Summary
彗星测定是检测DNA损伤的常用方法。本研究描述了一种在彗星测定的代表性变体中运行载玻片的方法。这种方法显著增加了样品数量，同时减少了分析运行时间、玻片操作次数和凝胶损坏风险。
Abstract
细胞不断暴露于来自内部和外部环境产生的物质中，这可能会破坏DNA。这种损伤会导致细胞功能异常，因此DNA损伤可能在可想象的所有主要人类疾病的发展中发挥关键作用，例如癌症，神经退行性疾病和心血管疾病以及衰老。单细胞凝胶电泳（即彗星测定）是研究体 外 和 体内 各种类型DNA损伤（例如单链和双链断裂、碱不稳定位点、DNA-DNA交联以及与某些修复酶、氧化嘌呤和嘧啶）的形成和修复的最常见和最灵敏的方法之一 系统。然而，传统检测方法的低样品通量和费力的样品后处理是其最广泛应用的限制因素。随着彗星的“评分”越来越自动化，现在的限制是处理大量彗星幻灯片的能力。在这里，已经开发出彗星测定（HTP 彗星测定）的高通量（HTP）变体，它显着增加了分析的样品数量，减少了分析运行时间，减少了单个载玻片操作的次数，试剂要求以及对凝胶的物理损坏风险。此外，由于载玻片的垂直方向和整体冷却，电泳槽的占地面积显着减小。这里还报道了一种冷却彗星测定载玻片的新方法，该方法方便有效地促进了彗星凝胶的固化。这里，已经描述了这些装置在代表性彗星测定方法中的应用。这些简单的创新极大地支持了彗星测定的使用及其在研究领域的应用，如暴露生物学、生态毒理学、生物监测、毒性筛查/测试，以及了解发病机制。
Introduction
细胞不断暴露于来自内部和外部环境的物质中，这些物质会破坏DNA1，2。这种损伤会导致细胞功能异常3，因此DNA损伤可能在许多主要人类疾病的发展中起关键作用，例如癌症，神经退行性和心血管疾病以及衰老4。彗星测定（也称为单细胞凝胶电泳）是一种越来越流行的检测和量化细胞DNA损伤的方法。
简单来说，碱性彗星测定（ACA）检测链断裂（SB;单链和双链），以及嘧啶/无嘧啶位点和碱不稳定位点（ALS），两者在碱性条件下都变成单链断裂5。中性pH彗星测定可以评估坦率的单链和双链断裂6。此外，ACA与许多DNA修复酶相结合，可以检测相当多的DNA损伤类型，例如氧化嘌呤（通过使用人8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1鉴定;hOGG17）;氧化嘧啶（使用核酸内切酶III;EndoIII）和环丁烷嘧啶二聚体（使用T4核酸内切酶V;T4endoV）8.彗星测定也可用于评估由交联剂（例如顺铂9，10，11）诱导的DNA损伤。如测定的正式名称（即单细胞凝胶电泳）所示，该测定依赖于所分析的细胞是单细胞悬浮液;最常见的是，这些是培养细胞，但可以从全血中分离12，13，或者可以使用全血本身14，15。或者，可以从实体组织产生单细胞悬液。
除了少数例外，最值得注意的是Engleward实验室16的CometChip报告，整个彗星测定方案与该测定的发明者最初描述的方案没有显着变化（Östling和Johansson17 和Singh等人18）。彗星测定涉及许多步骤（图1）。其中许多步骤涉及转移含有细胞的琼脂糖凝胶，一次一张载玻片，因此存在凝胶损坏或丢失的风险，危及实验的成功。因此，彗星测定可能非常耗时，尤其是在运行大量载玻片的情况下。通常，在大型（33 cm x 59 cm x 9 cm）电泳槽中最多运行40张载玻片，该电泳槽位于包含用于冷却的湿冰的更大托盘中。最近有报道称，通过减少裂解步骤的持续时间并且在染色19之前不干燥载玻片，可以将测定运行时间缩短至1天。
本文作者先前报道了一种高通量碱性彗星测定（HTP ACA）的新方法，其中可以在整个彗星测定过程中同时操作多个（25批次）彗星测定显微镜载片20，21，22。这种专利方法无需单独操作显微镜载玻片，从而最大限度地降低了含样品凝胶损坏或丢失的风险，并且可以应用于使用显微镜载玻片的彗星测定的所有变体。含玻片的载玻片架可在操作过程中保护凝胶，因此样品处理更快、更高效。载玻片也可以在架子上进行电泳，保持垂直而不是水平方向。这种整体冷却可显著减少电泳槽的占地面积，并消除了对湿冰的需求。综上所述，这代表了对传统程序的重大改进。所使用的设备如图2所示。这里描述的方案，使用这种新方法，展示了培养细胞和全血14在检测碱不稳定位点（ALS），DNA链间交联（ICL）和各种DNA修复酶底物中的代表性应用。
Protocol
本研究使用了市售血液样本。在我们的机构，使用市售血液不需要机构审查委员会的批准。
1. 彗星测定材料的制备
- 显微镜载玻片的制备
- 将1%（w / v）正常熔点琼脂糖[溶解在双蒸水（ddH 2 O）中]倒入50 mL管中，并微波将琼脂糖溶解在ddH2O中。如果发生凝固，请丢弃并准备新鲜。
- 通过将载玻片浸入含有 1% （w/v） 正常熔点琼脂糖的 50 mL 管中，对显微镜载玻片进行预涂。
- 浸渍幻灯片后快速擦拭幻灯片的背面。
注意：在显微镜分析步骤中，未能正确擦拭载玻片背面会增加载玻片的背景噪音。 - 在磨砂部分的右下角用永久性标记标记涂层载玻片（图3A）。这显示了载玻片的哪一侧是预涂的。
- 让琼脂糖凝固并在室温下干燥过夜。
- 将干燥的载玻片包裹在薄纸中并存放在盒子中。
2. 样品的制备
- 培养细胞
注意：首先，在开始彗星测定之前用破坏剂处理细胞。然后，执行以下操作。- 如果细胞贴壁，则在适当的细胞汇合处对细胞进行胰蛋白酶消化，以将其从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中释放出来。通过添加含血清的培养基来中和胰蛋白酶。
- 将细胞转移到 50 mL 管中，离心（例如，对于 HaCaTs，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟），轻轻除去上清液，并向细胞沉淀中加入 1 mL PBS。
- 进行细胞计数。
- 将30，000个细胞转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以7，607× g 离心5分钟。
- 在进行彗星测定之前，轻轻除去上清液并将细胞沉淀储存在黑暗中的冰上。
注意：在进行彗星测定之前，应定期测试细胞的支原体污染，以防止形成人工DNA损伤和改变的DNA损伤反应，如其他地方报道的那样23。离心条件可根据需要使用改变，具体取决于所使用的细胞类型。
- 制备用于修复测定的培养细胞
- 在细胞培养瓶或培养皿中培养细胞。
- 在用损伤剂处理细胞之前，用 1 mL PBS 洗涤细胞两次（例如，对于 BE-M17 细胞，用 50 μM H 2 O2处理 20 分钟）在冰上以防止在处理过程中发生修复。
- 用 1 mL PBS 轻轻清洗细胞两次，以去除任何残留的有害物质。
- 重新引入细胞培养基，并让细胞在加湿培养箱（37°C，5%CO 2）中修复不同的持续时间（例如，0分钟，30分钟，2小时，6小时，24小时和30小时）。
- 在每个时间点，在含有10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养基中收集30，000个细胞，并将其储存在-80°C。
- 在进行彗星测定之前，在水浴中以37°C快速解冻细胞，并在4°C下以7，607× g 离心5分钟。
- 在进行测定之前，除去上清液并将细胞沉淀储存在冰上（即，从步骤3开始）。
- 全血制备
注意：以下方法受益于（i）是获取血液样本的微创方法，（ii）在彗星测定之前不需要分离PBMC，以及（iii）允许血液样品（体积<250μL）在-80°C下储存长达1个月（尽管最近的证据表明可以保存更长时间）， 无需冷冻保存剂，无风险或人为损害形成14.在从患者或动物身上获取血液样本之前，可能需要获得伦理批准或同等批准。或者，市售的血液样品可以如本研究一样使用。在我们的机构，使用市售血液不需要机构审查委员会的批准。- 使用移液器将全血样品（<250 μL）（材料表）转移到含有最小体积的收集管中，该收集管含有0.4 mg EDTA（每250 μL血液）。
- 在进行HTP彗星测定之前，将血液样品冷冻在-80°C。
- 在室温下解冻储存的血液样品（<250μL），无需加热。
- 在进行彗星测定之前，将 5 μL 全血转移到微量离心管中（参见步骤 3）。
3. 细胞裂解
注意：在冰上执行所有程序。
- 每块凝胶使用 12，000 个细胞或 2.5 μL 全血。
- 使用微波制备溶解在PBS中的0.6%（w / v）低熔点琼脂糖，并置于37°C的水浴中以防止其凝固。
- 使用永久性记号笔或铅笔在预涂布载玻片的磨砂端标记研究者的姓名、日期和治疗信息。
- 将冷却板放在平坦的工作台上，然后将两个冷冻冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中（如图 4所示）21。
- 将载玻片放在冷却板上，让载玻片预冷1-2分钟，然后加入含0.6%（w / v）的低熔点琼脂糖细胞（步骤3.7）。
注意：由于环境湿度，将载玻片放在冷却板上超过 1-2 分钟可能会导致载玻片表面形成冷凝。这可能导致低熔点琼脂糖凝胶在载玻片上的稳定性降低。 - 通过涡旋分散沉淀（步骤2.2.7）。确保已从沉淀中除去所有上清液。将样品管（包含沉淀细胞）立即放回冰上。
注意：将含样品的试管放入离心机时，将它们的铰链朝外放置，以便将沉淀收集在试管的这一侧。有时很难看到沉淀，并且在去除上清液时很容易将其移开。用管盖以这个方向离心将使人知道细胞沉淀的位置。 - 用 200 μL 0.6% 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）重悬细胞沉淀，并通过上下移液混合而不会产生气泡。接下来，快速将 80 μL 含 LMP 琼脂糖的细胞转移到冷却载玻片上，并快速将盖玻片放在凝胶上。
- 让凝胶在冷却板上凝固1-2分钟。
- 同时，制备500 mL裂解缓冲液的工作溶液（表1），并将其倒入裂解皿中（图2）。
- 凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻握住载玻片并将盖玻片从凝胶上滑下，快速取出盖玻片。
- 将含有样品的载玻片放在载玻片内（载玻片上的所有黑色“点”标记在载玻片中放置时应朝向同一方向）（图3B），然后将载玻片放在裂解皿内（图2）。
- 关闭裂解盘的盖子，并将裂解盘在冰箱中在4°C下过夜或在室温下30分钟，以最适合操作员的时间表19为准。
4. 电泳
- 小心地从裂解培养皿中取出载玻片载体。注意不要干扰凝胶。
- 轻轻地将载玻片托架放入预装有冰冷的ddH 2 O的洗涤盘中，静置30分钟，确保载玻片完全被ddH2O覆盖。
- 将冷冻冷却包插入电泳槽下方的滑动抽屉内，以保持最佳缓冲温度。
- 小心地将冰冷的电泳工作溶液（表1）加入电泳槽中，并将载玻片转移到电泳槽中。定向载玻片，使其带有含细胞凝胶的透明部分（即，不是磨砂/标记端）指向阴极（红色电极）。
- 让载玻片在电泳槽中静置20分钟，使DNA放松并展开。在此步骤中保持电源关闭。
- 如果需要，插入新的冷冻冷却包以最大限度地提高冷却效果。
- 在1.19V / cm或任何已优化的条件下进行电泳20分钟。
注意：建议每个实验室优化电泳运行条件和缓冲液体积24.在电泳过程中仅使用单个载玻片不会对电泳缓冲液的电阻产生任何影响，并且当载玻片数量发生变化时，作者没有看到电压或电流的显着影响。 - 关闭电源，小心地从电泳槽中取出载玻片载体，让它在薄纸上排出 30 秒。
- 将载玻片放入含有中和缓冲液的培养皿中（表1）。静置20分钟。
- 从中和盘中取出载玻片载体，将其放入含有冰冷ddH2O的洗涤盘中，放置20分钟。
- 从水中取出载玻片载体，让载玻片在37°C的培养箱中干燥1小时，或在室温下干燥过夜，或者不要干燥，具体取决于操作员的时间表19。
注意：如果在步骤4.11中没有干燥，请执行5.2中的染色步骤。
5. 碘化丙啶（PI）染色
- 将载玻片载体转移到含有冰冷ddH2O的洗涤盘中，使载玻片再水化并放置30分钟。
- 将载玻片支架放入含有 2.5 μg/mL 碘化丙啶溶液的染色皿中。
注意：碘化丙啶对光敏感，因此请在黑暗区域处理。它也是有毒的。 - 关闭染色皿的盖子，并在室温下在黑暗中孵育20分钟。
- 将载玻片载体转移到单独的培养皿中，并用冰冷的ddH2O清洗20分钟。
- 从培养皿中取出载玻片载体，并在黑暗中完全干燥，无论是在37°C培养箱中还是在室温下，具体取决于操作员的时间表或偏好。
- 载玻片完全干燥后，将其从载玻片托架中取出，并在黑暗中存放在载玻片盒中，直到准备好进行图像分析。
注意：载玻片将无限期保持可读性，必要时可以重新染色。
6. 酶修饰碱性彗星测定
注意：酶修饰的碱性彗星测定在裂解后但在电泳之前采用酶处理步骤。酶的活性导致作为酶底物的位点的DNA断裂。在进行该测定之前，必须优化酶浓度和酶孵育持续时间。
- 细胞裂解后（步骤3），用冰冷的ddH2O洗涤载玻片两次，每次20分钟。
- 从水中取出载玻片托架，然后将载玻片转移到衬有纸巾的托盘中。
- 以优化浓度加入 80 μL 酶（例如，用于 BE-M17 细胞的 hOGG1 为 3.2 U/mL，在酶反应缓冲液中稀释），并用盖玻片覆盖以将酶铺在含凝胶的样品上。
- 将载玻片在37°C孵育优化持续时间（例如，hOGG1为45分钟）。
- 孵育后，轻轻取出盖玻片并将载玻片转移到载体上。
注意：酶处理后不要清洗载玻片;直接从步骤4.3进行电泳。
7. DNA链间交联（ICL）修饰的碱性彗星测定
注意：ICL-ACA的这种变体的概念是，DNA中ICL的存在将延迟受损DNA的电泳迁移，这是在暴露于氧化产生的损伤后诱导的。在这种情况下，彗尾越短，ICL25，26，27，28的数量就越多。
- 用诱导ICL的试剂（例如顺铂;参见 补充文件）处理细胞。
- 用以下试剂之一暴露处理过的细胞，以诱导足够的链断裂以产生适当大小的彗尾（~20%尾部DNA）：过氧化氢（50μM H 2 O230分钟），电离辐射（2-5Gy）或紫外线B（UVB）（0.5J / cm2）。
- 此外，通过用步骤7.2中使用的相同试剂和剂量处理一批细胞来产生链断裂阳性对照（即，不使用ICL诱导剂处理）。
- 将细胞以7，607× g 离心5分钟，弃去上清液，用1mL PBS洗涤细胞沉淀三次，并像碱性彗星测定一样处理（步骤3-5）。
- 使用以下公式计算DNA链间交联的水平。
注意：MOTM（平均橄榄尾巴力矩）是描述ICL修饰彗星测定时广泛使用的彗星测定终点，定义为尾巴长度与尾部总DNA分数的乘积（即尾部力矩=尾部长度x尾部DNA的百分比）29;TMdi：用交联剂和H2O2（或其他断链诱导剂）处理的样品的尾部力矩;TMcu：未用交联剂处理且未用H2O 2处理（无处理）处理的样品的尾部矩，TMci：未用交联剂处理但用H 2 O 2处理的样品的尾部矩。
8. 彗星评分和数据分析
注意：术语“彗星”源自在进行测定后在显微镜下观察受损细胞的图像（图5）。在电泳条件下，未受损细胞中的DNA基本上不会迁移，而是保留在称为彗星“头部”的球体中。然而，链断裂的存在允许细胞的DNA从头部迁移出来，并形成“尾巴”，从而导致像彗星一样的外观（图5）。尾巴中的DNA越多，损伤就越大。
- 使用PI（红色）滤光片（λ = 536/617 nm）和彗星测定评分软件打开荧光显微镜。
- 使用巴斯德移液管在凝胶中加入一滴水，并盖上盖玻片。
- 将载玻片放入荧光显微镜中并对彗星进行“评分”。
注意：评分是评估彗星的一种手段，以确定每颗彗星中存在的损坏量。从广义上讲，这可以通过使用两种方法来实现，根据用户选择的偏好，要么通过肉眼（以0到4的尺度测量彗星的大小），要么使用自由的或市售的软件30。一般来说，这两种方法都评估彗尾的大小，尽管可以确定各种与彗星相关的终点。如果使用该软件，请单击彗星头的中间，等待软件自动检测到彗星，然后评估所选端点（图5）。 - 每个凝胶50颗彗星，每个样品100颗彗星（即，每个样品对应于不同的DNA损伤处理或其重复）。
- 重复实验（n = 2）或将实验一式三份（n = 3）。
注意：如果仅进行n = 2重复实验，则无法进行统计分析，但如果n = 3，则执行D'agostino正态性检验。大多数彗星检测数据没有通过正态性测试。在这种情况下，请使用非参数检验（Kruskal-Wallis 检验与邓恩多重比较检验，曼-惠特尼检验显著性设置为 p < 0.05）。
Representative Results
优化 HTP ACA 的电泳电压
人角质形成细胞（HaCaTs;目录）用不同剂量的紫外线A辐射（UVA）（5或10J / cm2;图 6A）、UVB（0.5 或 1 J/cm2;图6B），或用50μM H 2 O2（图6C）处理以诱导损伤。 测试了三种不同的电泳电压，以确定电泳的最佳电压。所有三种DNA损伤处理的结果表明，虽然所有电压都产生线性剂量反应，但最敏感的反应是1.19 V / cm。与1 V/cm和1.09 V/cm相比，HaCaTs在电泳过程中使用1.19 V / cm显示出最高的基线DNA损伤（图6A-C）。此外，使用1.19 V / cm，在所有破坏性处理后，可以看到最大的尾部DNA百分比（图6）31。
使用Fpg修饰的HTP ACA检测人全血中的DNA损伤
用不同剂量的10J / cm2 UVA照射人腰血（材料表）以诱导损伤。使用四种不同浓度的 Fpg （1、2、4 或 8 U/mL） 来确定 HTP ACA 中酶处理的最佳浓度。结果表明，4 U/mL Fpg揭示了DNA损伤的最佳水平（图7A）。来自UVA辐照血液样本的代表性彗星图像（图7B）。
使用 ICL 修饰的 HTP ACA 检测代表性卵巢癌细胞系中的 DNA ICL
卵巢癌细胞系（SKOV-3;目录）用200μM顺铂的组合处理和/或随后用50μM H 2 O2在冰上处理30分钟。在未暴露的细胞中没有发现明显的损伤（图8A）。单独暴露于H2O2会产生显着的MOTM（图8B）。相比之下，诱导ICL的细胞显示出降低的MOTM（图8C）28。
顺铂诱导的DNAICL在代表性卵巢癌细胞系中的形成和修复
ICL 修饰的 HTP ACA 用于确定顺铂在卵巢癌细胞系中诱导的 DNA ICL 形成和修复的时间过程 （A2780; 目录）。用100μM顺铂处理细胞1小时，然后在不含顺铂的培养基（补充有10%（v / v）胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基）中孵育后续时间。在不同的时间点，进行ICL修饰的HTP ACA以确定ICL的水平（图9）28。在顺铂治疗前未检测到ICL。然而，在用100μM顺铂单次处理后，ICL水平显着增加，在12小时达到峰值，之后水平在30小时后下降到零。
DNA ICL 和 DNA 铂水平之间的相关性
在通过ICL修饰的HTP ACA和电感耦合质谱分析之前，用100μM顺铂处理三个卵巢癌细胞以诱导不同水平的DNA-ICL（ICP-MS;详见 补充文件 ）。 如图10所示，在三种细胞系中诱导了不同水平的DNA-ICL，以及DNA中不同水平的Pt。观察到DNA ICL水平与铂浓度之间存在正相关（R2 = 0.9235），表明DNA铂水平与相应的ICL28之间存在关联。
支原体感染和未感染BE-M17细胞的碱基切除修复
支原体感染和未感染的BE-M17细胞用50μMH2 O 2处理30分钟，并与完全培养基（Dulbecco的改良Eagle培养基补充有10%（v / v）FBS）孵育不同持续时间（0分钟，30分钟，1小时，2 小时，6小时，24小时或30小时），在此期间允许细胞修复。在每个时间点，在进行hOGG1修饰的HTP ACA（步骤6）之前，在-80°C下收集细胞并在含10%DMSO的培养基中冷冻。30分钟后，未感染细胞中的SB / ALS水平降至21%TD（百分比尾DNA），而感染细胞显示49%TD（图11A）。~15小时后，感染和未感染细胞的SB / ALS水平已恢复到基线。对于氧化嘌呤，未感染的BE-M17最初显示出损伤的小幅增加，然后在30小时内恢复到基线（图11B）。相比之下，受感染的细胞显示出氧化嘌呤的持续，显着增加，其仍然升高，即使在30小时后也没有恢复到基线水平（图11B）23。
图1：常规碱性彗星测定程序概述 。 （i）将培养细胞或全血样品的单细胞悬液与0.6%（w / v）LMP琼脂糖混合。（ii）将细胞/琼脂糖混合物施加到预包被的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖直至凝固。（iii）使用高pH裂解缓冲液裂解细胞过夜，形成类核小体，然后（iv）用ddH2O洗涤。 （v）细胞DNA在高pH电泳缓冲液中展开。链断裂的存在使DNA松弛和展开，在电泳下，DNA从类核体中抽出，形成尾巴。然后将载玻片（vi）排干，干燥，（vii）中和，（viii）在（ix）干燥过夜之前用ddH2O洗涤。然后（x）用ddH2O再水化载玻片，（xi）染色，（xii）洗涤，最后（xiii）评分和分析，通常使用荧光显微镜和图像分析软件。这一数字转载自以前的出版物20。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：包含高通量彗星电泳系统的材料。 图中显示了HTP电泳槽，HTP架以及用于裂解，洗涤，中和和染色的培养皿。 请点击此处查看此图的大图。
图3：彗星测定载玻片和HTP架 （显微镜载玻片载体）的代表性图像。 （A）为了正确定位，显微镜载玻片的预涂布面由显微镜载玻片右上角的黑点识别。（B） HTP 架的图像说明了载玻片如何保持紧密的垂直方向，载体上的卡舌用于将其方向固定在电泳槽内。每个托架最多可容纳 25 张载玻片。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：带有样品载玻片和冷冻包的冷却板的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图5：评分期间拍摄的代表性彗星的屏幕截图。 HaCaT （A） 未经处理和 （B） 在进行 HTP ACA 之前用 1 J/cm2 UVB 处理。大多数软件包可以计算各种彗星终点，但最常见的是基于这些图像的尾巴DNA（首选）或尾部力矩（蓝色：头部的起点，绿色：头部的中间，紫色：尾巴的末端）。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：代表性图表说明了电泳电压对使用 HTP ACA 测定的尾部 DNA 百分比的影响。在HTP ACA之前，细胞暴露于（A）5或10J / cm 2 UVA，（B）0.5或1.0 J / cm 2 UVB或（C）50μM H 2 O2，电泳电压为1，1.09或1.19 V/ cm。数据表示 n = 2 重复实验 200 次测定的平均值31.请点击此处查看此图的大图。
图7：由Fpg修饰的HTP ACA分析的人类血液的代表性图和彗星图像。 在裂解步骤之前，用10J / cm2 UVA或假照射（“ctrl”）在冰上照射人类血液样品。电泳前使用不同浓度的Fpg（1、2、4或8 U/mL）进行酶处理。 （A） 数据表示来自 n=3 次实验的 300 次测定的平均± SEM。 （B） 10 J/cm2 UVA辐照血液样本中每种浓度的Fpg的彗星的代表性图像。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图8：代表性彗星图像，说明顺铂处理后的ICL检测。 （A）未经任何处理的对照细胞，（B）仅用H 2 O 2（50μM）处理的细胞，（C）用H 2 O 2（50μM）和顺铂（200μM）处理的细胞，说明由于ICL28的存在，尾巴比（B）中短。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图9：顺铂诱导的ICL形成和修复动力学的演示。 A2780细胞在培养基中用100μM顺铂处理1小时。然后除去含顺铂的培养基，并将细胞培养不同的时间点，然后通过ICL修饰的HTP ACA进行分析。数据表示从n = 3实验28±SEM的平均值。 P < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图10：DNA ICL与铂浓度之间的相关性。 DNA ICL 通过 ICL 修饰的 HTP ACA 测定，铂水平通过 ICP-MS（具有单四动能鉴别，SQ-KED）在三种卵巢癌细胞系中测量。R2 = 0.9235。参见ICP-MS定量DNA中铂含量的方法补充文件28。请点击此处查看此图的大图。
图 11：通过 hOGG1 修饰的彗星测定法确定的 DNA 损伤和修复的代表性图，在支原体感染与未感染的 BE-M17 细胞中。用50μM H 2O 2处理30分钟后，允许细胞修复不同的持续时间（0，30分钟，1小时，2小时，6小时，24小时或30小时）。hOGG1修饰的HTP ACA用于测量感染（红色数据点）和未感染（黑色数据点）BE-M17细胞中的（A）SB / ALS和（B）氧化嘌呤。数据表示 n = 2 个重复实验的 200 次测定的平均值。本图经先前出版物23许可转载。请点击此处查看此图的大图。
| 试剂 | 储备液 | 工作解决方案 | |
| 裂解缓冲液 | 100 mM Na 2 EDTA、2.5 M NaCl 和 10 mM Tris 碱基在 ddH2O 中;用 10 M 氢氧化钠调节 pH 值至 10 | 1% Triton X-100 裂解储备液 | |
| 电泳缓冲液 | 10 M 氢氧化钠和 200 mM Na 2 EDTA在 ddH2O 中 | 300 mM 氢氧化钠和 1 mM Na2EDTA;酸碱度 > 13 | |
| 中和缓冲液 | 0.4 M Tris 碱基在 ddH2O;用盐酸调节pH值至7.5 | ||
| 染色缓冲液 | 1毫克/毫升碘化丙啶 | 2.5 μg/mL 碘化丙啶DDH 2O | |
表1：HTP ACA中使用的试剂组成。 图中显示了裂解、电泳、中和和染色缓冲液的储备和工作浓度。
补充文件。请点击此处下载此文件。
Discussion
这项研究证明了当前设备提供的多功能性，可用于通过彗星测定的各种代表性常见变体（即碱性，酶修饰，血液和ICL）实现高通量，其他变体也将适用）。此外，本方法还带来了几个好处20，21：（a）由于并行操作多个载玻片，分析运行时间减少（处理时间减少60%）;（b）凝胶损坏的风险，从而降低实验的风险;（c）试剂需求降低（例如，电泳槽的体积小于常规罐）;（d） 幻灯片的运行次数增加。与单个传统储罐相比，一个储罐可以使载玻片运行次数增加 20%;然而，多个电泳槽可以从同一电源并行运行或从属（即，由单个电源控制的多个电泳槽），并且仍然需要比单个带冰盘的传统罐更小的台式占地面积;（e）由于载玻片的垂直方向和整体冷却，储罐占地面积减少（节省实验室空间）;HTP罐包括一个高性能陶瓷冷却底座和一个滑动抽屉，可以容纳一个冷冻冷却包，以保持最佳缓冲温度，而无需在冷藏室中执行该过程。
此外，我们开发的冷却板可容纳26张彗星载玻片，使彗星测定载玻片上的低熔点琼脂糖快速凝固，并便于在琼脂糖凝胶固化后轻松检索载玻片。上述创新使彗星检测过程更简单、更容易。
虽然已经开发了其他高通量方法（例如，12 凝胶 Comet 测定、CometChip 或 96 种微型凝胶形式）25，但许多科学家更喜欢使用传统的显微镜载玻片（包括市售的预包被载玻片或其他专用载玻片）。本方法可以容纳所有类型的显微镜载玻片，允许使用这些载玻片的实验通过更快的载玻片处理和处理来扩大规模。如上所述，HTP彗星系统带来了许多优点，但有一个明显的局限性：与传统的水平罐相比，目前的方法仅增加了20%的样品运行数量（尽管载玻片的处理速度要快得多）。CometChip 和 96 种微凝胶规格可运行更多样品。迄今为止，我们不知道目前的方法是否可以适应CometChip或96种微型凝胶形式，尽管我们预测它会。如上所述，通过将储罐从属于单个电源，可以进一步增加样品数量。与所有方法一样，在加载样品并在显微镜下分析凝胶时，仍有可能丢失或损坏凝胶，但这更多是由于操作人员的错误，并且使用当前方法将这种情况的可能性降至最低。
HTP彗星系统的使用可以极大地帮助分析DNA损伤，促进彗星测定在广泛的应用中的使用，例如分子流行病学，男性生殖科学，遗传毒理学研究和环境毒理学。对于那些希望获得提高通量和易用性的所有好处而又不放弃熟悉的、经济高效的传统显微镜载玻片的用户来说尤其如此。
Disclosures
库克博士和卡尔巴斯基博士是与此处所述技术相关的三项授权专利的发明人。
Acknowledgments
本出版物中报告的工作部分得到了美国国立卫生研究院国家环境健康科学研究所的支持，奖励号为：1R41ES030274。内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
| A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
| Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
| Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
| Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
| HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
| Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
| Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
| ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
| Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
| Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
| Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
| Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
| Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
| NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
| OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
| Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
| Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
| Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
| SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
| Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
| Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
| Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
| Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
| Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
| Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |
References
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