Summary
Fluorescensaktiveret cellesortering-radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) er et kraftfuldt værktøj til at studere rollen som 18 kDa translocatorprotein eller Serotonin 5HT 2A-receptorekspression i Alzheimers sygdom i cellulær skala. Denne protokol beskriver ex vivo-anvendelsen af FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.
Abstract
Gliaceller har sandsynligvis en betydelig implikation i patofysiologien af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom (AD). Deres ændringer er måske forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet til at udtrykke humane APP- og humane PS1ΔE9-gener , der koder for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskud med aldring. TgF344-AD rottemodellen anvendes i denne undersøgelse til at evaluere den cellulære oprindelse af 18 kDa translocatorproteinet (TSPO, en markør for gliacelleaktivering) binding og 5HT2A-receptoren (5HT2AR) serotoninreceptorniveauer, der muligvis forstyrres i AD. Den teknik, der præsenteres her, er fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespecifik teknik, der supplerer in vivo PET- eller SPECT- eller ex vivo/in vitro-autoradiografiteknikker . Det kvantificerer det samme radioaktivt mærkede sporstof, der blev brugt tidligere til billeddannelse, ved hjælp af en γ tæller efter cytometricellesortering. Dette gør det muligt at bestemme den cellulære oprindelse af det radioaktivt mærkede protein med høj cellulær specificitet og følsomhed. For eksempel viste undersøgelser med FACS-RTT, at (i) stigningen i TSPO-binding var forbundet med microglia i en rottemodel af lipopolysaccharid (LPS)-induceret neuroinflammation, (ii) en stigning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneder var først forbundet med astrocytter og derefter mikroglia i TgF344-AD-rotter sammenlignet med vildtyperotter (WT) og (iii) striataldensiteten af 5HT2A R falder i astrocytter efter 18 måneder i samme rotte AD-model. Interessant nok kan denne teknik udvides til stort set alle radiotracere.
Introduction
Neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom (AD), er karakteriseret ved et neuronalt tab forbundet med øgede symptomer. AD, den mest almindelige årsag til demens, der tegner sig for 60%-70% af tilfældene, påvirker omkring 50 millioner mennesker verden over1. På et neuropatologisk niveau er de to vigtigste egenskaber ved AD akkumuleringen af ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plaques og intracellulære Tau neurofibrillære tangles. Gliacelleændringer har også været forbundet med AD2 og mulig forstyrrelse af flere neurotransmittersystemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er blevet modificeret til model AD ved at udtrykke humane APP- og PS1ΔE9-transgener, hvilket fører til opløselig og uopløselig Aβ-40 og Aβ-42-ekspression og amyloidplaquedannelse5. Det præsenterer også akkumuleringen af hyperphosphorylerede former for Tau-proteinet, der fører til tauopati. Fra en alder af 9-24 måneder udvikler rotterne gradvist de patologiske kendetegn ved AD og en kognitiv svækkelse 5,6,7,8,9.
Positronemissionstomografi (PET), enkeltfotonemission computertomografi (SPECT) og autoradiografi er teknikker baseret på emission og kvantificering af γ stråler. Radiotracere kvantificeres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse følsomme teknikker har bidraget til forståelsen af mekanismer i flere hjernesygdomme, såsom AD. Med hensyn til neuroinflammation er der faktisk mange undersøgelser, der vurderer 18 kDa Translocator Protein (TSPO), en in vivo neuroinflammationsmarkør, med radioaktivt mærkede sporstoffer såsom [11C] -(R) -PK11195 eller [11C] PBR28 (for gennemgang se10). Derudover er ændringer af neurotransmittersystemer blevet undersøgt ved hjælp af radiotracere 11,12,13.
Disse teknikker bestemmer imidlertid ikke det radioaktive signals cellulære oprindelse. Dette kan hæmme fortolkningen af det biologiske grundlag for ændringen i bindingen af en radioligand i PET/SPECT. For eksempel i tilfælde af TSPO-undersøgelser af neuroinflammation er det af afgørende betydning at forstå, om stigningen eller faldet i TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale ændringer. Teknikken Fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) blev udviklet for at omgå disse problemer, hvilket muliggør vurdering af radioligandbinding i hver celletype separat og kvantificering af målproteintætheden pr. Celle. Denne innovative teknik er derfor komplementær og yderst kompatibel med PET- og SPECT-billeddannelse.
Her blev denne teknik anvendt langs to akser: undersøgelsen af neuroinflammation ved hjælp af TSPO-specifikke radioligands og vurdering af det serotonerge system. På den første akse var målet at forstå TSPO-signalets cellulære oprindelse som reaktion på en akut inflammatorisk reaktion. Derfor blev FACS-RTT anvendt på hjernevæv hos rotter efter induktion af neuroinflammation via en lipopolysaccharid (LPS) injektion og efter en in vivo [125I] CLINDE SPECT billeddannelsesundersøgelse. Desuden blev den samme billeddannelses- og FACS-RTT-protokol anvendt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende vildtyperotter (WT). Den anden akse havde til formål at bestemme oprindelsen af serotoninerge systemændringer i denne rottemodel via ex vivo 5-HT2AR-densitetsvurdering efter celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter aftale med henholdsvis den etiske komité for forsøg på mennesker og dyr i kantonen Genève, den kantonale kommission for forskningsetik (CCER) og den generelle retning for sundheden i kantonen Genève (Schweiz). Data rapporteres efter Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE) retningslinjer.
1. Forberedelse og kalibrering af SPECT-kamera
- Tænd kameraet, læg betjeningssoftwaren i (se Materialetabel). Klik på knappen Home XYZ Stage for at udføre homing.
- Konfigurer eksperimentet, der består af en 10 minutters scanningsanskaffelse. Indstil tilstanden Trin til Fin og Anskaffelsestilstand til Listmode (for at registrere hele emissionsspektret).
- Opsæt sengen og sørg for, at opvarmningssystemet, åndedrætssensoren og anæstesien er funktionelle og sikre (figur 1A-D). Anbring derefter et fantom (dvs. 2 ml af en kendt koncentration på 125I i et 2 ml mikrofugerør), hvor dyrets hoved vil blive placeret (centreret om området, figur 1E).
- Indstil scanningsområdet ved at skubbe markørerne for de tre dimensioner ved hjælp af de tre billeder i den nederste del af skærmen. Sørg for, at fantomets og dyrets scanningsvolumen er det samme.
- Start fantomscanningen for efterfølgende kalibrering med de parametre, der er fastlagt i trin 1.2-1.4.
2. Opsætning af arbejdsområde til SPECT-billeddannelse
- Rengør arbejdsområdet med desinfektionsmiddel virucid og læg blødt papir på alle overflader.
- Sørg for, at der er nok isofluran og ilt i deres respektive tanke.
- Forbered et 24 G kateter ved at afskære finnerne på sommerfuglekateteret for at få et klarere overblik over rottehalevenen.
- Belæg kateteret ved at fylde det helt med heparinopløsning (25000 U/ml) efter fjernelse af nålen. Placer derefter nålen tilbage i den for at undgå dannelse af blodpropper efter kateterindsættelse.
3. [125I]CLINDE radiotracer syntese
FORSIGTIG: Radioaktivitet kan have tilstrækkelig ioniserende energi til at påvirke atomerne i de levende celler og beskadige deres genetiske materiale (DNA).
- Sørg for at arbejde i et passende miljø, der er godkendt til eksperimenter, der involverer radioaktivitet.
BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler (PPE) til håndtering af radioaktivitet, herunder finger- og kropsdosimetre. Prøv at holde dig i sikker afstand fra enhver kilde til radioaktivitet. - Inkuber 100 μg tributylinprækursor i 100 μL eddikesyre med natriumiodid (Na125I) (se materialetabel) og 5 μL 37 % pereddikesyre ved 70 °C i 20 minutter i en termocyklist placeret i en handskeboks.
- Fortynd reaktionen med 50 % acetonitril (ACN) i vand for at nå et volumen på 500 μL. Injicer 500 μL af den fortyndede reaktion på en omvendt fasekolonne (se materialetabel).
- Isoler [125I]CLINDE med en lineær gradient HPLC-kørsel fra 5% -95% ACN i 7 mM H3PO4 i 10 minutter. Fortynd isolatet iH20for at opnå et endeligt volumen på 10 ml, og sprøjt derefter den fortyndede reaktion på en koncentrationskolonne (se materialetabellen).
- Eluter [125I]CLINDE fra kolonnen med 300 μL absolut ethanol, og fordamp derefter ethanolen ved at inkubere den i en vakuumcentrifuge ved RT i 40 minutter.
- Fortynd restproduktet indeholdende [125I]CLINDE i 300 μL sterilt saltvand for at skabe en stamopløsning.
- Efter måling af dets radioaktivitet fortyndes stamopløsningen i sterilt saltvand for at opnå en opløsning på 0,037 MBq i 500 μL.
- Rens sporstoffet ved hjælp af HPLC (High-performance liquid chromatography). Bestem elueringstiden ved hjælp af en standardkalibrering ved 450 nm, og isoler den enkelte radioaktive top. Udfør standardkalibreringskurven ved hjælp af syv standardkoncentrationer af kold (ikke-radioaktiv) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg og 5 μg i 400 μL af en opløsning på 50% ACN). Etablere den radiokemiske renhed ved at måle en enkelt top i radio TLC (Tyndtlagskromatografi). Sørg for, at renheden af det radiokemiske er over 60%.
- Kontrollér den specifikke aktivitet af radioligandmålingen af ultraviolet absorbans ved 450 nm og kalibreringskurverne etableret med kolde referenceforbindelser. Sørg for, at den specifikke aktivitet er større end 1000 GBq / pmol.
4. [125I]R91150 syntese af radiotracer
BEMÆRK: Sørg for at følge de samme sikkerhedsregler som nævnt i afsnittet CLINDE-syntese.
- 300 μg R91150-prækursor blandes i en opløsning af 3 μL absolut ethanol, 3 μL iseddikesyre, 15 μL bærerfri Na125I (se materialetabellen) (10 mCi) i 0,05 M NaOH og 3 μL 30 %H2O2. Inkuber i 30 minutter i et handskeboks.
- Indsprøjt hele reaktionen i en omvendt fasekolonne (se tabel over materialer).
- Isoler [125I]R91150 ved isokratisk HPLC-kørsel (ACN/vand 50/50, 10 mM eddikesyrebuffer) med en strømningshastighed på 3 ml/min.
- Fortynd [125I]R91150 iH20til et endeligt volumen på 10 ml.
- 10 ml af den fortyndede reaktion injiceres på en koncentrationskolonne (se materialetabel).
- Elute [125I]R91150 fra kolonnen med 300 μL absolut ethanol.
- Ethanolen fordampes ved at inkubere den i en vakuumcentrifuge ved RT i 40 minutter.
- Fortynd restproduktet indeholdende [125I]R91150 i 300 μL saltvand.
- Rens sporstoffet med HPLC. Bestem elueringstiden ved hjælp af en standardkalibrering ved 450 nm, og isoler den enkelte radioaktive top. Fastlæg den radiokemiske renhed ved at måle en enkelt top i radio-TLC. Sørg for, at renheden af det radiokemiske er over 98%.
5. Tilberedning af dyr
- Vej og bedøve TgF344-AD rotten (han eller hun, fra 2-24 måneder gammel) i et induktionskammer med 3% isofluran. Når isofluranstrømmen er dybt bedømt, sænkes isofluranstrømmen til 2% (0,4 l / min, 100% O2) i kammeret.
- Placer dyret på en forvarmet seng udstyret med en anæstesi næsecone. Isofluran ved 2% (0,4 L/min, 100%O2).
- Påfør øjengelsmøremiddel i dyrets øjne og bekræft dybden af anæstesi via åndedrætsovervågning; juster anæstesi om nødvendigt.
- Udfør 24 G kateterindsættelsen i halevenen.
6. Erhvervelse af SPECT
- Overfør dyret til kamerasengen udstyret med en temperaturstyret varmepude indstillet til 38 °C (figur 1E).
- Fastgør dyrets hoved på bidstangen og fastgør hovedstøtterne.
- Sæt eksperimentet op på en 60 minutters scanning, der udgør 60 billeder af 1 min. Genbrug alle andre parametre, der er konfigureret i trin 1. Klik på knappen Opdater billede for at opdatere dyrets position.
- Indstil scanningsområdet ved at skubbe markørerne ved hjælp af de tre billeder i den nederste del af skærmen for de tre dimensioner.
- Injicer 500 μL af det radioaktive radiotracer ([125I]CLINDE eller [125I]R91150), og skyl derefter røret med 300 μL sterilt 0,9% NaCl. Klik samtidig på Start erhvervelse for at starte scanningen.
- I løbet af scanningstiden skal du sørge for at opretholde dyret under konstant anæstesi med overvågning af respirationshastighed. Juster strømmen af isofluran, hvis det er nødvendigt.
- Når scanningen er overstået, skal du hurtigt aflive det anæstetiserede dyr ved halshugning.
7. Scan rekonstruktion
- Åbn scanningsrekonstruktionssoftwaren (se Tabel over materialer), og åbn derefter datasættet og se efter filen [filnavn].parametre, der er oprettet i mappen til scanningen.
- Vælg isotopen af interesse. Bemærk, at Parameteren Listmode tillader flere isotopvalg på dette trin.
- Vælg følgende parametre: 0,4 mm Voxel-størrelse, 4 (POS-EM) undersæt, 6 iterationer (24ME-EM-ækvivalent), intet efterfilter og den isotop, der svarer til henfaldskorrektion. Vælg outputformatet til NIfTI, og vælg derefter Start SPECT-rekonstruktion .
8. Rotte hjerne ekstraktion
- I samme bedøvelseshændelse som scanningsproceduren og efter at have sikret dyrets dybe anæstesitilstand ved at overvåge dets respirationshastighed, fortsæt til halshugningen med guillotin og overfør hurtigt hovedet til dissektionsbænken.
- Med en saks skal du forsigtigt skære huden oven på hovedet fra bagsiden til forsiden indtil midten af øjnene.
- Afskær de overskydende muskler omkring bunden af kraniet og livmoderhvirvlerne.
- Placer derefter forsigtigt et blad af saksen i hullet bag på kraniet, foramen magnum, og fjern den bageste del af kraniet med kirurgisk tang.
- Fjern derefter forsigtigt den øverste del af kraniet med kirurgiske tænger. Kraniet af gamle hanrotter kan være tykt, fjerne som små stykker for at undgå skader på hjernen.
- Skær forsigtigt meninges med en saks. Meninges kan beskadige hjernen under ekstraktionsprocessen; fjern det som en sikkerhedsforanstaltning.
- Når du har fjernet den øverste del af kraniet, skal du dreje dyrets hoved rundt, og med en lille flad spatel skal du forsigtigt trække hjernen ud ved at skære de optiske og trigeminusnerver.
- Overfør forsigtigt hjernen til en flad, ren glasoverflade til dissektion på is.
- Brug en flad metalspatel og et barberblad til at dissekere hjernens områder af interesse. Anbring vævene i et 2 ml centrifugerør og vej det opnåede væv. Brug hjernesektionen direkte til celleisolering eller frys den hurtigt i flydende nitrogen til senere brug.
9. Celleisolering
- Sørg for at arbejde i et rent og sterilt miljø. Det anbefales at arbejde under et klasse II biosikkerhedsskab (BSC). Sørg for, at handskerne og hvert stykke udstyr, der indføres i BSC, er sterile.
- For at forberede cellerne til cellesortering skal du følge protokollen fra Jaclyn M. Schwarz14.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev et kommercielt tilgængeligt neuralt dissociationssæt (se Table of Materials) anvendt til cellepræparation.- Prøverne kom i et 2 ml centrifugerør med 1 ml HBSS (Ca- og Mg-fri), og centrifuge (300 x g, 2 min, stuetemperatur = RT) og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Tilsæt 1900 μL enzym mix-1 og inkuber det i 15 minutter ved 37 °C, mens rørene omrøres ved inversion hvert 5. minut.
- Tilsæt 30 μL enzym mix-2, omrør forsigtigt med pipette 1 (se tabel over materialer) frem og tilbage 30 gange. Derefter inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C, mens du omrører rørene ved inversion hvert 5. minut.
- Bland forsigtigt frem og tilbage med pipette 2, og pipette 3, inden du inkuberer i 10 minutter ved 37 °C for at adskille vævene.
- Filtrer cellerne med en 80 μm cellesil, tilsæt 10 ml HBSS (Ca- og Mg-fri). Centrifugering (300 x g, 10 min, RT) og fjern supernatanten uden at forstyrre pillen.
- Ved myelinudtømning skal pillen resuspenderes med 400 μL myelinfjernelsesbuffer (se materialetabellen), og derefter tilsættes 100 μL myelinfjernelsesperler (se materialetabel), inden den inkuberes i 15 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 5 ml myelinfjernelsesbuffer, centrifuge (300 x g, 10 min, RT), og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Tilsæt 500 μL myelinfjernelsesbuffer, og anbring røret i magnetfeltsøjlen. Vask søjlen med 1 ml myelinfjernelsesbuffer fire gange.
- Centrifugering (300 x g, 2 min, RT) og fjern supernatanten uden at forstyrre pillen. Vortex kort (2 s) for at dissociere cellerne og tilføje 5 μL Fc blok CD32. Hvirvel igen og inkubere i 5 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 100 μL af blandingen af primære antistoffer af interesse; inkubere i 20 minutter ved 4 °C.
- Centrifugering (350 x g, 5 min, 4 °C) og fjern supernatanten uden at forstyrre pillen. Blot rørene på hovedet på blødt papir.
- Efter en kort hvirvel (2 s) tilsættes 100 μL af den sekundære antistofblanding og inkuberes i 15 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 2 ml myelinfjernelsesbuffer, centrifuge (350 x g, 5 min, 4 °C) og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Blot rørene på hovedet på blødt papir. Resuspend cellerne i 250 μL steril PBS og fortsæt direkte til cellesortering.
10. Cellesortering
- Forbered mikrofugerøret med 500 μL steril PBS til opsamling af de sorterede celler.
- Tilsæt 10 μL Hoechst pr. 1000 μL celleopløsning for at farve kernerne i de levende celler og skelne dem fra de døde celler.
- Cellerne overføres så hurtigt som muligt til cellesorteringsmaskinen ved 4 °C.
- Sorter først cellerne efter spredning fremad og ved siden, og sorter derefter de Hoechst-positive celler. Sorter derefter cellerne baseret på antistofferne af interesse. Saml de positivt farvede celler separat. Sørg for at skelne de positive celler fra de autofluorescerende.
- Tæl antallet af sorterede celler for hver pulje af interesse.
11. Gammatælling
- Kalibrer γ tællesystem med 10 μL af den samme fantomopløsning, der anvendes til SPECT-kalibreringen, men fortynd den i 1 ml vand.
BEMÆRK: Fantomopløsningen fortyndes på grund af den forbedrede præcision af γ tællesystem. - Placer røret med sorterede celler i γ tællesystem, og fortsæt med γ tælling i henhold til producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WT-rotter oplevede in vivo SPECT-scanning med [125I]CLINDE radiotracer efter en ensidig LPS-injektion (figur 2). Denne scanning (ved hjælp af opsummerede data fra billeder af 45-60 min postradiostofinjektion) viste højere binding af [125I]CLINDE på stedet for LPS-injektionen (figur 2A) end i den kontralaterale region i hjernen (figur 2B). Ex vivo-prøverne , der gennemgik FACS-RTT, bekræftede disse resultater og afslørede tilstedeværelsen af et højere antal [125I] CLINDE-bindingssteder kun i microglia, hvilket viste, at den cellulære oprindelse af [125I] CLINDE-signalet i den ipsilaterale side af hjernen var mikroglial (figur 3A)15.
Ved hjælp af den samme [125I] CLINDE radiotracer blev protokollen derefter udført på hippocampus af gamle TgF344-AD rotter (12- og 24 måneder gamle) og sammenlignet med 24 måneder gamle WT. Resultaterne viste, at stigningen i TSPO-binding efter 12 måneder hos TgF344-AD-rotter var begrænset til astrocytter. Hos 24 måneder gamle rotter skyldtes stigningen i TSPO-binding både astrocytiske og mikrogliale ændringer (figur 3B). Resultaterne viste, at TSPO-overekspressionen i astrocytter sandsynligvis observeres før den mikrogliale. Uafhængigt blev denne teknik ved hjælp af radiosporeren [125I]R91150 anvendt i cellulær skala for at vise, at i ældre TgF344-AD-rotter viste striatale astrocytter en nedsat 5HT2AR-tæthed sammenlignet med WT (figur 3C)16.
Endelig blev FACS-RTT udført på humane AD post mortem-prøver. Efter dissociation blev cellerne inkuberet med [125I] CLINDE før farvning og FACS-proceduren. Dette gjorde det muligt at opdage en kortikal overekspression af TSPO i både astrocytter og mikroglia af AD-emner sammenlignet med aldersmatchede kontroller (figur 3D).
Figur 1: Opsætning af SPECT-kamera. (A) SPECT-kameraets samlede præsentation. (B) Sengepræsentation med varmelegeme og overvågning af respirationsfrekvens. (C) Anæstesi rør stik. (D) Varmeseng og åndedrætssondestik. (E) Fantompositioneringsovervågningsvisning fra softwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: TSPO hjernebilleddannelse ved hjælp af SPECT med [125I] CLINDE radiotracer. Repræsentative billeder (45-60 min efter injektion af [125I]CLINDE) af hippocampus efter (A) LPS eller (B) saltvandsinjektion i den ipsilaterale (hvide) og kontralaterale (røde) side af hjernen. In vivo-tidsaktivitetskurver målt i interessevolumen er repræsenteret i højre panel. SPECT: computertomografi med enkeltfotonemission; TSPO: translocatorprotein; LPS: lipopolysaccharid. n = 7 dyr pr. tilstand. Dette tal er blevet modificeret fra Tournier et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af TSPO og 5HT2AR. (A) Cellulær oprindelse af TSPO-overekspression efter en ensidig hjerneinjektion af LPS. Radioaktiviteten blev målt (% injiceret dosis/g væv) i hver cellepopulation i den kontralaterale (grå, n = 7) og den ipsilaterale (grøn, n = 7) side af injektionen. Anvendt statistisk test: parret t-test. (B) TSPO i gammel TgF344-AD rotte. [125I]CLINDE-koncentrationerne (% injiceret dosis/g væv) blev bestemt hos 24 måneder gamle vildtypedyr (grå, n = 9) og hos 12- (grøn, n = 8) og 24 måneder gamle (lilla, n = 7) TgF344- AD-rotter. Statistisk test anvendt: tovejs ANOVA. (C) 5HT2AR er nedsat i astrocytter af striatum hos gamle TgF344-AD rotter. [125I]R91150-koncentrationen blev bestemt i astrocytter og mikroglia på celleniveau (% injiceret dosis/celle) i WT (grå, n = 7) og gamle TgF344-AD (grøn, n = 11) rotter. Statistisk test anvendt: envejs ANOVA. (D) Celle herkomst af TSPO overekspression i frontal cortex i Alzheimers sygdom (AD). I hver cellepopulation måles radioaktiviteten (% injiceret dosis/g væv) hos AD-forsøgspersoner (grøn, n = 9) og kontrol (grå, n = 9). Anvendt statistisk test: uparret t-test. Alle data er repræsenteret som gennemsnitlig ± 95% CI med følgende kommentar: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så vidt vi ved, var denne teknik den første til at beskrive en tilgang, der muliggør en bedre forståelse af in vivo-bindende ændringer af en radiotracer på celleniveau. Protokollen beskriver en multiskala metode til kvantificering af radiotracerbinding på celleniveau ved hjælp af [125I] CLINDE (TSPO) eller [125I] R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknik er robust og følsom nok til præcist at detektere den cellulære oprindelse af et bredt spektrum af gliacelleændringer, der spænder fra en intens inflammatorisk reaktion induceret af LPS til mere subtile gliacelleændringer observeret i en rottemodel af AD, hvilket bringer vigtig komplementær information til in vivo nuklear neuroimaging, som den mikrogliale oprindelse af signalet opnået med SPECT, der blev bestemt. Undersøgelsen viste endvidere, at FACS-RTT endda var i stand til at skelne neuroreceptordensitetsændringer på cellulær skala med eksemplet på 5HT2AR (figur 3C). Endelig blev der fremlagt bevis for anvendelse af teknikken i humant post mortemvæv, der viste en øget TSPO-koncentration i astrocytter og mikroglia af AD-emner.
Den største fordel ved denne teknik er dens komplementaritet med PET- og SPECT-billeddannelse. Faktisk er nuklear billeddannelse en kraftfuld teknik, der kan udtrække information fra en hjerneregion eller voxelniveau. Imidlertid ligger dens grænse på cellulær skala; det er umuligt at skelne mellem hver celletypes bidrag til signalet. FACS-RTT gør det muligt at gå videre ved at afsløre en radiotracerkoncentration i hver celletype. Interessant nok kan der i teorien vurderes et ubegrænset sæt mål med denne teknik, idet begrænsningen er tilgængeligheden af en radiotracer til målet af interesse.
De kritiske trin i protokollen omfatter brugen af radioaktivitet, der skal udføres i et sikkert miljø med kvalificeret personale. Desuden er det afgørende at overveje radioaktivt henfald. Til FACS-forberedelse skal man sikre antistofs specificitet, bølgelængde, lysintensitet, der varierer afhængigt af celletypen og behovsoptimering for effektiv cellesortering.
En af begrænsningerne ved denne teknik, der understreges i de undersøgelser, der præsenteres her, ligger i at bruge ældre dyr og humane post mortem hjerneprøver på grund af autofluorescerende celler. Lipofuscin, dvs. en rest af lysosomal fordøjelse, er fluorescerende og akkumuleres i aldrende neuroner, mikroglia og astrocytter. FACS kan med forudgående optimering skelne autofluorescerende celler fra positivt mærkede, hvilket er et vigtigt skridt, hvis ældre dyr undersøges. En anden begrænsning af teknikken er umuligheden af direkte at sammenligne radiotracerkoncentrationen mellem de forskellige sorterede celletyper på tværs af forskellige dyr. Dette kunne udføres, hvis koncentrationen af de ikke-metaboliserede, ikke-proteinbundne radiotracere i blodet blev overvejet til normalisering på tværs af dyr.
En sidste begrænsning er behovet for, at alt det anvendte udstyr, f.eks. cyklotron, PET/SPECT-kamera, FACS og γ tæller, skal være i tæt fysisk nærhed af hinanden, især hvis der anvendes isotoper med kort halveringstid til in vivo-billeddannelse og FACS-RTT.
FACS-RTT kan også anvendes som en selvstændig tilgang, dvs. ikke nødvendigvis efter en in vivo-undersøgelse af nuklear billeddannelse15. Kompleksiteten af hjernesygdom kræver at studere mekanismer på cellulært niveau eller enkeltcelleskala. FACS-RTT kunne være et translationelt værktøj, der bygger bro mellem in vivo-billeddannelsesmetoder med et stort spektrum af ex vivo - eller in vitro-cellulære og molekylærbiologiske tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (bevilling nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC er støttet af Velux Fonden (projekt n. 1123). Forfatter ST modtog støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipendium) og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
