Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq in Bacteria: коллекция образцов и протокол подготовки библиотеки для секвенирования NGS

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Здесь мы опишем этапы отбора проб и подготовки к RIBO-seq у бактерий. Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с этими руководящими принципами, приводит к получению достаточных данных для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, прост, использует стандартное лабораторное оборудование и занимает семь дней от лизиса до получения библиотек.

Abstract

Метод профилирования рибосом (RIBO-seq) в настоящее время является наиболее эффективным инструментом для изучения процесса синтеза белка in vivo. Преимуществом этого метода, по сравнению с другими подходами, является его способность контролировать трансляцию путем точного отображения положения и количества рибосом на транскрипте мРНК.

В этой статье мы опишем последовательные этапы сбора проб и подготовки к методу RIBO-seq у бактерий, выделив детали, имеющие отношение к планированию и выполнению эксперимента.

Поскольку RIBO-seq опирается на интактные рибосомы и связанные с ними мРНК, ключевым шагом является быстрое ингибирование трансляции и адекватный распад клеток. Таким образом, мы предлагаем фильтрацию и мгновенное замораживание жидкого азота для сбора клеток с дополнительной предварительной обработкой хлорамфениколом для остановки трансляции бактерий. Для распада мы предлагаем шлифовать замороженные клетки раствором и пестиком в присутствии оксида алюминия, чтобы механически разрушить клеточную стенку. В этом протоколе не требуется сахарозная подушка или ультрацентрифугирование градиента сахарозы для очистки моносом. Вместо этого проводится разделение мРНК с использованием электрофореза полиакриламидного геля (PAGE) с последующим иссечением рибосомного следа (полоса 28-30 нт) и дает удовлетворительные результаты. Это значительно упрощает метод, а также сокращает время и требования к оборудованию для процедуры. Для подготовки библиотеки мы рекомендуем использовать коммерчески доступный небольшой набор РНК для секвенирования Illumina от New England Biolabs, следуя рекомендациям производителя с некоторой степенью оптимизации.

Полученные библиотеки кДНК представляют соответствующее количество и качество, необходимые для секвенирования следующего поколения (NGS). Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с описанным протоколом, приводит к 2-10 млн однозначно нанесенных на карту считывания на образец, что обеспечивает достаточные данные для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, является быстрым и относительно простым и может быть выполнен с помощью стандартного лабораторного оборудования.

Introduction

Методика профилирования рибосом (RIBO-seq) была разработана в лаборатории Джонатана Вайсмана в Калифорнийском университете в Сан-Франциско1. По сравнению с другими методами, используемыми для изучения экспрессии генов на трансляционном уровне, RIBO-seq фокусируется на связывании каждой рибосомы с мРНК и предоставляет информацию о ее местоположении и относительном количестве рибосом на транскрипте. Он позволяет контролировать процесс синтеза белка in vivo и может обеспечить одно разрешение и точность кодона, что позволяет измерять плотность рибосом как на отдельной мРНК, так и на всем транскриптоме в клетке. В основе методики RIBO-seq лежит тот факт, что во время трансляции рибосома связывает молекулу мРНК и тем самым защищает погребенный фрагмент транскрипта от переваривания рибонуклеазы. При добавлении рибонуклеазы незащищенная мРНК переваривается, и фрагменты, заключенные рибосомами - обычно длиной ~ 28-30 нт - остаются нетронутыми. Эти фрагменты, называемые рибосомными следами (RF), затем могут быть выделены, секвенированы и нанесены на транскрипт, из которого они произошли, что приводит к обнаружению точного положения рибосом. Фактически, способность рибосомы защищать фрагменты мРНК используется с 1960-х годов для изучения рибосомных сайтов связывания и инициации трансляции (TIS)2,3,4. Однако с развитием технологии глубокого секвенирования RIBO-seq стал золотым стандартом для мониторинга трансляции5, который благодаря взаимодействию с рибосомами может предоставить общегеномную информацию о синтезе белка6. Профилирование рибосом заполнило технологический пробел, который существовал между количественной оценкой транскриптома и протеома6.

Для проведения рибосомного профилирования необходимо получить лизат клеток организма, выросших в исследуемых условиях. Нарушение этих условий во время сбора и лизиса клеток может обеспечить ненадежные данные. Чтобы предотвратить это, обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый сбор и мгновенное замораживание в жидком азоте. Клетки могут быть лизированы криогенным измельчением в механическом гомогенизаторе, таком как смеситель мельницы7,8 или бисерный взбиватель9,и путем тритурации через пипетку10 или с помощью иглы11. Буфер лизиса может быть добавлен непосредственно перед или вскоре после измельчения клеток. В нашем протоколе мы используем жидкий азот для предварительного охлаждения раствора и пестиков, а также оксид алюминия в качестве более мягкого подхода к разрушению бактериальной клеточной стенки, что предотвращает сдвиг РНК, часто встречающийся при применении таких методов, как сонификация. После измельчения мы добавляем ледяной буфер лизиса в охлажденный содержимое раствора. Выбор подходящего буфера лизиса важен для получения наилучшего разрешения рибосомных следов. Поскольку ионная сила влияет как на размер ВЧ, так и на точность кадра считывания, в настоящее время рекомендуется использовать лизисные буферы с низкой ионной силой и буферной емкостью, даже если окажется, что буферный состав не влияет на рибосомную занятость на мРНК11,12. Важными компонентами лизисного буфера являются ионы магния, наличие которых предотвращает диссоциацию рибосомных субъединиц и подавляет спонтанные конформационные изменения в бактериальных рибосомах11,13. Ионы кальция также играют значительную роль и необходимы для активности микрококковой нуклеазы (МНазы), используемой в методе профилирования бактериальных рибосом14. Добавление гуанозина 5'-[β,γ-имидо]трифосфата (GMP-PNP), негидролизуемого аналога ГТФ, вместе с хлорамфениколом ингибирует трансляцию во время лизиса15.

При получении лизата его осветляют центрифугированием и делят на две части, каждая для RIBO-seq и высокопроизводительного полного секвенирования мРНК (RNA-seq), поскольку они выполняются одновременно(фиг.1). RNA-seq обеспечивает точку отсчета, которая позволяет сравнивать данные как RIBO-seq, так и RNA-seq во время анализа данных. Исследуемый транслейлом определяется нормализацией рибосомных следов до обилия мРНК16. Данные из RNA-seq также могут помочь идентифицировать артефакты клонирования или секвенирования17.

Figure 1
Рисунок 1. Схемы пробоподготовки мРНК для RIBO-seq и RNA-seq. Для подготовки библиотеки RIBO-seq РНК переваривается МНазой (A), с последующим выбором размера РЧ ~28-30 nt длины (B); для РНК-seq РНК выделяют (С), истощают рРНК (D), а полученную мРНК случайным образом фрагментируют на фрагменты различной длины (Е). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Начальные этапы процедуры пробоподготовки для RIBO-seq и RNA-seq отличаются незначительно(рисунок 1). Для рибосомного профилирования лизат должен быть переварен специфической эндонуклеазой, чтобы раздуть молекулы мРНК, не защищенные рибосомами. В стандартных протоколах полученные моносомы восстанавливают ультрацентрифугированием сахарозной подушки или ультрацентрифугированием градиента сахарозы8,14. В этой статье мы показываем, что этот шаг не является необходимым для выделения РЧ, необходимого для RIBO-seq у бактерий, аналогично для эукариотических клеток18,и что выбор размера фрагментов мРНК соответствующей длины из полиакриламидного геля является достаточным.

Для РНК-seq мРНК получается путем истощения рРНК из общей РНК - молекулы рРНК гибридизируются с биотинилированными олигонуклеотидными зондами, которые связываются с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином. Комплексы рРНК-олигонуклеотид-шарики затем удаляются из образца магнитом, в результате чего рРНК истощается образцом19,20. Очищенные молекулы мРНК затем случайным образом фрагментируются щелочным гидролизом. Полученные фрагменты мРНК, а также рибосомные следы преобразуются в библиотеки кДНК и подготавливаются к глубокому секвенированию(рисунок 2). Это включает в себя восстановление концов, необходимое после щелочного гидролиза (для мРНК) и ферментативного пищеварения (для RF): дефосфорилирование 3' концов с последующим фосфорилированием 5' концов. Следующими шагами являются лигирование адаптеров и обратная транскрипция для создания вставок кДНК, обрамленных последовательностями, необходимыми для секвенирования следующего поколения (NGS) с использованием платформы Illumina. Последняя фаза подготовки библиотеки представляет собой реакцию ПЦР, в которой конструкции усиливаются и маркируются штрих-кодами для конкретных образцов, чтобы обеспечить мультиплексирование и секвенирование различных образцов на одном канале. Перед секвенированием качество и количество библиотек оцениваются с помощью высокочувствительного электрофореза ДНК на кристалле. Затем библиотеки cDNA с соответствующими параметрами могут быть объединены в пул и секвенированы. Секвенирование может выполняться на различных платформах Illumina, таких как MiSeq, NextSeq или HighSeq, в зависимости от количества библиотек, требуемой длины чтения и глубины секвенирования. После секвенирования проводится биоинформатический анализ.

Figure 2
Рисунок 2. Подготовка библиотеки. Подготовка библиотеки включает в себя ремонт концов, перевязку адаптеров, обратную транскрипцию и усиление штрих-кодированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Профилирование рибосом является универсальным методом, который может быть легко модифицирован и скорректирован в соответствии с научным вопросом. Первоначально он использовался в дрожжах1,но вскоре после этого он был применен к бактериальным клеткам21, а также к эукариотическим модельным организмам, включая мышь10,рыбку данио22,плодовуюмуху 23 и Arabidopsis thaliana24. Он также использовался для изучения различных типов рибосом: цитоплазматических, митохондриальных25,26 и хлоропластов27,28. У эукариот RIBO-seq обычно адаптируется и уточняется для исследования конкретных аспектов трансляции, включая инициацию10,11,29,30,31,32,удлинение1,10,11,31,33,рибосомное сваливание33 и изменение конформации33. Большинство модификаций предполагают использование различных ингибиторов трансляции. Однако на бактериях аналогичные исследования было трудно провести из-за нехватки ингибиторов с требуемым механизмом действия34. Наиболее часто используемым ингибитором трансляции у бактерий является хлорамфеникол (CAM), который связывается с центром пептидилтрансферазы (PTC) и предотвращает правильное позиционирование аминоацил-тРНК в А-сайте. В результате CAM предотвращает образование пептидной связи, что приводит к остановке удлиняющихся рибосом35. Другими примерами ингибиторов трансляции у бактерий являются тетрациклин (TET)36,ретапамулин (RET)34 и Onc11237, которые использовались для исследования сайтов инициации трансляции. ТЕТ, который предотвращает доставку тРНК в рибосому путем прямого перекрытия с антикодоном стволовым контуром тРНК в А-месте, первоначально применялся для проверки результатов, полученных от лечения CAM, поскольку они оба являются антибиотиками, ингибируя удлинение трансляции38. Было обнаружено, что TET обнаруживает первичный TIS, однако не смог выявить внутренний TIS36. RET связывается в PTC бактериальной рибосомы и предотвращает образование первой пептидной связи путем вмешательства в элонгатор аминоацил-тРНК в месте А. Применение RET приводит к остановке рибосом как на первичном, так и на внутреннем TISs34. Onc112, богатый пролином антимикробный пептид, связывается в выходном туннеле и блокирует связывание аминоацил-тРНК в рибосомном участке А. В результате Onc112 предотвращает вход комплексов инициации в фазуудлинения 37.

Основной информацией, которую обеспечивает профилирование рибосом, является плотность рибосом и их положение на мРНК. Он был успешно применен для исследования дифференциальной экспрессии генов на уровне трансляции в различных условиях роста1,6,измерения поступающей эффективности1,38,39 и обнаружения событий регуляции трансляции, таких как рибосомная пауза10. RIBO-seq также позволяет раскрыть трансляцию аннотированных ncRNA, псевдогенов и неаннотированных малых открытых кадров чтения (ORF), что приводит к идентификации новых и/или очень коротких генов, кодирующих белки10,12,22,30,37. В таких случаях RIBO-seq может точно настроить и улучшить аннотацию генома. Обладая высокой чувствительностью к идентификации переведенных ОРФ и его количественной природой, профилирование рибосом может также служить прокси для определения протеома или в оказании помощи протеомным исследованиям31,34,39. Путем картирования TIS, профилирование рибосом выявляет N-терминально расширенные и усеченные изоформы известных белков10,32. RIBO-seq также был адаптирован для изучения ко-трансляционного сворачивания белков14,21,24. Этот метод позволяет измерять скорости удлинения1,10,39 или скорость декодирования отдельных кодонов6 и помогает в разработке количественных моделей трансляции17. Метод профилирования рибосом также способен обеспечить механистическое понимание паузы рибосомы у бактерий7,15,17,сдвига кадра40,стоп-кодона через21,дефектов терминации/рециркуляции41,42 и рибосомных конформационных изменений33 у эукариот. RIBO-seq также был адаптирован для изучения влияния специфических трансдействующих факторов на трансляцию, таких как миРНК6 и РНК-связывающие белки у эукариот16,43. Однако важно признать, что экспериментальная конструкция и полученная разрешение RIBO-seq определяют объем информации, которая может быть извлечена из полученных данных секвенирования12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сбор образцов

  1. Подготовьте бактериальную культуру. Мы рекомендуем культуру объемом 100 мл на образец.
  2. Подготовка оборудования и реагентов для отбора проб: две мерные ложки на образец, стерильные мембранные фильтры смешанных эфиров целлюлозы (MCE) 0,45 мкм, стерильные пробирки объемом 50 мл, жидкий азот, 50 мг/мл хлорамфеникола в 70% (об/об)этанола (опционально). Проколите крышку трубок объемом 50 мл, чтобы обеспечить испарение жидкого азота и предотвратить взрыв закрытых трубок. Обеззараживайте совки лабораторным моющим средством и 70% этанолом.
  3. Предварительно прогрейте фильтрующее оборудование и одну из мерных совков до температуры роста бактериальной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем полностью стеклянный фильтрационный аппарат с воронкой, фритированной основой, колба для заземления и пружинным зажимом Ø диаметром 47 мм.
  4. Перед сбором пробы добавьте хлорамфеникол в бактериальную культуру до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 1 минуту (необязательно).
  5. Налейте жидкий азот в стерильную трубку объемом 50 мл и поместите вторую мерную ложку внутрь трубки для охлаждения.
    осторожность! Жидкий азот может привести к взрыву закрытых контейнеров из-за изменения давления при испарении. Чтобы этого не допустить, необходимо создать несколько отверстий в крышке пробирок объемом 50 мл, чтобы можно было испарить жидкий азот.
  6. Собирайте клетки путем фильтрации. Прекратите фильтрацию, когда среда прошла через мембрану, но не дайте фильтру полностью высохнуть.
  7. Собирайте бактериальные гранулы, быстро соскребая клетки с фильтрующего диска с помощью предварительно выпуклой совки. Немедленно поместите всю мерную ложку с собранными клетками в трубку объемом 50 мл, заполненную жидким азотом. Заготовленная гранула должна быть полностью покрыта жидким азотом.
  8. Дайте грануле тщательно замерзнуть и вытесните замороженные клетки, используя предварительно охлажденный второй совок. Закройте проколотую крышку и перенесите трубку на -80°C. Точка ОСТАНОВКИ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфицируйте совки после каждого сбора проб.

2. Лизис клеток

  1. Для лизатов готовят 0,1 М GMP-PNP в реакционных трубках 10 мМ Tris pH 8, DNase I и 1,5 мл и держат их на льду. Охладите центрифугу до 4 °C.
  2. Готовят лизисный буфер (20 мМ TRIS pH 7,6, 10 мМ MgAcet, 150 мМ KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мМCaCl2 и опционально 1 мМ хлорамфеникола). Аликвота 500 мкл лизисного буфера на образец в 1,5 мл реакционных пробирок и поместите их на лед.
  3. Обеззаражьте раствор и пестик лабораторным моющим средством и 70% этанолом и высушите их. Охладите раствор и пестик, налив в раствор жидкий азот.
  4. Переложите замороженные гранулы в предварительно охлажденный раствор и измельчите его в порошок. Шпателем добавьте примерно 1 объем оксида алюминия и продолжайте измельчение. Держите раствор, пестик и клетки в прохладном, заливая жидким азотом, когда это необходимо, не дайте содержимому раствора оттаять.
  5. Непосредственно перед использованием лизисного буфера добавляют GMP-PNP и ДНКазу I в аликвоту буфера лизиса до конечной концентрации 2 мМ и 100 Ед/мл соответственно. Переложить раствор в раствор с ячейками и оксидом алюминия и продолжить измельчение. Дайте лизат медленно оттаять во время измельчения и перенесите смесь в предварительно охлажденный реакционный пробирку 1,5 мл и немедленно поместите на лед.
  6. Центрифужные лизаты при 20 000 х г в течение 5 минут при 4 °C. Переложите супернатанты в новые, предварительно охлажденные реакционные трубки 1,5 мл и держите их на льду.
  7. Измерьте концентрацию РНК в каждом образце с помощью NanoDrop. Используйте разбавления образцов 1:10 и разбавление лизисного буфера 1:10 в воде без нуклеаз в качестве заготовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что хлорамфеникол демонстрирует значительную абсорбцию при 260 нм.
  8. Разделите каждый лисат на две порции: одну для RIBO-seq (0,5 - 1 мг РНК) и вторую для RNA-seq (остальные).
  9. Очистите образцы для RNA-seq с помощью коммерчески доступного комплекта для очистки РНК в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать набор Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (см. Таблицу материалов). Мы также рекомендуем добавлять 4,5 объема этанола (по сравнению с объемом образца) в смесь образца и связывающего буфера для рибосомных следов и фрагментированной мРНК, чтобы повысить эффективность очистки коротких фрагментов РНК.
  10. Хранить образцы, предназначенные для РНК-seq, при -80 °C. Процедура РНК-seq будет продолжаться с шага 5.

3. МНазное переваривание образцов для RIBO-seq

  1. К 1 мг РНК добавляют 3,8 мкл 187,5 Ед/мкл МНазы в 10 мМ Tris pH 8 и засыпку его лизисным буфером до общего объема 500 мкл.
  2. Инкубировать при 25 °C, 300 об/мин, в течение 45 минут в термомиксаторе.
  3. Очистите образцы с помощью коммерчески доступного комплекта для очистки РНК (как на шаге 2.9).
  4. Храните образцы для RIBO-seq при -80 °C (точка STOP) или переходите к выбору размера.

4. Электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) и подбор размеров образцов для RIBO-seq

  1. Приготовьте 15% полиакриламид-ТБЭ-гель с 8 М мочевины и поместите в емкость с буфером ТБЭ. Предварительный запуск в течение минимум 10 минут при постоянном напряжении 200 В.
  2. Смешайте образцы с буфером образцов TBE-мочевины, денетрируйте при 95 °C в течение 1 минуты и немедленно поместите их на лед.
  3. Вымойте мочевину, введя буфер TBE в гелевые колодцы с помощью шприца. Загрузите образцы, оставляя пространство между ними в одном колодезном пространстве, чтобы отделить каждый образец и предотвратить перекрестное загрязнение. Используйте 29 nt олигонуклеотид и смесь 26 nt и 32 nt олигонуклеотидов в качестве маркеров. Проводят электрофорез при постоянном напряжении 180 В.
  4. Подготовьте стерильный буфер для ночной инкубации (5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaOAc pH 5).
  5. После электрофореза окрасьте гель в SYBR Gold-ванна примерно на 2-3 минуты и промойте гель водой без нуклеаз.
  6. Иссейте фрагменты геля от 26 до 32 нт стерильными иглами или лезвиями бритвы и поместите фрагменты геля в отдельные пробирки по 1,5 мл для каждого образца. Замените иглу или лезвие бритвы между образцами.
  7. Добавьте 200 мкл ночного инкубационного буфера в каждую реакционную трубку.
  8. Инкубировать образцы при 10 °C, 1000 об/мин в течение ночи в термомикшере.
  9. На следующий день очистите образцы, как по шагам 2.9. Элюют следы в 80 мкл воды без нуклеаз.
  10. Храните образцы при -80 °C. STOP точка. Процедура RIBO-seq будет продолжена с шага 7.

5. Очистка бактериальной мРНК путем истощения рРНК из образцов для РНК-seq

  1. Удалите рРНК из образцов с помощью набора для очистки бактериальной мРНК (например, Invitrogen MICROBExpress). Следуйте протоколу производителя.
  2. Очистите образцы, как по шагам 2.9. Элюют мРНК в 50 мкл безнуклеазной воды.
  3. Храните образцы для РНК-seq при -80 °C (точка STOP) или продолжайте щелочную фрагментацию.

6. Щелочная фрагментация образцов для РНК-seq

  1. Готовят щелочной гидролизный буфер (смешивают 220 мкл 0,1 М NaHCO3,30 мкл 0,1М Na2СО3 и 1 мкл 0,5 М ЭДТА). Смешайте 1 объем (50 мкл) щелочного буфера с 1 объемом (50 мкл) образца и инкубируют при 95 °C в течение 25 минут.
  2. Добавьте 5 мкл 3 М NaOAc pH 5,5, чтобы остановить реакцию.
  3. Очистите образцы, как на этапе 2.9, и элюйте образцы в 80 мкл воды без нуклеазы.
  4. Возможная точка ОСТАНОВКИ: хранить образцы РНК-сек при -80 °C. Однако мы рекомендуем перейти непосредственно к шагу 7, чтобы избежать ненужного замораживания и оттаивания.

7. Дефосфорилирование и фосфорилирование образцов как для РНК-, так и для RIBO-seq

  1. Добавьте 10 мкл 10-кратного реакционного буфера PNK и 5 мкл T4 PNK к каждому образцу. Инкубировать при 37 °C в течение 1,5 часа, чтобы дефосфорилировать 3' концы.
  2. Добавьте 3 мкл 1 мМ АТФ и инкубировать при 37 °C в течение 1 часа, чтобы фосфорилировать 5' концы.
  3. Очистите образцы, как на этапе 2.9, элюйте в воде без нуклеазы 30 мкл.
  4. Храните образцы при -80 °C. STOP точка.

8. Подготовка библиотеки с использованием NEBNext Мультиплекс Малая библиотека РНК Подготовительный Набор для Illumina

  1. Подготовьте 100-1000 нг входной РНК (полученных фрагментов мРНК и рибосомных следов) в 6 мкл безнуклеазной воды и добавьте 1 мкл 3' SR Adaptor. Инкубировать по протоколу производителя.
  2. Добавьте 10 мкл 3'-го буфера реакционной лигиции (2X) и 3 мкл 3'-го лигационного ферментного микса и инкубировать при 37 °C в течение 2,5 часов вместо 1 часа при 25 °C, как указано в протоколе производителя.
  3. Гибридизируйте праймер обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя с модифицированной программой: 5 минут при 75 °C, 30 минут при 37 °C и держите при 4 °C.
  4. Ligate 5' SR адаптер. Следуйте протоколу производителя с одним изменением: выполняйте инкубацию при 37 °C в течение 2,5 часов вместо 1 часа при 25 °C.
  5. Выполните обратную транскрипцию в соответствии с протоколом производителя.
  6. Возможная точка ОСТАНОВКИ: инкубировать образцы, содержащие синтезированные кДНК при 70 °C, в течение 15 минут для инактивации обратной транскриптазы и хранить их при -80 °C. Однако мы рекомендуем перейти непосредственно к следующим шагам, чтобы избежать ненужного замораживания и размораживания образцов.
  7. Храните половину каждой библиотеки кДНК при -80 °C в качестве резервной.
  8. Выполните амплификацию ПЦР по протоколу производителя. Используйте половину реакционной смеси. Храните полученные библиотеки при -80 °C. ТОЧКА STOP.

9. Выбор размера библиотек кДНК с помощью PAGE

  1. Приготовьте 6% полиакриламид-ТБЭ гель и поместите его в резервуар с буфером ТБЭ. Предварительный запуск в течение минимум 10 минут при постоянном напряжении 200 В.
  2. Смешайте образцы с гелевым красителем Blue (6X) и загрузите их на гель. Используйте Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest в качестве лестницы. В начале запустите электрофорез при постоянном напряжении 120 В, чтобы позволить ДНК войти в гель, а затем измените напряжение до 180 В.
  3. Когда электрофорез закончится, окрасьте гель в SYBR Gold-ванна примерно на 2-3 минуты и промойте гель водой без нуклеазы.
  4. Фрагменты акцизного геля, содержащие библиотеки. Для образцов РНК-seq акцизируется между 135-180 нт, а для RIBO-seq - между 135-170 нт. Используйте стерильную иглу или лезвие бритвы и поместите иссеченные фрагменты геля в отдельные реакционные трубки по 1,5 мл. Не забудьте поменять иглу или лезвие бритвы между образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры и штрих-код из NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina имеют в общей сложности 119 nt, что определяет более низкую отсечку иссечения.
  5. Добавьте 100 мкл воды без нуклеазы к каждому иссеченному фрагменту геля.
  6. Инкубировать фрагменты геля при 10 °C, 450 об/мин в течение ночи в термомикшере.
  7. Очистите и сконцентрируйте библиотеки кДНК с помощью коммерческого комплекта для очистки ДНК в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать комплект Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (см. Таблицу материалов).
  8. Храните очищенные библиотеки кДНК при -80 °C. Точка ОСТАНОВКИ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Примерные результаты, представленные здесь, были получены в исследовании, изучающего регуляцию трансляции в спорулирующих клетках WT Bacillus subtilis. Ночные культуры разбавляли до OD600, равного 0,1 в 100 мл богатой среды, и инкубировали при 37 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пока OD600 не достиг 0,5-0,6. Затем богатая среда была заменена минимальной средой, чтобы вызвать процесс споруляции, и инкубация продолжалась до четырех часов. Клетки собирали каждый час, начиная с T0 - индукции споруляции - в результате чего было пять временных точек. За минуту до сбора урожая культуры обрабатывали хлорамфениколом, как описано в протоколе выше. Клетки собирали путем фильтрации в предварительной стеклянной системе фильтрации с использованием мембранных фильтров смешанных эфиров целлюлозы (MCE) 0,45 мкм и мгновенно замороженных в жидком азоте.

Количество рибонуклеиновой кислоты, полученной в лисате, зависит от условий роста, объема культуры и плотности. Следуя нашему протоколу, 100 мл бактериальной культуры(Bacillus subtilis)дает в среднем 1-4 мг РНК. Примеры лизатов, полученных в результате эксперимента, описанного выше, приведены в таблице 1.

Концентрация РНК [нг/мкл] Количество РНК [мг] А260/А280 А260/А230
ВТ0 5845 3.21 1.57 0.83
ВТ1 6275 3.45 1.58 0.79
ВТ2 3525 1.94 1.38 0.56
ВТ3 3717 2.04 1.37 0.61
ВТ4 1653 0.91 1.11 0.43

Таблица 1. Концентрация и количество РНК в репрезентативных образцах лизатов B. subtilis. Таблица включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции. Лизис проводили с 550 мкл лизисного буфера, содержащего хлорамфеникол. Можно заметить, что по мере протекания споруляции количество полученной РНК уменьшается.

Когда количество РНК ниже 1 мг, для RIBO-seq используется 0,25 мг РНК вместо 1-0,5 мг, и количество МНазы затем корректируется соответственно. Репрезентативное количество и концентрация РНК после переваривания нуклеазы приведены в таблице 2. Среднее количество РНК после переваривания и очистки составляет 50 мкг из 0,5 мг поступления РНК.

Концентрация РНК [нг/мкл] Количество РНК [мкг] А260/А280 А260/А230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
ВТ1-Р 1157.4 57.87 2.10 2.19
ВТ2-Р 847.2 42.36 2.10 2.00
ВТ3-Р 983.6 49.18 2.09 2.16
ВТ4-Р 206 10.30 2.13 1.00

Таблица 2. Количество и концентрация РНК после нуклеазного переваривания репрезентативных образцов для RIBO-seq. Таблица включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции; буква "R" относится к образцам для RIBO-seq. Поскольку концентрация РНК в образце WT4-R была низкой, 0,25 мг РНК переваривали, в то время как 0,5 мг РНК для остальных образцов использовали для генерации рибосомного следа. Количество МНазы для пищеварения составляло 178,125 Ед для 0,25 мг РНК в WT4-R и 356,25 ЕД для 0,5 мг РНК в других образцах. После пищеварения образцы очищали коммерческим набором для очистки РНК, а концентрацию рибонуклеиновой кислоты измеряли с помощью NanoDrop.

После переваривания МНазы подбор размера выполняется с помощью PAGE. Пример 15% TBE-мочевинного полиакриламидного геля с переваренными образцами показан на рисунке 3. Фрагменты геля между 26 и 32 nt иссякали стерильным лезвием бритвы и инкубировали в течение ночи в ночном инкубационном буфере. На следующий день рибосомные следы были очищены коммерческим набором для очистки РНК.

Figure 3
Рисунок 3. 15% TBE-мочевинный полиакриламидный гель с репрезентативными образцами после сбраживания МНазы. Рисунок включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции; буква "R" относится к образцам для RIBO-seq. 15 мкл денатурированных образцов загружали в гелевые скважины по порядку: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R, а оставшийся объем хранили при -80 °C в качестве резервной. В качестве маркеров использовали 29 nt олигонуклеотидов и смесь 26 nt и 32 nt олигонуклеотидов. Электрофорез проводили, как описано выше, и гель окрашивали в SYBR Gold-ванна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Параллельно с перевариванием нуклеазы, лизаты для РНК-seq очищали коммерческим набором для очистки РНК, а полученные концентрации РНК измеряли с помощью NanoDrop. Репрезентативные результаты представлены в таблице 3. После очистки количество рибонуклеиновой кислоты уменьшилось до 40-500 мкг.

Концентрация РНК [нг/мкл] Количество РНК [мкг] А260/А280 А260/А230
WT0-м 10274.1 513.70 2.14 2.35
ВТ1-м 10118.3 505.92 2.12 2.33
ВТ2-м 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
ВТ4-м 757 37.85 2.01 1.95

Таблица 3. Количество РНК и концентрация образцов для РНК-seq после очистки РНК. Таблица включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции; буква «m» относится к образцам для RNA-seq (мРНК).

Полученные концентрации РНК образцов для РНК-seq были использованы для определения входных данных РНК для истощения рРНК. 8 мкг РНК из каждого образца РНК-seq использовали с набором для очистки бактериальной мРНК MICROBExpress (см. Таблицу материалов)в соответствии с протоколом производителя и впоследствии очищали коммерческим набором для очистки РНК. Репрезентативные результаты истощения рРНК приведены в таблице 4.

Концентрация РНК [нг/мкл] А260/А280 А260/А230 Количество РНК [мкг]
WT0-м 62.7 1.99 1.75 3.1
ВТ1-м 59.3 2.00 2.16 2.9
ВТ2-м 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
ВТ4-м 85.0 1.97 2.00 4.2

Таблица 4. Репрезентативный объем и концентрация РНК после истощения рРНК. Таблица включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции; буква «m» относится к образцам для RNA-seq. 8 мкг РНК из образцов для RNA-seq были использованы для истощения рРНК и впоследствии очищены коммерческим набором для очистки РНК.

Далее полученную мРНК фрагментировали щелочным гидролизом и очищали коммерческим набором, как описано в протоколе. Фрагментированные мРНК и рибосомные следы дефосфорилировали на 3' концах и фосфорилировали на 5' концах в соответствии с вышеуказанным протоколом. Затем образцы использовались для построения библиотек кДНК для секвенирования Illumina, как описано в протоколе. На фиг.4 показан пример 6% полиакриламидного геля с полученными библиотеками. Фрагменты геля в диапазоне 135-180 нт для РНК-seq и 135-170 нт для RIBO-seq иссекали стерильными бритвенными лезвиями и инкубировали в течение ночи в воде без нуклеаз. Библиотеки были очищены коммерческим набором для очистки ДНК, а качество и количество оценивалось с помощью высокочувствительного электрофореза ДНК на кристалле с использованием биоанализатора Agilent 2100.

Figure 4
Рисунок 4. 6% полиакриламидный гель библиотек кДНК до и после выбора размера. В качестве лестницы использовался быстрозагруженный pBR322 DNA-MspI Digest. 25 мкл образцов были загружены в гель в следующем порядке: три библиотеки RIBO-seq и шесть библиотек RNA-seq. Остальные объемы образцов хранились при -80 °C в качестве резервной. Рисунок включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны через час (1), два (2), три (3) или четыре (4) часа после индукции споруляции; буква «R» относится к образцам для RIBO-seq, а буква «m» относится к образцам для RNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Примеры виртуальных гелевых изображений и электроферограмм, полученных с помощью биоанализатора Agilent 2100, показаны на рисунке 5. Полосы и пики, представляющие библиотеки RIBO-seq, более узкие и лучше определены по сравнению с библиотеками RNA-seq. Согласно микросхеме электрофореза, библиотеки имеют длину около 150 bp, что является ожидаемым размером библиотеки. Адаптеры и штрих-код, используемые при подготовке библиотеки, имеют длину 119 нт, а вставки либо 29-30 нт длиной (для RIBO-seq), либо в диапазоне от 25 до 50 нт (для РНК-сек). Дополнительные пики, близкие к 200 bp, полученные из библиотек RIBO-seq, могут указывать на артефакты ПЦР, которые могут быть отброшены во время биоинформатического анализа, когда данные, полученные от секвенирования, обрезаются и рРНК/тРНК фильтруются. Среднее количество ДНК составляет 32 нг, обеспечивая достаточное количество материала, необходимого для секвенирования следующего поколения.

Figure 5
Рисунок 5. Приведены примеры электроферограмм и виртуальных гелевых изображений из высокочувствительного ДНК-микросхемного электрофореза. Рисунок включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и одного часа (1), двух (2), трех (3) или четырех (4) часов после индукции споруляции; буква «R» относится к библиотекам RIBO-seq, а буква «m» относится к библиотекам RNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После контроля качества с помощью микросхеменного электрофореза библиотеки были объединены для одностороннего секвенирования 50 bp на платформе NextSeq500 от Illumina (10 библиотек на канал, с минимумом 350 млн считывания на канал). Секвенирование дало 30-57 миллионов считывания на образец для библиотек RNA-seq и 30-50 миллионов считывания на образец для библиотек RIBO-seq. Обрезка адаптеров и некачественных последовательностей привела к 24-47 млн считывания на образец для образцов РНК-seq и 25-50 млн считывания на образец для образцов RIBO-seq. Картирование, выполненное с помощью STAR44,дало 2,4-9,6 миллиона уникально отображенных считывания на образец для образцов RNA-seq (которые составляют 8-16,8% от общего числа считывания) и 2,3-10,4 миллиона уникально отображенных считывания (7,7-22,1%) для образцов RIBO-seq. Полученные данные были проверены контролем качества с помощью FastQC45. Примеры качественных графиков, созданных FastQC для обрезанных последовательностей, показаны на рисунке 6. Последовательности интересуемой длины, которая составляет <32 nt для RIBO-seq и <50 nt для RNA-seq, представили очень хорошее качество. Примеры графиков содержимого GC и распределения длин последовательностей по всем обрезанным последовательностям показаны на рисунке 7. Дополнительный пик в 72% на участке распределения GC библиотеки RIBO-seq может потенциально указывать на загрязнение рРНК, которое может быть удалено в ходе биоинформатического анализа фильтрацией рРНК46,47,48. Распределение длин последовательностей очень узкое для библиотек RIBO-seq, с пиком в 26-27 nt, тогда как распределение длины для библиотек RNA-seq шире и колеблется между 15 и 50 nt.

Figure 6
Рисунок 6. Приведены примеры коробчатых и усатых графиков показателей качества по всем базам библиотек RIBO-seq и RNA-seq после обрезки. Рисунок включает образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны до индукции споруляции (0) и четырех (4) часов после индукции споруляции; буква «R» относится к образцам RIBO-seq, а буква «m» относится к образцам RNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7. Приведены примеры графиков содержания GC и распределения длины последовательности всех последовательностей для библиотек RIBO-seq и RNA-seq после обрезки. На рисунке показаны образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны через четыре (4) часа после индукции споруляции; буква «R» относится к образцу для RIBO-seq, а буква «m» относится к образцу для RNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы проверить, предоставляют ли данные RIBO-seq информацию об истинных рибосомных следах, а не о случайных фрагментах мРНК выбранной длины, мы сравнили данные секвенирования из RIBO-seq и RNA-seq с помощью RiboToolkit, веб-сервера для анализа данных RIBO-seq49. Данные Рибо-сек демонстрируют триплетную периодичность и высокий, узкий пик, соответствующий инициирующим рибосомам и характерный для РЧ, как показано на рисунке 8А,что не наблюдается в данных РНК-сек(Рисунок 8В). Кроме того, график метагенов, показывающий профили среднего покрытия фрагментов РЧ и мРНК на кодирующих последовательностях (CDS), показал более высокую долю считывания, сопоставленных с CDS в наборе данных RIBO-seq(рисунок 8C),как и ожидалось.

Figure 8
Рисунок 8. Графики периодичности метагенов и среднее покрытие фрагментов РЧ и мРНК на CDS. Профили Metagene были получены с помощью RiboToolkit, интегрированного веб-сервера49. Длина CDS была нормализована до значения 1, и каждый CDS был разделен на 100 равных контейнеров. На рисунке показаны образцы дикого типа (WT) B. subtilis, которые были собраны через один (1) час после индукции споруляции; буква «R» относится к образцу для RIBO-seq, а буква «m» относится к образцу для RNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы сравнить, дает ли представленный здесь протокол RIBO-seq результаты, аналогичные тем, которые получены стандартным методом восстановления ВЧ (ультрацентрифугирование градиента сахарозы), мы сопоставили результаты секвенирования из библиотек, подготовленных по двум методам. Эксперименты, изучающие регуляцию трансляции при споруляции в WT B. subtilis, проводились по представленной протоколе RIBO-seq, а также по стандартному протоколу, включающему восстановление моносом ультрацентрифугированием градиента сахарозы. Результаты профилей покрытия рибосом, полученных в результате двух экспериментов, показаны на рисунке 9. Визуализация нанесенных на карту RF очень похожа между двумя экспериментами и дала аналогичные результаты при биоинформатической аналитике.

Figure 9
Рисунок 9. Визуализация полученного РЧ нанесена на геном. Рисунок включает РЧ, полученные из дикого типа B. subtilis, собранные через четыре часа после индукции споруляции и подготовленные по стандартному протоколу (WT4-R-s, верхняя панель) или представленному протоколу (WT4-R, нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ключевой технической проблемой профилирования рибосом является необходимость быстрого ингибирования трансляции, чтобы захватить снимок рибосом на мРНК в определенном физиологическом состоянии, представляющих интерес. Для этого обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый сбор и мгновенное замораживание в жидком азоте. Применение антибиотиков не является обязательным, поскольку они могут вызвать артефакты. Хлорамфеникол является широко используемым препаратом для остановки удлиняющихся рибосом в бактериальном RIBO-seq. Однако это не препятствует инициации, в результате чего происходит накопление рибосом около шести кодонов ниже по течению от сайта инициации трансляции14. Более того, его способность ингибировать пептидилтрансферазную реакцию может зависеть от природы рибосомных субстратов P- и A-сайтов. Предположительно, CAM более эффективно арестовывает рибосомы с Gly, Ala, Ser, Cys или Thr в качестве предпоследней аминокислоты зарождающегосяпептида 17,38,50. Это стоит учитывать при экспериментальном проектировании и биоинформатике, особенно при изучении рибосомной паузы17. Было также показано, что CAM влияет на точность трансляции, способствуя считывание стоп-кодона и сдвигу кадра51. Тем не менее, ингибирование CAM является относительно быстрым и достаточным для типичного исследования RIBO-seq14 и не вызывает неправильной инкорпорации51. Некоторых артефактов, вызванных антибиотиками, можно избежать, увеличив количество препаратана 9. Концентрация CAM, применяемая в нашем протоколе, является типичным количеством, используемым в экспериментах RIBO-seq7,14,21,однако концентрация может варьироваться для разных микроорганизмов и должна быть оптимизирована перед сбором пробы. В связи с возможностью возникновения артефактов, вызванных применением ингибиторов трансляции, рекомендуется избегать лечения ингибитором, если это не является необходимым для исследовательского вопроса и если возможен быстрый сборурожая 14. Быстрый сбор клеток имеет решающее значение, особенно если он выполняется без лечения ингибиторами, поскольку длительный сбор может привести к потере полисом и/или изменению транслейлома в ответ на изменение условий окружающей среды14. Таким образом, мы рекомендуем использовать фильтрацию в качестве метода сбора урожая, поскольку она может быть выполнена в тех же или аналогичных условиях, что и рост культуры, включая температуру и /или встряхивание. Во время фильтрации клетки, собранные на поверхности фильтра, постоянно смываются питательной средой, препятствуя им в восприятии сдвигов плотности клеток, оксигенации и уровня аминокислот и других питательных веществ14. Фильтрация более мягкая и может быть быстрее, чем центрифугирование, если плотность культуры умеренная, в противном случае большое количество клеток может закусорить поры фильтра и замедлить процесс. Если есть вероятность длительной фильтрации, мы рекомендуем предварительную обработку культуры хлорамфениколом, что приводит к остановке трансляции и позволяет продлить время сбора урожая. Если фильтрация становится трудной для завершения из-за засорения фильтра, мы предлагаем прекратить фильтрацию, удалить лишнюю культуру и мгновенно заморозить фракцию культуры, собранной на фильтре. Мы заметили, что 50 мл плотной бактериальной культуры достаточно для выполнения RIBO-seq. Последующее мгновенное замораживание клеток в жидком азоте является наиболее универсальным и эффективным подходом к немедленной остановке трансляции8,21,52.

Переваривание рибонуклеазы является критическим шагом, необходимым для получения РЧ хорошего качества. Выбор правильного фермента важен, поскольку рибосомные субъединицы состоят из молекул РНК, которые могут перевариваться, нарушая целостность рибосомы, вызывая загрязнение рРНК и разрушая RF44. Первоначально РНКаза I использовалась для переваривания мРНК и генерации РЧ у эукариот1. Поскольку этот фермент казался неактивным у бактерий, его заменили микрококковой нуклеазой (МНазой) из меретического стафилококка21. Позже было показано, что RNAse I действительно может выполнять переваривание бактериальных образцов, однако МНаза остается широко используемой для этой цели53. Недостаток МНазы заключается в последовательности смещения ее каталитической активности, которая в 30 раз увеличивается проксимально к А или Т, в результате чего 80% фрагментов мРНК начинаются с А или Т на 5′ конце14. Однако это было преодолено наблюдением, что большая часть вариаций длины происходит на 5'-конце RF, и присвоение плотности рибосомы 3'-концу дает точную и точную информацию о положении рибосомы7. Активность МНазы зависит от концентрации фермента, рН и времени сбраживания и должна определяться для каждой новой партии МНазы. Повышенная активность нуклеазы приводит к увеличению загрязнения рРНК, в то время как снижение активности вызывает менее точное расщепление рибосомных следов. Это может снизить общий выход РЧ в процедуре селективной по размеру гелевой очистки и обеспечить менее точную информацию о положениях рибосом на мРНК14. Таким образом, необходимое количество МНазы должно быть определено тщательно. Для наших экспериментов мы применяем 712,5 ЕД микрококковой нуклеазы на 1 мг РНК, в то время как концентрация, о которых сообщается в литературе, варьируется между 50 U38,450 U34,1000 U14 и 1500 U15,21,36 на 1 мг РНК. Как уже упоминалось выше, МНаза требует присутствия ионов кальция для своей активности. В стандартных протоколах EGTA, хелатирующий агент для двухвалентных ионов, который имеет более высокое сродство к кальцию по сравнению с магнием54,используется для остановки пищеварения путем связывания кальция и инактивации МНазы. Однако в нашем протоколе реакция пищеварения останавливается с помощью набора для очистки РНК непосредственно после инкубации с нуклеазой.

В стандартных протоколах следующим этапом является восстановление рибосом ультрацентрифугированием сахарозной подушки или ультрацентрифугированием градиента сахарозы8,14. Центрифугирование градиента сахарозы позволяет селективно отделить моносомы от субъединиц и полисом, однако для этого требуется специальное оборудование, такое как градиентный смеситель и ультрацентрифуга. Также пропускная способность этого метода ограничена 500-700 мкл лизата. С другой стороны, ультрацентрифугирование сахарозной подушки гранулирует большинство рибосомных частиц, позволяет обрабатывать более десятка миллилитров лизата и менее требовательно с точки зрения необходимых приборов. Тем не менее, оба подхода являются длительными, поскольку они занимают минимум от 4 до 6,5 часов14 и требуют ультрацентрифуги. В нашем протоколе этот шаг опущен, поскольку мы переходим непосредственно к выбору размера в 15% TBE-мочевинном полиакриламидном геле. Электрофорез проводится в условиях денатурирования с целью раскрытия вторичных структур РНК и предотвращения внутримолекулярных взаимодействий. Мы используем 26 nt, 29 nt и 32 nt олигонуклеотиды в качестве маркеров для иссечения узкого диапазона рибосомных следов. Мы предполагаем, что концентрация фактической РЧ значительно превышает потенциальное загрязнение ложной РЧ, рассматриваемой как случайные, незащищенные рибосомными фрагментами мРНК или рРНК длиной в этом диапазоне. Результаты, полученные с использованием нашего протокола, действительно показали обогащенную фракцию РЧ в выбранном диапазоне размеров. Проверка качества с помощью биоанализатора Agilent 2100 показывает библиотеки RIBO-seq как единые, хорошо определяемые полосы и пики, в отличие от библиотек RNA-seq, которые визуализируются как значительно более широкие мазки и пики(рисунок 5). Также полученные данные Ribo-seq демонстрируют триплетную периодичность(рисунок 8A),которая не наблюдается в данных RNA-seq(рисунок 8B). Более того, визуализации полученного РЧ, нанесенного на геном, показывают очень похожие паттерны экспрессии независимо от метода выделения следа, что было дополнительно подтверждено в наших биоинформационных анализах(рисунок 9). Тем не менее, мы знаем, что ложный RF может отображаться в геноме, что может нарушить полученный сигнал. Однако тот факт, что ложные РЧ генерируются случайным образом, подразумевает, что они не должны накапливаться в одном месте генома и, следовательно, не должны приводить к артефактам и ложному результату. Кроме того, следует отметить, что в бактериальных исследованиях нет единого мнения относительно размера RF, которые должны быть выделены53,55 и что выбор только подфракции диапазона длин может привести к неправильной интерпретации результатов17. Предполагается, что широкий диапазон длин, характерных для бактериальных следов, является следствием поведения прокариотической рибосомы, а не переваривания МНазы55. Например, комплементарное взаимодействие между 3'-концом 16S рРНК в малой рибосомной субъединицах и мотивом Шайн-Далгарно в мРНК может привести к более длительному RF56. Учитывая широкий диапазон длин бактериальных следов, Mohammad et al. рекомендуют выполнять подбор размеров от 15 до 40 нт17,55. Это должно привести к выделению потенциально целого ряда РН и обеспечить получение комплексного представления рибосом на различных стадиях трансляционного цикла. Из-за продолжающейся дискуссии диапазон иссечения следует тщательно рассмотреть и важно помнить, что неправильный выбор может исключить некоторые подфракции РФ и привести к смещению при последующем анализе.

Благодаря выбору размера, выполняемому непосредственно после переваривания нуклеазы и с пропуском выделения моносом ультрацентрифугированием, наш протокол является быстрым, относительно простым и может проводиться со стандартным лабораторным оборудованием. Использование специальных наборов для очистки РНК и ДНК, очистка мРНК и подготовка библиотек обеспечивают стандартизацию и повторяемость. Приложение большего объема этанола во время очистки РНК повышает эффективность очистки <200 нт фрагментов РНК57. Модификации библиотечного препарата - увеличение времени инкубации и повышение температуры во время лигирования адаптеров - применяются для снижения эффективности лигирования для метилированной РНК, такой как рРНК, и для уменьшения загрязнения рРНК58. Наш протокол использовался для исследования регулирования перевода в различных условиях роста (публикации в стадии подготовки), но может быть применен для изучения других аспектов перевода, таких как обнаружение TIS, или для улучшения аннотации генома и оказания помощи в протеомных исследованиях. Дополнительная модификация протокола, зависящая от исследовательского вопроса, может быть легко включена, например, сшивание рибосомы с интересующим белком или аффинная очистка рибосом, представляющих интерес, что приводит к обогащению фракций рибосом. С нашим протоколом процедура RIBO-seq более доступна для ученых и, таким образом, может стимулировать новые открытия и ускорять разработки в этой области.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

ALS хотел бы отметить финансовую поддержку EMBO Installation Grants IG 3914 и POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 осуществляется в рамках программы First TEAM Фонда польской науки, совместно финансируемой Европейским Союзом в рамках Европейского фонда регионального развития.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Биохимия выпуск 174
RIBO-seq in Bacteria: коллекция образцов и протокол подготовки библиотеки для секвенирования NGS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter