Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq i bakterier: ett protokoll för insamling av prover och biblioteksförberedelser för NGS-sekvensering

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Här beskriver vi stadierna av provtagning och förberedelse för RIBO-seq i bakterier. Sekvensering av de bibliotek som utarbetats enligt dessa riktlinjer resulterar i tillräckliga data för omfattande bioinformatisk analys. Protokollet vi presenterar är enkelt, använder standard laboratorieutrustning och tar sju dagar från lysis till att få bibliotek.

Abstract

Ribosomprofileringstekniken (RIBO-seq) är för närvarande det mest effektiva verktyget för att studera processen med proteinsyntes in vivo. Fördelen med denna metod, i jämförelse med andra tillvägagångssätt, är dess förmåga att övervaka översättning genom att exakt kartlägga positionen och antalet ribosomer på en mRNA-transkription.

I den här artikeln beskriver vi de på varandra följande stadierna av provtagning och förberedelse för RIBO-seq-metoden i bakterier, vilket belyser de detaljer som är relevanta för planering och genomförande av experimentet.

Eftersom RIBO-seq förlitar sig på intakta ribosomer och relaterade mRNAs, är det viktigaste steget snabb hämning av översättning och adekvat sönderfall av celler. Således föreslår vi filtrering och blixtfrysning i flytande kväve för cellskörd med en valfri förbehandling med kloramfenikol för att stoppa översättning i bakterier. För upplösningen föreslår vi slipning av frusna celler med mortel och mortel i närvaro av aluminiumoxid för att mekaniskt störa cellväggen. I detta protokoll krävs inte sackaroskudde eller sackarosgradient ultracentrifugation för monosome rening. Istället appliceras mRNA-separation med polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) följt av ribosomal fotavtryck excision (28-30 nt band) och ger tillfredsställande resultat. Detta förenklar till stor del metoden samt minskar tids- och utrustningskraven för förfarandet. För biblioteksförberedelse rekommenderar vi att du använder det kommersiellt tillgängliga lilla RNA-kitet för Illumina-sekvensering från New England Biolabs, enligt tillverkarens riktlinjer med viss grad av optimering.

De resulterande cDNA-biblioteken presenterar lämplig kvantitet och kvalitet som krävs för nästa generations sekvensering (NGS). Sekvensering av de bibliotek som utarbetats enligt det beskrivna protokollet resulterar i 2 till 10 mln unikt kartlagda läsningar per prov som ger tillräckliga data för omfattande bioinformatisk analys. Protokollet vi presenterar är snabbt och relativt enkelt och kan utföras med standard laboratorieutrustning.

Introduction

Ribosomprofileringstekniken (RIBO-seq) utvecklades i jonathan Weissmans laboratorium vid University of California, San Francisco1. I jämförelse med andra metoder som används för att studera genuttryck på translationell nivå fokuserar RIBO-seq på varje ribosombindning till mRNA och ger information om dess läge och det relativa antalet ribosomer på en transkription. Det möjliggör övervakning av processen för proteinsyntes in vivo och kan ge enkel kodonupplösning och noggrannhet som möjliggör mätning av ribosomtätheten på båda, det enskilda mRNA och längs hela transkriptomen i cellen. På fundamentet av RIBO-seq-tekniken ligger faktumet att under översättning binder ribosomen mRNA-molekylen och skyddar thus det begravda fragmentet av avskriften från en ribonuclease matsmältning. Vid tillsats av ribonukleasen smälts det oskyddade mRNA och fragmenten omslutna av ribosomer - vanligtvis på ~ 28-30 nt långa - förblir intakta. Dessa fragment, så kallade ribosomala fotspår (RF), kan sedan isoleras, sekvenseras och mappas på den transkription de härstammar från vilket resulterar i detektion av ribosomens exakta position. Faktum är att ribosomens förmåga att skydda mRNA-fragment har använts sedan 1960-talet för att studera ribosomala bindnings- och översättningsinitieringsplatser (TIS)2,3,4. Men med utvecklingen inom djupsekvenseringsteknik har RIBO-seq blivit en guldstandard föröversättningsövervakning 5 som genom ribosomengagemanget kan ge en genomomfattande information om proteinsyntes6. Ribosomprofilering fyllde det tekniska gapet som fanns mellan kvantifiering av transkriptomen och proteomen6.

För att genomföra ribosomprofilering måste vi få celllyat av organismen som hade vuxit under de undersökta förhållandena. Att störa dessa förhållanden under cellinsamling och lys kan ge otillförlitliga data. För att förhindra detta används ofta översättningshämmare, snabb skörd och blixtfrysning i flytande kväve. Celler kan lysas genom kryogen slipning i en mekanisk homogenisator som en mixerkvarn7,8 eller en pärlviss9, och genom trituration genom en pipett10 eller med ennål 11. Lysbufferten kan tillsättas strax före eller strax efter pulveriseringen av cellerna. I vårt protokoll använder vi flytande kväve för att förkyla mortel och mortel, samt aluminiumoxid som ett mildare tillvägagångssätt för störningar i bakteriecellväggen, vilket förhindrar RNA-shearing som ofta uppstår när metoder som sonifiering tillämpas. Efter pulverisering lägger vi till en iskall lysbuffert i det kylda innehållet i morteln. Val av lämplig lysbuffert är viktigt för att uppnå bästa upplösning av ribosomala fotavtryck. Eftersom jonisk styrka påverkar både RF-storleken och läsramens precision, rekommenderas det för närvarande att använda lysbuffertar med låg jonisk hållfasthet och buffertkapacitet, även om det verkar som om buffertsammansättningen inte påverkar ribosombeläggningen på mRNAs11,12. Viktiga komponenter i lysbufferten är magnesiumjoner, vars närvaro förhindrar dissociation av ribosomala underenheter och hämmar spontana konformationsförändringar i bakteriella ribosomer11,13. Kalciumjoner spelar också en viktig roll och är viktiga för aktiviteten hos mikrokoccal nukleas (MNase) som används i bakteriell ribosomprofileringsmetod14. Tillsats av guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphate (GMP-PNP), en icke-hydrolyserbar analog av GTP, tillsammans med kloramfenikol hämmar översättning under lysis15.

När lysatet erhålls förtydligas det genom centrifugation och delas in i två portioner, var och en för en RIBO-sekvensq och en hög genomströmning total mRNA-sekvensering (RNA-seq) eftersom de utförs samtidigt (Figur 1). RNA-seq ger en referenspunkt som möjliggör jämförelse av data från både RIBO-seq och RNA-seq under dataanalys. Den undersökta översättningen definieras av normalisering av ribosomal fotspår till mRNA överflöd16. Data från RNA-seq kan också hjälpa till att identifiera kloning eller sekvensering av artefakter17.

Figure 1
Figur 1. Ritningar av mRNA prov förberedelse för RIBO-seq och RNA-seq. För RIBO-seq biblioteksberedning smälts RNA med MNase (A), följt av storleksvalet av RF på ~ 28-30 nt längd (B); för RNA-seq RNA isoleras (C), utarmas av rRNA (D), och den resulterande mRNA är slumpmässigt fragmenterad i fragment av varierande längder (E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

De första stegen i förfarandet för provberedning för RIBO-seq och RNA-seq skiljer sig något åt (figur 1). För ribosomprofilering måste lysatet smältas av en specifik endonukleas för att bryta ner mRNA-molekylerna som inte skyddas av ribosomerna. I standardprotokoll återvinns de erhållna monosomerna av en sackaroskudde ultracentrifugation eller en sackarosgradient ultracentrifugation8,14. I den här artikeln visar vi att detta steg inte är nödvändigt för att isolera RF som krävs för RIBO-seq i bakterier, likaså för eukaryotaceller 18, och att storleksval av lämpliga längd mRNA-fragment från polyakrylamidgelen är tillräckligt.

För RNA-seq erhålls mRNA genom utarmning av rRNA från den totala RNA - rRNA-molekyler hybridiseras till de biotinylerade oligonukleotidsonderna som binder till de streptavidinbelagda magnetiska pärlorna. RRNA-oligonukleotid-pärlkomplexen avlägsnas sedan från provet med en magnet som resulterar i ett rRNA-utarmat prov19,20. De renade mRNA-molekylerna fragmenteras sedan slumpmässigt av alkalisk hydrolys. De erhållna fragmenten av mRNA samt ribosomala fotavtryck omvandlas till cDNA-bibliotek och förbereds för djup sekvensering (figur 2). Detta innebär slutreparation som behövs efter alkalisk hydrolys (för mRNA) och enzymatisk matsmältning (för RF): defosforylering av 3 ändar följt av fosforylering av 5 ändar. Nästa steg är adapterligantion och omvänd transkription för att skapa cDNA-skär inramade av sekvenser som krävs för nästa generations sekvensering (NGS) med Illumina-plattformen. Den sista fasen av biblioteksberedningen är en PCR-reaktion där konstruktionerna förstärks och märks med exempelspecifika streckkoder för att möjliggöra multiplexering och sekvensering av olika prover på en kanal. Före sekvensering bedöms bibliotekens kvalitet och kvantitet med hög känslighet DNA-elektrofores. cDNA-bibliotek med lämpliga parametrar kan sedan slås samman och sekvenseras. Sekvensering kan utföras på olika Illumina-plattformar, till exempel MiSeq, NextSeq eller HighSeq, beroende på antalet bibliotek, önskad läslängd och sekvenseringsdjup. Efter sekvensering utförs den bioinformatiska analysen.

Figure 2
Figur 2. Förberedelse av bibliotek. Biblioteksförberedelserna omfattar reparation av ändar, adapterligion, omvänd transkription och förstärkning med streckkodning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Ribosomprofilering är en universell metod som lätt kan modifieras och justeras enligt den vetenskapliga frågan. Ursprungligen användes den i jäst1, men kort efter att den applicerades på bakterieceller21 samt eukaryota modellorganismer inklusive mus10, zebrafisk22, fruktfluga23 och Arabidopsis thaliana24. Det användes också för att studera olika ribosomtyper: cytoplasma, mitokondriell25,26 och kloroplast27,28. I eukaryoter är RIBO-seq ofta anpassad och raffinerad för att undersöka specifika aspekter av översättning, inklusiveinitiering 10,11,29,30,31,32, förlängning1,10,11,31,33, ribosom stalling33 och konformationsändring33. De flesta ändringarna innebär användning av olika översättningshämmare. I bakterier har dock liknande studier varit svåra att genomföra på grund av inhibitorens brist med den erforderliga verkningsmekanismen34. Den vanligaste översättningshämmaren i bakterier är kloramfenikol (CAM) som binder till peptidyltransferascentret (PTC) och förhindrar korrekt positionering av aminoacyl-tRNA på A-sitet. Som ett resultat förhindrar CAM bildandet av en peptidbindning som leder till att de långsträckta ribosomerna35. Andra exempel på översättningshämmare i bakterier är tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 och Onc11237 som har använts för att undersöka översättningsinitieringsplatser. TET, som förhindrar tRNA leverans till ribosomen genom att direkt överlappa med antikodon stam-loop av tRNA på A-platsen, tillämpades ursprungligen för att verifiera resultaten från CAM behandling eftersom de båda är antibiotika hämma översättning förlängning38. TET konstaterades för att upptäcka primära TIS, men kunde inte avslöja interna TIS36. RET binder i PTC av bakteriell ribosom, och förhindrar bildandet av den första peptidbindningen genom att störa en elongator aminoacyl-tRNA i A-platsen. Applicering av RET resulterar i ribosomer gripande vid både primära såväl som interna TISs34. Onc112, en proline-rik antimikrobiell peptid, binder i utgångstunneln och blockerar aminoacyl-tRNA-bindning i ribosomal A-platsen. Som ett resultat förhindrar Onc112 initieringskomplex från att komma in i förlängningsfasen37.

Den huvudsakliga informationen ribosom profilering ger är ribosom densitet och deras position på mRNA. Det tillämpades framgångsrikt för att undersöka differentiella genuttryck på översättningsnivå under olikatillväxtförhållanden 1,6, mäta translationelleffektivitet 1,38,39 och upptäcka översättningsregleringshändelser som ribosomalpausning 10. RIBO-seq gör det också möjligt att avslöja översättningen av kommenterade ncRNA, pseudogenes och unannotated små öppna läsramar (ORF) som leder till identifiering av nya och / eller mycket korta proteinkodningsgener10,12,22,30,37. I sådana fall kan RIBO-seq finjustera och förbättra genomanteckningen. Med sin höga känslighet för identifiering av översatta ORF och dess kvantitativa karaktär kan ribosomprofilering också fungera som en proxy för proteomebestämningen eller för att hjälpa proteomikstudier31,34,39. Genom att kartlägga TIS avslöjar ribosomprofilering N-terminalt utsträckta och trunkerade isoformer av kändaproteiner 10,32. RIBO-seq anpassades också för att studera samöversättningsvikning avproteiner 14,21,24. Denna metod möjliggör mätning av förlängningshastigheter1,10,39 eller avkodningshastigheter för enskilda kodoner6 och hjälper till att utveckla kvantitativa modeller av översättning17. Ribosomprofileringsmetoden kan också ge mekanistiska insikter om ribosomen som pausar ibakterierna 7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, terminering / återvinningdefekter 41,42 och ribosomal konformation ändras33 i eukaryoter. RIBO-seq anpassades också för att undersöka effekten av specifika transverkande faktorer på översättning såsom miRNAs6 och RNA-bindande proteiner i eukaryoter16,43. Det är dock viktigt att erkänna att den experimentella utformningen och den erhållna upplösningen av RIBO-seq bestämmer mängden information som kan extraheras från de resulterande sekvenseringsdata12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provtagning

  1. Förbered en bakteriekultur. Vi rekommenderar en kulturvolym på 100 ml per prov.
  2. Bered utrustning och reagenser för provtagning: två skopor per prov, sterila 0,45 μm blandade cellulosaestermembran (MCE), 50 ml sterila rör, flytande kväve, 50 mg/ml kloramfenikol i 70 % (vol/vol) etanol (tillval). Punktera locket på 50 ml rör för att möjliggöra vätskekväveavdunstning och förhindra explosion av slutna rör. Dekontaminera skopor med laboratorietvättmedel och 70% etanol.
  3. Förvärm filtreringsutrustningen och en av skoporna till bakteriekulturens tillväxttemperatur.
    OBS: Vi rekommenderar en allglasfiltreringsapparat med tratt, fritt bas, slipad fogkolv och en 47 mm Ø fjäderklämma.
  4. Före provskörd, tillsätt kloramfenikol i bakteriekulturen till den slutliga koncentrationen av 100 μg/ml och inkubera 1 minut (valfritt).
  5. Häll flytande kväve i 50 ml sterilt rör och placera den andra skopan inuti röret för att svalna.
    försiktighet! Flytande kväve kan orsaka att slutna behållare exploderar på grund av tryckförändringen vid avdunstning. För att förhindra detta är det nödvändigt att skapa några hål i locket på 50 ml rör för att tillåta vätskekväveavdunstning.
  6. Samla celler genom filtrering. Sluta filtrera när medium har passerat genom membranet, men låt inte filtret torka helt.
  7. Samla bakteriepellets genom att snabbt skrapa bort cellerna från filterskivan med hjälp av en förvärmd scoopula. Placera omedelbart hela scoopulan med de skördade cellerna i 50 ml-röret fyllt med flytande kväve. Den skördade pelleten ska vara helt täckt av flytande kväve.
  8. Låt pelleten frysa ordentligt och lossa frusna celler med en tidigare kyld andra skopa. Stäng det punkterade locket och överför röret till -80°C. STOPPpunkt
    OBS: Desinficera skopor efter varje provskörd.

2. Celllys

  1. Förbered 0,1 M GMP-PNP i 10 mM Tris pH 8, DNase I och 1,5 ml reaktionsrör för lysater och håll dem på is. Kyl centrifugen till 4 °C.
  2. Förbered lysbuffert (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 och 1 mM kloramfenikol som tillval). Alikvot 500 μL lysbuffert per prov i 1,5 ml reaktionsrör och placera dem på is.
  3. Dekontaminera mortel och mortel med laboratorietvättmedel och 70% etanol och torka dem. Kyl mortel och mortel genom att hälla flytande kväve i morteln.
  4. Överför fryst pellet till den förkylda morteln och slipa den till ett pulver. Tillsätt cirka 1 volym aluminiumoxid med en spatel och fortsätt slipa. Håll mortel, mortel och celler svala genom att hälla flytande kväve vid behov, låt inte innehållet i morteln tina.
  5. Strax innan du använder lysbuffert, tillsätt GMP-PNP och DNase I i lysbufferten aliquot till den slutliga koncentrationen av 2 mM respektive 100 U/ mL. Överför lösningen till morteln med celler och aluminiumoxid och fortsätt slipa. Låt lysatet tina långsamt under slipning och överför blandningen till det förkylda reaktionsröret på 1,5 ml och lägg omedelbart på is.
  6. Centrifugering lyser vid 20 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför supernatanter till nya, förkylda 1,5 ml reaktionsrör och håll dem på is.
  7. Mät RNA-koncentrationen i varje prov med en NanoDrop. Använd 1:10 utspädningar av prover och 1:10 utspädning av lysbuffert i nukleasfritt vatten som ett blankvatten.
    OBS: Var medveten om att kloramfenikol visar betydande absorption vid 260 nm.
  8. Dela varje lysat i två portioner: en för RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) och den andra för RNA-seq (resten).
  9. Rengör proverna för RNA-seq med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt RNA-rengöringskit enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: Vi rekommenderar att du använder Zymo RNA Clean & Concentrate -25 kit (se Materialförteckning). Vi rekommenderar också att du lägger till 4,5 volymer etanol (jämfört med provvolym) i blandningen av prov och bindningsbuffert för ribosomala fotavtryck och fragmenterat mRNA, för att öka reningseffektiviteten hos korta RNA-fragment.
  10. Förvara proverna avsedda för RNA-seq vid -80 °C. Förfarandet för RNA-seq kommer att fortsätta från steg 5.

3. MNase matsmältning av prover för RIBO-seq

  1. Till 1 mg RNA tillsätt 3,8 μL 187,5 U/μL MNase i 10 mM Tris pH 8 och fylla på lysbufferten till den totala volymen 500 μL.
  2. Inkubera vid 25 °C, 300 varv/min, i 45 minuter i en termomixer.
  3. Rengör proverna med ett kommersiellt tillgängligt RNA-rengöringskit (som i steg 2.9).
  4. Förvara proverna för RIBO-seq vid -80 °C (STOP-punkt) eller fortsätt till storleksval.

4. Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) och storleksval av prover för RIBO-seq

  1. Förbered en 15% polyakrylamid-TBE gel med 8 M urea och placera den i en tank med TBE-buffert. Förkörning i minst 10 minuter med en konstant spänning på 200 V.
  2. Blanda proverna med TBE-Urea Provbuffert, denatur vid 95 °C i 1 minut och lägg dem omedelbart på is.
  3. Tvätta urea genom att injicera TBE-buffert i gelbrunnar med en spruta. Ladda proverna och lämna ett brunnsutrymme mellan dem för att separera varje prov och förhindra korskontaminering. Använd 29 nt oligonukleotid och en blandning av 26 nt och 32 nt oligonukleotider som markörer. Kör elektrofores med en konstant spänning på 180 V.
  4. Förbered steril buffert för inkubation över natten (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Efter elektrofores, färga gelén i ett SYBR Guldbad i ca 2-3 minuter och skölj gelén med nukleasfritt vatten.
  6. Punktskattefragment av gel mellan 26 och 32 nt med sterila nålar eller rakblad och placera gelfragmenten i separata 1,5 ml-rör för varje prov. Byt nål eller rakblad mellan proverna.
  7. Tillsätt 200 μL av inkubationsbufferten över natten i varje reaktionsrör.
  8. Inkubera proverna vid 10 °C, 1000 varv/min över natten i en termomixer.
  9. Nästa dag, rengör proverna som i steg 2.9. Eluera fotspåren i 80 μL nukleasfritt vatten.
  10. Förvara proverna vid -80 °C. STOPPpunkt. Förfarandet för RIBO-seq kommer att fortsätta från steg 7.

5. Rening av bakteriell mRNA genom rRNA-utarmning från prover för RNA-seq

  1. Ta bort rRNA från prover med ett bakteriellt mRNA-reningskit (t.ex. Invitrogen MICROBExpress). Följ tillverkarens protokoll.
  2. Rengör proverna enligt steg 2.9. Eluera mRNA i 50 μL nukleasfritt vatten.
  3. Förvara proverna för RNA-seq vid -80 °C (STOP-punkt) eller fortsätt att alkalisk fragmentering.

6. Alkalisk fragmentering av prover för RNA-seq

  1. Förbered alkalisk hydrolysbuffert (blanda 220 μL på 0,1 M NaHCO3,30 μL 0,1 M Na2CO3 och 1 μL 0,5 M EDTA). Blanda 1 volym (50 μL) alkalisk buffert med 1 volym (50 μL) av provet och inkubera vid 95 °C i 25 minuter.
  2. Tillsätt 5 μL 3 M NaOAc pH 5,5 för att stoppa reaktionen.
  3. Rengör proverna enligt steg 2.9 och eluera proverna i 80 μL nukleasfritt vatten.
  4. Möjlig STOP-punkt: lagra RNA-seq-prover vid -80 °C. Vi rekommenderar dock att du går direkt till steg 7 för att undvika onödig frysning och upptining.

7. Defosforylering och fosforylering av prover för både RNA- och RIBO-seq

  1. Tillsätt 10 μL 10x reaktionsbuffert PNK och 5 μL T4 PNK till varje prov. Inkubera vid 37 °C i 1,5 timme för att defosforylera 3' ändarna.
  2. Tillsätt 3 μL 1 mM ATP och inkubera vid 37 °C i 1 timme för att fosforylera 5' ändarna.
  3. Rengör proverna enligt steg 2.9, eluera i 30 μL nukleasfritt vatten.
  4. Förvara proverna vid -80 °C. STOPPpunkt.

8. Biblioteksförberedelse med NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set för Illumina

  1. Förbered 100-1000 ng ingångs-RNA (erhållna mRNA-fragment och ribosomala fotavtryck) i 6 μL nukleasfritt vatten och tillsätt 1 μL 3' SR-adapter. Inkubera enligt tillverkarens protokoll.
  2. Tillsätt 10 μL 3' Ligation Reaction Buffer (2X) och 3 μL 3' Ligation Enzyme Mix och inkubera vid 37 °C i 2,5 timmar, i stället för 1 timme vid 25 °C som tillverkarens protokoll anger.
  3. Hybridisera reverse transcription primer enligt tillverkarens protokoll med ett modifierat program: 5 minuter vid 75 °C, 30 minuter vid 37 °C och håll vid 4 °C.
  4. Ligate den 5' SR Adapter. Följ tillverkarens protokoll med en ändring: utför inkubationen vid 37 °C i 2,5 timmar, i stället för 1 timme vid 25 °C.
  5. Utför omvänd transkription enligt tillverkarens protokoll.
  6. Möjlig STOP-punkt: inkubera de prover som innehåller syntetiserade cDNAs vid 70 °C i 15 minuter för att inaktivera den omvända transkriptionen och lagra dem vid -80 °C. Vi rekommenderar dock att du går direkt till nästa steg för att undvika onödig frysning och upptining av proverna.
  7. Förvara hälften av varje cDNA-bibliotek vid -80 °C som back-up.
  8. Utför PCR-förstärkning enligt tillverkarens protokoll. Använd hälften av reaktionsblandningen. Förvara de erhållna biblioteken vid -80 °C. STOP-punkten.

9. Storleksval av cDNA-bibliotek med PAGE

  1. Förbered 6% polyakrylamid-TBE-gel och placera den i en tank med TBE-buffert. Förkörning i minst 10 minuter med en konstant spänning på 200 V.
  2. Blanda proverna med Gel Loading Dye, Blue (6X) och ladda dem på gelén. Använd Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest som stege. I början kör elektrofores vid en konstant spänning på 120 V för att låta DNA komma in i gelén och sedan ändra spänningen till 180 V.
  3. När elektrofores är klar, färga gelén i ett SYBR Guldbad i ca 2-3 minuter och skölj gelén med nukleasfritt vatten.
  4. Punktskattegelfragment som innehåller biblioteken. För RNA-seq prover punktskatter mellan 135-180 nt och för RIBO-seq mellan 135-170 nt. Använd steril nål eller rakblad och placera de strukna gelfragmenten i separata 1,5 ml reaktionsrör. Kom ihåg att byta nål eller rakblad mellan proverna.
    OBS: Adaptrarna och streckkoden från NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set för Illumina har totalt 119 nt som bestämmer den nedre excisionsavskärningen.
  5. Tillsätt 100 μL kärnvatten till varje struket gelfragment.
  6. Inkubera gelfragmenten vid 10 °C, 450 varv/min över natten i en termomixer.
  7. Rengör och koncentrera cDNA-biblioteken med ett kommersiellt DNA-saneringskit enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: Vi rekommenderar att du använder Zymo DNA Clean & Concentrate -5 kit (se Materialförteckning).
  8. Förvara renade cDNA-bibliotek vid -80 °C. STOPPpunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De exemplariska resultaten som presenteras här erhölls i en studie som undersöker översättningsreglering i sporulera WT Bacillus subtilis celler. Över natten kulturer späddes ut till OD600 lika med 0,1 i 100 mL rikt medium och inkuberades vid 37 °C med kraftig skakning tills OD600 nådde 0,5-0,6. Det rika mediet ersattes sedan med minimalt medium för att inducera sporuleringsprocessen och inkubationen fortsatte i upp till fyra timmar. Celler skördades varje timme från och med T0 - sporulering induktion - vilket resulterade i fem tidpunkter. En minut före skörd behandlades kulturerna med kloramfenikol enligt beskrivningen i protokollet ovan. Cellerna samlades in genom filtrering i ett förvärmt glasfiltreringssystem med 0,45 μm blandade cellulosaestermembran (MCE) och blixtfrysta i flytande kväve.

Mängden ribonukleinsyra som erhålls i lysatet beror på tillväxtförhållanden, odlingsvolym och densitet. Efter vårt protokoll ger 100 ml av bakteriekulturen (Bacillus subtilis) 1-4 mg RNA i genomsnitt. Exempel på lysater från det experiment som beskrivs ovan visas i tabell 1.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-mängd [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 (på andra) 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 (på andra) 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 (på andra) 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 (på andra) 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 (på andra) 1653 0.91 1.11 0.43

Tabell 1. RNA-koncentration och mängd i representativa prover av B. subtilislyat. Tabellen innehåller prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporulering induktion. Lysis utfördes med 550 μL lysbuffert som innehåller kloramfenikol. Det kan märkas att när sporuleringen fortsätter minskar mängden erhållna RNA.

När mängden RNA är lägre än 1 mg används 0, 25 mg RNA för RIBO- seq istället för 1-0, 5 mg och mängden MNase justeras sedan. Den representativa RNA-mängden och koncentrationen efter nukleassammanfattning visas i tabell 2. Den genomsnittliga mängden RNA efter matsmältning och rengöring är 50 μg från 0,5 mg RNA-ingång.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-mängd [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R (på andra) 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R (på andra) 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R (på andra) 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R (på andra) 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R (på andra) 206 10.30 2.13 1.00

Tabell 2. Mängden och koncentrationen av RNA efter nukleas matsmältningen av de representativa proverna för RIBO-seq. Tabellen innehåller prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. bokstaven "R" avser prover för RIBO-seq. Eftersom RNA koncentrationen av WT4-R prov var låg, 0,25 mg RNA smältes, medan 0,5 mg av RNA för de återstående proverna användes för ribosomal fotavtryck generation. Mängden MNase för matsmältningen var 178.125 U för 0,25 mg RNA i WT4-R och 356,25 U för 0, 5 mg RNA i andra prover. Efter matsmältningen var proverna rengjorda med den kommersiella RNA sanering kit och ribonukleinsyra koncentration mättes med NanoDrop.

Efter MNase-matsmältningen utförs storleksval med hjälp av PAGE. Ett exempel på en 15% TBE-urea polyakrylamidgel med de smälta proverna visas i figur 3. Fragment av gel mellan 26 och 32 nt var strukits med ett sterilt rakblad och inkuberades över natten i natten inkubation buffert. Nästa dag rengjordes ribosomala fotspår med det kommersiella RNA-saneringspaketet.

Figure 3
Bild 3. 15% TBE- urea polyakrylamidgel med representativa prover efter MNase matsmältning. Siffran omfattar prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. bokstaven "R" avser prover för RIBO-seq. 15 μL denaturerade prover laddades i gelbrunnarna i ordning: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R och den återstående volymen lagrades vid -80 °C som en säkerhetskopiering. 29 nt oligonukleotid och blandning av 26 nt och 32 nt oligonukleotider användes som markörer. Elektrofores utfördes som beskrivits ovan och gelén var fläckad i ett SYBR Guldbad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Parallellt med nukleas matsmältningen rengjordes lysates för RNA-seq med den kommersiella RNA sanering kit och de erhållna koncentrationerna av RNA mättes med NanoDrop. De representativa resultaten presenteras i tabell 3. Efter rengöring minskade mängden ribonukleinsyra till 40-500 μg.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-mängd [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m (på 1000) 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabell 3. RNA-mängd och koncentration av prover för RNA-seq efter RNA-rening. Tabellen innehåller prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. bokstaven "m" avser prover för RNA-seq (mRNA).

De erhållna RNA-koncentrationerna av proverna för RNA-seq användes för att definiera RNA-ingång för rRNA-utarmning. 8 μg RNA från varje RNA-seq-prov användes med MICROBExpress bakteriell mRNA-rening kit (se Materialförteckning)enligt tillverkarens protokoll och rengjordes med det kommersiella RNA-rengöringspaketet efteråt. De representativa resultaten av rRNA-utarmningen visas i tabell 4.

RNA-koncentration [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA-mängd [μg]
WT0-m (på 1000) 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabell 4. Den representativa RNA-mängden och koncentrationen efter rRNA-utarmning. Tabellen innehåller prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. bokstaven "m" avser prover för RNA-seq. 8 μg RNA från prover för RNA-seq användes för rRNA-utarmning och rengjordes med ett kommersiellt RNA-saneringskit efteråt.

Därefter fragmenterades den erhållna mRNA av alkalisk hydrolys och rengjordes med ett kommersiellt kit som beskrivs i protokollet. De fragmenterade mRNA och ribosomal fotavtryck var dephosphorylated vid 3' ändar och fosforylerade vid 5' ändar enligt ovanstående protokoll. Proverna användes sedan för att konstruera cDNA-bibliotek för Illumina-sekvensering, enligt beskrivningen i protokollet. Figur 4 visar ett exempel på en 6% polyakrylamidgel med de erhållna biblioteken. Gelfragment i intervallet 135-180 nt för RNA-seq och 135-170 nt för RIBO-seq strukits med sterila rakblad och inkuberats över natten i nukleasfritt vatten. Biblioteken rengjordes med ett kommersiellt DNA-rengöringskit och kvalitet och kvantitet bedömdes av en högkänslig DNA-elektrofores med agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
Figur 4. 6% polyakrylamidgel av cDNA-bibliotek före och efter storleksval. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest användes som stege. 25 μL prover laddades i gelén i följande ordning: tre RIBO-seq-bibliotek och sex RNA-seq-bibliotek. De återstående provvolymerna lagrades vid -80 °C som en back-up. Siffran omfattar prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. Bokstaven "R" avser prover för RIBO-seq och bokstaven "m" avser prover för RNA-seq. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Exemplen på virtuella gelbilder och elektrosfärogram från Agilent 2100 Bioanalyzer visas i figur 5. Band och toppar som representerar RIBO-seq-biblioteken är smalare och bättre definierade jämfört med dessa som representerar RNA-seq-bibliotek. Enligt elektroforesen på chip är biblioteken cirka 150 bp långa, vilket är en förväntad biblioteksstorlek. Adaptrarna och streckkoden som används vid biblioteksberedning är 119 nt långa och skären är antingen 29-30 nt långa (för RIBO-seq) eller i ett intervall mellan 25 och 50 nt (för RNA-seq). De ytterligare topparna närmare de 200 bp som erhålls från RIBO-seq-bibliotek kan indikera PCR-artefakter som kan kasseras under bioinformatisk analys när de data som erhålls från sekvensering trimmas och rRNA/tRNA filtreras. Den genomsnittliga mängden DNA är 32 ng vilket ger tillräcklig mängd material som krävs för nästa generations sekvensering.

Figure 5
Figur 5. Exemplen på elektrosfärogram och virtuella gelbilder från en högkänslig DNA-elektrofores. Siffran omfattar prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och en timme (1), två (2), tre (3) eller fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. Bokstaven "R" avser RIBO-seq-bibliotek och bokstaven "m" avser RNA-seq-bibliotek. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Efter kvalitetskontroll av elektroforesen på chip samlades biblioteken för enkelslutssekvensering på 50 bp på Illuminas NextSeq500-plattform (10 bibliotek per kanal, med minst 350 mln läsningar per kanal). Sekvensering gav 30-57 miljoner läsningar per prov för RNA-seq-bibliotek och 30-50 miljoner läsningar per prov för RIBO-seq-bibliotek. Trimning av adaptrar och sekvenser av dålig kvalitet resulterade i 24-47 mln avläsningar per prov för RNA-seq-prover och 25-50 mln läsningar per prov för RIBO-seq-prover. Kartläggning, utförd med STAR44, gav 2,4-9,6 miljoner unikt kartlagda läsningar per prov för RNA-seq-prover (som utgör 8-16,8% av det totala antalet läsningar) och 2,3-10,4 miljoner unikt kartlagda läsningar (7,7-22,1%) för RIBO-seq-prover. De erhållna uppgifterna kontrollerades av kvalitetskontroll med FastQC45. Exempel på de kvalitetsdiagram som FastQC har producerat för de trimmade sekvenserna visas i figur 6. Sekvenserna av längden på intresset, som är <32 nt för RIBO-seq och <50 nt för RNA-seq, presenterade mycket god kvalitet. Exemplen på diagram över GC-innehåll och fördelningar av sekvenslängder över alla trimmade sekvenser visas i figur 7. Den extra toppen på 72% i GC-distributionsdiagram i RIBO-seq-biblioteket kan potentiellt indikera rRNA-förorening som kan avlägsnas under bioinformatisk analys genom rRNA-filtrering46,47,48. Sekvenslängdsfördelningen är mycket smal för RIBO-seq-bibliotek, med en topp på 26-27 nt medan längdfördelningen för RNA-seq-bibliotek är bredare och sträcker sig mellan 15 och 50 nt.

Figure 6
Figur 6. Exemplen på box-and-whisker-tomter av kvalitetspoäng över alla baser för RIBO-seq- och RNA-seq-bibliotek efter trimning. Siffran omfattar prover från den vilda typ (WT) B. subtilis som skördades före sporuleringsinduktion (0) och fyra (4) timmar efter sporuleringsinduktion. Bokstaven "R" avser RIBO-seq-prover och bokstaven "m" avser RNA-seq-prover. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7. Exemplen på tomter med GC-innehåll och sekvenslängdsfördelning av alla sekvenser för RIBO-seq- och RNA-seq-bibliotek efter trimning. Figuren visar prover från den vilda typen (WT) B. subtilis som skördades fyra (4) timmar efter sporulering induktion; Bokstaven "R" avser provexempplande för RIBO-seq och bokstaven "m" avser prov för RNA-seq. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

För att verifiera om RIBO-seq-data ger information om verkliga ribosomala fotavtryck snarare än slumpmässiga mRNA-fragment av den valda längden jämförde vi sekvenseringsdata från RIBO-seq och RNA-seq med RiboToolkit, en webbserver för RIBO-seq-dataanalys49. Ribo-seq-data uppvisar trillingtidlighet och en hög, smal topp som motsvarar de initierande ribosomerna och egenskaper hos RF enligt figur 8A, som inte observeras i RNA-seq-data (Figur 8B). Dessutom visade metagenediagrammet som visar profilerna för genomsnittlig täckning av RF- och mRNA-fragment på kodningssekvenserna (CDS) en högre andel läsningar som kartlagts till CDS i RIBO-seq-datauppsättningen (figur 8C), som förväntat.

Figure 8
Bild 8. Metagene periodicitet tomter och genomsnittlig täckning av RF och mRNA fragment på CDSs. Metagene profiler erhölls med RiboToolkit, en integrerad webbserver49. CDS-längden normaliserades till värdet 1 och varje CDS delades in i 100 lika stora lagerplatser. Figuren visar prover från den vilda typen (WT) B. subtilis som skördades en (1) timme efter sporulering induktion; Bokstaven "R" avser provexempplande för RIBO-seq och bokstaven "m" avser prov för RNA-seq. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

För att jämföra om RIBO-seq-protokollet som presenteras här ger resultat som liknar dem som erhålls med standardmetod för RF-återhämtning (sackarosgradient ultracentrifugation), parallellerade vi sekvenseringsresultaten från bibliotek som utarbetats enligt de två metoderna. Experimenten som undersöker översättning reglering under sporulering i WT B. subtilis genomfördes enligt det presenterade RIBO-seq protokollet, samt följer standardprotokollet som innehåller monosomer återhämtning av en sackaros gradient ultracentrifugation. Resultaten av ribosomtäckningsprofiler som erhållits från de två experimenten visas i figur 9. Visualiseringen av kartlagda RFs är mycket likartad mellan de två experimenten och gav liknande resultat vid bioinformatisk analys.

Figure 9
Figur 9. Visualiseringen av erhållna RF mappade på genomet. Figuren omfattar RF som erhållits från vilda typ B. subtilis skördas fyra timmar efter sporulering induktion och beredd enligt standardprotokollet (WT4-R-s, övre panel) eller det presenterade protokollet (WT4-R, nedre panel). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den viktigaste tekniska utmaningen med ribosomprofilering är behovet av att snabbt hämma översättningen för att fånga en ögonblicksbild av ribosomer på mRNAs vid ett visst fysiologiskt tillstånd av intresse. För att åstadkomma detta används ofta översättningshämmare, snabb skörd och blixtfrysning i flytande kväve. Att applicera antibiotika är valfritt eftersom de kan orsaka artefakter. Kloramfenikol är ett vanligt läkemedel för att stoppa långsträckta ribosomer i bakteriell RIBO-seq. Det förhindrar dock inte initiering, vilket resulterar i en ackumulering av ribosomer cirka sex kodoner nedströms översättningsinitieringsplatsen14. Dessutom kan dess förmåga att hämma peptidyltransferasreaktionen vara beroende av ribosomala P- och A-platssubstratens natur. Förmodligen arresterar CAM ribosomer mer effektivt med Gly, Ala, Ser, Cys eller Thr som näst sista aminosyran i den gryendepeptiden 17,38,50. Detta är värt att ta hänsyn till under experimentell design och bioinformatisk analys, särskilt när man studerar ribosomal pausning17. CAM har också visat sig påverka translationell noggrannhet genom att främja en stop codon-genomläsning och frameshifting51. Ändå är CAM-hämningen relativt snabb och tillräcklig för typisk RIBO-seq-forskning14 och inducerar inte felinkorporering51. Några av artefakterna som orsakas av antibiotika kan undvikas genom att öka läkemedelsmängden9. CAM-koncentration som tillämpas i vårt protokoll är den typiska mängden som används i RIBO-seq-experiment7,14,21, men koncentrationen kan variera för olika mikroorganismer och bör optimeras före provskörd. På grund av risken för en förekomst av artefakter som orsakas av applicering av översättningshämmare rekommenderas att undvika inhibitorbehandling om det inte är nödvändigt för forskningsfrågan och om den snabba skörden ärmöjlig 14. Snabb cellsamling är avgörande, särskilt om den utförs utan inhibitorbehandling, eftersom långvarig skörd kan leda till förlust av polyomer och/eller förändring av översättaren som svar på de förändrade miljöförhållandena14. Således rekommenderar vi att du använder filtrering som avverkningsmetod eftersom den kan utföras under samma eller liknande förhållanden som kulturtillväxten, inklusive temperatur och / eller skakningar. Under filtreringsceller som samlas in vid filterytan spolas ständigt med tillväxtmedium, vilket gör dem från att känna av förändringar i celltäthet, syresättning och nivå av aminosyror och andra näringsämnen14. Filtreringen är skonsammare och kan vara snabbare än centrifugation, om kulturens densitet är måttlig, annars kan ett stort antal celler täppa till filterporerna och sakta ner processen. Om det finns en sannolikhet för en långvarig filtrering rekommenderar vi en kloramfenikolförbehandling av kulturen, vilket resulterar i ett översättningsstopp och gör det möjligt att förlänga skördetiden. Om filtrering blir svår att slutföra på grund av filtrets igensättning föreslår vi att filtreringen stoppas, ta bort överskottskulturen och blixtfrysningsfraktionen av den kultur som samlas in på filtret. Vi observerade att 50 ml tät bakteriekultur är tillräckligt för att utföra RIBO-seq. Den efterföljande blixtfrysningen av celler i flytande kväve är det mest universella och effektiva tillvägagångssättet för att omedelbart stoppaöversättningen 8,21,52.

Ribonukleas matsmältning är ett kritiskt steg som krävs för att få god kvalitet RF. Att välja rätt enzym är viktigt eftersom ribosomal underenheterna består av RNA-molekyler som kan smältas, störa ribosomens integritet, orsaka rRNA-förorening och förstöra RF44. Ursprungligen, RNase jag användes för matsmältningen av mRNA och RF generation i eukaryotes1. Eftersom detta enzym verkade inaktivt i bakterier ersattes det med en mikrokoccal nukleas (MNase) från Staphylococcus aureus21. Det visades senare att RNAse Jag kan faktiskt utföra matsmältningen av bakteriella prover, men MNase förblir vanligt förekommande för detta ändamål53. Nackdelen med MNase ligger i sekvensförskjutningen av dess katalytiska aktivitet, som är 30-faldigt ökad proximal till A eller T, vilket resulterar i 80% av mRNA-fragmenten som börjar med A eller T vid 5′ änden14. Detta har dock övervunnits av observationen att den största variationen i längd sker i 5′-änden av RF, och att tilldela ribosomtäthet till 3′-änden ger exakt och exakt information om ribosompositionen7. MNase-aktiviteten påverkas av enzymkoncentrationen, pH- och matsmältningstiden och bör bestämmas för varje ny MNase-sats. En ökad nukleas aktivitet resulterar i ökad rRNA förorening, medan minskad aktivitet orsakar mindre exakt klyvning av ribosomal fotspår. Detta kan minska det totala utbytet av RF i det storlekselektiva gelreningsförfarandet och ge mindre exakt information om ribosompositioner på mRNA14. Således bör den erforderliga mängden MNase bestämmas noggrant. För våra experiment applicerar vi 712,5 U mikrokoccal nukleas per 1 mg RNA medan koncentrationen som rapporteras i litteraturen varierar mellan 50 U38,450 U34,1000 U14 och 1500 U15,21,36 per 1 mg RNA. Som nämnts ovan kräver MNase närvaro av kalciumjoner för sin aktivitet. I standardprotokoll egta, ett kelaterande medel för divalent joner som har en högre affinitet för kalcium jämfört med magnesium54, används för att stoppa matsmältningen genom att binda kalcium och inaktivera MNase. Men i vårt protokoll stoppas matsmältningsreaktionen genom att använda RNA-rengöringssats direkt efter inkubation med kärnan.

I standardprotokoll är nästa steg ribosomer återhämtning av en sackaros kudde ultracentrifugation eller en sackarosgradient ultracentrifugation8,14. En sackarosgradientcentriugation möjliggör selektiv separation av monosomerna från underenheterna och polysomerna, men det kräver specifik utrustning som en gradientblandare och en ultracentrifuge. Dessutom är genomströmningen av denna metod begränsad till 500-700 μL av lysatet. Å andra sidan möjliggör sackaroskudde ultracentrifugationspellets de flesta ribosomala partiklar, möjliggör bearbetning av över tio milliliter lysat och är mindre krävande när det gäller den instrumentering som behövs. Båda metoderna är dock långa eftersom de tar minst 4 till 6,5 timmar14 och kräver en ultracentrifuge. I vårt protokoll utelämnas detta steg när vi går direkt till storleksval i 15% TBE-urea polyakrylamidgel. Elektroforesen utförs under denatureringsförhållanden för att veckla ut RNA:s sekundära strukturer och förhindra intramolekylära interaktioner. Vi använder 26 nt, 29 nt och 32 nt oligonukleotider som markörer för att excising ett smalt utbud av ribosomal fotspår. Vi antar att koncentrationen av den faktiska RF avsevärt överstiger potentiella kontaminering med falska RF betraktas som slumpmässiga, oskyddade av ribosom mRNA eller rRNA fragment av längd i det intervallet. Resultaten som erhållits med hjälp av vårt protokoll visade verkligen berikad fraktion av RF i det valda storleksintervallet. Kvalitetskontrollen med Agilent 2100 Bioanalyzer visar RIBO-seq-bibliotek som ett enda, väl definierat band och toppar, i motsats till RNA-seq-bibliotek som visualiseras som betydligt bredare utstryk och toppar (Figur 5). Erhållna Ribo-seq-data uppvisar också trillingtidlighet (figur 8A), som inte observeras i RNA-seq-data (figur 8B). Dessutom visar visualiseringarna av den erhållna RF som kartlagts på genomet mycket liknande uttrycksmönster oavsett den fotavtrycksisoleringsmetod som bekräftades ytterligare i våra bioinformatiska analyser (figur 9). Ändå är vi medvetna om att falsk RF kan mappa till genomet som kan störa den erhållna signalen. Det faktum att falsk RF genereras slumpmässigt innebär dock att de inte bör ackumuleras till en plats på genomet och därför inte bör resultera i artefakter och falskt resultat. Det måste också noteras att det inte finns någon konsensus i bakteriestudier om storleken på RFs som börisoleras 53,55 och att valet av endast en underförstöring av längdintervallet kan leda till feltolkningar av resultaten17. Det föreslås att ett brett spektrum av längder som är karakteristiska för bakteriella fotavtryck är en följd av prokaryota ribosom beteende snarare än MNase matsmältning55. Till exempel kan kompletterande interaktion mellan 3′ slutet av 16S rRNA i liten ribosomal underenhet och ett Shine-Dalgarno-motiv i mRNA resultera i längre RF56. Med tanke på ett brett spektrum av längder av bakteriella fotavtryck, Mohammad et al. rekommenderar att du utför storleksval mellan 15 och 40 nt17,55. Detta bör leda till isolering av potentiellt en hel rad RFs och säkerställa en omfattande representation av ribosomer i olika stadier av översättningscykeln. På grund av den pågående diskussionen bör excisionsområdet övervägas noggrant och det är viktigt att komma ihåg att det felaktiga valet kan utesluta vissa underfraktioner av RF och leda till partiskhet i den efterföljande analysen.

På grund av storleksvalet som utförs direkt efter nukleas matsmältningen och med utelämna den monosome isoleringen genom ultracentrifugation, är vårt protokoll snabbt, relativt enkelt och kan utföras med en standard laboratorieutrustning. Med hjälp av dedikerade satser för rengöring av RNA och DNA säkerställer rening av mRNA och biblioteksberedning standardisering och repeterbarhet. Appling mer volym etanol under RNA rengöring ökar reningseffektiviteten hos <200 nt RNA fragment57. Ändringar av biblioteksberedningen - förlängning av inkubationstiden och ökning av temperaturen under adapterligantion - tillämpas för att minska ligatureffektiviteten för metylerat RNA, såsom rRNA, och för att minska rRNA-förorening58. Vårt protokoll har använts för att undersöka översättningsreglering under olika tillväxtförhållanden (publikationer som är under utarbetande) men kan tillämpas för att studera andra aspekter av översättning som TIS detektering eller för att förbättra genomanteckning och hjälpa proteomiska studier. En ytterligare ändring av protokollet, beroende på forskningsfrågan, kan enkelt inkluderas, t.ex. Med vårt protokoll är RIBO-seq-proceduren mer tillgänglig för forskare och kan därmed stimulera nya upptäckter och påskynda utvecklingen inom området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

ALS vill bekräfta det ekonomiska stödet från EMBO Installationsbidrag IG 3914 och POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 inom ramen för fonden för polsk vetenskaps första gruppprogram som medfinansieras av Europeiska unionen inom ramen för Europeiska regionala utvecklingsfonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Biokemi nummer 174
RIBO-seq i bakterier: ett protokoll för insamling av prover och biblioteksförberedelser för NGS-sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter