Summary
Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) er et kraftig verktøy for å studere rollen til 18 kDa translokatorprotein eller Serotonin 5HT2A-reseptoruttrykk i Alzheimers sykdom i cellulær skala. Denne protokollen beskriver ex-vivo-applikasjonen av FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.
Abstract
Glialceller har sannsynligvis en betydelig implikasjon i patofysiologien til nevrodegenerative lidelser, som Alzheimers sykdom (AD). Deres endringer er kanskje forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet for å uttrykke human APP og menneskelige PS1ΔE9-gener , koding for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskudd med aldring. TgF344-AD rottemodellen brukes i denne studien til å evaluere den cellulære opprinnelsen til 18 kDa translokatorprotein (TSPO, en markør for glial celleaktivering) binding, og 5HT2A-reseptoren (5HT2AR) serotoninreseptornivåer som muligens forstyrres i AD. Teknikken som presenteres her er fluorescensaktivert cellesortering til radioligand behandlet vev (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespesifikk teknikk komplementær til in vivo PET eller SPECT eller ex vivo / in vitro autoradiografiteknikker. Den kvantifiserer den samme radiomerkede sporingsenheten som ble brukt før avbildning, ved hjelp av en γ teller etter cytometricellesortering. Dette gjør det mulig å bestemme den cellulære opprinnelsen til det radiomerkede proteinet med høy cellulær spesifisitet og følsomhet. For eksempel viste studier med FACS-RTT at (i) økningen i TSPO-binding var forbundet med mikroglia i en rottemodell av lipopolysakkarid (LPS)-indusert nevroinflammasjon, (ii) en økning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneders var først forbundet med astrocytter, og deretter mikroglia hos TgF344-AD-rotter sammenlignet med villtype (WT) rotter, og (iii) den striatale tettheten på 5HT2A R minker i astrocytter ved 18 måneder i samme rotte AD-modell. Interessant nok kan denne teknikken utvides til nesten alle radiotracers.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD), er preget av et nevronalt tap forbundet med økte symptomer. AD, den vanligste årsaken til demens, som står for 60% -70% av tilfellene, påvirker rundt 50 millioner mennesker over hele verden1. På et nevropatisk nivå er de to viktigste egenskapene til AD akkumulering av ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plakk og intracellulære Tau nevrofibrillære tangles. Glial celle endringer har også vært assosiert med AD2 og mulig forstyrrelse av flere nevrotransmitter systemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er modifisert til modell AD ved å uttrykke human APP og PS1ΔE9 transgenes, noe som fører til løselig og uoppløselig Aβ-40 og Aβ-42 uttrykk og amyloid plakkdannelse5. Det presenterer også akkumulering av hyperfosforrylaterte former for Tau-proteinet som fører til tauopati. Fra en alder av 9-24 måneder utvikler rottene gradvis de patologiske kjennetegnene til AD og en kognitiv svikt 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) og autoradiografi er teknikker basert på utslipp og kvantifisering av γ stråler. Radiotracers kvantifiseres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse sensitive teknikkene har bidratt til forståelsen av mekanismer for flere hjernesykdommer, for eksempel AD. Faktisk, når det gjelder nevroinflammasjon, er det mange studier som vurderer 18 kDa translokatorprotein (TSPO), en in vivo neuroinflammation-markør, med radiomerkede sporstoffer som [11C]-(R)-PK11195 eller [11C]PBR28 (for gjennomgang se10). I tillegg er endringer av nevrotransmittersystemer studert ved hjelp av radiotracers 11,12,13.
Disse teknikkene bestemmer imidlertid ikke den cellulære opprinnelsen til det radioaktive signalet. Dette kan hemme tolkningen av de biologiske understøttelsene av endringen i bindingen av en radioligog i PET/SPECT. For eksempel, når det gjelder TSPO-studier av nevroinflammasjon, er det viktig å forstå om økningen eller reduksjonen av TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale endringer. Fluorescensaktivert cellesortering til radioligandbehandlet vev (FACS-RTT) ble utviklet for å omgå disse problemene, slik at vurderingen av radioligog binding i hver celletype separat og kvantifisering av målproteintetthet per celle. Denne innovative teknikken er følgelig komplementær og svært kompatibel med PET- og SPECT-avbildning.
Her ble denne teknikken brukt langs to akser: studiet av nevroinflammasjon ved hjelp av TSPO-spesifikke radioligander og vurdering av det serotonergiske systemet. På den første aksen var målet å forstå den cellulære opprinnelsen til TSPO-signalet som svar på en akutt inflammatorisk reaksjon. Derfor ble FACS-RTT brukt på hjernevev av rotter etter induksjon av nevroinflammasjon via en lipopolysakkarid (LPS) injeksjon og etter en in vivo [125I]CLINDE SPECT maging studie. Videre ble den samme bilde- og FACS-RTT-protokollen brukt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende villtype (WT) rotter. Den andre aksen hadde som mål å bestemme opprinnelsen til serotoninergiske systemendringer i denne rottemodellen via ex vivo 5-HT2AR tetthetsvurdering etter celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført i samsvar med etikkkomiteen for menneske- og dyreeksperimentering av henholdsvis Kantonen Genève, Kantonalkommisjonen for forskningsetikk (CCER) og den generelle retningen av helsen til kantonen Genève (Sveits). Data rapporteres etter dyreforskning: Rapportering av retningslinjer for in-vivo-eksperimenter (ARRIVE).
1. SPECT-kameraforberedelse og kalibrering
- Slå på kameraet, last inn driftsprogramvaren (se Tabell over materialer). Klikk på Home XYZ Stage-knappen for å utføre homing.
- Sett opp eksperimentet som består av en 10 min skanneanskaffelse. Sett trinnmodusen til Fin og Anskaffelsesmodus til Listmode (for å registrere hele utslippsspekteret).
- Sett opp sengen og sørg for at varmesystemet, pustesensoren og anestesien er funksjonelle og sikre (figur 1A-D). Plasser deretter et fantom (dvs. 2 ml av en kjent konsentrasjon på 125I i et 2 ml mikrofugerør) hvor dyrets hode vil bli plassert (sentrert på området, figur 1E).
- Angi skanneområdet ved å skyve markørene for de tre dimensjonene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen. Forsikre deg om at skannevolumet til fantomet og dyret er det samme.
- Start fantomskanningen for senere kalibrering med parametrene som er angitt i trinn 1.2-1.4.
2. Oppsett av arbeidsområde for SPECT-avbildning
- Rengjør arbeidsområdet med desinfeksjonsmiddel virucide og legg myke papirer på alle overflatene.
- Forsikre deg om at det er nok isofluran og oksygen i sine respektive tanker.
- Forbered et 24 G kateter ved å kutte av finner av sommerfuglkateteret for å ha en klarere utsikt over rottehalevenen.
- Belegge kateteret ved å fylle det helt med heparinoppløsning (25000 U/ml) etter at nålen er fjernet. Sett deretter nålen tilbake i den for å unngå blodproppdannelse etter kateterinnsetting.
3. [125I]CLINDE radiotracer syntese
FORSIKTIG: Radioaktivitet kan ha tilstrekkelig ioniserende energi til å påvirke atomene i levende celler og skade deres genetiske materiale (DNA).
- Sørg for å arbeide i et passende miljø, autorisert for eksperimenter som involverer radioaktivitet.
MERK: Bruk riktig personlig verneutstyr (PVU), for håndtering av radioaktivitet, inkludert finger- og kroppsdosimeter. Prøv å holde deg på trygg avstand fra alle kilder til radioaktivitet. - Inkuber 100 μg sideelvforløper i 100 μL eddiksyre med natriumjodid (Na125I) (se Materialtabell) og 5 μL 37% peracetisk syre ved 70 °C i 20 minutter i en termosirkulerer plassert i en hanskeboks.
- Fortynn reaksjonen ved hjelp av 50 % acetonitril (ACN) i vann for å nå et volum på 500 μL. Injiser 500 μL av den fortynnede reaksjonen på en omvendt fasekolonne (se materialtabellen).
- Isoler [125I]CLINDE med en lineær gradient HPLC-kjøring fra 5%-95% ACN i 7 mM H3PO4 i 10 min. Fortynn isolasjonen i H2O for å oppnå et endelig volum på 10 ml, og injiser deretter den fortynnede reaksjonen på en konsentrasjonskolonne (se Materialtabell).
- Elute [125I]CLINDE fra kolonnen med 300 μL absolutt etanol, og fordamp deretter etanolet ved å inkubere det i en vakuumsentrifuge ved RT i 40 minutter.
- Fortynn restene som inneholder [125I]CLINDE i 300 μL steril saltvann for å lage en lagerløsning.
- Etter å ha målt radioaktiviteten, fortynn lagerløsningen i steril saltvann for å få en løsning på 0,037 MBq i 500 μL.
- Rens traceren ved HPLC (høyytelses væskekromatografi). Bestem elutiontiden ved hjelp av en standardkalibrering på 450 nm, og isoler den enkle radioaktive toppen. Utfør standard kalibreringskurve ved hjelp av syv standardkonsentrasjoner av kald (ikke-radioaktiv) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg og 5 μg i 400 μL av en løsning på 50% ACN). Etablere radiokjemisk renhet ved å måle en enkelt topp i radio TLC (Thin layer chromatography). Forsikre deg om at renheten til radiokjemisk er over 60%.
- Kontroller radioligog måling av ultrafiolett absorbans ved 450 nm og kalibreringskurvene som er etablert med kaldreferanseforbindelser. Påse at den spesifikke aktiviteten er større enn 1000 GBq/μmol.
4. [125I]R91150 radiotracer syntese
MERK: Sørg for å følge de samme sikkerhetsreglene som nevnt i CLINDE-syntesedelen.
- Bland 300 μg R91150 forløper i en løsning på 3 μL absolutt etanol, 3 μL glasial eddiksyre, 15 μL bærerfri Na125I (se Materialtabell) (10 mCi) i 0,05 M NaOH og 3 μL av 30% H2O2. Inkuber i 30 min i en hanskeboks.
- Injiser hele reaksjonen i en omvendt fasekolonne (se Materialtabell).
- Isoler [125I]R91150 ved isokratisk HPLC-kjøring (ACN/vann 50/50, 10 mM eddiksyrebuffer) med en strømningshastighet på 3 ml/min.
- Fortynn [125I]R91150 i H2O for et endelig volum på 10 ml.
- Injiser 10 ml av den fortynnede reaksjonen på en konsentrasjonskolonne (se Materialtabell).
- Elute [125I]R91150 fra kolonnen med 300 μL absolutt etanol.
- Fordamp etanol ved å inkubere det i en vakuum sentrifuge på RT i 40 minutter.
- Fortynn restene som inneholder [125I]R91150 i 300 μL saltvann.
- Rens sporingsenheten av HPLC. Bestem elutiontiden ved hjelp av en standardkalibrering på 450 nm og isoler den enkle radioaktive toppen. Etablere radiokjemisk renhet ved å måle en enkelt topp i radio TLC. Forsikre deg om at renheten til radiokjemisk er over 98%.
5. Dyreforberedelse
- Vei og bedøv TgF344-AD-rotten (mann eller kvinne, fra 2-24 måneder gammel) i et induksjonskammer med 3% isofluran. Når isofluranstrømmen er dypt bedøvet, senkes den til 2 % (0,4 l/min, 100 % O2) i kammeret.
- Plasser dyret på en forvarmet seng utstyrt med en anestesi nosecone. Vedlikehold isofluran ved 2 % (0,4 l/min, 100 % O2).
- Påfør øyegelsmøremiddel i dyrets øyne og bekreft dybden av anestesi via respiratorisk overvåking; justere anestesi om nødvendig.
- Utfør 24 G kateterinnsetting i halevenen.
6. Oppkjøp av SPECT
- Overfør dyret til kamerasengen utstyrt med en temperaturkontrollert varmepute satt til 38 °C (figur 1E).
- Fest dyrets hode på bitebaren og fest hodestøttene.
- Sett opp eksperimentet på en 60 min skanning som utgjør 60 bilder på 1 min. Bruk alle andre parametere som er definert i trinn 1, på nytt. Klikk på Oppdater bilde-knappen for å oppdatere dyreposisjonen.
- Angi skanneområdet ved å skyve markørene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen for de tre dimensjonene.
- Injiser 500 μL av den radioaktive radiotraceren ([125I]CLINDE eller [125I]R91150), og skyll deretter røret med 300 μL steril 0,9% NaCl. Klikk samtidig på Start anskaffelse for å starte skanningen.
- I løpet av skannetiden, sørg for å opprettholde dyret under konstant anestesi med respirasjonshastighetsovervåking. Juster strømmen av isofluran om nødvendig.
- Når skanningen er over, avskyr du raskt det bedøvede dyret ved halshugging.
7. Rekonstruksjon av skanning
- Åpne programvaren for rekonstruksjon av skanning (se Materialfortegnelser), og åpne deretter datasettet, og se etter filen [filnavn].parameters, som er opprettet i mappen for skanningen.
- Velg interesseisotoper. Vær oppmerksom på at Listmode-parameteren tillater valg av flere isotoper på dette trinnet.
- Velg følgende parametere: 0,4 mm Voxel-størrelse, 4 (POS-EM)-delsett, 6 gjentakelser (tilsvarende 24 MB-EM), ikke noe etterfilter og isotopen tilsvarende Decay Correction. Velg utdataformatet til NIfTI, og velg deretter Start SPECT-rekonstruksjon .
8. Rotte hjerneutvinning
- I samme bedøvelseshendelse som skanneprosedyren og etter å ha sikret dyrets dype anestesitilstand ved å overvåke åndedrettsfrekvensen, fortsett til halshugging av giljotin og overfør raskt hodet til disseksjonsbenken.
- Med saks, kutt huden forsiktig på toppen av hodet fra baksiden til forsiden til midten av øynene.
- Klipp av overflødige muskler rundt bunnen av skallen og livmorhalsvirvlene.
- Deretter plasserer du forsiktig ett blad av saksen i hullet på baksiden av skallen, foramen magnum, og fjern den bakre delen av skallen med kirurgiske tanger.
- Deretter, med kirurgisk tang, fjern forsiktig den øverste delen av skallen. Skallen av gamle hannrotter kan være tykk, fjern som små biter for å unngå skade på hjernen.
- Klipp forsiktig meningene med saks. Meninges kan skade hjernen under ekstraksjonsprosessen; fjern den som en forholdsregel.
- Etter å ha fjernet den øverste delen av skallen, snu dyrets hode rundt, og med en liten flat spatel trekker du hjernen forsiktig ut ved å kutte de optiske og trigeminale nervene.
- Overfør hjernen forsiktig til en flat, ren glassoverflate for disseksjon på is.
- Bruk en flat metallspatel og et barberblad for å dissekere hjernens interesseområder. Plasser vevet i et 2 ml sentrifugerør og vei vevet som er oppnådd. Bruk hjerneseksjonen direkte for celleisolering eller frys den raskt i flytende nitrogen til senere bruk.
9. Celleisolasjon
- Sørg for å arbeide i et rent og sterilt miljø. Det anbefales å arbeide under et klasse-II biosikkerhetsskap (BSC). Sørg for at hanskene og alt utstyr som introduseres i BSC er sterile.
- Følg protokollen fra Jaclyn M. Schwarz14 for å klargjøre cellene for cellesortering.
MERK: I dette eksperimentet ble et kommersielt tilgjengelig Neural dissosiasjonssett (se Materialfortegnelse) brukt til celleforberedelse.- Sett prøvene i et 2 ml sentrifugerør med 1 ml HBSS (Ca- og Mg-fri), og sentrifuger deretter (300 x g, 2 min, romtemperatur = RT) og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Tilsett 1900 μL enzymblanding-1 og inkuber den i 15 min ved 37 °C mens du agiterer rørene ved inversjon hver 5.
- Tilsett 30 μL enzymblanding-2, rør forsiktig med pipette 1 (se Materialfortegnelser) frem og tilbake 30 ganger. Deretter inkuberer du i 15 min ved 37 °C mens du agiterer rørene ved inversjon hvert 5.
- Bland forsiktig frem og tilbake med pipette 2, og rør deretter 3 før du inkuberer i 10 min ved 37 °C for å fjerne vevet.
- Filtrer cellene med en 80 μm cellesil, tilsett 10 ml HBSS (Ca- og Mg-fri). Sentrifuge (300 x g, 10 min, RT) og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- For myelintømming, resuspend pellet med 400 μL av myelin fjerning buffer (se Tabell over materialer), og tilsett deretter 100 μL myelin fjerning perler (se Tabell over materialer), før inkubering i 15 min ved 4 °C.
- Tilsett 5 ml myelinfjerningsbuffer, sentrifuge (300 x g, 10 min, RT), og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Tilsett 500 μL myelinfjerningsbuffer og plasser røret i magnetfeltkolonnen. Vask kolonnen med 1 ml myelinfjerningsbuffer fire ganger.
- Sentrifuge (300 x g, 2 min, RT) og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Virvel kort (2 s) for å fjerne cellene og legge til 5 μL av Fc blokk CD32. Virvel igjen og inkuber i 5 min ved 4 °C.
- Tilsett 100 μL av blandingen av primære antistoffer av interesse; inkubere i 20 min ved 4 °C.
- Sentrifuge (350 x g, 5 min, 4 °C) og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Flekk rørene opp-ned på mykt papir.
- Etter en kort virvel (2 s), tilsett 100 μL av den sekundære antistoffblandingen og inkuber i 15 min ved 4 °C.
- Tilsett 2 ml myelinfjerningsbuffer, sentrifuge (350 x g, 5 min, 4 °C) og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Flekk rørene opp-ned på mykt papir. Resuspend cellene i 250 μL steril PBS og fortsett direkte til cellesortering.
10. Cellesortering
- Forbered mikrofugerøret med 500 μL steril PBS for å samle de sorterte cellene.
- Tilsett 10 μL Hoechst per 1000 μL celleløsning for å fargelegge kjernene i levende celler og skille dem fra de døde cellene.
- Overfør cellene så snart som mulig til cellesorteringsmaskinen ved 4 °C.
- Først sorterer du cellene etter fremover- og sidespredning, og deretter sorterer du De positive cellene i Hoechst. Deretter sorterer du cellene basert på interessens antistoffer. Samle de positivt fargede cellene separat. Sørg for å skille de positive cellene fra de autofluorescent.
- Tell antall sorterte celler for hvert interesseutvalg.
11. Gammatelling
- Kalibrer det γ tellesystemet med 10 μL av samme fantomløsning som brukes til SPECT-kalibreringen, men fortynn det i 1 ml vann.
MERK: Fantomløsningen fortynnes på grunn av den forbedrede presisjonen til γ tellesystem. - Plasser røret med sorterte celler i γ tellesystem og fortsett med γ teller i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WT-rotter opplevde in vivo SPECT-skanning med [125I]CLINDE-radiotracer etter en ensidig LPS-injeksjon (figur 2). Denne skanningen (ved hjelp av summerte data fra bilder av 45-60 min post radiotracer injeksjon) viste høyere binding av [125I]CLINDE på stedet for LPS-injeksjonen (figur 2A) enn i hjernens kontralaterale område (figur 2B). Ex vivo-prøvene som gjennomgikk FACS-RTT bekreftet disse resultatene og avslørte tilstedeværelsen av et høyere antall [125I]CLINDE-bindingssteder bare i mikroglia, og viste at den cellulære opprinnelsen til [125I]CLINDE-signalet i den ipsilaterale siden av hjernen var mikroglial (figur 3A)15.
Ved hjelp av den samme [125I]CLINDE-radiotraceren ble protokollen deretter utført på hippocampus av gamle TgF344-AD Rats (12- og 24 måneder gammel) og sammenlignet med 24 måneder gamle WT. Resultatene viste at økningen i TSPO binding ved 12 måneder i TgF344-AD rotter var begrenset til astrocytter. Hos 24 måneder gamle rotter skyldtes økningen i TSPO-binding både astrocytiske og mikrogliale endringer (figur 3B). Resultatene viste at TSPO-overekspressjonen i astrocytter sannsynligvis observeres før den mikrogliale. Uavhengig, ved hjelp av radiotracer [125I]R91150, ble denne teknikken brukt i cellulær skala for å vise at i eldre TgF344-AD rotter viste striatal astrocytter en redusert tetthet på 5HT2AR sammenlignet med WT (figur 3C)16.
Til slutt ble FACS-RTT utført på humane AD post-mortem prøver. Etter dissosiasjon ble cellene inkubert med [125I]CLINDE før farging og FACS-prosedyren. Dette gjorde det mulig å oppdage en kortikale overekspression av TSPO i både astrocytter og mikroglia av AD-forsøkspersoner sammenlignet med alderstilpassede kontroller (figur 3D).
Figur 1: SPECT Camera Set-up. (A) SPECT-kameraets generelle presentasjon. (B) Sengepresentasjon med varmeapparat og respirasjonsfrekvensovervåking. (C) Anestesirørplugger. (D) Varmeseng og respirasjonssondekontakt. (E) Fantom posisjonering overvåking visning fra programvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: TSPO hjerneavbildning ved bruk av SPECT med [125I]CLINDE radiotracer. Representative bilder (45-60 min etter injeksjon av [125I]CLINDE) av hippocampus etter (A) LPS eller (B) saltvannsinjeksjon i den ipsilaterale (hvite) og kontralaterale (røde) siden av hjernen. In vivo tidsaktivitetskurver målt i interessevolumet er representert i høyre panel. SPECT: enkeltfoton utslipp beregnet tomografi; TSPO: translokatorprotein; LPS: lipopolysakkarid. n = 7 dyr per tilstand. Denne figuren er endret fra Tournier et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av TSPO og 5HT2AR. (A) Cellulær opprinnelse av TSPO-overekspression etter en ensidig hjerneinjeksjon av LPS. Radioaktiviteten ble målt (% injisert dose/g vev) i hver cellepopulasjon i den kontralaterale (grå, n = 7) og den ipsilaterale (grønn, n = 7) siden av injeksjonen. Statistisk test brukt: paret t-test. (B) TSPO i gammel TgF344-AD rotte. [125I]CLINDE-konsentrasjonene (% injisert dose/g vev) ble bestemt hos 24 måneder gamle villdyr (grå, n = 9) og i 12- (grønn, n = 8) og 24 måneder gammel (lilla, n = 7) TgF344- AD rotter. Statistisk test brukt: toveis ANOVA. (C) 5HT2AR reduseres i astrocytter av striatum hos gamle TgF344-AD rotter. [125I]R91150-konsentrasjonen ble bestemt i astrocytter og mikroglia på cellenivå (% injisert dose/celle) i WT (grå, n = 7) og gamle TgF344-AD (grønn, n = 11) rotter. Statistisk test brukt: enveis ANOVA. (D) Celle proveniens av TSPO overekspression i frontal cortex i Alzheimers sykdom (AD). I hver cellepopulasjon måles radioaktiviteten (% injisert dose/g vev) hos AD-forsøkspersoner (grønn, n = 9) og kontroll (grå, n = 9). Statistisk test brukt: ubetalt t-test. Alle data representeres som gjennomsnittlige ± 95 % KI med følgende merknad: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så vidt vi vet, var denne teknikken den første til å beskrive en tilnærming som gir en bedre forståelse av in vivo bindende endringer av en radiotracer på cellenivå. Protokollen beskriver en flerskalametode for å kvantifisere radiotracerbinding på cellenivå ved hjelp av [125I]CLINDE (TSPO) eller [125I]R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknikken er robust og følsom nok til å nøyaktig oppdage den cellulære opprinnelsen til et bredt spekter av glialcelleendringer som spenner fra en intens inflammatorisk reaksjon indusert av LPS til mer subtile glialcelleendringer observert i en rottemodell av AD, og bringer viktig komplementær informasjon til in vivo kjernefysisk neuroimaging, som den mikrogliale opprinnelsen til signalet oppnådd med SPECT som ble bestemt. Studien viste videre at FACS-RTT til og med var i stand til å skjelne nevroreseptortetthetsendringer i cellulær skala med eksempelet 5HT2AR (figur 3C). Til slutt ble det gitt bevis for bruk av teknikken i humant post-mortem vev, som viste en økt TSPO-konsentrasjon i astrocytter og mikroglia av AD-forsøkspersoner.
Den største fordelen med denne teknikken er komplementariteten med PET- og SPECT-avbildning. Faktisk er kjernefysisk avbildning en kraftig teknikk som kan trekke ut informasjon fra en hjerneregion eller voxel-nivå. Imidlertid ligger grensen i mobilskalaen; Det er umulig å skille hver celletypes bidrag til signalet. FACS-RTT gjør det mulig å gå videre ved å avsløre en radiotracerkonsentrasjon i hver celletype. Interessant, i teorien, kan et ubegrenset sett med mål vurderes med denne teknikken, begrensningen er tilgjengeligheten av en radiotracer for målet av interesse.
De kritiske trinnene i protokollen inkluderer bruk av radioaktivitet som må utføres i et sikkert miljø med kvalifisert personell. Videre er det avgjørende å vurdere radioaktivt forfall. For FACS-forberedelse må man sikre antistoffspesifikkitet, bølgelengde, lysintensitet som varierer avhengig av celletype og trenger optimalisering for effektiv cellesortering.
En av begrensningene i denne teknikken understreket i studiene som presenteres her, ligger i å bruke eldre dyr og menneskelige post-mortem hjerneprøver på grunn av autofluorescent celler. Lipofuscin, det vil si en rest av lysosomal fordøyelse, er fluorescerende og akkumuleres i aldrende nevroner, mikroglia og astrocytter. FACS kan, med tidligere optimalisering, skille autofluorescerende celler fra positivt merkede, noe som er et viktig skritt hvis eldre dyr studeres. En annen begrensning ved teknikken er umuligheten til å sammenligne radiotracerkonsentrasjonen direkte mellom de forskjellige sorterte celletypene på tvers av forskjellige dyr. Dette kan utføres hvis konsentrasjonen av ikke-metaboliserte, ikke-proteinbundne radiotracers i blod ble vurdert for normalisering på tvers av dyr.
En siste begrensning er behovet for at alt utstyret som brukes, for eksempel syklotron, PET/SPECT-kamera, FACS og γ teller, er i nærheten av hverandre, spesielt hvis isotoper med kort halveringstid brukes til in vivo-avbildning og FACS-RTT.
FACS-RTT kan også brukes som en frittstående tilnærming, det vil si ikke nødvendigvis etter en in vivo kjernefysisk bildebehandlingsstudie15. Kompleksiteten i hjernesykdom krever å studere mekanismer på cellenivå eller encelleskala. FACS-RTT kan være et translasjonsverktøy som bygger bro mellom in vivo-avbildningsmetoder med et stort spekter av ex vivo - eller in vitro-cellulære og molekylærbiologiske tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC støttes av Velux Foundation (prosjekt n. 1123). Forfatter ST fikk støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nei. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipend), og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
