Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lokomotorisk vurdering av 6-hydroksydopaminindusert voksen sebrafiskbasert Parkinsons sykdomsmodell

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Den nåværende protokollen beskriver intracerebroventricular (ICV) injeksjon av voksen sebrafisk med nevrotoksisk 6-hydroksydopamin (6-OHDA) ved ventral diencephalon (Dn) og vurdering av svekkelse og påfølgende gjenoppretting av svømmeadferd postlesion ved hjelp av åpen tank test, som er ledsaget av analyse ved hjelp av en videosporing programvare.

Abstract

Begrensningene ved nåværende behandlinger i å forsinke dopaminerge nevronale tap i Parkinsons sykdom (PD) øker behovet for alternative terapier som kan gjenopprette disse nevronene. Mye innsats er for tiden rettet mot en bedre forståelse av nevroregistrering ved hjelp av prekliniske in vivo-modeller . Denne regenerative evnen til selvreparasjon er imidlertid ineffektiv hos pattedyr. Ikke-pattedyr dyr som sebrafisk har dermed dukket opp som en utmerket nevroregenerativ modell på grunn av sin evne til kontinuerlig selvfornyelse og ha en nær hjerne homologi til mennesker. Som en del av arbeidet med å belyse cellulære hendelser involvert i nevroregistrering in vivo, har vi etablert den 6-hydroksydopamin (6-OHDA)-induserte voksen sebrafiskbaserte PD-modellen. Dette ble oppnådd gjennom optimalisert intracerebroventricular (ICV) mikroinjeksjon på 99,96 mM 6-OHDA for å spesifikt fyre opp dopaminerge nevroner (DpN) i ventral diencephalon (Dn) av sebrafiskhjernen. Immunfluorescens indikerte mer enn 85% av DpN-ablasjon på dag tre postlesion og full restaurering av DpN på lesjonert sted 30 dager etter etterlesning. Den nåværende studien bestemte svekkelse og påfølgende utvinning av sebrafisk svømmeadferd etter lesjon ved å bruke den åpne felttesten der to parametere, tilbakelagt avstand (cm) og gjennomsnittlig hastighet (cm / s), ble kvantifisert. Bevegelse ble vurdert ved å analysere opptakene av individuell fisk i hver gruppe (n = 6) ved hjelp av videosporingsprogramvare. Funnene viste en signifikant (p < 0,0001) reduksjon i hastighet (cm/s) og tilbakelagt avstand (cm) av lesjonert sebrafisk 3 dager etter selesion sammenlignet med sham. Den lesjonerte sebrafisken viste full gjenoppretting av svømmeadferd 30 dager etter fordøyelsen. De nåværende funnene tyder på at 6-OHDA lesjonert voksen sebrafisk er en utmerket modell med reproduserbar kvalitet for å lette studiet av nevroregistrering i PD. Fremtidige studier på mekanismene som ligger til grunn for nevroregistrering samt iboende og ekstrinsiske faktorer som modulerer prosessen, kan gi viktig innsikt i nye celleerstatningsbehandlingsstrategier mot PD.

Introduction

Parkinsons sykdom (PD), en sykdom som er karakteristisk preget av muskelstivhet, hvilende skjelving og bradykinesi, er den raskest voksende nevrologiske sykdommen i verden1,2. Risikoen og utbredelsen av PD øker raskt med alderen, spesielt hos personer over 50 år. Etiologien og patogenesen av PD hittil forblir dårlig forstått. Dette har ofte etterlatt tidlig start av PD udiagnostisert. For tiden er mangelen på dopamin og tap av dopaminerge nevroner (DpN) hos PD-pasienter sterkt knyttet til manifestasjon av motoriske symptomer4. Ved å utnytte dette forholdet er flere behandlinger designet enten for å fungere direkte som dopaminerstatning (dvs. levodopa) eller for å kompensere for tap av DpN (dvs. dyp hjernestimulering). Selv om disse behandlingene gir symptomatiske fordeler, endrer de ikke det forverrede sykdomsforløpet5. I lys av denne betydelige svakheten er celleerstatningsterapi foreslått. Effekten av denne tilnærmingen er imidlertid inkonsekvent gitt utfordringene med graftforberedelse, cellevekstkontroll og fenotype ustabilitet. Celleerstatningsterapi, som hadde reist etiske bekymringer, utgjør også risikoen for å indusere hjernesvulster og uønskede immunreaksjoner6,7.

Begrensningene i dagens terapeutiske strategier har ført til større vekt på regenerering av DpN som en potensiell tilnærming til behandling av PD. Regenerering av DpN eller nevroregistrering har dukket opp som et av de lovende gjennombruddene i ledelsen av PD, ikke bare på grunn av potensialet som en ny terapeutisk metode, men også som et middel til å forstå sykdomsmekanismen8, 9. Denne tilnærmingen fokuserer på restaurering av nevronfunksjon gjennom differensiering, migrasjon og integrasjon av eksisterende stamceller i lesjonerte kretser10. For å utforske nevroregistreringen ytterligere, har ulike in vivo-studier blitt gjennomført. Det ble funnet at vertebrater som pattedyr, amfibier og reptiler genererer nye hjerneceller etter skade11,12. Blant vertebratene er pattedyr dyrere ettertraktet gitt deres genetiske likhet med mennesker. Pattedyr har imidlertid begrenset og dårlig reparativ kapasitet i sentralnervesystemet (CNS) som kan vare gjennom voksen alder etter en hjernelesjon13. Generelt er pattedyr uegnet som dyremodeller for å forstå nevroregistrering gitt at det lave antallet produserte nevroner ikke vil være tilstrekkelig til å gjenopprette skadede nevrale kretser observert i PD. Som sådan er den teleostbaserte modellen, spesielt i sebrafisk, sterkt favorisert for sin høye proliferative hastighet, evne til kontinuerlig selvfornyelse og nær hjerne homologi med mennesker14,15.

Sebrafisk brukes oftest til å studere uorden i PD16. Den sebrafiskbaserte PD-modellen er vanligvis indusert av nevrotoksiner, som inkluderer 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) og 6-hydroksydopamin (6-OHDA)17. Selv om mptp-baserte modeller er effektive for å indusere spesifikt tap av DpN og reduksjon av dopaminnivåer, etterligner ikke MPTP-baserte modeller betingelsene for PD nøye, da DpN-tapet ikke bare er begrenset til CNS18. Manglende evne til 6-OHDA å krysse blod-hjernebarrieren begrenset effekten på cellulære og funksjonelle endringer i hjernen når den administreres intracranially i motsetning til intramuskulært19. Perifer administrering av 6-OHDA forårsaket en global reduksjon av dopaminnivåer i hele nervesystemet20. Mens administrering av 6-OHDA i cerebrospinalvæsken forårsaket ablasjon av DpN gjennom CNS21, som ikke etterligner tilstanden som sett i PD, hvorved tapet av DpN oppstår spesielt ved substantia nigra i den menneskelige hjerne. ICV administrasjon av 6-OHDA, tvert imot, spesielt indusert betydelig ablasjon av DpN i området ventral Dn i sebrafisk hjernen, som nært lignet substantia nigra22. Interessant nok ble utvinning av DpN rapportert 30 dager etter 6-OHDA-indusert lesjon, og disse nevronene overlevde i løpet av livet23,24. Den funksjonelle utvinningen av DpN ble demonstrert gjennom en lokomotorisk vurdering av tilbakelagt avstand (cm) og gjennomsnittlig hastighet (cm/s) ved hjelp av den 6-OHDA-induserte voksen sebrafiskbaserte PD-modellen22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nåværende studien er godkjent av Komiteen for dyreforskning og etikk (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referansenr.: UiTM CARE 346/2021, datert 7. mai 2021].

MERK: De publiserte protokollene22,25,26 for standard husdyrhold og vedlikehold av den 6-OHDA-leioned voksen sebrafisk PD-modellen ble brukt. Eksperimenter ble utført med voksen mannlig sebrafisk (Danio rerio) i alderen mer enn fem måneder gammel med en standardisert lengde på 3,2-3,7 cm.

1. Sebrafiskvedlikehold og pre-ICV mikroinjeksjonspreparater

  1. Vedlikehold fisken i en vanntank under en kontrollert temperatur på 28 ± 1,0 °C. For sebrafiskhold og vedlikehold, bruk destillert vann mineralisert med kommersielt havsalt (1 g/L) gjennom hele eksperimentet27.
  2. Hus maksimalt 25 fisk per 45 L tank eller en fisk per 1,8 L vann og utsett dem for en tidsplan på 14 timers lys og 10 timers mørk fotoperiod. Fôr fisken minst to ganger per dag med matpellets supplert med frysetørkede ormer.
  3. Forbered en konsentrert lagerløsning av trikainmetansulfat (MS-222) ved å oppløse 2,5 g MS-222 og 5 g natriumbikarbonat i 250 ml destillert vann. Fortynn 2 ml lagerløsning for å produsere 200 ml arbeidsbedøvelsesløsning.
  4. Forbered 99,96 mM 6-OHDA ved først å oppløse 0,2 mg askorbinsyre i 1 ml 0,9 % m/v sterilfiltrert NaCl. Filtrer oppløsningen med 0,2 mikron filter før tilsetning av 25 mg 6-OHDA i pulverform i oppløsningen. Forbered oppløsningen frisk før hver injeksjon og oppbevar den i mørket ved 4 °C.
    FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr (dvs. hansker, laboratoriebelegg og munnbind) og øv god laboratoriepraksis ved håndtering av kjemikaliene. Alle håndteringer av kjemikaliene skal gjøres i et biosikkerhetsskap.

2. Anestesi og ICV injeksjon av sebrafisk

  1. Spol fisken i 24 timer for å unngå oppblåsthet under anestesi. Bedøv fisken ved å nedsenke den i en beholder som inneholder 0,01% m/v MS-222-oppløsning i ca. 1 min eller til all synlig muskelbevegelse opphører.
  2. Plasser den bedøvede fisken på en vann-gjennomvåt svamp plassert under et stereomikroskop og våt fisken regelmessig.
  3. Identifiser injeksjonsposisjonen basert på skjæringspunktet mellom den metopiske suturen (MS), koronal sutur (CS) og sagittal sutur (SS) som forbinder frontal- og parietalskallen i sebrafiskhjernen.
  4. Lag et lite hull på 1,0 mm2 område ved hjelp av en skarp 27 G nål i skallen styrt av den spesifikke anatomiske posisjonen på sebrafiskskallen (figur 1A, B).
  5. Senk mikrokapillærinjektoren i en 60° vinkel til den når en dybde på 1200 μm fra kranialtaket på sebrafiskskallen (figur 1C). Trykk på Z-grensen for å fikse posisjonen.
  6. Sett det første injeksjonstrykket til 4000 hPa og kompensasjonstrykket til 10 hPa. Sett injeksjonsvarigheten til 0,3 s. Senk injeksjonsintensiteten med hver etterfølgende injeksjon.
  7. Injiser 0,5 μL 99,96 mM nevrotoksin 6-OHDA (eller 0,9% m/v saltvann for sham control group) og la mikrokapillær hvile i 20 s. Fortsett å våte fisken med destillert vann gjennom hele injeksjonsprosessen for å forhindre uttørking.
  8. Fjern mikrokapselen langsomt og gjenoppliv fisken under rennende destillert vann. Plasser fisken i en isolert utvinningstank og fjern eventuelle distraksjoner som potensielt kan forstyrre gjenopprettingsprosessen.
  9. Skyll mikrokapselen før neste injeksjon for å fjerne blokkeringen og sikre at injeksjonsintensiteten er tilstrekkelig til å gi ønsket volum på 0,5 μL 6-OHDA.

Figure 1
Figur 1: Injeksjonssted for nevrotoksin, 6-OHDA. (A) Punktet for mikrokapillær oppføring styres av skjæringspunktet mellom metopisk sutur (MS), koronal sutur (CS) og sagittal sutur (SS) som forbinder frontal og parietal skallen i sebrafiskhjernen (planvisning). (B) En skjematisk tegning (planvisning) av sebrafiskskallen og hjernen viser mikrokapillæren, som senkes rett over habenulaen (Hab), og inngangspunktet i skjæringspunktet mellom halvkule. (C) En skjematisk tegning (sagittal del) av sebrafiskhjernen viser injeksjonsvinkelen og penetrasjonsdybden. Den svarte prikken representerer det lesjonerte stedet som ligger over det målrettede området, ventral diencephalon. Forkortelser: 6-OHDA: 6-hydroksydopamin, CS: coronal sutur, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: metopisk sutur, OB: olfaktorisk pære, POA: preoptisk område, PT: bakre tuberculum, SS: sagittal sutur, Tec: tectum og Tel: telenon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Lokomotorisk vurdering

MERK: Lokomotorisk vurdering av sebrafisk (n = seks / gruppe; sham vs lesjonert) ble vurdert individuelt via åpen tanktest ved hjelp av etablerte protokoller28,29 på dag tre og dag 30 post-6-OHDA lesjon.

  1. Videoinnspilling
    1. Plasser den eksperimentelle tanken (lengde 20 cm, bredde 11,5 cm, høyde 13 cm) med veggene dekket med hvitt papir på en hevet plattform (figur 2A).
    2. Lys tanken fra bunnen ved hjelp av en lyskilde. Fyll tanken med destillert vann (80% -90% full) og opprettholde temperaturen ved 28 ± 1,0 °C. Mål temperaturen ved hjelp av et termometer og reguler det ved hjelp av en kommersiell akvariumvarmer.
    3. Etter minst 2 min akklimatisering, registrer fiskens svømmeadferd fra en planvisning på det 2-dimensjonale (2D) planet på den eksperimentelle arenaen ved hjelp av et videokamera i 5 min (figur 2B). For å unngå inkonsekvens i svømmeadferden til den tidligere og den siste batchen av opptak, må du ikke overskride akklimatiseringen med 10 min30.
    4. Analyser videoene ved hjelp av videosporingsprogramvare med åpen tankprotokoll for oppkjøp av tilbakelagt avstand (cm) og gjennomsnittlig hastighet (cm /s) for hvert emne.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentelt oppsett av en åpen tanktest for vurdering av sebrafisk lokomotorisk oppførsel. (A) Den eksperimentelle tanken (sett forfra) er plassert på en hevet plattform som er opplyst nedenfra. Tankens fire vegger er dekket med hvitt papir og opptakene er fanget aksialt. Temperaturen måles ved hjelp av et termometer og reguleres ved 28 ± 1,0 °C ved hjelp av en kommersiell akvariumvarmer. (B) Skjermbilde (planvisning) av videoopptak som er tatt opp ved hjelp av oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Dataanalyse
    1. Dobbeltklikk på ikonet for å åpne videosporingsprogramvaren. Klikk kategorien Fil , og velg Opprett nytt tomt eksperiment. Dette vil tillate brukeren å tilpasse eksperimentparametrene i henhold til målene for undersøkelsen.
    2. Klikk på Protokoll-fanen , velg Videokilder, og klikk på Legg til ny videokilde. Klikk på den tilgjengelige rullegardinlisten og velg videofilalternativet . Dette vil be om at popup-vinduet for filsurfing som videoopptakene av interesse kan velges fra.
    3. Klikk på underfanen Apparat og velg rektangulært ikon for å sette opp apparatet. Dra det rektangulære ikonet for å dekke hele den eksperimentelle arenaen. Angi skalalinjen tilsvarende, og skriv inn den numeriske verdien for skaleringsmålet som brukes i lengden på linjaldelen. Det nåværende eksperimentet brukte en 10 mm skala for åpen tanktest.
    4. Angi dyrefarge ved å velge Dyrene er mørkere enn apparatbakgrunnen. La de andre tilgjengelige alternativene i Sporing være de forhåndsinnstilte standardinnstillingene.
    5. I underfanen Soner klikker du på det tidligere tegnede apparatet. Denne sonen er angitt som standardsonen der posisjonen er den samme for alle tester.
    6. Velg følgende alternativer under testplanlegging og testdatarapport: Testvarighet, Total tilbakelagt distanse og Gjennomsnittlig hastighet. Andre tilgjengelige tester på listen er valgfrie og avhengige av forskerens undersøkende interesse.
    7. I kategorien Eksperiment tilordner du dyrene i henhold til testgruppen ved å skrive inn gruppenavnet under Navn-delen og antall dyr per gruppe i Antall dyr-delen .
    8. Bytt til Tester-fanen for å kjøre eksperimentet. Klikk på Start test-ikonet og vent til alle videoene er analysert.
    9. I kategorien Resultater klikker du vis rapportikonet for å vise de lokomotoriske dataene i tekstrapportskjemaet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det nåværende eksperimentet vurderte endringene i voksen sebrafisk svømmeatferd etter ICV mikroinjeksjon med 6-OHDA. Årsaken til å bruke 6-OHDA som det valgte nevrotoksinet var på grunn av manglende evne til å krysse blod-hjernebarrieren, som produserte spesifikk og målrettet ablasjon av DpN innen interesse-ventral diencephalon (Dn)16. DpN-subpopulasjonen her har anatomisk likhet med DpN-subpopulasjonen i menneskets substantia nigra pars compacta31.

I henhold til vårt tidligere arbeid22 ble den cellulære effekten av 6-OHDA ICV mikroinjeksjon mot DpN av voksen sebrafisk bekreftet gjennom immunhistostaining av DpN-markør-tyrosinhydroksylase (TH). Den viktigste hjerneregionen av interesse var Dn, som består av det preoptiske området (POA), bakre tuberculum (PT) og hypothalamus (Hyp). Det ble funnet at 99,96 mM 6-OHDA resulterte i en 100% overlevelsesrate for den voksne sebrafisken med det laveste antallet TH-immunoreaktive (TH-ir) i Dn. Det ble også funnet at mer enn 85% (p < 0,01) av TH-ir DpN i Dn ble ablated på dag tre postlesion. Antallet TH-ir DpN økte deretter med mer enn 50% på dag 14 postlesion før det oppnådde full regenerering 30 dagers etterlesning (figur 3). Disse dataene støtter regenerative evner av DpN subpopulation i Dn av voksen sebrafisk etter ablation32.

Figure 3
Figur 3: Regenerering av DpN i Dn-regionen av sebrafisk lesjonert med 99,96 mM 6-OHDA. (A) Antall TH-ir DpN i tre hovedområder i Dn-regionen, POA, PT og Hyp, over fire datapunkter: sham, 3, 14 og 30 dager etter lesjon med 99,96 mM 6-OHDA nevrotoksin. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± SD på n = 6 uavhengige eksperimenter; *p < 0,05. (B) Representative konfokale mikroskopbilder av sagittalt seksjonert sebrafiskhjerne av sham (I, I', og jeg'),3 dager etter lesjon (II, II', og II''), 14 dager etter lesjon (III, III', og III''), og 30 dager etter lesjon (IV, IV', og IV'') farget med TH (DpN; grønn) og DAPI (nuclei; blå). Skalastang = 50 μm. Forkortelser- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-fenylindol, 6-OHDA: 6-hydroksydopamin, Dn: diencephalon, DpN: dopaminerge nevroner, Hyp: hypothalamus, POA: preoptisk område, PT: bakre tuberkulum, SD: standardavvik, og TH-ir: tyrosinhydroksylase immunaseaktiv. Tilpasset fra Vijayanathan et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi utførte deretter lokomotorisk vurdering ved hjelp av åpen tanktest for å undersøke endringer i tilbakelagt avstand (cm) og gjennomsnittlig hastighet (cm/s) av voksen sebrafisk etter ICV mikroinjeksjon av 6-OHDA og sham. Eksperimentell fisk ble deretter vurdert på dag tre postlesion (minst antall TH-ir DpN observert) og dag 30 postlesion (fullstendig restaurert DpN rapportert på lesjonsstedet). Analyse av sebrafisksvømmingsatferd ved hjelp av en videosporingsprogramvare indikerte at både gjennomsnittshastigheten (cm/s) og tilbakelagt distanse (cm) av den lesjonerte gruppen på dag tre postlesion ble betydelig redusert (p < 0,001) til <45% sammenlignet med sham (figur 4). Den lesjonerte gruppen viste gjenvinning av motorisk funksjon 30 dagers etterlesning uten signifikant forskjell både gjennomsnittshastighet (cm/s) og tilbakelagt distanse (cm) sammenlignet med sham.

Figure 4
Figur 4: Endringer i svømmeatferd etter intrarebroventrikulær injeksjon med 6-OHDA. Svømmeadferd hos voksen sebrafisk ble vurdert før lesjon, på dag tre og dag 30 postlesion med 99,96 mM 6-OHDA. Parametere som ble vurdert inkludert: (A) gjennomsnittlig hastighet (cm/s) og (B) tilbakelagt distanse (cm). Hver bar representerer gjennomsnittlig ± SD på seks fisk; p < 0.0001 (Student t-test). Forkortelser: 6-OHDA: 6-hydroksydopamin, SD: standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nåværende arbeidet demonstrerte vellykket den lokomotoriske vurderingen av den etablerte 6-OHDA-induserte, voksne sebrafiskbaserte PD-modellen. Hele eksperimentet involverte tre hovedtrinn: pre-ICV mikroinjeksjonspreparater, ICV mikroinjeksjon av sebrafisk og lokomotorisk vurdering. For å sikre sunn utvinning av voksen sebrafisk etter ICV mikroinjeksjonsprosedyren og godt eksperimentelt utfall, har noen gode praksiser for hvert trinn blitt anbefalt i den nåværende studien.

Pre-ICV mikroinjeksjonsforberedelse: Dyrevalg ble best utført dagen før eksperimentet. Kjønnet ble identifisert og lengden på fisken ble målt. Mannlig voksen sebrafisk med en standardisert lengde på 3,2-3,7 cm ble plassert i en separat eksperimentell tank. I tillegg bør fisken gjennomgå 24 timers fastetid for å unngå oppblåsthet under anestesi33. En fisketank (med sine fire vegger dekket med hvitt papir) med en stående vanntank satt opp, bør utarbeides før eksperimentet for å redusere utvendig stress og hjelpe gjenopprettingsprosessen til sebrafisken. Alle kjemikalier ble tilberedt rett før starten av hvert eksperiment, da de kunne forverres raskt over tid og bli ustabile ved romtemperatur34,35.

Mikroinjeksjon av 6-OHDA: Ren og skånsom håndtering av sebrafisk bør utføres gjennom hele prosessen for å forhindre innføring av unødvendig skade og infeksjon til fisken. Fisken skal plasseres på toppen av en våt svamp og holdes i fuktig tilstand for å unngå å tørke ut36. Et lite snitt ble gjort ved hjelp av en steril nål med fast og passende kraft for å unngå ekstra trykk som kan knekke sebrafiskskallen. Dette snittet bør tillate innføring av mikrokapillæren i hjernehulen. Mikrokapselen ble deretter senket til en dybde på 1200 μm fra inngangspunktet, som er mellom to halvkule - telencephalon og tectum (figur 1B, C). Inngangspunktet ble valgt mellom disse halvkule for å forhindre ytterligere kutt av nevroner37. Denne teknikken involverte bruk av en mikroinjektor, trykket og tidspunktet for leveransen bør kalibreres for å sikre levering av 0,5 μL nevrotoksin. Denne kalibreringen kan utføres ved å måle størrelsen på dråpen som dannes på filterpapiret38. Vår praksis involverte vanligvis følgende oppsett av programmerbare parametere der injeksjonsintensiteten ble senket med hver påfølgende injeksjon (injeksjonstrykk: 4000 hPa, injeksjonsvarighet: 0,3 s og kompensasjonstrykk: 10 hPa). For å unngå at nevrotoksinet lekker ut av hjernehulen, ble det brukt et intervall på 20 s mellom injeksjon og tilbaketrekking av mikrokapillæren35. På grunn av den lille størrelsen på kapillæren kan mikrokapillæren blokkeres etter hver injeksjon. Som sådan bør mikrokapselen i hovedsak skylles før neste injeksjon for å fjerne blokkeringen og sikre at injeksjonsintensiteten er tilstrekkelig til å gi ønsket volum på 0,5 μL 6-OHDA. Fisken skulle deretter overføres til en utvinningstank opprettholdt ved 28 ± 1,0 °C. Hvis fisken ikke klarer å gjenopprette innen 30 s, skyll ut gjell og munn med destillert vann til full gjenoppretting av muskelbevegelser oppstår.

Locomotorisk vurdering: For å sikre god lokomotorisk vurdering av 6-OHDA-indusert voksen sebrafisk, bør atferdsstudien gjennomføres innenfor samme tidsramme for hvert tidspunkt. Hver atferdsstudie bør tillate minst 2 min akklimatiseringsperiode og bør utføres innen 4 h39. Det nåværende eksperimentet ble utført tidlig om morgenen mellom kl. 08.00 og 12.00, da sebrafisk var mer aktiv i denne perioden40. En lengre akklimatiseringsperiode er nødvendig hvis sebrafisk viser unormal oppførsel med klare tegn på stress og angst (frysing og uberegnelig oppførsel)41. For å unngå inkonsekvens i svømmeadferden til den tidligere og den siste batchen av opptak, bør akklimatiseringen imidlertid ikke overstige 10 min30. For testen av det åpne feltet kan en eksperimentell tank av hvilken som helst størrelse, farge, form og tekstur brukes til opptak som varierer fra minimum 5 til 30 min42,43. Sebrafiskadferd er sterkt påvirket av temperaturen i omgivelsene. Små svingninger på mer enn 4 °C kan ha stor innvirkning på svømmehastigheten44. Derfor bør temperaturen på vann i den eksperimentelle tanken opprettholdes strengt under en kontrollert temperatur på 28 ± 1,0 °C ved hjelp av en kommersiell varmeapparat, og vannstanden ble holdt rundt 12 cm dyp gjennom hele eksperimentet. Tankens vegger var dekket med hvitt papir for å skape kontrast mellom testpersonen og eksperimentell arena, samt for å redusere ytre stimuli som kan forårsake en ubeskyttet reaksjon fra testpersoner45. Fisken fra hver gruppe ble testet individuelt i henhold til gjeldende standardpraksis for sebrafisk nevrobehavioural forskning23,37,46. Gitt sebrafiskens tilbøyelighet til sosiale interaksjoner, er det bekymring for at isolasjon i testperioden kan påvirke deres oppførsel47. Imidlertid var det nåværende eksperimentelle oppsettet begrenset til maksimalt 10 minutter per studie, og denne korte isolasjonsperioden ble funnet å ikke ha noen effekt på den lokomotoriske aktiviteten til voksen sebrafisk48. For å gi nøyaktig datainnsamling for atferdsstudien ble vurderingen utført ved å tilfeldig velge sebrafisk fra forskjellige eksperimentelle grupper (dvs. vekslende to sebrafisk fra enten sham og 6-OHDA lesjonert gruppe til n = 6) under åpen tanktest49. De innspilte videoene ble analysert ved hjelp av et videosporingssystem som ofte brukes til gnagernes atferdssporing. Siden sebrafisk er en fremvoksende dyremodell, er atferdstestene utført ved hjelp av sebrafisk vanligvis tilpasset fra den etablerte vitenskapelige litteraturen om gnagere50. Her demonstrerte vi videosporingsprogramvarens evne til automatisk å spore sebrafisk på den eksperimentelle arenaen og effektivt beregne de ønskede parametrene. Videosporingsprogramvaren skilte seg ut fra den andre tilgjengelige programvaren på grunn av forskjellige videofiler som støttes av programvaren, vanlige oppdateringspakkeutgivelser og støtte som tilbys for forskjellige operativsystemer51.

En av begrensningene ved eksisterende dyrebaserte PD-modeller er mangelen på mekanistiske likheter som etterligner motorisk svekkelse som observert etter dopaminerge nevrontap i substantia nigra pars compacta i den menneskelige hjerne52. Fremveksten av den voksne sebrafiskbaserte PD-modellen kan imidlertid adressere denne spesielle begrensningen. Som observert i den nåværende studien, den reduserte svømmehastigheten korresponderte med våre tidligere cellulære funn der mer enn 85% dopaminerge nevronale tap i ventral diencephalon av 6-OHDA-indusert voksen sebrafisk modell tre dager etter etterlesning22. Det ser ut til at spesifikk ablasjon av dopaminerge nevroner på dette interesseområdet er nødvendig for å forstyrre den synkende motorsignaleringen fra hjernen, noe som forårsaker treghet i bevegelse53. L. J. Caldwell, et al.23 som utførte ICV-injeksjon av 6-OHDA ved det optiske tectum (inngangspunkt), observerte for eksempel bare endringer i sebrafisk shoaling og parringsadferd. Ablasjon av DpN i ventral Dn er avgjørende da befolkningen i DpN i Dn av voksen sebrafisk fungerer som den eneste dopaminkilden for sebrafiskmotornevroner. Dette er analogt med den menneskelige substantia nigra54. Den nåværende studien observerte også raskere svømmehastighet og lengre avstand reist av lesjonert sebrafisk i senere postlesjonstidspunkter, noe som indikerer fortsatt og til slutt full restaurering av dopaminsignalering som styrer sebrafisksvømmingsadferd. Disse funnene validerte dermed evnen til nylig regenererte dopaminerge nevroner i å gjenvinne sine funksjonelle aktiviteter i lesjonert voksen sebrafisk.

Den nåværende applikasjonsruten til 6-OHDA involverte et litt invasivt injeksjonsparadigme som krevde innsetting av mikrokapillær dypt inn i hjernen, mot lesjonsområdet til ventral Dn. Denne metoden er litt arbeidskrevende sammenlignet med perifer injeksjon og må utføres innen 3 min per fisk for å redusere risikoen for dødelighet etter injeksjon. Som sådan er det nødvendig med tidligere praksis med ICV-injeksjon for å sikre at metoden kan utføres innen den kritiske varigheten på det målrettede området (Dn). For å oppnå en gyldig lokomotorisk vurdering av voksen sebrafisk, er den åpne tanktesten begrenset til bare 4 timers vurderingsperiode per dag. Derfor er det nødvendig med forhåndsplanlegging i et eksperimentelt rammeverk som involverer et stort antall dyr der det skal tildeles ekstra tid for å sikre at oppsettet oppfyller minimumskravene for hver registrering (f.eks. temperatur og vanndybde). Denne planleggingen er spesielt avgjørende i tidsbaserte eksperimenter som for den nåværende studien, da hver registrering må utføres på det tiltenkte tidspunktet. Det nåværende eksperimentelle oppsettet var begrenset til studiet av to svømmeparametere som spesifikt vurderte sebrafiskmotorfunksjonen. Andre atferdsparametere som shoaling og angstlignende oppførsel krevde imidlertid andre eksperimentelle oppsett og forskjellige analytiske metoder. Oppsummert er dette en reproduserbar og nyttig metode for å studere DpN nevroregistreringsprosessen i 6-OHDA-indusert voksen sebrafisk som kan gi viktig innsikt i celleerstatningsbehandlingsstrategier mot PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Departementet for høyere utdanning Malaysia under Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

Tags

Nevrovitenskap utgave 178
Lokomotorisk vurdering av 6-hydroksydopaminindusert voksen sebrafiskbasert Parkinsons sykdomsmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter