Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle des 18-kDa-Translokatorproteins oder der Serotonin-5HT-2A-Rezeptorexpression bei der Alzheimer-Krankheit auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Ex-vivo-Anwendung von FACS-RTT im Rattenmodell TgF344-AD.
Abstract
Gliazellen haben wahrscheinlich eine erhebliche Bedeutung in der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD). Ihre Veränderungen sind vielleicht mit einem entzündungsfördernden Zustand verbunden. Der Rattenstamm TgF344-AD wurde entwickelt, um menschliche APP- und menschliche PS1ΔE9-Gene zu exprimieren, die für die Amyloidproteine Aβ-40 und Aβ-42 kodieren und Amyloidpathologie und kognitive Defizite mit zunehmendem Alter aufweisen. Das TgF344-AD-Rattenmodell wird in dieser Studie verwendet, um den zellulären Ursprung der Bindung des 18-kDa-Translokatorproteins (TSPO, ein Marker für die Aktivierung von Gliazellen) und der Serotoninrezeptorspiegel des5HT 2A-Rezeptors (5HT2A R) zu bewerten, die möglicherweise bei AD gestört sind. Die hier vorgestellte Technik ist Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), eine quantitative zelltypspezifische Technik, die in vivo PET oder SPECT oder ex vivo/in vitro Autoradiographietechniken ergänzt. Es quantifiziert den gleichen radioaktiv markierten Tracer, der zuvor für die Bildgebung verwendet wurde, unter Verwendung eines γ-Zählers nach der Zellsortierung der Zytometrie. Dies ermöglicht es, den zellulären Ursprung des radioaktiv markierten Proteins mit hoher zellulärer Spezifität und Sensitivität zu bestimmen. Zum Beispiel zeigten Studien mit FACS-RTT, dass (i) die Zunahme der TSPO-Bindung mit Mikroglia in einem Rattenmodell von Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammation assoziiert war, (ii) eine Zunahme der TSPO-Bindung nach 12 und 18 Monaten zuerst mit Astrozyten und dann mit Mikroglia bei den TgF344-AD-Ratten im Vergleich zu Wildtyp-Ratten (WT) assoziiert war, und (iii) die striatale Dichte von 5HT2A R nimmt in Astrozyten nach 18 Monaten im selben Ratten-AD-Modell ab. Interessanterweise kann diese Technik auf praktisch alle Radiotracer ausgedehnt werden.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD) sind durch einen neuronalen Verlust gekennzeichnet, der mit erhöhten Symptomen einhergeht. AD, die häufigste Ursache für Demenz, die 60% -70% der Fälle ausmacht, betrifft weltweit rund 50 Millionen Menschen1. Auf neuropathologischer Ebene sind die beiden Hauptmerkmale von AD die Ansammlung von extrazellulären Amyloid-β (Aβ) -Plaques und intrazellulären Tau-Neurofibrillenverwicklungen. Gliazellveränderungen wurden auch mit AD2 und einer möglichen Störung mehrerer Neurotransmittersysteme in Verbindung gebracht 3,4.
Die TgF344-AD-Rattenlinie wurde modifiziert, um AD zu modellieren, indem humane APP- und PS1ΔE9-Transgene exprimiert wurden, was zu einer löslichen und unlöslichen Aβ-40- und Aβ-42-Expression und Amyloid-Plaquebildungführte 5. Es zeigt auch die Anhäufung von hyperphosphorylierten Formen des Tau-Proteins, die zur Tauopathie führen. Ab dem Alter von 9-24 Monaten entwickeln die Ratten allmählich die pathologischen Merkmale von AD und eine kognitive Beeinträchtigung 5,6,7,8,9.
Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Autoradiographie sind Techniken, die auf der Emission und Quantifizierung von γ Strahlen basieren. Radiotracer werden entweder in vivo (PET und SPECT) oder ex vivo/in vitro (Autoradiographie) quantifiziert. Diese empfindlichen Techniken haben zum Verständnis der Mechanismen verschiedener Gehirnerkrankungen wie AD beigetragen. Tatsächlich gibt es in Bezug auf Neuroinflammation viele Studien, in denen 18 kDa Translocator Protein (TSPO), ein in vivo Neuroinflammation Marker, mit radioaktiv markierten Tracern wie [11 C]-(R)-PK11195 oder [11C]PBR28 bewertet wird (zur Überprüfung siehe 10). Darüber hinaus wurden Veränderungen von Neurotransmittersystemen mit Radiotracern11,12,13 untersucht.
Diese Techniken bestimmen jedoch nicht den zellulären Ursprung des radioaktiven Signals. Dies könnte die Interpretation der biologischen Grundlagen der Veränderung der Bindung eines Radioliganden in PET/SPECT behindern. Im Falle von TSPO-Studien zur Neuroinflammation ist es beispielsweise von größter Bedeutung zu verstehen, ob der Anstieg oder Rückgang des TSPO auf astrozytäre oder mikrogliale Veränderungen zurückzuführen ist. Die FACS-RTT-Technik (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) wurde entwickelt, um diese Probleme zu umgehen und die Beurteilung der Radioligandenbindung in jedem Zelltyp separat und die Quantifizierung der Zielproteindichte pro Zelle zu ermöglichen. Diese innovative Technik ist daher komplementär und hochgradig kompatibel mit PET- und SPECT-Bildgebung.
Hier wurde diese Technik entlang zweier Achsen angewendet: der Untersuchung der Neuroinflammation mit TSPO-spezifischen Radioliganden und der Beurteilung des serotonergen Systems. Auf der ersten Achse ging es darum, den zellulären Ursprung des TSPO-Signals als Reaktion auf eine akute Entzündungsreaktion zu verstehen. Daher wurde FACS-RTT am Hirngewebe von Ratten nach der Induktion einer Neuroinflammation über eine Lipopolysaccharid (LPS) -Injektion und nach einer in vivo [125I]CLINDE SPECT Bildgebungsstudie eingesetzt. Darüber hinaus wurden die gleiche Bildgebung und das FACS-RTT-Protokoll auf 12 und 24 Monate alte TgF344-AD-Ratten und passende Wildtyp-Ratten (WT) angewendet. Die zweite Achse zielte darauf ab, den Ursprung serotoninerger Systemveränderungen in diesem Rattenmodell durch ex vivo 5-HT2AR Dichtebewertung nach Zelltyp zu bestimmen.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden in Absprache mit der Ethikkommission für Menschen- und Tierversuche des Kantons Genf, der Kantonalen Kommission für Forschungsethik (CCER) bzw. der Allgemeinen Gesundheitsdirektion des Kantons Genf (Schweiz) durchgeführt. Die Daten werden gemäß den Richtlinien von Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE) gemeldet.
1. Vorbereitung und Kalibrierung der SPECT-Kamera
- Schalten Sie die Kamera ein, laden Sie die Bediensoftware (siehe Materialverzeichnis). Klicken Sie auf die Schaltfläche Home XYZ Stage , um das Homing durchzuführen.
- Richten Sie das Experiment ein, das aus einer 10-minütigen Scanerfassung besteht. Stellen Sie den Step-Modus auf Fine und den Acquisition-Modus auf den Listmode (um das gesamte Emissionsspektrum aufzuzeichnen).
- Stellen Sie das Bett auf und stellen Sie sicher, dass das Wärmesystem, der Atemsensor und die Anästhesie funktionsfähig und sicher sind (Abbildung 1A-D). Platzieren Sie dann ein Phantom (d. h. 2 ml einer bekannten Konzentration von 125I in einem 2 ml Mikrofugenröhrchen), wo der Kopf des Tieres positioniert wird (zentriert auf dem Bereich, Abbildung 1E).
- Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor für die drei Dimensionen mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms verschieben. Stellen Sie sicher, dass das Scanvolumen des Phantoms und des Tieres gleich ist.
- Starten Sie den Phantomscan für die anschließende Kalibrierung mit den in den Schritten 1.2-1.4 festgelegten Parametern.
2. Einrichtung des Arbeitsbereichs für SPECT-Bildgebung
- Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsvirucid und legen Sie weiche Papiere auf alle Oberflächen.
- Stellen Sie sicher, dass genügend Isofluran und Sauerstoff in den jeweiligen Tanks vorhanden sind.
- Bereiten Sie einen 24-G-Katheter vor, indem Sie die Flossen des Schmetterlingskatheters abschneiden, um eine klarere Sicht auf die Rattenschwanzvene zu erhalten.
- Beschichten Sie den Katheter, indem Sie ihn nach dem Entfernen der Nadel vollständig mit Heparinlösung (25000 E/ml) füllen. Legen Sie dann die Nadel wieder hinein, um die Bildung von Blutgerinnseln nach der Kathetereinführung zu vermeiden.
3. [125I]CLINDE Radiotracer-Synthese
VORSICHT: Radioaktivität kann genügend ionisierende Energie haben, um die Atome der lebenden Zellen zu beeinflussen und ihr genetisches Material (DNA) zu schädigen.
- Stellen Sie sicher, dass Sie in einer geeigneten Umgebung arbeiten, die für Experimente mit Radioaktivität zugelassen ist.
HINWEIS: Tragen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) für die Handhabung der Radioaktivität, einschließlich Finger- und Körperdosimeter. Versuchen Sie, in sicherer Entfernung von jeder Radioaktivitätsquelle zu bleiben. - Inkubieren Sie 100 μg Tributylinvorstufe in 100 μL Essigsäure mit Natriumiodid (Na125I) (siehe Materialtabelle) und 5 μL 37% Peressigsäure bei 70 °C für 20 min in einem Thermocycler, der in einem Handschuhfach positioniert ist.
- Verdünnen Sie die Reaktion mit 50% Acetonitril (ACN) in Wasser, um ein Volumen von 500 μL zu erreichen. Injizieren Sie die 500 μL der verdünnten Reaktion auf eine Umkehrphasensäule (siehe Materialtabelle).
- Isolieren Sie die [125I]CLINDE mit einem linearen Gradienten-HPLC-Lauf von 5%-95% ACN in 7 mMH 3PO4 für 10 min. Verdünnen Sie das Isolat inH2O, um ein Endvolumen von 10 ml zu erreichen, und injizieren Sie dann die verdünnte Reaktion auf eine Konzentrationssäule (siehe Materialtabelle).
- Das [125I]CLINDE wird aus der Säule mit 300 μL absolutem Ethanol elutiert und dann durch Inkubieren in einer Vakuumzentrifuge bei RT für 40 min verdampft.
- Verdünnen Sie den Rückstand, der die [125I]CLINDE enthält, in 300 μL steriler Kochsalzlösung, um eine Stammlösung zu erhalten.
- Nach der Messung der Radioaktivität wird die Stammlösung in steriler Kochsalzlösung verdünnt, um eine Lösung von 0,037 MBq in 500 μL zu erhalten.
- Reinigen Sie den Tracer durch HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie). Bestimmen Sie die Elutionszeit mit einer Standardkalibrierung bei 450 nm und isolieren Sie den einzelnen radioaktiven Peak. Führen Sie die Standardkalibrierungskurve mit sieben Standardkonzentrationen von kaltem (nicht radioaktivem) CLINDE durch (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg und 5 μg in 400 μl einer Lösung von 50% ACN). Stellen Sie die radiochemische Reinheit fest, indem Sie einen einzelnen Peak in der Radio-TLC (Thin Layer Chromatography) messen. Stellen Sie sicher, dass die Reinheit der Radiochemikalie über 60% liegt.
- Überprüfen Sie die spezifische Aktivität des Radioliganden, der die UV-Absorption bei 450 nm misst, und die Kalibrierkurven, die mit kalten Referenzverbindungen erstellt wurden. Stellen Sie sicher, dass die spezifische Aktivität größer als 1000 GBq/μmol ist.
4. [125I]R91150 Radiotracer-Synthese
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die gleichen Sicherheitsregeln befolgen, die im Abschnitt CLINDE-Synthese erwähnt werden.
- 300 μg Vorstufe R91150 in einer Lösung von 3 μL absolutem Ethanol, 3 μL Eisessigsäure, 15 μL trägerfreiem Na 125 I (siehe Materialtabelle) (10 mCi) in 0,05 m NaOH und 3 μL 30%H2O2mischen. Inkubiere für 30 min in einem Handschuhfach.
- Injizieren Sie die gesamte Reaktion in eine Umkehrphasenspalte (siehe Materialtabelle).
- Isolieren Sie [125I]R91150 durch isokratischen HPLC-Lauf (ACN/Wasser 50/50, 10 mM Essigsäurepuffer) mit einer Durchflussrate von 3 ml/min.
- Verdünnen Sie [125I]R91150 in H2O für ein Endvolumen von 10 ml.
- Injizieren Sie 10 ml der verdünnten Reaktion auf eine Konzentrationssäule (siehe Materialtabelle).
- Elute [125I]R91150 aus der Säule mit 300 μL absolutem Ethanol.
- Verdampfen Sie das Ethanol, indem Sie es in einer Vakuumzentrifuge bei RT für 40 min inkubieren.
- Der Rückstand, der [125I]R91150 enthält, wird in 300 μL Kochsalzlösung verdünnt.
- Reinigen Sie den Tracer per HPLC. Bestimmen Sie die Elutionszeit mit einer Standardkalibrierung bei 450 nm und isolieren Sie den einzelnen radioaktiven Peak. Stellen Sie die radiochemische Reinheit fest, indem Sie einen einzelnen Peak in Radio TLC messen. Stellen Sie sicher, dass die Reinheit der Radiochemikalie über 98% liegt.
5. Tierpräparation
- Wiegen und betäuben Sie die TgF344-AD-Ratte (männlich oder weiblich, im Alter von 2-24 Monaten) in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran. Nach der Tiefenbetäubung senken Sie den Isofluranfluss in der Kammer auf 2% (0,4 l / min, 100% O2).
- Positionieren Sie das Tier auf einem vorgewärmten Bett, das mit einem Anästhesie-Nasenkegel ausgestattet ist. Isofluran bei 2% (0,4 l/min, 100%O2) beibehalten.
- Tragen Sie Augengel-Gleitmittel in die Augen des Tieres auf und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Atemüberwachung; Passen Sie die Anästhesie bei Bedarf an.
- Führen Sie die 24 G Kathetereinführung in die Schwanzvene durch.
6. SPECT-Erfassung
- Bringen Sie das Tier auf das Kamerabett, das mit einem temperaturgesteuerten Heizkissen ausgestattet ist, das auf 38 °C eingestellt ist (Abbildung 1E).
- Befestigen Sie den Kopf des Tieres an der Bissstange und befestigen Sie die Kopfstützen.
- Richten Sie das Experiment auf einem 60-minütigen Scan ein, der 60 Bilder von 1 Minute umfasst. Verwenden Sie alle anderen in Schritt 1 eingerichteten Parameter wieder. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bild aktualisieren, um die Tierposition zu aktualisieren .
- Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms für die drei Dimensionen schieben.
- Injizieren Sie 500 μL des radioaktiven Radiotracers ([125I]CLINDE oder [125I]R91150) und spülen Sie dann das Röhrchen mit 300 μL sterilem 0,9% NaCl. Klicken Sie gleichzeitig auf Aufnahme starten, um den Scan zu starten.
- Stellen Sie während der Scanzeit sicher, dass das Tier unter ständiger Narkose mit Überwachung der Atemfrequenz bleibt. Passen Sie den Fluss von Isofluran bei Bedarf an.
- Sobald der Scan abgeschlossen ist, euthanasieren Sie das betäubte Tier schnell durch Enthauptung.
7. Rekonstruktion scannen
- Öffnen Sie die Scan-Rekonstruktionssoftware (siehe Materialtabelle), und öffnen Sie dann den Datensatz, indem Sie nach der Datei [filename].parameters suchen, die im Ordner des Scans erstellt wurde.
- Wählen Sie das gewünschte Isotop aus. Beachten Sie, dass der Parameter Listmode in diesem Schritt die Auswahl mehrerer Isotopen ermöglicht.
- Wählen Sie die folgenden Parameter aus: 0,4 mm Voxelgröße, 4 (POS-EM) Teilmengen, 6 Iterationen (24ME-EM-Äquivalent), kein Nachfilter und die isotopenentsprechende Zerfallskorrektur. Wählen Sie das Ausgabeformat für NIfTI und dann SPECT-Rekonstruktion starten aus.
8. Rattenhirnextraktion
- Im selben Anästhesieereignis wie das Scannen und nachdem der Tiefenanästhesiezustand des Tieres durch Überwachung seiner Atemfrequenz sichergestellt wurde, fahren Sie mit der Enthauptung durch Guillotine fort und bringen Sie den Kopf schnell auf die Dissektionsbank.
- Schneiden Sie mit einer Schere vorsichtig die Haut oben auf dem Kopf von hinten nach vorne bis zur Mitte der Augen.
- Schneiden Sie die überschüssigen Muskeln um die Schädelbasis und die Halswirbel ab.
- Als nächstes legen Sie vorsichtig eine Klinge der Schere in das Loch an der Rückseite des Schädels, das Foramen magnum, und entfernen Sie den hinteren Teil des Schädels mit einer chirurgischen Zange.
- Entfernen Sie dann mit einer chirurgischen Zange vorsichtig den oberen Teil des Schädels. Der Schädel alter männlicher Ratten kann dick sein und als kleine Stücke entfernt werden, um Schäden am Gehirn zu vermeiden.
- Schneiden Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer Schere ab. Hirnhäute können das Gehirn während des Extraktionsprozesses schädigen; Entfernen Sie es vorsichtshalber.
- Nachdem Sie den oberen Teil des Schädels entfernt haben, drehen Sie den Kopf des Tieres um und ziehen Sie mit einem kleinen flachen Spatel vorsichtig das Gehirn heraus, indem Sie die Seh- und Trigeminusnerven durchschneiden.
- Übertragen Sie das Gehirn vorsichtig auf eine flache, saubere Glasoberfläche, um es auf Eis zu sezieren.
- Verwenden Sie einen flachen Metallspatel und eine Rasierklinge, um die interessierenden Regionen des Gehirns zu sezieren. Legen Sie die Gewebe in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen und wiegen Sie das erhaltene Gewebe. Verwenden Sie den Hirnschnitt direkt zur Zellisolierung oder frieren Sie ihn schnell in flüssigem Stickstoff für den späteren Gebrauch ein.
9. Zellisolierung
- Stellen Sie sicher, dass Sie in einer sauberen und sterilen Umgebung arbeiten. Es wird empfohlen, unter einer Biosicherheitskabine (BSC) der Klasse II zu arbeiten. Stellen Sie sicher, dass die Handschuhe und jedes Gerät, das in das BSC eingeführt wird, steril sind.
- Um die Zellen für die Zellsortierung vorzubereiten, folgen Sie dem Protokoll von Jaclyn M. Schwarz14.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein kommerziell erhältliches neuronales Dissoziationskit (siehe Materialtabelle) zur Zellpräparation verwendet.- Geben Sie die Proben in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml HBSS (Ca- und Mg-frei), zentrifugieren Sie dann (300 x g, 2 min, Raumtemperatur = RT) und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Fügen Sie 1900 μL Enzymmix-1 hinzu und inkubieren Sie es für 15 min bei 37 ° C, während Sie die Röhrchen alle 5 Minuten durch Inversion rühren.
- 30 μL Enzymmix-2 zugeben, vorsichtig mit Pipette 1 (siehe Materialtabelle) 30 Mal hin und her rühren. Dann 15 min bei 37 °C inkubieren, während die Röhrchen alle 5 min durch Inversion gerührt werden.
- Mit Pipette 2 vorsichtig hin und her mischen und dann 3 pipettieren, bevor Sie 10 Minuten bei 37 °C inkubieren, um das Gewebe zu dissoziieren.
- Filtern Sie die Zellen mit einem 80 μm Zellsieb, fügen Sie 10 ml HBSS (Ca- und Mg-frei) hinzu. Zentrifugieren (300 x g, 10 min, RT) und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.
- Bei Myelinabbau suspendieren Sie das Pellet mit 400 μL Myelinentfernungspuffer (siehe Materialtabelle) und fügen dann 100 μL Myelinentfernungsperlen hinzu (siehe Materialtabelle), bevor Sie 15 Minuten bei 4 °C inkubieren.
- 5 ml Myelinentfernungspuffer hinzufügen, zentrifugieren (300 x g, 10 min, RT) und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.
- Fügen Sie 500 μL Myelinentfernungspuffer hinzu und legen Sie das Rohr in die Magnetfeldsäule. Waschen Sie die Säule viermal mit 1 ml Myelinentfernungspuffer.
- Zentrifugieren (300 x g, 2 min, RT) und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Wirbeln Sie kurz (2 s) vor, um die Zellen zu dissoziieren und 5 μL Fc-Block CD32 hinzuzufügen. Erneut vorwirbeln und 5 min bei 4 °C inkubieren.
- 100 μL der Mischung der interessierenden primären Antikörper hinzufügen; 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Zentrifugieren (350 x g, 5 min, 4 °C) und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier.
- Nach einem kurzen Wirbel (2 s) 100 μL der sekundären Antikörpermischung zugeben und 15 min bei 4 °C inkubieren.
- 2 ml Myelinentfernungspuffer hinzufügen, zentrifugieren (350 x g, 5 min, 4 °C) und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 μL sterilem PBS und fahren Sie direkt mit der Zellsortierung fort.
10. Zellsortierung
- Bereiten Sie das Mikrofugenröhrchen mit 500 μL sterilem PBS für die Sammlung der sortierten Zellen vor.
- Fügen Sie 10 μL Hoechst pro 1000 μL Zelllösung hinzu, um die Kerne der lebenden Zellen zu färben und sie von den toten Zellen zu unterscheiden.
- Übergeben Sie die Zellen so schnell wie möglich bei 4 °C zur Zellsortiermaschine.
- Sortieren Sie zuerst die Zellen nach Vorwärts- und Seitenstreuung und sortieren Sie dann die Hoechst-positiven Zellen. Als nächstes sortieren Sie die Zellen basierend auf den Antikörpern von Interesse. Sammeln Sie die positiv gefärbten Zellen separat. Achten Sie darauf, die positiven Zellen von den autofluoreszierenden zu unterscheiden.
- Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen für jeden Pool von Interesse.
11. Gamma-Zählung
- Kalibrieren Sie das γ Zählsystem mit 10 μL derselben Phantomlösung, die für die SPECT-Kalibrierung verwendet wurde, aber verdünnen Sie es in 1 ml Wasser.
HINWEIS: Die Phantomlösung wird aufgrund der verbesserten Präzision des γ Zählsystems verdünnt. - Legen Sie das Rohr der sortierten Zellen in das γ Zählsystem und fahren Sie mit der γ Zählung gemäß dem Protokoll des Herstellers fort.
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Representative Results
WT-Ratten erlebten einen vivo SPECT-Scan mit [125I]CLINDE Radiotracer nach einer einseitigen LPS-Injektion (Abbildung 2). Dieser Scan (unter Verwendung summierter Daten aus Bildern von 45-60 min nach der Radiotracer-Injektion) zeigte eine höhere Bindung von [125I]CLINDE an der Stelle der LPS-Injektion (Abbildung 2A) als in der kontralateralen Region des Gehirns (Abbildung 2B). Die Ex-vivo-Proben, die FACS-RTT unterzogen wurden, bestätigten diese Ergebnisse und zeigten das Vorhandensein einer höheren Anzahl von [125 I]CLINDE-Bindungsstellen nur in Mikroglia, was zeigt, dass der zelluläre Ursprung des [125I]CLINDE-Signals auf der ipsilateralen Seite des Gehirns mikroglial war (Abbildung 3A)15.
Mit demselben [125I]CLINDE Radiotracer wurde das Protokoll dann auf dem Hippocampus alter TgF344-AD-Ratten (12 und 24 Monate alt) durchgeführt und mit 24 Monate alten WT verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Anstieg der TSPO-Bindung nach 12 Monaten bei TgF344-AD-Ratten auf Astrozyten beschränkt war. Bei 24 Monate alten Ratten war der Anstieg der TSPO-Bindung sowohl auf astrozytäre als auch auf mikrogliale Veränderungen zurückzuführen (Abbildung 3B). Die Ergebnisse zeigten, dass die TSPO-Überexpression in Astrozyten wahrscheinlich vor der Mikroglia-Überexpression beobachtet wird. Unabhängig davon wurde diese Technik unter Verwendung des Radiotracers [125I]R91150 auf zellulärer Ebene verwendet, um zu zeigen, dass bei älteren TgF344-AD-Ratten striatale Astrozyten im Vergleich zu WT eine verringerte Dichte von 5HT2AR aufwiesen (Abbildung 3C)16.
Schließlich wurde FACS-RTT an humanen AD-Post-mortem-Proben durchgeführt. Nach der Dissoziation wurden die Zellen vor der Färbung und dem FACS-Verfahren mit [125I]CLINDE inkubiert. Dies ermöglichte die Entdeckung einer kortikalen Überexpression von TSPO sowohl in Astrozyten als auch in Mikroglia von AD-Probanden im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen (Abbildung 3D).
Abbildung 1: Einrichtung der SPECT-Kamera. (A) Gesamtpräsentation der SPECT-Kamera. (B) Bettpräsentation mit Heizung und Atemfrequenzüberwachung. (C) Anästhesie-Schlauchstopfen. D) Heizbett und Steckdose für Atemsonden. (E) Phantom-Positionierungsüberwachungsansicht von der Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: TSPO-Bildgebung des Gehirns mit SPECT mit [125I]CLINDE Radiotracer. Repräsentative Bilder (45-60 min nach der Injektion von [125I]CLINDE) des Hippocampus nach (A) LPS oder (B) Kochsalzinjektion in die ipsilaterale (weiße) und kontralaterale (rote) Seite des Gehirns. Im rechten Bereich sind In-vivo-Zeit-Aktivitätskurven dargestellt, die im Volumen von Interesse gemessen werden. SPECT: Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie; TSPO: Translokatorprotein; LPS: Lipopolysaccharid. n = 7 Tiere pro Zustand. Diese Figur wurde von Tournier et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung von TSPO und 5HT2AR. (A) Zellulärer Ursprung der TSPO-Überexpression nach einer einseitigen Hirninjektion von LPS. Die Radioaktivität (% injizierte Dosis/g Gewebe) wurde in jeder Zellpopulation auf der kontralateralen (grau, n = 7) und der ipsilateralen (grünen, n = 7) Seite der Injektion gemessen. Verwendeter statistischer Test: gepaarter t-Test. (B) TSPO in alten TgF344-AD-Ratten. Die [125I]CLINDE-Konzentrationen (% injizierte Dosis/g Gewebe) wurden bei 24 Monate alten Wildtyp-Tieren (grau, n = 9) und bei 12- (grün, n = 8) und 24 Monate alten (violett, n = 7) TgF344- AD-Ratten bestimmt. Verwendeter statistischer Test: Zwei-Wege-ANOVA. (C) 5HT2AR ist in Astrozyten des Striatums bei alten TgF344-AD-Ratten erniedrigt. Die [125I]R91150-Konzentration wurde in Astrozyten und Mikroglia auf zellulärer Ebene (% injizierte Dosis/Zelle) bei WT (grau, n = 7) und alten TgF344-AD (grün, n = 11) Ratten bestimmt. Verwendeter statistischer Test: Einweg-ANOVA. (D) Zellherkunft der TSPO-Überexpression im frontalen Kortex bei der Alzheimer-Krankheit (AD). In jeder Zellpopulation wird die Radioaktivität (% injizierte Dosis/g Gewebe) bei AD-Probanden (grün, n = 9) und Kontrolle (grau, n = 9) gemessen. Verwendeter statistischer Test: ungepaarter t-Test. Alle Daten werden als Mittelwert ± 95% CI mit folgender Anmerkung dargestellt: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Unseres Wissens war diese Technik die erste, die einen Ansatz beschrieb, der ein besseres Verständnis von in vivo bindenden Veränderungen eines Radiotracers auf zellulärer Ebene ermöglicht. Das Protokoll beschreibt eine Multiskalenmethode zur Quantifizierung der Radiotracerbindung auf zellulärer Ebene am Beispiel von [125I]CLINDE (TSPO) oder [125I]R91150 (5HT2AR).
Diese Technik ist robust und empfindlich genug, um den zellulären Ursprung eines breiten Spektrums von Gliazellenveränderungen genau zu erkennen, die von einer intensiven Entzündungsreaktion, die durch LPS induziert wird, bis hin zu subtileren Gliazellenveränderungen, die in einem Rattenmodell von AD beobachtet wurden, reichen und wichtige ergänzende Informationen zur in-vivo-Kernneurobildgebung bringen, als der mikrogliale Ursprung des mit SPECT erhaltenen Signals, das bestimmt wurde. Die Studie zeigte weiter, dass FACS-RTT am Beispiel von 5HT2AR sogar in der Lage war, Veränderungen der Neurorezeptordichte auf zellulärer Ebene zu erkennen (Abbildung 3C). Schließlich wurden Beweise für die Anwendung der Technik in menschlichem Post-mortem-Gewebe vorgelegt, die eine erhöhte TSPO-Konzentration in Astrozyten und Mikroglia von AD-Probanden zeigten.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Komplementarität mit PET- und SPECT-Bildgebung. Tatsächlich ist die nukleare Bildgebung eine leistungsstarke Technik, die Informationen aus einer Gehirnregion oder Voxelebene extrahieren kann. Seine Grenze liegt jedoch auf zellulärer Ebene; Es ist unmöglich, den Beitrag jedes Zelltyps zum Signal zu unterscheiden. FACS-RTT ermöglicht es, weiter zu gehen, indem es eine Radiotracer-Konzentration in jedem Zelltyp aufdeckt. Interessanterweise kann theoretisch eine unbegrenzte Anzahl von Zielen mit dieser Technik bewertet werden, wobei die Einschränkung die Verfügbarkeit eines Radiotracers für das Ziel von Interesse ist.
Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehört die Verwendung von Radioaktivität, die in einer sicheren Umgebung mit qualifiziertem Personal durchgeführt werden muss. Darüber hinaus ist es wichtig, den radioaktiven Zerfall zu berücksichtigen. Für die FACS-Präparation muss man Antikörperspezifität, Wellenlänge und Lichtintensität sicherstellen, die sich je nach Zelltyp unterscheiden und für eine effiziente Zellsortierung optimiert werden müssen.
Eine der Einschränkungen dieser Technik, die in den hier vorgestellten Studien hervorgehoben werden, liegt in der Verwendung von gealterten Tieren und menschlichen postmortalen Gehirnproben aufgrund autofluoreszierender Zellen. Lipofuscin, d.h. ein Rückstand der lysosomalen Verdauung, ist fluoreszierend und reichert sich in alternden Neuronen, Mikroglia und Astrozyten an. FACS kann mit vorheriger Optimierung autofluoreszierende Zellen von positiv markierten unterscheiden, was ein wesentlicher Schritt ist, wenn ältere Tiere untersucht werden. Eine weitere Einschränkung der Technik ist die Unmöglichkeit, die Radiotracer-Konzentration zwischen den verschiedenen sortierten Zelltypen über verschiedene Tiere hinweg direkt zu vergleichen. Dies könnte durchgeführt werden, wenn die Konzentration der nicht metabolisierten, nicht proteingebundenen Radiotracer im Blut für die Normalisierung bei Tieren in Betracht gezogen würde.
Eine letzte Einschränkung ist die Notwendigkeit, dass sich alle verwendeten Geräte, z. B. Zyklotron, PET / SPECT-Kamera, FACS und γ-Zähler, in unmittelbarer physischer Nähe zueinander befinden, insbesondere wenn Isotope mit kurzer Halbwertszeit für In-vivo-Bildgebung und FACS-RTT verwendet werden.
FACS-RTT könnte auch als eigenständiger Ansatz verwendet werden, d. h. nicht unbedingt nach einer In-vivo-Studie zur nuklearen Bildgebung15. Die Komplexität von Hirnerkrankungen erfordert die Untersuchung von Mechanismen auf zellulärer Ebene oder Einzelzellskala. FACS-RTT könnte ein translationales Werkzeug sein, das In-vivo-Bildgebungsansätze mit einem breiten Spektrum von Ex-vivo- oder In-vitro-Zell- und Molekularbiologieansätzen verbindet.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 320030-184713) unterstützt. Die Autoren BBT und KC werden von der Velux Foundation (Projekt Nr. 1123) unterstützt. Autor ST erhielt Unterstützung vom Schweizerischen Nationalfonds (Early Post-Doc Mobility Scholarship, Nr. P2GEP3_191446), die Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus Stipendium) und die Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
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