Summary
本プロトコールは、腹側間脳(Dn)における神経毒性6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)による成体ゼブラフィッシュの脳室内(ICV)注射、およびビデオ追跡ソフトウェアを用いた分析を伴うオープンタンク試験を用いた病変後の遊泳行動の障害およびその後の回復の評価を記載する。
Abstract
パーキンソン病(PD)におけるドーパミン作動性ニューロン喪失を遅らせる現在の治療法の限界は、これらのニューロンを回復させることができる代替療法の必要性を提起する。現在、前臨床in vivoモデルを用いた神経再生の理解を深めるために多くの努力 が払われている 。しかし、自己修復のためのこの再生能力は、哺乳類では非効率的である。したがって、ゼブラフィッシュのような哺乳類以外の動物は、継続的に自己再生する能力と人間との密接な脳相同性を有するため、優れた神経再生モデルとして浮上してきた。 生体内の神経再生に関与する細胞事象の解明の一環として、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)誘導成体ゼブラフィッシュ由来PDモデルを確立しました。これは、ゼブラフィッシュ脳の腹側間脳(Dn)内のドーパミン作動性ニューロン(DpN)を特異的に遮断するために、99.96mM 6-OHDAの最適化された脳室内脳室(ICV)マイクロインジェクションによって達成された。免疫蛍光は、病変後3日目におけるDpNアブレーションの85%以上を示し、病変後30日目におけるDpNの完全な回復を示した。本研究では、移動距離(cm)と平均速度(cm/s)の2つのパラメータを定量化したオープンフィールドテストを用いて、病変後のゼブラフィッシュの遊泳行動の障害とその後の回復を決定した。移動運動は、ビデオ追跡ソフトウェアを用いて各群(n=6)の個々の魚の記録を分析することによって評価された。この知見は、偽物と比較して、病変後3日目の病変ゼブラフィッシュの速度(cm/s)および移動距離(cm)の有意な減少(p <0.0001)を示した。病変したゼブラフィッシュは、病変後30日目に遊泳行動の完全な回復を示した。本知見は、6-OHDA病変成体ゼブラフィッシュがPDにおける神経再生の研究を促進する再現性のある品質を有する優れたモデルであることを示唆している。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、筋肉の硬直、安静時振戦、運動緩慢を特徴とする疾患で、世界で最も急速に成長している神経疾患です1,2。PDのリスクと有病率は、特に50歳以上の個人において、年齢とともに急速に増加する3。PDの病因および病因は、これまでほとんど理解されていないままである。これはしばしばPDの早期発症を未診断のままにしている。現在、PD患者におけるドーパミンの欠乏およびドーパミン作動性ニューロン(DpN)の喪失は、運動症状の発現と強く関連している4。この関係を利用して、いくつかの治療法は、ドーパミン補充(すなわち、レボドパ)として直接作用するか、またはDpNの損失を補う(すなわち、深部脳刺激)ように設計されている。これらの治療法は症候性の利益をもたらしますが、病気の悪化する経過を変更するものではありません5。この重大な弱点に鑑み、細胞補充療法が提案されている。しかしながら、このアプローチの有効性は、移植片調製、細胞増殖制御、および表現型不安定性の課題を考えると矛盾している。倫理的な懸念を提起していた細胞補充療法は、脳腫瘍や望ましくない免疫反応を誘発するリスクも引き起こします6,7。
DpNの再生または神経再生は、新しい治療法としての可能性だけでなく、疾患のメカニズムを理解する手段としても、PDの管理における有望なブレークスルーの1つとして浮上しています。9.このアプローチは、既存の前駆細胞の分化、遊走、および病変回路への統合によるニューロン機能の回復に焦点を当てています10。神経再生をさらに探求するために、様々なin vivo研究が行われている。哺乳類、両生類、爬虫類などの脊椎動物は、傷害後に新しい脳細胞を生成することが判明しました11,12。脊椎動物の間では、哺乳類動物は人間との遺伝的類似性を考えると、より求められています。しかし、哺乳類は中枢神経系(CNS)において限定的で貧弱な修復能力を示し、脳病変後の成人期まで持続する可能性があります13。一般に、哺乳類は、産生されるニューロンの数が少ないとPDで観察された損傷した神経回路を回復させるのに十分ではないことを考えると、神経再生を理解するための動物モデルとしては不向きである。そのため、テレオストベースのモデル、特にゼブラフィッシュでは、その高い増殖速度、継続的に自己再生する能力、および人間との脳の相同性を閉じることで非常に好まれています14,15。
ゼブラフィッシュは、PD16の運動障害を研究するために最も一般的に使用されています。ゼブラフィッシュベースのPDモデルは、通常、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)および6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を含む神経毒によって誘導される17。DpNの特異的損失およびドーパミンレベルの低下を誘導するのに有効であるが、MPTPベースのモデルは、DpN損失がCNS18のみに限定されないため、PDの状態を厳密に模倣しない。6-OHDAが血液脳関門を通過することができないため、筋肉内投与ではなく頭蓋内投与時の脳内の細胞的および機能的変化への影響が制限されていました19。6-OHDAの末梢投与は、神経系全体のドーパミンレベルの世界的な低下を引き起こした20。脳脊髄液への6-OHDAの投与はCNS21全体にわたってDpNのアブレーションを引き起こしたが、これはPDに見られるような状態を模倣せず、それによってDpNの喪失はヒト脳の黒質で特異的に起こる。それどころか、6-OHDAのICV投与は、ゼブラフィッシュ脳における腹側Dnの領域におけるDpNの有意なアブレーションを特異的に誘導し、これは実体nigra22によく似ていた。興味深いことに、DpNの回復は6-OHDA誘発病変の30日後に報告され、これらのニューロンは生涯にわたって生存した23,24。DpNの機能回復は、6-OHDA誘導成体ゼブラフィッシュベースのPDモデルを用いて、移動距離(cm)および平均速度(cm/s)の自発運動評価によって実証された22。
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Protocol
本研究は、マラ大学(UiTM)動物研究倫理委員会(CARE)によって承認されている[参考文献番号:UiTM CARE 346/2021、2021年5月7日付]。
注:6-OHDA病変成体ゼブラフィッシュPDモデルの標準的な飼育および維持のための公開されたプロトコル22,25,26が利用された。実験は、3.2〜3.7cmの標準化された長さを有する生後5ヶ月以上の成体雄ゼブラフィッシュ(Danio rerio)を用いて実施された。
1.ゼブラフィッシュのメンテナンスとICV前のマイクロインジェクション製剤
- 魚を通気水槽に28〜1.0°Cの制御された温度±維持する。 ゼブラフィッシュの飼育と維持管理のために、実験全体を通して市販の海塩(1 g/L)でミネラル化した蒸留水を使用してください27。
- 45 Lタンクあたり最大25匹の魚、または1.8 Lの水あたり1匹の魚を収容し、14時間の光と10時間の暗光周期のスケジュールにさらします。フリーズドライワームを補充した食物ペレットで少なくとも1日2回魚に餌をやる。
- 250mLの蒸留水にMS-22222gおよび炭酸水素ナトリウム5gを溶解して、メタンスルホン酸トリカイン(MS-222)の濃縮原液を調製する。2 mLの原液を希釈して、200 mLの作業麻酔溶液を生成する。
- まず0.2mgのアスコルビン酸を1mLの0.9%w/v滅菌ろ過NaClに溶解して99.96mMの6-OHDAを調製する。溶液に粉末形態の6-OHDA25mgを加える前に、0.2ミクロンフィルターで溶液をろ過する。各注射前に溶液を新鮮に調製し、4°Cで暗所に保存する。
警告: 化学物質を取り扱う際には、適切な個人用保護具(手袋、実験用コート、フェイスマスクなど)を着用し、検査室での適切な練習を実践してください。化学物質のすべての取り扱いは、バイオセーフティキャビネット内で行う必要があります。
2. ゼブラフィッシュの麻酔とICV注射
- 麻酔中の逆流を避けるために、魚を24時間速くします。MS-222溶液の0.01% w/vを含む容器に約1分間、または目に見えるすべての筋肉の動きが止まるまで魚を麻酔します。
- 麻酔をかけた魚を実体顕微鏡下に置いた水浸しのスポンジの上に置き、定期的に魚を濡らします。
- ゼブラフィッシュ脳の前頭頭蓋骨と頭頂頭蓋骨をつなぐメトピー縫合糸(MS)、冠状縫合糸(CS)、矢状縫合糸(SS)の交点に基づいて注射位置を特定する。
- ゼブラフィッシュの頭蓋骨上の特定の解剖学的位置によって導かれる頭蓋骨に鋭い27G針を使用して、1.0mm2領域の小さな穴を開ける(図1A、B)。
- マイクロキャピラリーインジェクタを60°の角度で下げ、ゼブラフィッシュの頭蓋骨の頭蓋屋根から1,200μmの深さに達するまで下げます(図1C)。Z リミットを押して位置を固定します。
- 初期射出圧力を4000hPa、補償圧力を10hPaに設定してください。注入時間を 0.3 秒に設定します。後続の各注入で注入の強度を下げます。
- 0.5 μLの99.96 mM神経毒6-OHDA(または偽対照群の場合は0.9% w/v生理食塩水)を注入し、微小毛細血管を20秒間休ませます。乾燥を防ぐために、注入プロセス全体を通して蒸留水で魚を濡らし続けます。
- ゆっくりとマイクロキャピラリーを取り除き、実行中の蒸留水の下で魚を蘇生させます。魚を隔離された回収タンクに入れ、回復プロセスを妨害する可能性のある気を散らすものを取り除きます。
- 次の注射の前にマイクロキャピラリーをフラッシュして閉塞を解消し、注射の強度が所望の容量の6-OHDAを0.5μL得るのに十分であることを確認する。
図1:神経毒の注射部位、6-OHDA.(A)微小毛細血管進入点は、ゼブラフィッシュ脳の前頭蓋骨と頭頂頭蓋骨をつなぐメトピー縫合糸(MS)、冠状縫合糸(CS)、矢状縫合糸(SS)との交点によって導かれる(平面図)。(b)ゼブラフィッシュの頭蓋骨と脳の模式図(平面図)は、ハベヌラ(Hab)の真上に下降した微小毛細血管と、半球の交点におけるその進入点を示している。(c)ゼブラフィッシュ脳の模式図(矢状部)は、注入角度と浸透深さを示す。黒い点は、標的領域、腹側間脳の上に位置する病変部位を表す。略語:6-OHDA:6-ヒドロキシドーパミン、CS:冠状縫合糸、Dn:間脳、Hab:ハベヌラ、Hyp:視床下部、MS:メトピア縫合糸、OB:嗅球、POA:前視領域、PT:後結核、SS:矢状縫合糸、Tec:tectum、およびTel:テレシンファロン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. 自発運動評価
注:ゼブラフィッシュの自発運動評価(n=6個/群;偽物対病変)は、6-OHDA病変後の3日目および30日目に確立されたプロトコール28、29を用いたオープンタンク試験を介して個別に評価した。
- ビデオ録画
- 壁を白い紙で覆った実験槽(長さ20cm、幅11.5cm、高さ13cm)を、隆起した台の上に置きます(図2A)。
- 光源を使用してタンクを下から照らします。タンクに蒸留水(80%〜90%満杯)を満たし、温度を28±1.0°Cに維持します。 温度計を使用して温度を測定し、市販の水槽ヒーターを使用して温度を調整します。
- 最低2分間の順応後、ビデオカメラを用いて実験場の2次元(2D)平面上の平面図から魚の遊泳行動を5分間記録する(図2B)。記録の前のバッチと最後のバッチの水泳動作の不一致を避けるために、順応を10分30超過しないでください。
- オープンタンクプロトコルを備えたビデオトラッキングソフトウェアを使用してビデオを分析し、各被験者の移動距離(cm)と平均速度(cm/s)を取得します。
図2:ゼブラフィッシュの自発運動挙動を評価するためのオープンタンクテストの実験セットアップ 。 (A)実験タンク(正面図)は、下から照らされた隆起したプラットフォーム上に置かれる。タンクの4つの壁は白い紙で覆われており、録音は軸方向にキャプチャされています。温度は温度計を使用して測定され、市販の水槽ヒーターを使用して28±1.0°Cで調整されます。(B) セットアップを使用してキャプチャされたビデオ録画のスクリーンショット (平面図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- データ解析
- アイコンをダブルクリックしてビデオトラッキングソフトウェアを開きます。[ ファイル ] タブをクリックし、[ 新しい空の実験を作成] を選択します。これにより、ユーザーは調査の目的に応じて実験パラメータをカスタマイズできます。
- [プロトコル]タブをクリックし、[ビデオソース]を選択して、[新しいビデオソースの追加]をクリックします。利用可能なドロップダウンリストをクリックし、[ビデオファイル]オプションを選択します。これにより、目的のビデオ録画を選択できるファイルブラウジングポップアップが表示されます。
- 装置サブタブをクリックし、長方形アイコンを選択して装置を設定します。長方形のアイコンをドラッグして、実験アリーナ全体を覆います。それに応じてスケールバーを設定し、定規セクションの長さで使用されるスケール測定の数値を入力します。本実験では、開放槽試験に10mmスケールを用いた。
- 動物の色を設定する には、「動物は装置の背景よりも暗い」を選択します。トラッキングで使用可能なその他のオプションは、あらかじめ設定されたデフォルト設定のままにします。
- ゾーンサブタブで、以前に描画した装置をクリックします。このゾーンは、すべてのテストで位置が同じである標準ゾーンとして設定されます。
- テストのスケジュールとテスト データ レポートで、[テスト期間]、[合計移動距離]、[平均速度] のオプションを選択します。リスト上の他の利用可能なテストはオプションであり、研究者の調査の関心に依存します。
- [実験] タブで、[名前] セクションにグループ名を入力し、[動物の数] セクションにグループごとの動物数を入力して、テスト グループに従って動物を割り当てます。
- [ テスト] タブに切り替えて、実験を実行します。[ テストの開始] アイコンをクリックし、すべてのビデオが分析されるまで待ちます。
- [ 結果 ]タブで、[レポート の表示] アイコンをクリックして、自発運動データをテキストレポート形式で表示します。
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Representative Results
本実験は、6-OHDAによるICVマイクロインジェクション後の成体のゼブラフィッシュ遊泳行動の変化を評価した。6-OHDAを神経毒として選択した理由は、血液脳関門を通過することができず、関心のある腹側間脳(Dn)の領域でDpNの特異的かつ標的遮断を生じさせたためであった16。ここでのDpN亜集団は、ヒトの黒質パースコンパクト31におけるDpN亜集団と解剖学的に類似している。
我々の以前の研究22に従って、成体ゼブラフィッシュのDpNに対する6-OHDA ICVマイクロインジェクションの細胞効果は、DpNマーカー - チロシンヒドロキシラーゼ(TH)の免疫組織染色によって確認された。関心のある主な脳領域は、視神経前領域(POA)、結核後部(PT)、視床下部(Hyp)からなるDnであった。99.96 mM 6-OHDAは、成体ゼブラフィッシュの生存率を100%にし、DnにおけるTH免疫反応性(TH-ir)の数が最も少ないことが判明した。また、Dn中のTH-ir DpN の85%以上(p<0.01)が病変後3日目にアブレーションされたことも判明した。その後、TH-ir DpNの数は、病変後30日目に完全な再生を達成する前に、病変後14日目に50%以上増加した(図3)。このデータは、アブレーション後の成体ゼブラフィッシュのDnにおけるDpN亜集団の再生能力を支持している32。
図3:99.96 mM 6-OHDAによって病変したゼブラフィッシュのDn領域におけるDpNの再生 (A)Dn領域の3つの主要領域、POA、PT、およびHypにおけるTH-ir DpNの数を、4つのデータポイントにわたって:偽、3、14、および99.96mM 6-OHDA神経毒による病変後30日間。各バーは、n=6回の独立した実験の平均±SDを表す;*p < 0.05(b)偽物の射手切除されたゼブラフィッシュ脳(I、I'、およびI')、病変後3日(II、II'、およびII'')、病変後14日(III、III'、およびIII'')、およびTH(DpN;緑色)およびDAPI(核;青色)で染色された病変後30日(IV、IV'、およびIV')の代表的な共焦点顕微鏡画像。スケールバー = 50 μm。略語- DAPI:4'、6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、6−OHDA:6−ヒドロキシドーパミン、Dn:間脳、DpN:ドーパミン作動性ニューロン、Hyp:視床下部、POA:前視領域、PT:後結核、SD:標準偏差、およびTH−ir:チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性。Vijayanathan et al.22から翻案。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
次に、オープンタンク試験を用いて自発運動評価を行い、6-OHDAと偽物のICVマイクロインジェクション後の成体ゼブラフィッシュの移動距離(cm)と平均速度(cm/s)の変化を調べた。次いで、実験魚を、病変後3日目(観察されたTH−ir DpNの最小数)および病変後30日目(病変部位で報告された完全に回復したDpN)に評価した。ビデオ追跡ソフトウェアを用いたゼブラフィッシュの遊泳行動の分析により、病変後3日目の病変群の平均速度(cm/s)および移動距離(cm)の両方が、偽物と比較して<45%に有意に減少した(p < 0.001)。病変群は病変後30日目に運動機能の回復を示し、偽物と比較した場合、平均速度(cm/s)および移動距離(cm)の両方に有意差はなかった。
図4:6-OHDAによる脳室内注射後の遊泳行動の変化 成体ゼブラフィッシュの遊泳行動を、病変前、病変後3日目および30日目に99.96 mM 6-OHDAにより評価した。評価されたパラメータには、(A)平均速度(cm/s)および(B)移動距離(cm)が含まれていました。各バーは、6匹の魚の平均±SDを表します。p < 0.0001 (スチューデン ト t 検定)。略号:6-OHDA:6-ヒドロキシドーパミン、SD:標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、確立された6-OHDA誘導成体ゼブラフィッシュベースのPDモデルの自発運動評価を首尾よく実証した。実験全体は、ICV前のマイクロインジェクション調製物、ゼブラフィッシュのICVマイクロインジェクション、および自発運動評価の3つの主要なステップを含む。ICVマイクロインジェクション手順と良好な実験結果に続く成体ゼブラフィッシュの健全な回復を確実にするために、本研究では各ステップのためのいくつかの良い実践が推奨されている。
ICVマイクロインジェクション前の調製:動物選択は、実験の前日に最もよく行われた。性別を特定し、魚の長さを測定した。標準化された長さ3.2〜3.7cmの雄成体ゼブラフィッシュを別の実験槽に入れた。さらに、魚は麻酔中の逆流を避けるために24時間の絶食期間を受けるべきです33。外側のストレスを軽減し、ゼブラフィッシュの回復プロセスを助けるために、実験の前に、立っている水槽を備えた水槽(白い紙で覆われた4つの壁を持つ)を準備する必要があります。すべての化学物質は、時間の経過とともに急速に劣化し、室温で不安定になる可能性があるため、各実験の開始前に新鮮に調製されました34,35。
6-OHDAのマイクロインジェクション:ゼブラフィッシュの清潔で穏やかな取り扱いは、魚への不必要な傷害および感染の導入を防ぐために、プロセス全体を通して行われるべきである。魚は濡れたスポンジの上に置き、乾燥を避けるために湿った状態に保つべきです36。ゼブラフィッシュの頭蓋骨をひび割れる可能性のある余分な圧力を避けるために、しっかりとした適切な力を持つ滅菌針を使用して小さな切開が行われました。この切開は、脳腔への微小毛細血管の侵入を可能にするはずである。その後、マイクロキャピラリーを、2つの半球(間脳とテクタム)の間にあるエントリポイントから1,200μmの深さまで下げました(図1B、C)。エントリーポイントは、ニューロンのさらなる裂傷を防ぐために、これらの半球の間で選択された37。この技術はマイクロインジェクターの使用を伴い、送達の圧力およびタイミングは、0.5μLの神経毒の送達を確実にするために較正されるべきである。この校正は、ろ紙38上に形成された液滴の大きさを測定することにより行うことができる。私たちの実践は、通常、その後の各射出で射出の強度を低下させるプログラム可能なパラメータの以下の設定(射出圧力:4000hPa、射出持続時間:0.3秒、および補償圧力:10hPa)を含む。神経毒が脳腔外に漏れるのを避けるために、微小毛細血管35の注射と撤退の間に20秒間隔を適用した。毛細血管のサイズが小さいため、マイクロキャピラリーは各注射後にブロックされ得る。そのため、マイクロキャピラリーは、閉塞を解消し、注射の強度が0.5μLの所望の容量の6-OHDAを生じるのに十分であることを保証するために、次の注射の前に本質的にフラッシュされるべきである。その後、魚は28±1.0°Cに維持された回収タンクに移されます。 魚が30秒以内に回復しない場合は、筋肉の動きの完全な回復が起こるまで、蒸留水でそのえらと口を洗い流してください。
自発運動評価:6-OHDA誘導成体ゼブラフィッシュの良好な自発運動評価を確実にするために、行動研究は各時点について同じ時間枠内で実施されるべきである。各行動研究は、最低2分間の順応期間を可能にし、4時間39分以内に実施されるべきである。本実験は、ゼブラフィッシュがこの期間により活発であったため、早朝の午前8時から午後12時までに実施された40。ゼブラフィッシュがストレスや不安の明確な兆候(凍結や不規則な行動)を伴う異常な行動を示す場合、より長い順応期間が必要です41。ただし、記録の以前のバッチと最後のバッチの水泳動作の不一致を避けるために、順応は10分30を超えてはなりません。オープンフィールドテストでは、あらゆるサイズ、色、形状、質感の実験タンクを使用して、最低5〜30分の範囲の録音に使用することができます42,43。ゼブラフィッシュの行動は、周囲の温度に大きく影響されます。4°Cを超える小さな変動は、遊泳速度に大きな影響を与える可能性があります44。そのため、実験槽内の水温は業務用ヒーターを用いて28±1.0°Cの制御温度に厳密に維持し、水位は実験中12cm程度の深さに保たれた。タンクの壁は、被験者と実験アリーナとの間のコントラストを作り出し、被験者からの促されない反応を引き起こす可能性のある外部刺激を低減するために、白い紙で覆われていた45。各群の魚を、ゼブラフィッシュの神経行動研究のための現在の標準的な慣行に従って個別に試験した23,37,46。ゼブラフィッシュの社会的相互作用への傾向を考えると、テスト期間中の孤立が彼らの行動に影響を与えるかもしれないという懸念があります47。しかし、現在の実験セットアップは1試行あたり最大10分に制限されており、この短期間の単離は成体のゼブラフィッシュの自発運動活動に何の影響も及ぼさないことが判明した48。行動研究のための正確なデータ収集を提供するために、評価は、オープンタンクテスト中に、異なる実験群からゼブラフィッシュを無作為に選択することによって(すなわち、偽および6−OHDA病変群のいずれかからn=6まで2匹のゼブラフィッシュを交互に)実施した49。記録されたビデオは、げっ歯類の行動追跡に一般的に使用されるビデオ追跡システムを使用して分析された。ゼブラフィッシュは新興の動物モデルであるため、ゼブラフィッシュを使用して実施される行動試験は、通常、げっ歯類に関する確立された科学文献から適応されています50。ここでは、ビデオトラッキングソフトウェアが実験分野でゼブラフィッシュを自動的に追跡し、目的のパラメータを効果的に計算する能力を実証しました。ビデオトラッキングソフトウェアは、ソフトウェアでサポートされているビデオファイルの多様性、定期的なアップデートパッケージのリリース、およびさまざまなオペレーティングシステムに提供されるサポートにより、他の利用可能なソフトウェアよりも際立っていました51。
既存の動物ベースのPDモデルの限界の1つは、ヒト脳の黒質パースコンパクタにおけるドーパミン作動性ニューロン喪失後に観察される運動障害を模倣する機構的類似性の欠如である52。しかし、成体のゼブラフィッシュベースのPDモデルの出現は、この特定の制限に対処し得る。本研究で観察されたように、遊泳速度の低下は、病変後3日目の6-OHDA誘導成体ゼブラフィッシュモデルの腹側間脳における85%以上のドーパミン作動性ニューロン喪失という我々の以前の細胞所見に対応していた22。この関心領域におけるドーパミン作動性ニューロンの特異的アブレーションは、脳からの下降運動シグナル伝達を妨害し、運動の遅さを引き起こすために必要であると思われる53。例えば、 視蓋骨(侵入点)で6-OHDAのICV注射を行ったL. J. Caldwellら23は、ゼブラフィッシュの群れ形成および交配行動の変化のみを観察した。腹側DnにおけるDpNのアブレーションは、成体ゼブラフィッシュのDnにおけるDpNの集団がゼブラフィッシュ運動ニューロンの唯一のドーパミン源として作用するので極めて重要である。これは人間の実体ニグラ54に似ています。本研究はまた、病変後の時点において、病変したゼブラフィッシュによるより速い遊泳速度およびより長い距離の移動を観察し、ゼブラフィッシュの遊泳行動を支配するドーパミンシグナル伝達の継続的かつ最終的な完全な回復を示した。したがって、これらの知見は、新たに再生されたドーパミン作動性ニューロンが、病変した成体ゼブラフィッシュにおいて機能的活性を取り戻す能力を検証した。
6-OHDAの現在の適用経路は、腹側Dnの病変領域に向かって、脳の奥深くにマイクロキャピラリーを挿入することを必要とするわずかに侵襲的な注射パラダイムを含んでいた。この方法は、末梢注射と比較してわずかに面倒であり、注射後の死亡リスクを低減するために、魚1匹あたり3分以内に行う必要がある。そのため、ICV注入の事前実施は、標的領域(Dn)における臨界持続時間内に本方法が実施され得ることを保証するために必要とされる。成体ゼブラフィッシュの有効な自発運動評価を達成するために、オープンタンク試験は1日あたりわずか4時間の評価期間に制限されています。したがって、多数の動物を含む実験フレームワークでは事前計画が必要であり、それによってセットアップが各記録の最小要件(例えば、温度および水深)を満たすことを保証するために余分な時間を割り当てるべきである。この計画は、現在の研究のような時間ベースの実験では、各記録を意図した時点に実行する必要があるため、特に重要です。現在の実験セットアップは、ゼブラフィッシュの運動機能を特異的に評価する2つの水泳パラメータの研究に限定された。しかし、浅瀬や不安に似た行動などの他の行動パラメータには、他の実験セットアップと異なる分析方法が必要でした。要約すると、これは、PDに対する細胞置換治療戦略に重要な洞察をもたらす可能性がある6-OHDA誘導成体ゼブラフィッシュにおけるDpN神経再生プロセスを研究するための再現性があり有用な方法である。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、マレーシア高等教育省の基盤研究助成スキーム[600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)]の支援を受けたものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | - | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
References
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