 비율을 줄 수 있는 특정 양수 제어를 포함시켜 프로토콜을 보정하는 것이 좋습니다. 이는 각 테스트에 대한 LUV의 특성화를 강화하고 통계를 증가시킬 수 있는 다양한 측정을 통해 내부 제어를 구성합니다.
형광 누설 분석은 CPP에 의한 막 불안정화에서 빠른 비교를 제공할 수 있지만, 일부 펩타이드는 막 방해 나 누출을 유도하지 않고 지질 이중 층과 상호 작용할 수 있기 때문에 펩티드 멤브레인 상호 작용의 해석이 제한적이다. 이러한 펩티드의 경우 FRET30을가능하게 하는 특정 형광 마커를 사용한 추가 실험을 사용하는 것이 좋습니다.
또한 다른 형광 염료/담종 쌍(예: Tb3+/DPA31)을사용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 두 방법 모두 불편함을 가지고 있습니다: Terbium (III)은 물에 매우 용해되지 않으며 인산염의 존재에서 사용할 수 없지만 ANTS 담금질은 DPX 농도의 선형 기능이 아닙니다. 더욱이, 70mM칼신용액(32) 또는 덱스텐-PTS(33)와 같은 다른 자가담제 물질은 분석된 펩타이드 또는 화합물에 의해 유발되는 막 결함에 따라 처리될 수 있었다.
마지막으로, 이러한 형광 누설 분석의 주요 장점은 분자뿐만 아니라 다른 멤브레인 조성물을 상호 작용하는 수많은 잠재적 멤브레인을 테스트하는 능력입니다. 이러한 내시경 막 모방 [예를 들어, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC)/dioleoyl-포스파-디딜레타놀라민 (DOPE)/콩 (PI)/비스 (모노올레오일글리세로) 인산염 (LBPA) 모라 비에서5:24 , 미토콘드리아 멤브레인은 [예를 들어, 46.5% DOPC, 28.5% 포스파디에이들레타놀라민(PE), 9% 포스파디딜리노시톨(PI), 9% 포스파디딜세린(PS), 그리고 7% 카디오리핀(CL)35 또는 기타 원하는 지질 이중층 조성물을 모방한다. 그러나, 실험 및 저장 중에 100nm에 가까운 일정한 평균 크기를 갖는 소포(LUV 융합, 응집 또는 침전, 현탁액에서 떨어지는 립지딕 없음, 음의 멤브레인 곡률 등)의 안정성을 먼저 보장해야 합니다.
또한, 추출된 멤브레인(적혈구, 미토콘드리아 등)에 비해 이 방법의 장점은 단백질이 없는 경우 정제된 잘 특징화된 지질의 사용이다. 지질 이중층 조성물(플라즈마, 내성, 또는 미토콘드리아 막)의 조절은 또한 특정 멤브레인 단백질(양성자 펌프)의 삽입을 가능하게 한다. 또한, 내부 및 외부 환경을 모두 제어할 수 있으므로 막 장애/누출을 명확하게 해석할 수 있습니다. 또한 막 투과화 이벤트를 시각화할 수 있는 흑지질막 실험36과비교하여, 이 누설 프로토콜은 멤브레인 활성 펩타이드의 보다 간단한 스크리닝 방법을 제공한다.
결론적으로, 이 간단한 방법은 막 불안정화로 이어지는 강력한 펩타이드/멤브레인 상호 작용의 신속한 식별을 선호합니다. 그것은 CPP의 내재화 의 메커니즘을 조사하고 fusiogenic 또는 항균 펩티드와 같은 "막 활성 펩티드"의 보다 일반적인 접근에 적용될 수 있다.
일반적으로, 세포질에 도달하기 위하여 CPP에 의해 이용된 주요 경로의 특성은 아주 복잡하고 세포 생물학에 생물물리학에서 몇몇 명백한 접근이 필요합니다. 예를 들어, WRAP 내산화의 조사는 세포(내분비증 대 직접 전좌)와 다른 방법과 관련된 형광 누설 분석사이의 균형을 드러내며, 직접적인 침투 공정7을지원하는 데 기여했다.
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Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 원고의 비판적 검토에 대한 에밀리 호세에게 감사드립니다. 이 작품은 재단 "라 리그 콘트레 르 암", "퐁디아크 부어 라 레체쉬 쉬르 르 암", 그리고 "센터 국립 드 라 레체쉬 사이엔티피크"(CNRS)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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