Summary
Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.
Abstract
I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall'internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L'aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l'induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l'affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.
Introduction
Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membranaplasmatica 1,2. I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un'ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori "traslocanti diretti", il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, ulteriori indagini hanno rivelato che queste prime osservazioni provenivano principalmente da sovrastima di fluorescenza dovuta all'artefatto sperimentale e / o ai protocolli di fissazione che utilizzavano metanolo3. Al giorno d'oggi, è ampiamente accettato che l'assorbimento di CPP avviene sia per endocitosi che per traslocazione indipendente dall'energia4,5,6,7 a seconda di diversi parametri come la natura del carico, il collegamento utilizzato tra CPP e carico, la linea cellulare studiata, ecc.
I CPP possono essere utilizzati come agenti di trasfezione secondo due strategie, che coinvolgono un legame chimico (strategia covalente) o interazioni elettrostatiche / idrofobiche (strategia non covalente) tra il CPP e il suo carico8,9,10,11. Sebbene entrambe le strategie abbiano dimostrato la loro efficienza nel trasferimento cellulare di diversi carichi, la comprensione del meccanismo di internalizzazione da parte dei CPP è ancora controversa e l'equilibrio tra vie di endocitosi o penetrazione diretta è ancora difficile da misurare12,13. Sebbene sia disponibile una serie di strumenti e strategie sperimentali per affrontare chiaramente il coinvolgimento dei processi endocitici, la traslocazione diretta sembra, tuttavia, più difficile da caratterizzare poiché implica interazioni più discrete con i componenti della membrana plasmatica. Le membrane biologiche sono solitamente composte da numerosi componenti, dai fosfolipidi alle proteine di membrana, che possono variare a seconda del tipo cellulare e/o dell'ambiente (condizioni di stress, divisione cellulare, ecc.). Questa diversità di composizione, e di conseguenza l'assenza di un modello di membrana cellulare universale, non consente studi in un unico modo. Tuttavia, per aggirare queste limitazioni sono stati sviluppati approcci passo-passo con estratti di membrana o membrana artificiali. Dalle piccole vescicole unilamellari agli approcci monostrato, ogni modello era chiaramente pertinente per rispondere alle domande specifiche14,15. Tra questi, le grandi vescicole unilamellari (LUV) costituiscono un modello appropriato di imitazione della membrana per studiare le interazioni peptide/ membrana come punto chiave nel processo di internalizzazione.
In questo contesto, il seguente protocollo descrive lo studio degli effetti dei peptidi e delle interazioni peptidi/membrana sull'integrità dei LUD attraverso il monitoraggio sia di un colorante fluorescente anionico che del corrispondente quencher policanica incapsulato in liposomi. Questo strumento viene utilizzato per studiare le interazioni CPP/membrana al fine di capire se sono in grado di eseguire una traslocazione diretta della membrana. Sebbene di solito applicato per confrontare diversi peptidi che interagiscono con la membrana, questo saggio di perdita di fluorescenza LUV potrebbe anche essere utilizzato per studiare sia i coniugati CPP-cargo (strategia covalente) che i complessi CPP:cargo (strategia non covalente).
Il presente protocollo sarà quindi prima esemplificato con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WRAP)16recentemente sviluppati. WRAP è in grado di formare nanoparticelle a base di peptidi per fornire rapidamente ed efficacemente piccoli RNA interferenti (siRNA) in diverse linee cellulari16. Le proprietà di perdita di fluorescenza del peptide WRAP da solo o delle nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA sono state monitorate per caratterizzare il loro meccanismo di internalizzazione cellulare. La Corte ha dimostrato che il loro meccanismo di internalizzazione riguardava principalmente la traslocazione diretta7. In un secondo esempio, il peptide WRAP è stato coniugato covalentemente al peptide interferente proteina/proteina iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e la sua capacità di destabilizzare le membrane è stata confrontata in un saggio di perdita di fluorescenza con iCAL36 accoppiato a Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un altro CPP.
Infine, verranno discussi i vantaggi e i limiti del metodo sia dal punto di vista tecnologico che rispetto alla rilevanza biologica.
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Protocol
1. Preparazione di grandi vescicole unilamellari (LUV)
- Preparare i ROV per il loro uso come membrana cellulare mimica per il test di perdita di fluorescenza.
- Mescolare con una siringa di vetro Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g / mol), sfingomielina (SM, 760,22 g / mol) e colesterolo (Chol, 386,65 g / mol) al rapporto molare 4: 4: 2. La soluzione lipidica è ottenuta da una soluzione stock di ciascun lipide solubilizzato in un solvente a metanolo/cloroformio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL in un pallone a fondo tondo di vetro da 25 ml. Sulla base di 4 μmol di DOPC, 4 μmol di SM e 2 μmol di Chol, la soluzione lipidica è ottenuta da soluzione stock mescolando rispettivamente 126 μL, 117 μL e 31 μL.
ATTENZIONE: Il metanolo è un solvente tossico e infiammabile e il cloroformio è tossico e cancerogeno. Entrambi devono essere maneggiati con la protezione appropriata sotto un cappuccio. - Evaporare metanolo/cloroformio utilizzando un evaporatore rotativo sotto vuoto per 45-60 minuti a 60 °C fino alla formazione di un film lipidico essiccato.
- Preparare due soluzioni tampone HEPES di serie. Preparare il tampone HEPES 1 mescolando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e regolare il pH a 7,4. Preparare il tampone HEPES 2 mescolando 20 mM HEPES e 145 mM NaCl e regolare il pH a 7,4. I tamponi HEPES possono essere conservati a 4 °C per 1 mese.
NOTA: Si consiglia di verificare l'osmolarità dei buffer utilizzando un osmometro. - Preparare la soluzione di idratazione lipidica sciogliendo la coppia colorante-quencher fluorescente impermeabile alla membrana, 8-aminonaftalene-1, 3, acido 6-trisolfonico, sale disodico a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e p-xilene-bispyridinium bromuro a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in soluzione tampone HEPES. La miscelazione di ANTS con DPX porta a una soluzione di colore giallo. Per raggiungere le concentrazioni di 12,5 mM di ANTS e 45 mM di DPX, sciogliere 21,4 mg e 76 mg, rispettivamente in 4 mL di tampone HEPES 1.
NOTA: La soluzione di idratazione lipidica può essere conservata per 2 settimane a 4 °C avvolgendo il tubo con un foglio di alluminio. - Ricostituire le vescicole multilamellari (MLV) riconsesciendo il film lipidico essiccato con 1 mL della soluzione di idratazione lipidica e vorticosamente fino alla dissoluzione del film lipidico essiccato. Assicurarsi che la soluzione sia completamente solubilizzata poiché piccoli aggregati lipidici avranno un impatto negativo sui passaggi precedenti. Inoltre, controllare la parete del pallone di vetro a fondo tondo per assicurarsi che non vi sia alcun film lipidico rimanente.
NOTA: La soluzione apparirà opalescente e giallo chiaro dopo la solubilizzazione. - Sottoporre le vescicole a cinque cicli di congelamento/disgelo per ottenere vescicole unilamellari. Eseguire ogni ciclo mettendo il pallone di vetro a fondo tondo per 30 s in azoto liquido per la fase di congelamento, quindi lasciandolo a bagnomaria per 2 minuti per la fase di scongelamento.
NOTA: La temperatura dell'acqua del bagno deve essere superiore di 5-10°C alla temperatura di fusione dei lipidi. - Preparare l'estrusore lipidico inserendo due supporti filtranti preliminarmente umidificati con tampone HEPES in ciascun pezzo di estrusore in politetrafluoroetilene (PTFE) posto nel contenitore dell'estrusore metallico.
- Mettere una membrana in policarbonato umidificato HEPES (dimensione dei pori di 0,1 μm, diametro 25 mm) sulla parte superiore di un supporto del filtro.
- Assemblate i due monti per estrusori metallici e avvitali.
- Posizionare l'estrusore assemblato nel supporto e introdurre una siringa da 1 mL nel foro appropriato all'estremità di ciascun pezzo di estrusore di politetrafluoroetilene. L'estrusione corrisponde al passaggio del liquido testato da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato.
- Testare l'estrusore con 1 mL di buffer HEPES caricato in una delle siringhe da 1 mL per assicurarsi che non vi siano perdite o problemi.
- Sostituire il buffer HEPES da 1 mL con il campione MLV.
- Eseguire l'estrusione facendo passare il campione MLV da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato almeno 21 volte per ottenere LUT uniformi delle stesse dimensioni.
NOTA: L'estrusione deve essere eseguita a una temperatura superiore alla temperatura di fusione della miscela lipidica.
2. Purificazione dei UV
- Preparare una purificazione della colonna per rimuovere l'eccesso di ANTS e DPX non incapsulato.
- Introdurre gel destro reticolato (G-50) risospenso in mezzo acquoso con 0,01% NaN3 (65 g/mol) in una colonna per cromatografia liquida (Luer Lock, non rivestita, 1,0 cm x 20 cm, volume letto 16 mL) fino a 1 cm sotto la parte superiore della parte incolore della colonna.
- Aprire il rubinetto e lasciare scorrere il liquido per depositare il gel destrorso reticolato.
- Lavare la colonna eluita con 20 mL di buffer HEPES 2 ed eliminare il flusso di uscita della colonna.
- Chiudere il rubinetto una volta che il volume morto di solvente sopra la colonna è ridotto al minimo (<100 μL) ma sufficiente per evitare qualsiasi essiccazione del gel destrone reticolato.
- Posizionare i ROV appena estrusi (gialli) sulla colonna e farli entrare nel gel destrorso reticolato.
- Aggiungere continuamente il buffer HEPES 2 alla colonna per eseguire la purificazione LUV.
- Eluire circa 2 mL di tampone HEPES 2 (non dimenticare di riempire regolarmente la parte superiore della colonna per evitare di asciugare il gel destrolare reticolato): la soluzione libera gialla ANTS e DPX migra più lentamente dei liposomi.
- Inizia a raccogliere ROV purificati in tubi (1,5 ml).
- Osserva le gocce di eluente dalla colonna e quando diventano opalescenti, contengono liposomi. Cambiare il tubo per recuperare la frazione contenente LUV.
- Eluire fino a quando le gocce non sono più opalescenti (~1 mL). Successivamente, eluire altri 0,5 ml in una frazione separata e quindi interrompere l'eluizione.
NOTA: Gli standard sono ora disponibili in una vasta gamma di pesi molecolari, come kit o singoli pesi molecolari per calibrare il volume di eluizione dei LUN. - Avvolgere i tubi con i ROV in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del colorante a fluorescenza.
- Lavare la colonna con un buffer HEPES da 20 ml 2.
- I LUN possono quindi essere conservati per una settimana a 4 °C.
NOTA: Poiché la stabilità LUV potrebbe dipendere dalla concentrazione e dalla composizione di LUV, nonché dalla forza ionica, la dimensione dei UV deve essere controllata utilizzando uno strumento di diffusione dinamica della luce (DLS) (vedere paragrafo 4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità LUV) prima di ogni test.
3. Quantificare la concentrazione di ROV
- Stimare la concentrazione di LUV mediante un kit di quantificazione dei fosfolipidi, che consente la valutazione della concentrazione di colina19. Questo test potrebbe essere applicato quando i fosfolipidi con colina contenente testa polare sono sostanziali (>50% dei LUV).
- Preparare il reagente colorante sciogliendo 18 mg di substrato cromogeno in 3 mL di tampone fornito.
- Caricare una cuvetta di polistirene, 10 x 10 x 45 mm, con 3 ml di reagente di colore.
- Utilizzare il reagente di colore puro come condizione vuota (Blank). Aggiungere 20 μL di campione LUV (Test) o 20 μL di soluzione standard di concentrazione nota di colina (Standard).
- Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 37 °C tutte le condizioni (Blank, Test e Standard).
- Misurare l'assorbanza (densità ottica, OD) del campione di prova e della soluzione standard con la soluzione in bianco come controllo a 600 nm con uno spettrofotometro.
- Controllare i valori OD che consentono di stimare la concentrazione lipidica dei LUD, C[LUV], in equivalente colina rispetto allo standard di concentrazione nota.
- Eseguire il calcolo utilizzando la seguente equazione:
C[LUV] (mol / l) = (Campione OD / Standard OD) x C[Standard] (mol / l)
NOTA: Il kit di quantificazione dei fosfolipidi ha fornito una soluzione standard di cloruro di colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL corrispondente alla concentrazione molare di C[Standard] = 3,87 mmol/L. OD Sample e OD Standard sono le assorbanze misurate a 600 nm per le soluzioni LUV e Colina, rispettivamente.
4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità del LUV
- Eseguire una misurazione utilizzando uno strumento DLS per determinare la dimensione LUV (in nm) e l'indice di polidispersità (PdI).
- Programmare la "procedura operativa standard" (SOP) appropriata indicando la viscosità del solvente/tampone e della cuvetta utilizzata.
- Posizionare 500 μL della soluzione di LUV in una semi-micro cuvetta di polistirene.
- Inserire la semi-micro cuvetta in polistirene in uno strumento DLS.
- A temperatura ambiente, misurare la distribuzione dimensionale in termini di dimensione media (Z-media) della distribuzione delle particelle e di omogeneità (indice di polidispersità, PdI).
- Tutti i risultati sono ottenuti da due misurazioni indipendenti eseguite ciascuna in tre cicli ripetitivi.
NOTA: i valori standard per i LUV saranno una dimensione media di 137 ± 7 nm con un PdI di 0,149 ± 0,041.
5. Preparazione di soluzioni peptidiche
- Preparare una soluzione stock del peptide, che deve essere analizzata per il test di perdita.
- Sciogliere la polvere peptidica (purezza >95%) in acqua pura (ad esempio, 1 mg di peptide in 500 μL di acqua pura).
NOTA: Si raccomanda di diluire i peptidi in acqua pura e di evitare la solubilizzazione del dimetilsolfossido (DMSO), che potrebbe indurre artefatti (ad esempio, permeabilizzazione della membrana20). - Vortice la soluzione peptidica per 5 s.
- Sonicare la soluzione peptidica in un bagno di sonicazione in acqua per 5 minuti e quindi centrifugare per 5 minuti a 12.225 x g. Raccogliere il surnatante per la determinazione della concentrazione.
- Misurare l'assorbanza a 280 nm di tre diluizioni peptidiche indipendenti e quindi calcolare la concentrazione peptidica utilizzando il suo coefficiente di estinzione molare ε (a seconda del contenuto di triptofano e tirosina nella sequenza peptidica) e la regola di Beer-Lambert.
NOTA: Se il peptide contiene triptofano e tirosina, il coefficiente di estinzione molare ε viene calcolato sulla base di triptofano ε = 5.690 M-1cm-1 e tirosina ε = 1.280 M-1cm-1. Se la sequenza peptidica non contiene triptofano o tirosina, è possibile eseguire altri test colorimetrici per misurare la concentrazione (ad esempio, BCA o Bradford). - Diluire la soluzione peptidica in acqua pura fino a una soluzione finale di 100 μM e conservare a 4 °C.
NOTA: In acqua pura, non si verifica alcuna degradazione peptidica durante lo stoccaggio a 4 °C. Tuttavia, la concentrazione di peptidi deve essere misurata ogni 2 settimane per garantire che non si verifichi alcuna evaporazione dell'acqua.
6. Saggio di perdita di fluorescenza
- Il saggio di perdita di fluorescenza viene misurato su uno spettrofluorometro a temperatura ambiente. La lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione è fissata rispettivamente a Ex = 360 nm ± 3 nm ed Em = 530 nm ± 5 nm.
- Diluire i ROV in tampone HEPES 2 da 1 mL fino a una concentrazione finale di 100 μM in una cuvetta a fluorescenza al quarzo. Aggiungere un agitatore magnetico per omogeneizzare la soluzione durante l'esperimento.
- Misurare i SOLI ROV durante i primi 100 s, tra t = 0 s e t = 99 s per accedere alla fluorescenza di fondo.
NOTA: I SOLI VUV potrebbero anche essere misurati durante l'intero esperimento (15 min) per accedere alla fluorescenza di fondo e alle potenziali perdite. - Successivamente, misurare la perdita come un aumento dell'intensità di fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica per i successivi 900 s (15 min). Questo protocollo viene eseguito per ogni concentrazione di peptide testata da 0,1 μM a 2,5 μM.
- Infine, la fluorescenza al 100% è stata ottenuta solubilizzando i UV con l'aggiunta di 1 μL di Triton X-100 (0,1%, v/v), risultando nella sonda completamente inestinguibile tra t = 1.000 s e t = 1.100 s.
7. Quantificazione della perdita
- Sopprimere i valori ottenuti dopo t = 1.090 s per mantenere lo stesso numero di punti per ogni condizione testata.
- Calcola la fluorescenza minima, Fmin, facendo la media di 50 punti tra t = 0 s e t = 49 s (solo LUV).
- Calcola la fluorescenza massima, Fmax, facendo la media di 50 punti tra t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUN con Triton X-100).
- Calcola la percentuale di perdita (%Perdita) in ogni punto temporale (t = x), secondo la seguente equazione:
%Perdita(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100 - Calcolare la deviazione media e standard per i valori ottenuti con diversa preparazione LUV (n ≥ 2) per la stessa condizione.
- Traccia la percentuale di perdita, %Perdita(t=x), in funzione del tempo (i).
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Representative Results
Il principio del saggio di dispersione in fluorescenza è mostrato nella Figura 1. In dettaglio, le grandi vescicole unilamellari (LUV) che incapsulano un colorante fluorescente e un quencher (nessun segnale di fluorescenza) sono trattate con la biomolecola di interesse. A causa dell'interazione del peptide con le membrane lipidiche, che potrebbe implicare permeabilità della membrana, riorganizzazione o addirittura rottura, il colorante a fluorescenza e il quencher vengono rilasciati dai LUT. Successive diluizioni nel tampone si traducono in un aumento del segnale di fluorescenza.
Sebbene questo schema mostri un test con peptidi liberi, il vantaggio del sistema risiede nella capacità di testare anche peptidi coniugati con carico, nanoparticelle a base di peptidi o altri biopolimeri, che si sospetta destabilizzino le membrane lipidiche. Sebbene sia necessaria un'ottimizzazione preliminare del protocollo, in particolare per quanto riguarda le molecole testate, questo saggio di perdita di fluorescenza potrebbe essere esteso a un'enorme varietà di componenti che interagiscono con la membrana. Nel presente protocollo, mostriamo alcuni risultati ottenuti con i CPP e le loro forme complessate (strategia non covalente) o coniugate (strategia covalente). I seguenti esempi implicano WRAP da solo così come nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA e due diversi coniugati peptidici (WRAP-iCAL3617 e Penetratin-iCAL36).
Per quanto riguarda la strategia non covalente, il saggio di perdita di fluorescenza con peptidi e con le corrispondenti nanoparticelle caricate con siRNA in presenza di LUV sono mostrati nella Figura 2. Le vescicole sono composte da una miscela di DOPC/SM/Chol (4:4:2) che riflette la membrana plasmatica come descritto in Konate et al.21 e sono solitamente utilizzate per valutare direttamente la possibilità di interazione lipidica a doppio strato e/o proprietà di trasduzione di nanoparticelle libere a base di WRAP e WRAP7. In assenza di peptidi, non si osserva alcuna perdita (basale durante i primi 100 s). L'aggiunta di WRAP libero sui VO induce un significativo aumento della fluorescenza rivelando un'importante perdita di LUV e rilascio di ANTS. Dopo 15 minuti, si ottiene una perdita del 67,8% ± dello 0,4% rispetto alla condizione di Tritone (controllo positivo) alla concentrazione utilizzata (2,5 μM) del peptide WRAP. Va notato qui che sono state testate anche diverse concentrazioni e hanno rivelato un aumento della fluorescenza dose-dipendente, corrispondente a una perdita di LUVdose-dipendente 7. Al contrario, quando WRAP viene assemblato alla stessa concentrazione con siRNA per formare nanoparticelle a base di peptidi, la perdita è 1,5 volte più debole (40,5% ± 0,5%) rispetto al peptide libero (Figura 2). Valori di perdita simili sono stati riportati per il peptide RICK (60%) o le nanoparticelle RICK:siRNA (28%)22. La differenza di valori tra peptidi liberi rispetto alle nanoparticelle potrebbe essere spiegata dal fatto che, quando impegnata nelle nanoparticelle, una parte sostanziale del peptide è coinvolta in interazioni dirette con il siRNA, riducendo la disponibilità peptidica per le interazioni con i lipidi.
Per quanto riguarda la strategia covalente, i saggi di perdita di fluorescenza con coniugati CPP in presenza di LUV sono mostrati nella Figura 3. Con la stessa composizione LUV [DOPC/SM/Chol (4:4:2)], vengono applicati due peptidi coniugati: WRAP-iCAL36 e Penetratin-iCAL36. Come notato in precedenza, non si osserva alcuna perdita in assenza di peptidi. 15 min dopo l'iniezione di 2,5 μM di Penetratin-iCAL36, non viene rilevato alcun aumento significativo della fluorescenza (2,3% ± 0,7%), mentre un'aggiunta di 2,5 μM di WRAP-iCAL36 induce una perdita netta caratterizzata da un segnale di fluorescenza molto forte (85,8% ± 11,1%)17. Queste osservazioni indicano che per alcuni peptidi, o coniugati, potrebbe non verificarsi alcuna perdita di fluorescenza, suggerendo che non si verifichino interazioni peptido / membrana o nessun disturbo del doppio strato lipidico. Questo è in accordo con i risultati precedentemente pubblicati che mostrano che Penetratin e Tat non sono stati in grado di destabilizzare le membrane23,24,25. Va evidenziato che le proprietà di destabilizzazione della membrana di un CPP potrebbero cambiare a seconda del carico accoppiato26.
Inoltre, sebbene WRAP-iCAL36 abbia causato una forte perdita, ulteriori studi non rivelano una specifica internalizzazione cellulare, indicando che questi coniugati sono rimasti all'interno del doppio strato lipidico della membrana plasmatica17. In contrasto con la nanoparticella WRAP, supponiamo che il coniugato WRAP-cargo sia in grado di destabilizzare la membrana LUV attaccandosi tra le catene lipidiche o formando pori.
Questi risultati indicano che il test di perdita di fluorescenza potrebbe rivelare la capacità di alcuni CPP di sviluppare interazioni peptidiche / membrana, che potrebbero portare a una permeabilità di membrana più o meno pronunciata. Inoltre, queste interazioni potrebbero verificarsi indipendentemente dalla strategia di consegna dei carichi (nanoparticelle contro coniugati). Al contrario, questo metodo non discrimina se un CPP, che non induce alcuna perdita di fluorescenza, possa ancora interagire con il doppio strato o la membrana biologica dei lipidi. Questo tipo di comportamento richiede approcci aggiuntivi come misurazioni del potenziale zeta, FRET tra peptide e membrana o esperimenti di fluorescenza del triptofano per citare solo alcuni esempi.
Figura 1: Principio del saggio di perdita di fluorescenza. I LUN sono stati caricati con un colorante fluorescente (ANTS) in bianco e il corrispondente quencher (DPX) in grigio. In assenza di peptidi (in rosso), non è stato osservato alcun segnale di fluorescenza perché la fluorescenza ANTS è stata spenta da DPX. L'aggiunta di peptidi sui ROV ha indotto la permeabilità della membrana e il successivo rilascio di ANTS e DPX con conseguente aumento significativo della fluorescenza ANTS (giallo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Saggio di perdita di fluorescenza con nanoparticelle WRAP e WRAP:siRNA libere. Il peptide da solo e le nanoparticelle caricate con siRNA sono state applicate sui ROV alla concentrazione peptidica di 2,5 μM. Le nanoparticelle a base di WRAP sono state formulate con un rapporto molare peptide:siRNA di 20 (R 20) come descritto in Konate et al.7,16. Le frecce nere mostrano iniezioni di peptide (nanoparticelle) e Triton X-100, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio di perdita di fluorescenza con coniugati WRAP-iCAL36 e Penetratin-iCAL36. I coniugati sono stati applicati sui ROV alla concentrazione di 2,5 μM. Le frecce nere mostrano iniezioni di peptide e Triton X-100, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il test di perdita di fluorescenza presentato è un metodo semplice e veloce per affrontare la destabilizzazione della membrana da parte del peptide che penetra nelle cellule. Facile da fare, consente anche un confronto indiretto tra diversi peptidi che interagiscono con la membrana o altre molecole che interagiscono con la membrana. Per quanto riguarda le fasi critiche del protocollo, poiché questo test fornisce valori relativi tra il basale (SOLO LUV) e il massimo rilascio di fluorescenza (condizione di Triton), di solito valutiamo la concentrazione di ROV utilizzando il kit di quantificazione dei fosfolipidi, che stima solo il contributo di colina dei LUV. Tuttavia, è anche possibile includere una misurazione più accurata della concentrazione di LUV determinando il contenuto totale di fosforo mediante digestione acida come descritto da Rouser e colleghi27 o da Bartlett28 o con metodo colorimetrico utilizzando fosfolipidi complessanti ferrotiocianati di ammonio29. Nelle nostre mani, non ha un impatto sulla quantificazione relativa della perdita e sul confronto tra peptidi che interagiscono con la membrana.
Per quanto riguarda l'uso dei UV, si dovrebbe anche notare l'importanza di controllare lo stato della linea di base della sola LUV al fine di verificare se sono utilizzabili e se stanno già mostrando perdite (caratterizzate da un continuo aumento della fluorescenza). Allo stesso modo, è importante misurare il massimo rilascio di fluorescenza dopo ogni incubazione peptidica per garantire che non siano stati registrati risultati falsi negativi a causa di un processo di tempra indesiderato (ad esempio, tempra peptidica / colorante).
In generale, secondo la caratterizzazione DLS, i LUN sono abbastanza stabili per 1 settimana e non dovrebbero mostrare uno sfondo di fluorescenza troppo elevato. In questo contesto, la purificazione dei liposomi caricati ANTS/DPX mediante filtrazione su gel è anche un punto chiave poiché consente la formazione di LUT senza avere fluorescenza residua che potrebbe contribuire allo sfondo o produrre sovrastima di fluorescenza. Inoltre, si consiglia vivamente di calibrare il protocollo includendo uno specifico controllo positivo che possa sempre dare la stessa percentuale di perdite. Ciò costituisce un controllo interno attraverso le diverse misurazioni, che potrebbe rafforzare la caratterizzazione dei UV per ogni test e aumentare le statistiche.
Sebbene il saggio di perdita di fluorescenza possa fornire un rapido confronto nella destabilizzazione della membrana da parte dei CPP, è tuttavia limitato nell'interpretazione delle interazioni peptide-membrana poiché alcuni peptidi sono in grado di interagire con il doppio strato lipidico senza indurre alcun disturbo o perdita di membrana. Per questi peptidi, si consiglia vivamente di utilizzare esperimenti aggiuntivi con marcatori di fluorescenza specifici che abilitano FRET30.
Va anche notato che potrebbero essere utilizzate altre coppie colorante/quencher a fluorescenza (ad esempio, Tb3+/ DPA31). Entrambi i metodi hanno i loro inconvenienti: il terbio (III) non è molto solubile in acqua e non può essere utilizzato in presenza di fosfato, mentre la tempra ANTS non è una funzione lineare della concentrazione di DPX. Inoltre, altri materiali auto-dissetanti come la soluzione di Calceina32 da 70 mM o il destrano-PTS33 potrebbero essere maneggiati a seconda dei difetti della membrana provocati dal peptide o dal composto analizzato.
Infine, il vantaggio principale di questo saggio di perdita di fluorescenza è la capacità di testare una moltitudine di potenziali molecole interagenti di membrana e diverse composizioni di membrana, come imitazioni di membrana endosomiale [ad esempio, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) / dioleoil-fosfato-fosfato-tidylethanolamine (DOPE) / fosfatidilinositolo da fosfato di soia (PI) / bis (monooleoilglicero) fosfato (LBPA) con un rapporto molare di 5: 2: 1:2] 34 , la membrana mitocondriale imita [ad esempio, 46,5% DOPC, 28,5% fosfatidiletanolamina (PE), 9% fosfatidilinositolo (PI), 9% fosfatidilserina (PS) e 7% cardiolipina (CL)35 o qualsiasi altra composizione lipidica a doppio strato desiderata. Tuttavia, si dovrà prima garantire la stabilità delle vescicole (nessuna fusione, aggregazione o precipitazione LUV, nessuna caduta lipidica dalla sospensione, nessuna curvatura negativa della membrana, ecc.) con una dimensione media costante vicina a 100 nm durante l'esperimento e lo stoccaggio.
Inoltre, il vantaggio di questo metodo rispetto alle membrane estratte (globuli rossi, mitocondri, ecc.) è l'uso di lipidi purificati ben caratterizzati in assenza di proteine. Il controllo della composizione lipidica a doppio strato (membrana plasmatica, endosomiale o mitocondriale) consente anche l'inserimento di specifiche proteine di membrana (pompa protonica). Inoltre, la capacità di controllare sia i LUV interni che gli ambienti esterni consente una chiara interpretazione del disturbo/perdita della membrana. Rispetto agli esperimenti sulla membrana lipidica nera36, che possono anche visualizzare gli eventi di permeabilizzazione della membrana, questo protocollo di perdita fornisce un metodo di screening più semplice dei peptidi attivi sulla membrana.
In conclusione, questo semplice metodo favorisce una rapida identificazione di forti interazioni peptido/membrana che portano alla destabilizzazione della membrana. Può essere applicato per studiare il meccanismo di internalizzazione dei CPP e in un approccio più generale di "peptidi attivi di membrana" come peptidi fusiogeni o antimicrobici.
In generale, la caratterizzazione della via principale utilizzata dai CPP per raggiungere il citoplasma è molto complessa e richiede diversi approcci distinti, dalla biofisica alla biologia cellulare. Ad esempio, lo studio dell'internalizzazione WRAP ha rivelato un equilibrio tra diversi meccanismi di ingresso nelle cellule (endocitosi contro traslocazione diretta) e il saggio di perdita di fluorescenza, associato ad altri metodi, ha contribuito a supportare un processo di penetrazione diretta7.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Emilie Josse per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione "La Ligue contre le Cancer", dalla "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" e dal "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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