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Biochemistry

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.

Abstract

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri approcci, è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi su una trascrizione di mRNA.

In questo articolo, descriviamo le fasi consecutive della raccolta e della preparazione dei campioni per il metodo RIBO-seq nei batteri, evidenziando i dettagli rilevanti per la pianificazione e l'esecuzione dell'esperimento.

Poiché il RIBO-seq si basa su ribosomi intatti e mRNA correlati, il passo chiave è la rapida inibizione della traduzione e un'adeguata disintegrazione delle cellule. Pertanto, suggeriamo la filtrazione e il congelamento flash nell'azoto liquido per la raccolta cellulare con un pretrattamento opzionale con cloramfenicolo per arrestare la traduzione nei batteri. Per la disintegrazione, proponiamo la macinazione di cellule congelate con malta e pestello in presenza di ossido di alluminio per interrompere meccanicamente la parete cellulare. In questo protocollo non è richiesto un cuscino di saccarosio o un ultracentrifugazione gradiente di saccarosio per la purificazione monosomatica. Invece, viene applicata la separazione dell'mRNA utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) seguita dall'escissione dell'impronta ribosomiale (banda 28-30 nt) e fornisce risultati soddisfacenti. Ciò semplifica in gran parte il metodo e riduce i tempi e i requisiti delle apparecchiature per la procedura. Per la preparazione della biblioteca, si consiglia di utilizzare il piccolo kit di RNA disponibile in commercio per il sequenziamento Illumina da New England Biolabs, seguendo le linee guida del produttore con un certo grado di ottimizzazione.

Le librerie cDNA risultanti presentano la quantità e la qualità appropriate necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il sequenziamento delle librerie preparate secondo il protocollo descritto comporta da 2 a 10 mln letture mappate in modo univoco per campione fornendo dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è rapido e relativamente semplice e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.

Introduction

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è stata sviluppata nel laboratorio di Jonathan Weissman presso l'Università della California, San Francisco1. Rispetto ad altri metodi usati per studiare l'espressione genica a livello traslazionale, RIBO-seq si concentra su ogni legame ribosoma all'mRNA e fornisce informazioni sulla sua posizione e sul numero relativo di ribosomi su una trascrizione. Consente di monitorare il processo di sintesi proteica in vivo e può fornire una risoluzione e una precisione del codone singolo consentendo la misurazione della densità ribosoma su entrambi, il singolo mRNA e lungo l'intero trascrittame nella cellula. Alla base della tecnica RIBO-seq si trova il fatto che durante la traduzione il ribosoma lega la molecola di mRNA e quindi protegge il frammento sepolto della trascrizione da una digestione della ribonucleasi. Dopo l'aggiunta della ribonucleasi, l'mRNA non protetto viene digerito e i frammenti racchiusi da ribosomi - tipicamente lunghi ~28-30 nt - rimangono intatti. Questi frammenti, chiamati impronte ribosomiali (RF), possono quindi essere isolati, sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine con conseguente rilevamento della posizione esatta dei ribosomi. Infatti, la capacità ribosoma di proteggere i frammenti di mRNA è stata utilizzata dagli anni '60 per studiare i siti di rilegatura ribosomiale e iniziazione alla traduzione (TIS)2,3,4. Tuttavia, con l'avanzamento della tecnologia di sequenziamento profondo, RIBO-seq è diventato un gold standard per il monitoraggio dellatraduzione 5 che, attraverso l'impegno ribosoma, può fornire informazioni a livello genomico sulla sintesi proteica6. La profilazione ribosoma ha colmato il divario tecnologico esistente tra la quantificazione del trascrittame e il proteoma6.

Per condurre la profilazione ribosoma è necessario ottenere il lisato cellulare dell'organismo che era cresciuto nelle condizioni studiate. Interrompere queste condizioni durante la raccolta e lalisi cellulare può fornire dati inaffidabili. Per evitare ciò, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento lampo nell'azoto liquido. Le cellule possono essere lisciviate mediante macinazione criogenica in un omogeneizzatore meccanico come un miscelatore7,8 o un battitore diperline 9e per triturazione attraverso una pipetta10 o con un ago11. Il tampone di lysis può essere aggiunto poco prima o poco dopo la polverizzazione delle cellule. Nel nostro protocollo utilizziamo azoto liquido per preraffreddare malta e pestello, così come l'ossido di alluminio come approccio più delicato all'interruzione della parete cellulare batterica, che impedisce la tosatura dell'RNA spesso riscontrata quando vengono applicati metodi come la sonificazione. Dopo la polverizzazione, aggiungiamo un tampone di lisi ghiacciata nel contenuto raffreddato della malta. La selezione di un buffer di lisi appropriato è importante per ottenere la migliore risoluzione delle impronte ribosomiali. Poiché la forza ionica influisce sia sulla dimensione RF che sulla precisione del fotogramma di lettura, si consiglia attualmente di utilizzare buffer di lisi con bassa forza ionica e capacità tampone, anche se sembra che la composizione tampone non influenzi l'occupazione ribosomiale su mRNA11,12. Componenti importanti del tampone di lisi sono gli ioni di magnesio, la cui presenza previene la dissociazione delle subunità ribosomiali e inibisce i cambiamenti conformazionali spontanei nei ribosomibatterici 11,13. Anche gli ioni di calcio svolgono un ruolo significativo e sono essenziali per l'attività della nucleasi micrococcica (MNasi) utilizzata nel metodo di profilazione ribosomabatterica 14. L'aggiunta di guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un analogo non idrolabile di GTP, insieme al cloramfenicolo inibisce la traduzione durante la lisi15.

Quando il lisato viene ottenuto, viene chiarito per centrifugazione e diviso in due porzioni, ognuna per un RIBO-seq e un sequenziamento totale dell'mRNA ad alta produttività (RNA-seq) poiché vengono eseguite simultaneamente(Figura 1). RNA-seq fornisce un punto di riferimento che consente il confronto dei dati sia ribo-seq che RNA-seq durante l'analisi dei dati. Il translatoma studiato è definito dalla normalizzazione delle impronte ribosomiche all'abbondanza di mRNA16. I dati di RNA-seq possono anche aiutare a identificare la clonazione o sequenziare gliartefatti 17.

Figure 1
Figura 1. Schemi di preparazione del campione di mRNA per RIBO-seq e RNA-seq. Per la preparazione della libreria RIBO-seq, l'RNA viene digerito con MNasi (A), seguito dalla selezione delle dimensioni di RF di ~28-30 nt di lunghezza (B); per l'RNA RNA-seq è isolato (C), impoverito di rRNA (D), e l'mRNA risultante è frammentato casualmente in frammenti di varie lunghezze (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I primi passi della procedura di preparazione del campione per RIBO-seq e RNA-seq differiscono leggermente (Figura 1). Per la profilazione ribosomiale, il lisato deve essere digerito da una specifica endonucleasi per degradare le molecole di mRNA non protette dai ribosomi. Nei protocolli standard, i monosomi ottenuti vengono recuperati da un cuscino di saccarosio ultracentrifugato o da un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione8,14. In questo articolo, mostriamo che questo passaggio non è necessario per isolare RF richiesto per il RIBO-seq nei batteri, allo stesso modo per le cellule eucariotiche18e che la selezione delle dimensioni dei frammenti di mRNA di lunghezza appropriata dal gel di poliacrilammide è sufficiente.

Per l'RNA-seq, l'mRNA è ottenuto dall'esaurimento dell'rRNA dalle molecole totali di RNA - rRNA che si ibridano alle sonde oligonucleotidi biotinylate che si legano alle perline magnetiche rivestite di streptavidina. I complessi rRNA-oligonucleotide-perline vengono quindi rimossi dal campione con un magnete con conseguente campionamento impoverito di rRNA19,20. Le molecole di mRNA purificate vengono quindi frammentate casualmente per idrolisi alcalina. I frammenti ottenuti di mRNA e le impronte ribosomiali vengono convertiti in librerie cDNA e preparati per il sequenziamento profondo (Figura 2). Ciò comporta la riparazione delle estremità necessaria dopo l'idrolisi alcalina (per mRNA) e la digestione enzimatica (per RF): defosforilazione di 3' estremità seguita da fosforilazione di 5' estremità. I passaggi successivi sono la legatura degli adattatori e la trascrizione inversa per creare inserti cDNA incorniciati da sequenze necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) utilizzando la piattaforma Illumina. L'ultima fase della preparazione della libreria è una reazione PCR in cui i costrutti vengono amplificati ed etichettati con codici a barre specifici del campione per consentire il multiplexing e il sequenziamento di vari campioni su un canale. Prima del sequenziamento, la qualità e la quantità delle librerie sono valutate dall'elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità. Le librerie cDNA con parametri appropriati possono quindi essere raggruppate e sequenziate. Il sequenziamento può essere eseguito su diverse piattaforme Illumina, come MiSeq, NextSeq o HighSeq, a seconda del numero di librerie, della lunghezza di lettura e della profondità di sequenziamento richieste. Dopo il sequenziamento, viene eseguita l'analisi bioinformatica.

Figure 2
Figura 2. Preparazione della biblioteca. La preparazione della libreria include la riparazione delle estremità, la legatura degli adattatori, la trascrizione inversa e l'amplificazione con codifica a barre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La profilazione ribosoma è un metodo universale che può essere facilmente modificato e regolato in base alla questione scientifica. Originariamente è stato utilizzato nellievito 1,ma poco dopo è stato applicato alle cellulebatteriche 21 così come agli organismi modello eucariotico tra cui topo10,zebrafish22,mosca dellafrutta 23 e Arabidopsis thaliana24. È stato anche usato per studiare diversi tipi di ribosomi: citoplasmatico, mitocondriale25,26 e cloroplasto27,28. Negli eucarioti RIBO-seq è comunemente adattato e raffinato per indagare aspetti specifici della traduzione, tra cuiiniziazione 10,11,29,30,31,32,allungamento 1,10,11,31,33,ribosoma stallo33 e modifica conformazione33. La maggior parte delle modifiche comporta l'uso di diversi inibitori della traduzione. Nei batteri, tuttavia, studi analoghi sono stati difficili da condurre a causa della scarsità di inibitori con il meccanismo d'azionerichiesto 34. L'inibitore della traduzione più comunemente usato nei batteri è il cloramfenicolo (CAM) che si lega al centro peptidil transferasi (PTC) e impedisce il corretto posizionamento dell'amminoacil-tRNA nel sito A. Di conseguenza, CAM impedisce la formazione di un legame peptidico che porta ad arrestare i ribosomi allunganti35. Altri esempi di inibitori della traduzione nei batteri sono la tetraciclina (TET)36, la retapamulina (RET)34 e l'Onc11237 che sono stati utilizzati per studiare i siti di iniziazione alla traduzione. TET, che impedisce la consegna di tRNA al ribosoma sovrapponendosi direttamente con l'anello staminali anticodonte del tRNA nel sito A, è stato originariamente applicato per verificare i risultati ottenuti dal trattamento CAM poiché sono entrambi antibiotici che inibiscono l'allungamento dellatraslazione 38. Tet è stato trovato per rilevare tis primario, tuttavia non è stato in grado di rivelare tis36 interno. Il RET si lega nel PTC del ribosoma batterico e previene la formazione del primo legame peptidico interferendo con un aminoacil-tRNA allungatore nel sito A. L'applicazione del RET comporta l'arresto dei ribosomi sia al TISs34primario che a quello interno. Onc112, un peptide antimicrobico ricco di prolina, si lega nel tunnel di uscita e blocca il legame amminoacil-tRNA nel sito ribosomiale A. Di conseguenza, Onc112 impedisce ai complessi di iniziazione di entrare nella fase diallungamento 37.

La principale profilazione ribosoma delle informazioni fornisce la densità dei ribosomi e la loro posizione sull'mRNA. È stato applicato con successo per studiare l'espressione genica differenziale a livello di traduzione in varie condizioni dicrescita 1,6,misurare l'efficienza traslazionale1,38,39 e rilevare eventi di regolazione della traduzione come la pausa ribosomiale10. RIBO-seq consente inoltre di scoprire la traduzione di ncRNA annotato, pseudogeni e piccoli telai di lettura aperti senza preavviso (ORF) che portano all'identificazione di geni di codifica proteica nuovi e/o molto brevi10,12,22,30,37. In questi casi, RIBO-seq può perfezionare e migliorare l'annotazione del genoma. Con la sua elevata sensibilità per l'identificazione degli ORF tradotti e la sua natura quantitativa, la profilazione ribosoma può anche servire da proxy per la determinazione del proteoma o per aiutare gli studi di proteomica31,34,39. Mappando TIS, la profilazione ribosoma rivela isoforme estese e troncate N-terminale di proteinenote 10,32. RIBO-seq è stato anche adattato per studiare il ripiegamento co-traslazionaledelle proteine 14,21,24. Questo metodo consente di misurare i tassi diallungamento 1,10,39 o velocità di decodifica dei singolicodoni 6 e aiuta a sviluppare modelli quantitativi ditraduzione 17. Il metodo di profilazione ribosoma è anche in grado di fornire approfondimenti meccanicistici sulla pausa ribosoma neibatteri 7,15,17,frameshifting40,stop-codon readthrough21,difetti di terminazione /riciclaggio41,42 e modifiche alla conformazione ribosomiale33 negli eucarioti. RIBO-seq è stato anche adattato per esaminare l'impatto di specifici fattori trans-acting sulla traduzione come le miRNA6 e le proteine leganti l'RNA negli eucarioti16,43. Tuttavia, è importante riconoscere che il progetto sperimentale e la risoluzione ottenuta di RIBO-seq determinano la quantità di informazioni che possono essere estratte dai dati di sequenziamentorisultanti 12.

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Protocol

1. Raccolta dei campioni

  1. Preparare una coltura batterica. Si consiglia un volume di coltura di 100 mL per campione.
  2. Preparare attrezzature e reagenti per la raccolta dei campioni: due scoopula per campione, filtri sterili a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm, tubi sterili da 50 ml, azoto liquido, 50 mg/mL di cloramfenicolo nel 70% (vol/vol) di etanolo (facoltativo). Forare il coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido e prevenire l'esplosione di tubi chiusi. Scoopulas decontaminati con detergente da laboratorio e 70% etanolo.
  3. Prewarm l'apparecchiatura filtrante e una delle scoopulas alla temperatura di crescita della coltura batterica.
    NOTA: Si consiglia un apparato di filtrazione tutto vetro con imbuto, base fritte, pallone a giunto a terra e morsetto a molla Ø da 47 mm.
  4. Prima della raccolta del campione, aggiungere il cloramfenicolo nella coltura batterica alla concentrazione finale di 100 μg/mL e incubare 1 minuto (facoltativo).
  5. Versare azoto liquido in un tubo sterile da 50 ml e posizionare la seconda scoopula all'interno del tubo per raffreddare.
    cautela! L'azoto liquido può causare l'esplosione di contenitori chiusi a causa del cambiamento di pressione all'evaporazione. Per evitare ciò, è necessario creare alcuni fori nel coperchio di tubi da 50 ml per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido.
  6. Raccogliere le cellule per filtrazione. Interrompere il filtraggio quando il mezzo è passato attraverso la membrana, ma non lasciare asciugare completamente il filtro.
  7. Raccogliere pellet batterici raschiando rapidamente le cellule dal disco filtrante utilizzando una scoopula prebellica. Posizionare immediatamente l'intera scoopula con le cellule raccolte nel tubo da 50 ml riempito con azoto liquido. Il pellet raccolto deve essere completamente ricoperto di azoto liquido.
  8. Lasciare congelare accuratamente il pellet e spodedare le cellule congelate utilizzando una seconda scoopula precedentemente raffreddata. Chiudere il coperchio perforato e trasferire il tubo a -80°C. Punto STOP
    NOTA: Disinfettare le scoopulas dopo ogni raccolta del campione.

2. Llisi cellulare

  1. Preparare 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNasi I e 1,5 mL di tubi di reazione per lisati e tenerli sul ghiaccio. Raffreddare la centrifuga a 4 °C.
  2. Preparare tampone di lysis (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0.4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoetanolo, 5 mM CaCl2 e opzionale 1 mM cloramfenicolo). Aliquota 500 μL del tampone di lisi per campione in tubi di reazione da 1,5 ml e metterli sul ghiaccio.
  3. Decontaminare malta e pestello con un detergente da laboratorio e 70% di etanolo, e asciugarli. Raffreddare malta e pestello versando azoto liquido nella malta.
  4. Trasferire il pellet congelato nella malta prerimente refrigerata e macinarlo in polvere. Con una spatola, aggiungere circa 1 volume di ossido di alluminio e continuare la macinazione. Mantenere malta, pestello e cellule raffreddare versando azoto liquido quando necessario, non lasciare che il contenuto della malta si scongeli.
  5. Poco prima di utilizzare il buffer di lisi, aggiungere GMP-PNP e DNasi I nell'aliquota del tampone di lisi alla concentrazione finale rispettivamente di 2 mM e 100 U/mL. Trasferire la soluzione nella malta con celle e ossido di alluminio e continuare la macinazione. Lasciare il disgelo del lysate lentamente durante la macinazione e trasferire la miscela nel tubo di reazione prerifuotto da 1,5 ml e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio.
  6. La centrifuga si disatti a 20 000 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi di reazione pre-raffreddati da 1,5 ml e tenerli sul ghiaccio.
  7. Misurare la concentrazione di RNA in ogni campione con un NanoDrop. Utilizzare 1:10 diluizioni di campioni e 1:10 diluizione del tampone di lisi in acqua priva di nucleasi come vuoto.
    NOTA: Tenere presente che il cloramfenicolo mostra un assorbimento significativo a 260 nm.
  8. Dividere ogni lisato in due porzioni: una per RIBO-seq (0,5 - 1 mg di RNA) e la seconda per RNA-seq (il resto).
  9. Pulire i campioni per RNA-seq utilizzando un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare il kit Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (vedi Tabella dei materiali). Si consiglia inoltre di aggiungere 4,5 volumi di etanolo (rispetto al volume del campione) nella miscela di campione e Buffer di legame per impronte ribosomiali e mRNA frammentato, al fine di aumentare l'efficienza di purificazione dei frammenti di RNA brevi.
  10. Conservare i campioni destinati all'RNA-seq a -80 °C. La procedura per RNA-seq continuerà dal passaggio 5.

3. Digestione MNasi di campioni per RIBO-seq

  1. A 1 mg di RNA aggiungere 3,8 μL di 187,5 U/μL MNasi in 10 mM Tris pH 8 e completarlo con tampone di lysis al volume totale di 500 μL.
  2. Incubare a 25 °C, 300 giri/min, per 45 minuti in un termomixer.
  3. Pulire i campioni con un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio (come nel passaggio 2.9).
  4. Conservare i campioni per RIBO-seq a -80 °C (punto STOP) o procedere alla selezione delle dimensioni.

4. Elettroforesi in gel di poliacrilammide (PAGE) e selezione delle dimensioni dei campioni per RIBO-seq

  1. Preparare un gel poliacrilammide-TBE al 15% con urea da 8 M e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per almeno 10 minuti ad una tensione costante di 200 V.
  2. Mescolare i campioni con TBE-Urea Sample Buffer, denaturare a 95 °C per 1 minuto e posizionarli immediatamente sul ghiaccio.
  3. Lavare l'urea iniettando il tampone TBE in pozzi di gel usando una siringa. Caricare i campioni lasciando uno spazio ben compreso tra di loro per separare ogni campione e prevenire la contaminazione incrociata. Utilizzare come marcatori oligonucleotidi da 29 nt e una miscela di oligonucleotidi da 26 nt e 32 nt. Eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 180 V.
  4. Preparare tampone sterile per l'incubazione notturna (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Dopo l'elettroforesi, macchiare il gel in un bagno d'oro SYBR per circa 2-3 minuti e risciacquare il gel con acqua priva di nucleasi.
  6. Asportare frammenti di gel tra 26 e 32 nt con gli aghi sterili o le lamette da barba e posizionare i frammenti di gel in tubi separati da 1,5 ml per ciascun campione. Cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.
  7. Aggiungere 200 μL del tampone di incubazione notturno a ciascun tubo di reazione.
  8. Incubare i campioni a 10 °C, 1000 giri/min durante la notte in un termomixer.
  9. Il giorno successivo pulire i campioni come nel passaggio 2.9. Elute le impronte in 80 μL di acqua priva di nucleasi.
  10. Conservare i campioni a -80 °C. PUNTO STOP. La procedura per RIBO-seq proseguirà dal passaggio 7.

5. Purificazione dell'mRNA batterico mediante esaurimento dell'rRNA da campioni per RNA-seq

  1. Rimuovere l'rRNA dai campioni con un kit di purificazione dell'mRNA batterico (ad esempio, Invitrogen MICROBExpress). Seguire il protocollo del produttore.
  2. Pulire i campioni come nel passaggio 2.9. Elute l'mRNA in 50 μL di acqua priva di nucleasi.
  3. Conservare i campioni per RNA-seq a -80 °C (punto STOP) o continuare a frammentazione alcalina.

6. Frammentazione alcalina dei campioni per RNA-seq

  1. Preparare tampone di idrolisi alcalina (miscela 220 μL di 0,1 M NaHCO3, 30 μL di 0,1 M Na2CO3 e 1 μL di 0,5 M EDTA). Mescolare 1 volume (50 μL) di tampone alcalino con 1 volume (50 μL) del campione e incubare a 95 °C per 25 minuti.
  2. Aggiungere 5 μL di 3 M NaOAc pH 5.5 per fermare la reazione.
  3. Pulire i campioni come al passaggio 2.9 ed elutare i campioni in 80 μL di acqua priva di nucleasi.
  4. Possibile punto STOP: conservare campioni di RNA-seq a -80 °C. Tuttavia, si consiglia di andare direttamente al passaggio 7 per evitare inutili congelamento e scongelamento.

7. Defosforilazione e fosforilazione di campioni sia per l'RNA che per il RIBO-seq

  1. Aggiungere 10 μL di 10x tampone di reazione PNK e 5 μL T4 PNK ad ogni campione. Incubare a 37 °C per 1,5 ore per defosforire le estremità 3 '.
  2. Aggiungere 3 μL di 1 mM di ATP e incubare a 37 °C per 1 ora per fosforilate le estremità 5'.
  3. Pulire i campioni come nel passaggio 2.9, elute in acqua priva di nucleasi da 30 μL.
  4. Conservare i campioni a -80 °C. PUNTO STOP.

8. Preparazione della libreria con NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set per Illumina

  1. Preparare 100-1000 ng di RNA di ingresso (frammenti di mRNA ottenuti e impronte ribosomiali) in 6 μL di acqua priva di nucleasi e aggiungere 1 μL di adattatore SR da 3'. Incubare secondo il protocollo del produttore.
  2. Aggiungere 10 μL di 3' Ligation Reaction Buffer (2X) e 3 μL di 3' Ligation Enzyme Mix e incubare a 37 °C per 2,5 ore, invece di 1 ora a 25 °C come specificato dal protocollo del produttore.
  3. Ibridare il primer di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore con un programma modificato: 5 minuti a 75 °C, 30 minuti a 37 °C e tenere a 4 °C.
  4. Ligate l'adattatore SR da 5'. Seguire il protocollo del produttore con una sola modifica: eseguire l'incubazione a 37 °C per 2,5 ore, invece di 1 ora a 25 °C.
  5. Eseguire la trascrizione inversa in base al protocollo del produttore.
  6. Possibile punto STOP: incubare i campioni contenenti cDNA sintetizzati a 70 °C per 15 minuti per inattivare la transcriptasi inversa e conservarli a -80 °C. Tuttavia, si consiglia di procedere direttamente ai passaggi successivi per evitare inutili congelamento e scongelamento dei campioni.
  7. Conservare metà di ogni libreria cDNA a -80 °C come backup.
  8. Eseguire l'amplificazione PCR secondo il protocollo del produttore. Utilizzare metà del mix di reazione. Conservare le librerie ottenute a -80 °C. PUNTO STOP.

9. Selezione delle dimensioni delle librerie cDNA utilizzando PAGE

  1. Preparare il 6% di gel poliacrilammide-TBE e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per almeno 10 minuti ad una tensione costante di 200 V.
  2. Mescolare i campioni con Gel Loading Dye, Blue (6X) e caricarli sul gel. Utilizzare il digest pBR322 DNA-MspI a caricamento rapido come scala. All'inizio, eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 120 V per consentire al DNA di entrare nel gel e quindi cambiare la tensione a 180 V.
  3. Al termine dell'elettroforesi, macchiare il gel in un bagno d'oro SYBR per circa 2-3 minuti e risciacquare il gel con acqua priva di nucleasi.
  4. Frammenti di gel di accisa contenenti le biblioteche. Per campioni di RNA-seq accisa tra 135-180 nt e per RIBO-seq tra 135-170 nt. Utilizzare aghi sterili o lamette da barba e posizionare i frammenti di gel asportati in tubi di reazione separati da 1,5 ml. Ricordarsi di cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.
    NOTA: gli adattatori e il codice a barre di NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina hanno 119 nt in totale che determina il taglio dell'escissione inferiore.
  5. Aggiungere 100 μL di acqua priva di nucleasi a ogni frammento di gel accisa.
  6. Incubare i frammenti di gel a 10 °C, 450 giri/min durante la notte in un termomixer.
  7. Pulire e concentrare le librerie cDNA con un kit di pulizia del DNA commerciale secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare il kit Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (vedi Tabella dei materiali).
  8. Conservare le librerie cDNA purificate a -80 °C. Punto STOP.

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Representative Results

I risultati esemplari qui presentati sono stati ottenuti in uno studio che esamina la regolazione della traduzione nelle cellule subtili sporulate di Bacillus bacillus. Le colture notturne sono state diluite in OD600 pari a 0,1 in 100 mL di mezzo ricco e incubate a 37 °C con scuotimenti vigorosi fino a quando L'OD600 ha raggiunto 0,5-0,6. Il ricco mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo minimo per indurre il processo di sporulazione e l'incubazione è stata continuata per un massimo di quattro ore. Le cellule venivano raccolte ogni ora a partire dall'induzione di T0 - sporulazione - con conseguente cinque punti di tempo. Un minuto prima della raccolta, le colture sono state trattate con cloramfenicolo come descritto nel protocollo precedente. Le cellule sono state raccolte per filtrazione in un sistema di filtrazione del vetro prebellica utilizzando filtri a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm e congelate in azoto liquido.

La quantità di acido ribonucleico ottenuta nel lysate dipende dalle condizioni di crescita, dal volume e dalla densità della coltura. Seguendo il nostro protocollo, 100 mL della coltura batterica (Bacillus subtilis) produce in media 1-4 mg di RNA. Esempi di lisati ottenuti dall'esperimento sopra descritto sono riportati nella tabella 1.

Concentrazione di RNA [ng/μL] Quantità di RNA [mg] A260/A280 A260/A230
Wt0 5845 3.21 1.57 0.83
Wt1 6275 3.45 1.58 0.79
Wt2 3525 1.94 1.38 0.56
Wt3 3717 2.04 1.37 0.61
Wt4 1653 0.91 1.11 0.43

La tabella 1. Concentrazione e quantità di RNA in campioni rappresentativi di Lire di B. subtilis. La tabella comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione. La lisi è stata eseguita con 550 μL di tampone di lisi contenente cloramfenicolo. Si può notare che man mano che la sporulazione procede, la quantità di RNA ottenuto diminuisce.

Quando la quantità di RNA è inferiore a 1 mg, 0,25 mg di RNA vengono utilizzati per RIBO-seq invece di 1-0,5 mg e la quantità di MNasi viene quindi regolata rispettivamente. La quantità rappresentativa di RNA e la concentrazione dopo la digestione della nucleasi sono indicate nella tabella 2. La quantità media di RNA dopo la digestione e la pulizia è di 50 μg da 0,5 mg di ingresso di RNA.

Concentrazione di RNA [ng/μL] Quantità di RNA [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

La tabella 2. La quantità e la concentrazione di RNA dopo la digestione nucleasi dei campioni rappresentativi per RIBO-seq. La tabella comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce ai campioni per RIBO-seq. Poiché la concentrazione di RNA del campione WT4-R era bassa, 0,25 mg di RNA sono stati digeriti, mentre 0,5 mg dell'RNA per i campioni rimanenti sono stati utilizzati per la generazione di impronta ribosomiale. La quantità di MNasi per la digestione era di 178,125 U per 0,25 mg di RNA in WT4-R e 356,25 U per 0,5 mg di RNA in altri campioni. Dopo la digestione i campioni sono stati puliti con il kit di pulizia dell'RNA commerciale e la concentrazione di acido ribonucleico è stata misurata con il NanoDrop.

Dopo la digestione della MNasi, la selezione delle dimensioni viene eseguita con l'aiuto di PAGE. Un esempio di gel di poliacrilammide TBE-urea al 15% con i campioni digeriti è mostrato nella figura 3. Frammenti di gel tra i 26 e i 32 nt sono stati asportati con una lama sterile e incubati durante la notte nel tampone di incubazione notturno. Il giorno dopo, le impronte ribosomiche sono state pulite con il kit di pulizia dell'RNA commerciale.

Figure 3
Figura 3. 15% di gel di poliacrilammide TBE-urea con campioni rappresentativi dopo la digestione della MNasi. La cifra comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce ai campioni per RIBO-seq. 15 μL di campioni denaturati sono stati caricati nei pozzi di gel in ordine: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R e il volume rimanente è stato conservato a -80 °C come backup. Come marcatori sono stati utilizzati 29 nt oligonucleotidi e miscele di oligonucleotidi da 26 nt e 32 nt. L'elettroforesi è stata eseguita come descritto sopra e il gel è stato macchiato in un bagno d'oro SYBR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parallelamente alla digestione della nucleasi, i lisati per l'RNA-seq sono stati puliti con il kit di pulizia dell'RNA commerciale e le concentrazioni ottenute di RNA sono state misurate con NanoDrop. I risultati rappresentativi sono presentati nella tabella 3. Dopo la pulizia, la quantità di acido ribonucleico è diminuita a 40-500 μg.

Concentrazione di RNA [ng/μL] Quantità di RNA [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

La tabella 3. Quantità di RNA e concentrazione di campioni per RNA-seq dopo la purificazione dell'RNA. La tabella comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "m" si riferisce ai campioni per RNA-seq (mRNA).

Le concentrazioni di RNA ottenute dei campioni per RNA-seq sono state utilizzate per definire l'input di RNA per l'esaurimento dell'rRNA. 8 μg di RNA da ciascun campione di RNA-seq sono stati utilizzati con il kit di purificazione dell'mRNA batterico MICROBExpress (vedi Tabella dei materiali)secondo il protocollo del produttore e sono stati puliti successivamente con il kit di pulizia dell'RNA commerciale. I risultati rappresentativi dell'esaurimento dell'rRNA sono riportati nella tabella 4.

Concentrazione di RNA [ng/μL] A260/A280 A260/A230 Quantità di RNA [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

La tabella 4. Quantità rappresentativa di RNA e concentrazione dopo l'esaurimento dell'rRNA. La tabella comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "m" si riferisce ai campioni per RNA-seq. 8 μg di RNA da campioni per RNA-seq sono stati utilizzati per l'esaurimento dell'rRNA e puliti successivamente con un kit di pulizia dell'RNA commerciale.

Successivamente, l'mRNA ottenuto è stato frammentato per idrolisi alcalina e pulito con un kit commerciale come descritto nel protocollo. Le impronte frammentarie di mRNA e ribosomiali sono state defosforilate a 3' estremità e fosforilate a 5' estremità secondo il protocollo di cui sopra. I campioni sono stati quindi utilizzati per costruire librerie cDNA per il sequenziamento Illumina, come descritto nel protocollo. La figura 4 mostra un esempio di gel di poliacrilammide al 6% con le librerie ottenute. Frammenti di gel dell'intervallo 135-180 nt per RNA-seq e 135-170 nt per RIBO-seq sono stati asportati con lamette da barba sterili e incubati durante la notte in acqua priva di nucleasi. Le librerie sono state pulite con un kit di pulizia del DNA commerciale e la qualità e la quantità sono state valutate da un'elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità utilizzando il Bioanalyzer Agilent 2100.

Figure 4
Figura 4. 6% gel di poliacrilammide di librerie cDNA prima e dopo la selezione delle dimensioni. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest è stato utilizzato come scala. 25 μL di campioni sono stati caricati nel gel nel seguente ordine: tre librerie RIBO-seq e sei librerie RNA-seq. I restanti volumi di campioni sono stati conservati a -80 °C come backup. La cifra comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce ai campioni per RIBO-seq e la lettera "m" si riferisce ai campioni per RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli esempi di immagini di gel virtuali ed elettroferogrammi ottenuti dal Bioanalizzatore Agilent 2100 sono riportati nella figura 5. Le bande e i picchi che rappresentano le librerie RIBO-seq sono più stretti e meglio definiti rispetto a questi che rappresentano librerie RNA-seq. Secondo l'elettroforesi su chip, le librerie sono lunghe circa 150 bp, che è una dimensione prevista della libreria. Gli adattatori e il codice a barre utilizzati nella preparazione della libreria sono lunghi 119 nt e gli inserti sono lunghi 29-30 nt (per RIBO-seq) o in un intervallo compreso tra 25 e 50 nt (per RNA-seq). I picchi aggiuntivi più vicini ai 200 bp ottenuti dalle librerie RIBO-seq possono indicare manufatti PCR che possono essere scartati durante l'analisi bioinformatica quando i dati ottenuti dal sequenziamento vengono tagliati e rRNA/tRNA viene filtrato. La quantità media di DNA è di 32 ng fornendo una quantità sufficiente di materiale necessaria per il sequenziamento di prossima generazione.

Figure 5
Figura 5. Gli esempi di elettroferogrammi e immagini di gel virtuali da un'elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità. La cifra comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e un'ora (1), due (2), tre (3) o quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce alle librerie RIBO-seq e la lettera "m" si riferisce alle librerie RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo il controllo qualità da parte dell'elettroforesi on-chip, le librerie sono state raggruppate per il sequenziamento single-end da 50 pb sulla piattaforma NextSeq500 di Illumina (10 librerie per canale, con un minimo di 350 mln di letture per canale). Il sequenziamento ha prodotto 30-57 milioni di letture per esempio per le librerie RNA-seq e 30-50 milioni di letture per esempio per le librerie RIBO-seq. Il taglio degli adattatori e sequenze di scarsa qualità ha comportato 24-47 mln di letture per campione per campioni di RNA-seq e 25-50 mln di letture per campione per campioni RIBO-seq. La mappatura, eseguita con STAR44, ha prodotto 2,4-9,6 milioni di letture mappate in modo univoco per campione per campioni di RNA-seq (che costituiscono l'8-16,8% del numero totale di letture) e 2,3-10,4 milioni di letture mappate in modo univoco (7,7-22,1%) per campioni RIBO-seq. I dati ottenuti sono stati controllati con FastQC45. Esempi dei grafici di qualità prodotti da FastQC per le sequenze rifilate sono riportati nella figura 6. Le sequenze della lunghezza di interesse, che è <32 nt per RIBO-seq e <50 nt per RNA-seq, hanno presentato un'ottima qualità. Gli esempi di grafici di contenuto GC e distribuzioni di lunghezze di sequenza su tutte le sequenze rifilate sono mostrati nella figura 7. Il picco aggiuntivo al 72% nel grafico di distribuzione GC della libreria RIBO-seq può potenzialmente indicare la contaminazione da rRNA che può essere rimossa durante l'analisi bioinformatica mediante filtrazione rRNA46,47,48. La distribuzione delle lunghezze di sequenza è molto stretta per le librerie RIBO-seq, con un picco di 26-27 nt mentre la distribuzione della lunghezza per le librerie RNA-seq è più ampia e varia tra 15 e 50 nt.

Figure 6
Figura 6. Esempi di grafici box-and-whisker di punteggi di qualità su tutte le basi per librerie RIBO-seq e RNA-seq dopo il taglio. La figura comprende campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti prima dell'induzione della sporulazione (0) e quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce ai campioni RIBO-seq e la lettera "m" si riferisce ai campioni di RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Esempi di grafici di contenuto GC e distribuzione della lunghezza della sequenza di tutte le sequenze per le librerie RIBO-seq e RNA-seq dopo il taglio. La figura mostra campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti quattro (4) ore dopo l'induzione della sporulazione; la lettera "R" si riferisce al campione per RIBO-seq e la lettera "m" si riferisce al campione per RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per verificare se i dati RIBO-seq forniscono informazioni sulle impronte ribosomiali vere anziché frammenti di mRNA casuali della lunghezza selezionata, abbiamo confrontato i dati di sequenziamento di RIBO-seq e RNA-seq utilizzando RiboToolkit, un server Web per l'analisi dei dati RIBO-seq49. I dati ribo-seq mostrano periodicità della tripletta e un picco alto e stretto corrispondente ai ribosomi di avvio e alla caratteristica della RF, come mostrato nella figura 8A, che non è osservato nei dati RNA-seq (Figura 8B). Inoltre, il grafico del metagene che mostra i profili di copertura media dei frammenti RF e mRNA sulle sequenze di codifica (CDS) ha rivelato una percentuale più elevata di letture mappate ai CDS nel set di dati RIBO-seq (Figura 8C), come previsto.

Figure 8
Figura 8. Grafici di periodicità metagene e copertura media di frammenti rf e mRNA su CDS. I profili Metagene sono stati ottenuti con RiboToolkit, un server webintegrato 49. La lunghezza del CDS è stata normalizzata ad un valore di 1 e ogni CDS è stato diviso in 100 contenitori uguali. La figura mostra campioni del tipo selvatico (WT) B. subtilis che sono stati raccolti un (1) ora dopo l'induzione della sporula; la lettera "R" si riferisce al campione per RIBO-seq e la lettera "m" si riferisce al campione per RNA-seq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per confrontare se il protocollo RIBO-seq qui presentato produce risultati simili a quelli ottenuti con il metodo standard di recupero RF (ultracentrifugazione del gradiente di saccarosio), abbiamo parallelo i risultati del sequenziamento delle librerie preparate seguendo i due metodi. Gli esperimenti che studiano la regolazione della traduzione durante la sporulazione nel WT B. subtilis sono stati condotti secondo il protocollo RIBO-seq presentato, oltre a seguire il protocollo standard che include il recupero dei monosomi mediante un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione. I risultati dei profili di copertura ribosoma ottenuti dai due esperimenti sono riportati nella figura 9. La visualizzazione dei FF mappati è molto simile tra i due esperimenti e ha dato risultati simili sull'analisi bioinformatica.

Figure 9
Figura 9. La visualizzazione della RF ottenuta mappata sul genoma. La figura comprende RF ottenuta da subtilis di tipo selvaggio B. raccolta quattro ore dopo l'induzione della sporulazione e preparata secondo il protocollo standard (WT4-R-s, pannello superiore) o il protocollo presentato (WT4-R, pannello inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La sfida tecnica chiave della profilazione ribosoma è la necessità di inibire rapidamente la traduzione al fine di catturare un'istantanea dei ribosomi sugli mRNA in un particolare stato fisiologico di interesse. A tal fine, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento flash nell'azoto liquido. L'applicazione di antibiotici è facoltativa poiché possono causare artefatti. Il cloramfenicolo è un farmaco comunemente usato per arrestare i ribosomi allunganti nel ribo-seq batterico. Tuttavia, non impedisce l'iniziazione, con conseguente accumulo di ribosomi circa sei codoni a valle del sito di iniziazione alla traduzione14. Inoltre, la sua capacità di inibire la reazione peptidiltransferasi può dipendere dalla natura dei substrati ribosomiali P- e A-sito. Presumibilmente, cam arresta i ribosomi in modo più efficace con Gly, Ala, Ser, Cys o Thr come penultimo amminoacido del nascente peptide17,38,50. Vale la pena prendere in considerazione questo aspetto durante la progettazione sperimentale e l'analisi bioinformatica, specialmente quando si studia la pausaribosomiale 17. CAM ha anche dimostrato di influenzare l'accuratezza traslazionale promuovendo un stop codon readthrough e frameshifting51. Tuttavia, l'inibizione cam è relativamente veloce e sufficiente per la tipica ricerca RIBO-seq14 e non induce incorporazioneerrata 51. Alcuni degli artefatti causati dagli antibiotici possono essere evitati aumentando la quantità di farmaco9. La concentrazione di CAM applicata nel nostro protocollo è la quantità tipica utilizzata negli esperimenti RIBO-seq7,14,21, tuttavia, la concentrazione può variare per diversi microrganismi e deve essere ottimizzata prima della raccolta del campione. A causa della possibilità di verificarsi di artefatti causati dall'applicazione di inibitori della traduzione, si consiglia di evitare il trattamento inibitore se non necessario per la domanda di ricerca e se la raccolta rapidaè possibile 14. La raccolta rapida delle cellule è fondamentale, soprattutto se viene eseguita senza il trattamento inibitore, poiché la raccolta prolungata può comportare una perdita di polisomi e / o cambiamenti nel trasoma come risposta alle mutevoli condizioni ambientali14. Pertanto, si consiglia di utilizzare la filtrazione come metodo di raccolta in quanto può essere eseguita nelle stesse condizioni o condizioni simili alla crescita della coltura, compresa la temperatura e / o lo scuotimento. Durante la filtrazione le cellule raccolte sulla superficie del filtro vengono costantemente lacresi con mezzo di crescita, impedendo loro di percepire spostamenti nelle densità cellulari, ossigenazione e livello di amminoacidi e altri nutrienti14. La filtrazione è più delicata e può essere più veloce della centrifugazione, se la densità della coltura è moderata, altrimenti un gran numero di cellule può ostruire i pori filtranti e rallentare il processo. Se c'è una probabilità di una filtrazione prolungata, si consiglia un pretrattamento del cloramfenicolo della coltura, che si traduce in un arresto della traduzione e consente di prolungare i tempi di raccolta. Se la filtrazione diventa difficile da completare a causa dell'intasamento del filtro, si consiglia di interrompere la filtrazione, rimuovere la coltura in eccesso e la frazione di congelamento flash della coltura raccolta sul filtro. Abbiamo osservato che 50 mL di densa coltura batterica sono sufficienti per eseguire RIBO-seq. Il successivo congelamento flash delle cellule in azoto liquido è l'approccio più universale ed efficace per interrompere immediatamente latraduzione 8,21,52.

La digestione della ribonucleasi è un passaggio critico necessario per ottenere rf di buona qualità. Selezionare l'enzima giusto è importante poiché le subunità ribosomiali sono composte da molecole di RNA che possono essere digerite, interrompendo l'integrità del ribosoma, causando la contaminazione da rRNA e distruggendo RF44. Originariamente, la RNasi I è stata utilizzata per la digestione di mRNA e generazione RF in eucarioti1. Poiché questo enzima sembrava inattivo nei batteri, è stato sostituito con una nucleasi micrococcica (MNasi) di Staphylococcus aureus21. In seguito è stato dimostrato che la RNAse I può effettivamente eseguire la digestione di campioni batterici, tuttavia la MNasi rimane comunemente utilizzata per questo scopo53. Lo svantaggio della MNasi risiede nella distorsione della sequenza della sua attività catalitica, che è 30 volte aumentata prossimale ad A o T, con conseguente 80% di frammenti di mRNA a partire da A o T alla fine 5 ′14. Tuttavia, questo è stato superato dall'osservazione che la maggior parte della variazione di lunghezza avviene all'estremità 5′-end di RF, e l'assegnazione della densità ribosoma alla 3′-end produce informazioni precise e accurate sulla posizione ribosoma7. L'attività della MNasi è influenzata dalla concentrazione enzimatica, dal pH e dal tempo di digestione e deve essere determinata per ogni nuovo lotto di MNasi. Una maggiore attività di nucleasi si traduce in una maggiore contaminazione da rRNA, mentre la diminuzione dell'attività causa una scissione meno accurata delle impronte ribosomiche. Ciò può ridurre la resa complessiva di RF nella procedura di purificazione del gel selettiva per dimensioni e fornire informazioni meno accurate sulle posizioni ribosomiche su mRNA14. Pertanto, la quantità richiesta di MNasi deve essere determinata con attenzione. Per i nostri esperimenti applichiamo 712,5 U di nucleasi micrococcica per 1 mg di RNA mentre la concentrazione riportata in letteratura varia tra 50 U38, 450 U34,1000 U14 e 1500 U15,21,36 per 1 mg di RNA. Come accennato in precedenza, la MNasi richiede la presenza di ioni di calcio per la sua attività. Nei protocolli standard EGTA, un agente chelante per ioni divalenti che ha una maggiore affinità per il calcio rispetto al magnesio54, viene utilizzato per fermare la digestione legando il calcio e inattivando la MNasi. Tuttavia, nel nostro protocollo la reazione di digestione viene interrotta utilizzando il kit di pulizia dell'RNA direttamente dopo l'incubazione con la nucleasi.

Nei protocolli standard, il passo successivo è il recupero dei ribosomi mediante un cuscino di saccarosio ultracentrifugato o un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione8,14. Una centrifugazione gradiente di saccarosio consente la separazione selettiva dei monosomi dalle subunità e dai polisomi, tuttavia richiede attrezzature specifiche come un miscelatore sfumato e un ultracentrifugo. Inoltre, la velocità effettiva di questo metodo è limitata a 500-700 μL del llysato. D'altra parte, il cuscinetto di saccarosio pellet di ultracentrifugazione la maggior parte delle particelle ribosomiali, consente la lavorazione di oltre una dozzina di millilitri di lisato ed è meno esigente in termini di strumentazione necessaria. Tuttavia, entrambi gli approcci sono lunghi in quanto richiedono da 4 a 6,5ore 14 e richiedono un ultracentrifugo. Nel nostro protocollo questo passaggio viene omesso mentre procediamo direttamente alla selezione delle dimensioni in gel di poliacrilammide TBE-urea al 15%. L'elettroforesi viene eseguita in condizioni di denaturazione al fine di spiegare le strutture secondarie dell'RNA e prevenire le interazioni intramolecolari. Usiamo oligonucleotidi da 26 nt, 29 nt e 32 nt come marcatori per l'accisa di una gamma ristretta di impronte ribosomiali. Supponiamo che la concentrazione dell'RF effettiva superi significativamente la potenziale contaminazione con falsa RF considerata casuale, non protetta dai frammenti di ribosoma mRNA o rRNA di lunghezza in quell'intervallo. I risultati ottenuti utilizzando il nostro protocollo hanno infatti mostrato una frazione arricchita della RF nell'intervallo di dimensioni selezionato. Il controllo di qualità con il Bioanalyzer Agilent 2100 mostra le librerie RIBO-seq come un'unica band e picchi ben definiti, in contrasto con le librerie RNA-seq che vengono visualizzata come strisci e picchi significativamente più ampi (Figura 5). Inoltre, i dati Ribo-seq ottenuti presentano periodicità della tripletta (Figura 8A), che non è osservata nei dati RNA-seq (Figura 8B). Inoltre, le visualizzazioni della RF ottenuta mappata sul genoma mostrano modelli di espressione molto simili indipendentemente dal metodo di isolamento dell'impronta che è stato ulteriormente confermato nelle nostre analisi bioinformatiche (Figura 9). Tuttavia, siamo consapevoli che la falsa RF potrebbe mapparsi al genoma che potrebbe disturbare il segnale ottenuto. Tuttavia, il fatto che la falsa RF sia generata casualmente implica che non dovrebbero accumularsi in un posto sul genoma e quindi non dovrebbero causare artefatti e risultati falsi. Inoltre, va notato che non vi è consenso negli studi batterici sulla dimensione dei FF che dovrebbero essereisolati 53,55 e che la selezione solo di una sottofrazione dell'intervallo di lunghezza può portare a interpretazioni errate dei risultati17. Si suggerisce che una vasta gamma di lunghezze caratteristiche per le impronte batteriche sia una conseguenza del comportamento procariotico ribosoma piuttosto che della digestione della MNasi55. Ad esempio, l'interazione complementare tra l'estremità 3′ di 16S rRNA in una piccola subunità ribosomiale e un motivo Shine-Dalgarno in mRNA può comportare un RF56 più lungo. Considerando una vasta gamma di lunghezze di impronte batteriche, Mohammad et al. si consiglia di eseguire la selezione delle dimensioni tra 15 e 40 nt17,55. Ciò dovrebbe portare all'isolamento di un'intera gamma di FF e garantire una rappresentazione completa dei ribosomi nelle varie fasi del ciclo traslazionale. A causa della discussione in corso, l'intervallo di escissione dovrebbe essere considerato attentamente ed è importante ricordare che la scelta errata può escludere alcune subfrazioni di RF e portare a distorsioni nell'analisi successiva.

A causa della selezione delle dimensioni eseguita direttamente dopo la digestione della nucleasi e con l'omissione dell'isolamento monosomaloso per ultracentrifugazione, il nostro protocollo è rapido, relativamente facile e può essere condotto con un'attrezzatura di laboratorio standard. L'utilizzo di kit dedicati per la pulizia dell'RNA e del DNA, la purificazione dell'mRNA e la preparazione della biblioteca garantiscono standardizzazione e ripetibilità. Appling più volume di etanolo durante la pulizia dell'RNA aumenta l'efficienza di purificazione di <200 nt frammenti di RNA57. Le modifiche alla preparazione della libreria - estendendo il tempo di incubazione e aumentando la temperatura durante la legatura degli adattatori - vengono applicate per ridurre l'efficienza di liscizione per l'RNA metilato, come l'rRNA, e per ridurre la contaminazione da rRNA58. Il nostro protocollo è stato utilizzato per studiare la regolazione della traduzione in varie condizioni di crescita (pubblicazioni in preparazione) ma può essere applicato per studiare altri aspetti della traduzione come il rilevamento TIS o per migliorare l'annotazione del genoma e assistere gli studi proteomici. Un'ulteriore modifica del protocollo, dipendente dalla questione della ricerca, può essere facilmente inclusa, ad esempio incrociando il ribosoma con la proteina di interesse o la purificazione di affinità dei ribosomi di interesse con conseguente frazioni arricchite di ribosomi. Con il nostro protocollo la procedura RIBO-seq è più accessibile agli scienziati e quindi può stimolare nuove scoperte e accelerare gli sviluppi nel settore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

ALS desidera riconoscere il sostegno finanziario delle sovvenzioni per l'installazione EMBO IG 3914 e POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizzato nell'ambito del programma First TEAM della Fondazione per la scienza polacca cofinanziato dall'Unione europea nell'ambito del Fondo europeo di sviluppo regionale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

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References

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Biochimica numero 174
RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS
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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

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