Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kometanalysetilnærming med høy gjennomstrømning for å vurdere cellulær DNA-skade

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63559
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 5, 1
1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences, University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.), US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment, Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, De Montfort University
* These authors contributed equally

Summary

Kometanalysen er et populært middel for å oppdage DNA-skade. Denne studien beskriver en tilnærming til å kjøre lysbilder i representative varianter av kometanalysen. Denne tilnærmingen økte antall prøver betydelig samtidig som den reduserte analysens kjøretid, antall lysbildemanipulasjoner og risikoen for skade på geler.

Abstract

Celler blir kontinuerlig utsatt for midler som oppstår fra interne og eksterne miljøer, noe som kan skade DNA. Denne skaden kan forårsake avvikende cellefunksjon, og derfor kan DNA-skade spille en kritisk rolle i utviklingen av tenkelig alle store menneskelige sykdommer, for eksempel kreft, nevrodegenerativ og kardiovaskulær sykdom og aldring. Encellet gelelektroforese (dvs. kometanalysen) er en av de vanligste og mest følsomme metodene for å studere dannelsen og reparasjonen av et bredt spekter av typer DNA-skader (f.eks. Enkelt- og dobbeltstrengsbrudd, alkali-labile steder, DNA-DNA-tverrbindinger, og i kombinasjon med visse reparasjonsenzymer, oksyderte puriner og pyrimidiner), i både in vitro og in vivo Systemer. Imidlertid er den lave prøvegjennomstrømningen av den konvensjonelle analysen og arbeidskrevende prøveopparbeidelse begrensende faktorer til bredest mulig anvendelse. Med "scoring" av kometer stadig mer automatisert, er begrensningen nå muligheten til å behandle et betydelig antall kometlysbilder. Her er det utviklet en høykapasitetsvariant (HTP) variant av kometanalysen (HTP-kometanalysen), noe som øker antall analyserte prøver betydelig, reduserer analysens kjøretid, antall individuelle lysbildemanipulasjoner, reagenskrav og risiko for fysisk skade på gelene. Videre reduseres fotavtrykket til elektroforesetanken betydelig på grunn av den vertikale orienteringen av lysbildene og integrert kjøling. Også rapportert her er en ny tilnærming til chilling komet analyse lysbilder, som praktisk og effektivt letter størkning av kometen geler. Her er anvendelsen av disse enhetene til representative kometanalysemetoder beskrevet. Disse enkle innovasjonene støtter i stor grad bruken av kometanalysen og dens anvendelse på studieområder som eksponeringsbiologi, økotoksikologi, biomonitorering, toksisitetsscreening / testing, sammen med forståelse av patogenese.

Introduction

Celler blir kontinuerlig utsatt for agenter som oppstår fra interne og eksterne miljøer, noe som kan skade DNA 1,2. Denne skaden kan forårsake avvikende cellefunksjon3, og derfor kan DNA-skade spille en kritisk rolle i utviklingen av mange store menneskelige sykdommer, for eksempel kreft, nevrodegenerativ og kardiovaskulær sykdom og aldring4. Kometanalysen (også kalt encellet gelelektroforese) er en stadig mer populær metode for å oppdage og kvantifisere cellulær DNA-skade.

På sitt enkleste oppdager den alkaliske kometanalysen (ACA) strengbrudd (SB; både enkle og doble), sammen med apuriniske/apyrimidiniske steder og alkali-labile steder (ALS), som begge blir enkeltstrengsbrudd under alkaliske forhold5. Den nøytrale pH-kometanalysen kan evaluere ærlige enkelt- og dobbeltstrengsbrudd6. Videre kan ACA, i kombinasjon med en rekke DNA-reparasjonsenzymer, oppdage et betydelig utvalg av typer DNA-skader, for eksempel oksyderte puriner (identifisert ved bruk av humant 8-oksoguanin DNA-glykosylase 1; hOGG17); oksyderte pyrimidiner (ved bruk av Endonuklease III; EndoIII) og cyklobutanpyrimidindimerer (ved bruk av T4 endonuklease V; T4endoV)8. Kometanalysen kan også brukes til å evaluere DNA-lesjoner indusert av tverrbindingsmidler, for eksempel cisplatin 9,10,11. Som indikert av analysens formelle navn, dvs. enkeltcellegelelektroforese, er analysen avhengig av at cellene som analyseres er en enkeltcellesuspensjon; Vanligvis er disse dyrkede celler, men kan isoleres fra fullblod 12,13, eller fullblod i seg selv kan brukes 14,15. Alternativt kan en enkelt cellesuspensjon genereres fra fast vev.

Bortsett fra noen få unntak, spesielt CometChip-rapportene fra Engleward lab 16, har den generelle kometanalyseprotokollen ikke endret seg dramatisk fra den som opprinnelig ble beskrevet av analysens oppfinnere (Östling og Johansson17 og Singh etal.18). Kometanalysen omfatter mange trinn (figur 1). Mange av disse trinnene innebærer overføring av de tynne, celleholdige agarosegelene, ett lysbilde om gangen, og utgjør derfor en risiko for skade eller tap av gelen, noe som truer eksperimentets suksess. Følgelig kan kometanalysen være tidkrevende, spesielt hvis et betydelig antall lysbilder kjøres. Vanligvis kjøres maksimalt 40 lysbilder i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforesetank, som sitter i et enda større brett som inneholder våt is for kjøling. Det har nylig blitt rapportert at analysens kjøretid kan forkortes til 1 dag ved å redusere varigheten av lysistrinnet og ikke tørke lysbildene før farging19.

De nåværende forfatterne har tidligere rapportert en ny tilnærming til alkalisk kometanalyse med høy gjennomstrømning (HTP ACA), der flere (batcher på 25) kometanalysemikroskoplysbilder kan manipuleres samtidig gjennom kometanalyseprosessen20,21,22. Denne patenterte tilnærmingen minimerer risikoen for skade på eller tap av de prøveholdige gelene ved å fjerne behovet for å manipulere mikroskoplysbildene individuelt og kan brukes på alle varianter av kometanalysen, som bruker mikroskoplysbilder. De glidende stativene beskytter gelene under manipulasjonene, og følgelig er prøvebehandlingen raskere og mer effektiv. Lysbildene kan også gjennomgå elektroforese i stativene, holdt i vertikal, i stedet for horisontal orientering. Dette, og integrert kjøling, reduserer fotavtrykket til elektroforesetanken betydelig og fjerner behovet for våt is. Til sammen representerer dette en betydelig forbedring i forhold til den konvensjonelle prosedyren. Utstyret som brukes er illustrert i figur 2. Protokollene beskrevet her, ved hjelp av denne nye tilnærmingen, demonstrerer den representative applikasjonen til dyrkede celler og fullblod14 for påvisning av alkali-labile steder (ALS), DNA-tverrbindinger (ICL) og substratene til forskjellige DNA-reparasjonsenzymer.

Protocol

Kommersielt tilgjengelige blodprøver ble brukt i denne studien. Ved vår institusjon er det ikke nødvendig med godkjenning fra Institutional Review Board for bruk av kommersielt tilgjengelig blod.

1. Forberedelse av materialer til kometanalysen

  1. Forberedelse av mikroskop lysbildene
    1. Hell 1% (w / v) normalt smeltepunkt agarose [oppløst i dobbeltdestillert vann (ddH 2 O)]i et 50 ml rør og mikrobølgeovn for å oppløse agarosen i ddH2O. Oppbevares ved 37 °C for å forhindre størkning før belegget glir. Skulle størkning oppstå, kast og tilbered deg frisk.
    2. Pre-coat mikroskop lysbilder ved å dyppe lysbildene i 50 ml røret som inneholder 1% (w / v) normalt smeltepunkt agarose.
    3. Tørk av baksiden av lysbildene raskt etter at du har dyppet lysbildene.
      MERK: Unnlatelse av å tørke baksiden av lysbildene riktig vil øke bakgrunnsstøyen til lysbildene under analysetrinnet for mikroskop.
    4. Merk det belagte lysbildet med en permanent markør nederst til høyre i den frostede delen (figur 3A). Dette viser hvilken side av lysbildet som er forhåndsbelagt.
    5. La agarosen sette seg og tørke over natten ved romtemperatur.
    6. Pakk de tørkede lysbildene i silkepapir og oppbevar dem i en boks.

2. Klargjøring av prøver

  1. Kultiverte celler
    MERK: For det første, behandle celler med skadelig middel (er) før du starter kometanalysen. Utfør deretter følgende.
    1. Hvis cellene er adherent, trypsinize cellene for å frigjøre dem fra cellekulturkolben eller cellekultur petriskåler, ved riktig sammenløp av celler. Nøytraliser trypsin ved å tilsette serumholdige medier.
    2. Overfør cellene til et 50 ml rør, sentrifuge (f.eks. for HaCaTs, sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur), fjern supernatanten forsiktig og tilsett 1 ml PBS til cellepelleten.
    3. Utfør celletelling.
    4. Overfør 30 000 celler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 7 607 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Fjern supernatanten forsiktig og oppbevar cellepelleten på is i mørket før du utfører kometanalysen.
      MERK: Celler bør regelmessig testes for Mycoplasma-forurensning før de utfører kometanalysen for å forhindre blant annet dannelse av artefakt DNA-skade og endret DNA-skaderespons, som rapportert andre steder23. Sentrifugeringsbetingelser kan endres etter behov, avhengig av hvilken celletype som brukes.
  2. Fremstilling av dyrkede celler for reparasjonsanalyse
    1. Kulturceller i cellekulturkolben eller petriskåler.
    2. Vask cellene med 1 ml PBS to ganger før du behandler cellene med skadelige stoffer (f.eks. For BE-M17-celler, behandle med 50 μM H2O2i 20 minutter) på is for å forhindre at reparasjonen skjer under behandlingen.
    3. Vask cellene forsiktig med 1 ml PBS to ganger for å fjerne eventuelle gjenværende skadelige stoffer.
    4. Introduser cellekulturmediet på nytt og la cellene reparere i varierende varighet (f.eks. 0 min, 30 min, 2 timer, 6 timer, 24 timer og 30 timer) i en fuktet inkubator (37 °C, 5 % CO2).
    5. Ved hvert tidspunkt samles 30 000 celler i 10 % dimetylsulfoksid (DMSO)-inneholdende cellekulturmedium og lagrer dem ved -80 °C.
    6. Før du utfører kometanalysen, tine cellene raskt ved 37 °C i et vannbad og sentrifuger dem ved 7 607 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    7. Fjern supernatanten og oppbevar cellepelleten på is før du utfører analysen (dvs. fra trinn 3).
  3. Fremstilling av fullblod
    MERK: Følgende metode drar nytte av (i) å være en minimal invasiv tilnærming for å oppnå en blodprøve, (ii) ikke krever isolering av PBMC før kometanalysen, og (iii) tillate at blodprøvene (med et volum < 250 μL) lagres ved -80 ° C i opptil 1 måned (selv om nyere bevis tyder på at lengre lagring er mulig), uten behov for kryokonserveringsmidler, og uten risiko eller artefakt skade dannelse14. Etisk godkjenning, eller tilsvarende, kan være nødvendig før det tas blodprøver av pasienter eller dyr. Alternativt kan kommersielt tilgjengelige blodprøver brukes som i denne studien. Ved vår institusjon er det ikke nødvendig med godkjenning fra Institutional Review Board for bruk av kommersielt tilgjengelig blod.
    1. Ved hjelp av en pipette overfører du fullblodsprøver (<250 μL) (materialtabell) til et oppsamlingsrør som inneholder et minimalt volum som inneholder 0,4 mg EDTA (per 250 μL blod).
    2. Frys blodprøver ved -80 ° C før du utfører HTP kometanalysen.
    3. Tine lagrede blodprøver (<250 μL) ved romtemperatur, uten oppvarming.
    4. Overfør 5 μL av fullblodet til mikrosentrifugerør før kometanalysen utføres (se trinn 3).

3. Cellelyse

MERK: Utfør alle prosedyrene på is.

  1. Bruk 12 000 celler eller 2,5 μL fullblod per gel.
  2. Forbered 0.6% (w / v) lavt smeltepunkt agarose oppløst i PBS ved hjelp av en mikrobølgeovn, og legg i et vannbad ved 37 ° C for å forhindre at det stivner.
  3. Merk den frostede enden av de forhåndsbelagte lysbildene med etterforskerens navn, dato og behandlingsinformasjon ved hjelp av en permanent markør eller blyant.
  4. Plasser en kjøleplate på en flat benk og sett de to frosne kjølepakkene inn i skyveskuffen under metalloverflaten (som vist i figur 4)21.
  5. Plasser lysbildene på kjøleplaten og la lysbildene forhåndskjøles i 1-2 minutter før du tilsetter de 0,6 % (w/v) cellene som inneholder agaroseholdig smeltepunkt (trinn 3,7).
    MERK: Hvis du lar lysbildene ligge på kjøleplaten i mer enn 1-2 minutter, kan det oppstå kondens på glideflaten på grunn av fuktighet i omgivelsene. Dette kan gjøre agarosegelene med lavt smeltepunkt mindre stabile på lysbildene.
  6. Spre pelleten (trinn 2.2.7) ved vortexing. Forsikre deg om at all supernatanten er fjernet fra pelleten. Plasser prøverørene (som inneholder pelleterte celler) umiddelbart tilbake på isen.
    MERK: Når du plasserer de prøveholdige rørene i sentrifugen, legg dem med hengslet vendt utover slik at pelleten samles på denne siden av røret. Noen ganger er det vanskelig å se pelleten, og det er lett å løsne den mens du fjerner supernatanten. Sentrifugering med rørlokket i denne retningen vil gjøre det mulig for en å vite hvor cellepelleten vil være.
  7. Resuspender cellepelleten med 200 μL 0,6% lavt smeltepunkt agarose (LMP agarose) og bland ved pipettering opp og ned uten å skape bobler. Deretter overfører du raskt 80 μL LMP agaroseholdige celler på et kjølt lysbilde og legger raskt en deksel på gelen.
  8. La gelen sette på kjøleplaten i 1-2 minutter.
  9. I mellomtiden forbereder du en 500 ml arbeidsløsning av lysisbuffer (tabell 1) og hell den i lysisfatet (figur 2).
  10. Når gelene er satt, fjern dekslene raskt ved å holde lysbildet forsiktig mellom tommel og pekefinger og skyve dekselet av gelen.
  11. Plasser lysbildene som inneholder prøver inne i skyvebæreren (alle de svarte "prikk"-merkene på lysbildene skal vende i samme retning når de plasseres i en bærer) (figur 3B), og plasser deretter glidebæreren inne i lysisfatet (figur 2).
  12. Lukk lokket på lysisfatet og oppbevar lysisfatet i kjøleskapet over natten ved 4 °C eller 30 minutter ved romtemperatur, avhengig av hva som passer best for operatørens tidsplan19.

4. Elektroforese

  1. Fjern glidebæreren forsiktig fra lysisfatet. Pass på at du ikke forstyrrer gelene.
  2. Legg sklieholderen forsiktig i en vaskemaskin som er forhåndslastet med iskald ddH 2 O, og la den stå i 30 minutter og sørg for at skliene er helt dekket med ddH2O.
  3. Sett inn en frossen kjølepakke inne i skyveskuffen under elektroforesetanken for å opprettholde optimal buffertemperatur.
  4. Tilsett forsiktig iskald elektroforesearbeidsløsning (tabell 1) til elektroforesetanken og overfør glidebæreren til elektroforesetanken. Orienter lysbildene slik at deres klare deler med celleholdige geler (dvs. IKKE de frostede / merkeendene) peker mot katoden (rød elektrode).
  5. La lysbildene sitte i elektroforesetanken i 20 minutter slik at DNA slapper av og slapper av. Hold strømforsyningen swtiched av i løpet av dette trinnet.
  6. Sett om nødvendig inn en ny frossen kjølepakke for å maksimere kjølingen.
  7. Utfør elektroforese i 20 minutter ved 1,19 V/cm, eller uansett hvilke forhold som er optimalisert.
    MERK: Optimalisering av elektroforesedriftsforhold og buffervolum anbefales for hvert laboratorium24. Bruk av bare en enkelt lysbildebærer under elektroforese forårsaker ingen effekt av lysbilder på motstanden til elektroforesebufferen, og forfatterne så ikke en signifikant effekt i spenningen eller strømmen når antall lysbilder endret seg.
  8. Slå av strømforsyningen, fjern lysbildebæreren forsiktig fra elektroforesetanken, og la den renne av på silkepapir i 30 s.
  9. Plasser glidebæreren i parabolen som inneholder nøytraliseringsbuffer (tabell 1). La det stå i 20 min.
  10. Fjern glideholderen fra nøytraliseringsfatet, legg den i vaskemaskinen som inneholder iskald ddH2O, og la den stå i 20 minutter.
  11. Fjern glidebæreren fra vannet og la skliene tørke i en inkubator ved 37 °C i 1 time, eller ved romtemperatur over natten, eller ikke tørk, avhengig av operatørens tidsplan19.
    MERK: Hvis det ikke er tørking i trinn 4.11, utfør fargetrinnet fra 5.2.

5. Propidiumjodid (PI) farging

  1. Overfør glideholderen til en vaskemaskin som inneholder iskald ddH2O for å rehydrere lysbildene og la stå i 30 minutter.
  2. Plasser glidebæreren i en fargeform som inneholder 2,5 μg / ml propidiumjodidoppløsning.
    MERK: Propidiumjodid er lysfølsom, så håndter det i et mørkt område. Det er også giftig.
  3. Lukk lokket på fargeformen og inkuber det i 20 minutter i mørket ved romtemperatur.
  4. Overfør glideholderen til en separat tallerken, og vask den med iskald ddH2O i 20 min.
  5. Fjern glidebæreren fra skålen og tørk den helt i mørket, enten i en 37 °C inkubator eller ved romtemperatur, avhengig av operatørens tidsplan eller preferanser.
  6. Når lysbildene er helt tørket, fjerner du dem fra lysbildebæreren og lagrer dem i en lysbildeboks i mørket til de er klare for bildeanalyse.
    MERK: Lysbildene forblir lesbare på ubestemt tid og kan farges på nytt om nødvendig.

6. Enzymmodifisert alkalisk kometanalyse

MERK: Den enzymmodifiserte alkaliske kometanalysen benytter et enzymbehandlingstrinn etter lysis, men før elektroforese. Aktiviteten til enzymet forårsaker brudd i DNA på steder som er substrater for enzymet. Før du utfører denne analysen, må enzymkonsentrasjonen og varigheten av enzyminkubasjonen optimaliseres.

  1. Etter cellelysen (trinn 3), vask lysbildene to ganger med iskald ddH2O i 20 minutter hver.
  2. Fjern glidebæreren fra vannet og overfør lysbildene til et brett foret med papirhåndklær.
  3. Tilsett 80 μL av enzymet ved den optimaliserte konsentrasjonen (f.eks. 3,2 U / ml hOGG1 for BE-M17-celler, fortynnet i enzymreaksjonsbuffer) og dekk med en coverslip for å spre enzymet over den gelholdige prøven.
  4. Inkuber lysbildene ved 37 °C i den optimaliserte varigheten (f.eks. 45 minutter for hOGG1).
  5. Etter inkubering, fjern dekslene forsiktig og overfør lysbildene til transportøren.
    MERK: Ikke vask lysbildene etter enzymbehandling; Utfør elektroforese direkte fra trinn 4.3.

7. DNA inter-strand tverrbindinger (ICL)-modifisert alkalisk kometanalyse

MERK: Konseptet med denne varianten av ICL-ACA er at tilstedeværelsen av ICL i DNA vil forsinke den elektroforetiske migrasjonen av skadet DNA, indusert etter eksponering for en oksidativt generert fornærmelse. I dette tilfellet, jo kortere komethalen er, desto større er antallet ICL25,26,27,28.

  1. Behandle celler med et reagens som induserer ICL (f.eks. cisplatin; se tilleggsfil).
  2. Utsett de behandlede cellene med ett av følgende midler for å indusere tilstrekkelige strengbrudd for å skape en komethale i passende størrelse (~ 20% hale-DNA): hydrogenperoksid (50 μM H 2 O 2 i 30 minutter), ioniserende stråling (2-5 Gy) eller Ultrafiolett B (UVB) (0,5 J / cm2).
  3. I tillegg produserer en streng bryte positiv kontroll ved å behandle en gruppe celler med samme middel og dose, som brukes i trinn 7.2 (dvs. ingen behandling med ICL-induserende middel).
  4. Sentrifuge cellene ved 7,607 x g i 5 minutter, kast supernatanten, vask cellepelleten tre ganger med 1 ml PBS, og behandle som for alkalisk kometanalyse (trinn 3-5).
  5. Beregn nivåer av DNA-tverrbinding mellom tråder ved hjelp av formelen nedenfor.
    Equation 1
    MERK: MOTM (Mean Olive Tail Moment) er et endepunkt for kometanalyse som er mye brukt når man beskriver den ICL-modifiserte kometanalysen, og er definert som produktet av halelengden og fraksjonen av totalt DNA i halen (dvs. halemoment = halelengde x % av DNA i halen)29; TMdi: halemoment av prøver behandlet med både tverrbindingsmiddel og H2 O2 (eller annen strengbryterinduktor); TMcu: halemoment av prøver som ikke er behandlet med et tverrbindingsmiddel og ikke behandletmed H 2 O 2 (ingen behandling), og TMci: halemoment av prøver som ikke er behandlet med et tverrbindingsmiddel, men behandlet med H 2 O 2.

8. Kometscoring og dataanalyse

MERK: Begrepet "komet" stammer fra bildene av skadede celler når det ses under et mikroskop etter at analysen er utført (figur 5). Under elektroforeseforhold migrerer DNA i de uskadede cellene stort sett ikke, men forblir i en sfæroid betegnet som komet "hode". Tilstedeværelsen av trådbrudd gjør imidlertid at cellens DNA kan migrere ut av hodet og danne en "hale", noe som fører til et utseende som en komet (figur 5). Jo mer DNA i halen, jo mer skade er til stede.

  1. Slå på fluorescensmikroskopet med PI (rødt) filter (λ = 536/617 nm) og kometanalysescoringsprogramvaren.
  2. Tilsett en dråpe vann ved hjelp av en Pasteur-pipette til gelen og dekk til med et deksel.
  3. Plasser lysbildene i fluorescensmikroskopet og "score" kometer.
    MERK: Scoring er et middel som kometene vurderes, for å bestemme mengden skade som er tilstede i hver komet. I stor grad kan dette oppnås ved å bruke to tilnærminger, i henhold til brukerens valgte preferanse, enten ved øye (måle størrelsen på kometene på en skala fra null til fire) eller ved å bruke fritt eller kommersielt tilgjengelig programvare30. Vanligvis vurderer begge tilnærmingene størrelsen på komethalen, selv om en rekke kometrelaterte endepunkter kan bestemmes. Hvis du bruker programvaren, klikker du på midten av komethodet og venter til programvaren oppdager kometen automatisk, og vurderer deretter det valgte endepunktet (figur 5).
  4. Score 50 kometer per gel og 100 kometer per prøve (dvs. hver prøve tilsvarer forskjellige DNA-skadelige behandlinger, eller deres replikasjoner).
  5. Repliker eksperimentene (n = 2) eller tredobler eksperimentene (n = 3).
    MERK: Hvis bare n = 2 replikasjonseksperimenter utføres, kan statistisk analyse ikke utføres, men hvis n = 3, utfør D'agostino normalitetstesten. De fleste kometanalysedata består ikke en normalitetstest. I dette tilfellet bruker du en ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis-test med Dunns multiple comparisons-test, og Mann-Whitney tester signifikans satt til p < 0,05).

Representative Results

Optimalisering av elektroforesespenningen for HTP ACA
Humane keratinocytter (HaCaTs; Tabell over materialer) bestrålt med forskjellige doser ultrafiolett A-stråling (UVA) (5 eller 10 J/cm2; Figur 6A), UVB (0,5 eller 1 J/cm2; Figur 6B), eller behandlet med 50 μM H 2 O2 (figur 6C) for å indusere skade. Tre forskjellige spenninger av elektroforesen ble testet for å bestemme den optimale spenningen for elektroforese. Resultatene fra alle tre DNA-skadelige behandlingene viste at mens alle spenninger genererte lineære doseresponser, ble den mest følsomme responsen oppnådd med 1,19 V / cm. HaCaTs viste den høyeste baseline DNA-skaden ved bruk av 1,19 V / cm under elektroforese sammenlignet med 1 V / cm og 1,09 V / cm (figur 6A-C). Ved bruk av 1,19 V/cm ses i tillegg størst % hale-DNA, etter alle skadelige behandlinger (figur 6)31.

Påvisning av DNA-skade i humant fullblod ved hjelp av Fpg modifisert HTP ACA
Humant vuggeblod (Table of Materials) ble bestrålt med forskjellige doser på 10 J/cm2 UVA for å indusere skade. Fire forskjellige konsentrasjoner av Fpg (1, 2, 4 eller 8 U / ml) ble brukt til å bestemme den optimale konsentrasjonen for enzymbehandling i HTP ACA. Resultatene viste at de optimale nivåene av DNA-skade ble avslørt med 4 U / ml Fpg (figur 7A). Representative kometbilder fra UVA-bestrålte blodprøver (figur 7B).

Påvisning av DNA ICL i en representativ eggstokkreftcellelinje ved bruk av ICL-modifisert HTP ACA
En eggstokkreft cellelinje (SKOV-3; Tabell over materialer) ble behandlet med kombinasjoner av 200 μM cisplatin og/eller påfølgende behandling med 50 μM H 2 O2i 30 minutter på is. Det ble ikke registrert nevneverdig skade i de ueksponerte cellene (figur 8A). Eksponering for H 2 O2alene genererte en signifikant MOTM (figur 8B). I motsetning til dette viste cellene der ICL ble indusert en redusert MOTM (figur 8C) 28.

Dannelse og reparasjon av cisplatinindusert DNA ICL i en representativ, eggstokkreftcellelinje
Den ICL-modifiserte HTP ACA ble brukt til å bestemme tidsforløpet for DNA ICL-dannelse og reparasjon indusert av cisplatin i en eggstokkreftcellelinje (A2780; Tabell over materialer). Cellene ble behandlet med 100 μM cisplatin i 1 time, og deretter inkubert i cisplatinfrie medier (RPMI 1640 medium supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS)) for et påfølgende tidsforløp. På forskjellige tidspunkter ble den ICL-modifiserte HTP ACA utført for å fastslå nivåene av ICL (figur 9) 28. Ingen ICL ble påvist før cisplatinbehandling. Men etter en enkelt behandling med 100 μM cisplatin økte ICL-nivåene betydelig, med en topp på 12 timer, hvoretter nivåene gikk tilbake til null etter 30 timer.

Korrelasjon mellom DNA ICL og DNA platina nivåer
Tre eggstokkreftceller ble behandlet med 100 μM cisplatin for å indusere forskjellige nivåer av DNA-ICL, før analyse av ICL-modifisert HTP ACA og induktivt koblet massespektrometri (ICP-MS; se tilleggsfil for detaljer). Som vist i figur 10 ble forskjellige nivåer av DNA-ICL indusert i de tre cellelinjene, sammen med forskjellige nivåer av Pt i DNA. En positiv korrelasjon (R2 = 0,9235) ble observert mellom DNA ICL-nivåer og platinakonsentrasjoner, noe som indikerer sammenhengen mellom DNA platinanivåer og tilsvarende ICL28.

Base excision reparasjon i Mycoplasma-infiserte og uinfiserte BE-M17 celler
Mykoplasmainfiserte og uinfiserte BE-M17-celler ble behandlet med 50 μM H 2O2 i 30 minutter og inkubert med komplett medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% (v / v) FBS) i forskjellige varigheter (0 min, 30 min, 1 time,2timer, 6 timer, 24 timer eller 30 timer) der celler fikk lov til å reparere. Ved hvert tidspunkt ble celler samlet og frosset ved -80 ° C, i et 10% DMSO-inneholdende medium, før de utførte hOGG1-modifisert HTP ACA (trinn 6). Etter 30 minutter hadde nivåene av SB/ALS sunket til 21 % TD (prosentvis hale-DNA) i de uinfiserte cellene, mens de infiserte cellene viste 49 % TD (figur 11A). Etter ~15 timer hadde nivåene av SB/ALS returnert til baseline i både infiserte og uinfiserte celler. For de oksyderte purinene viste den uinfiserte BE-M17 først en liten økning i skade, før den gikk tilbake til baseline innen 30 timer (figur 11B). I motsetning til dette viste de infiserte cellene en vedvarende, signifikant økning i oksyderte puriner, som forble forhøyet, og gikk ikke tilbake til baseline nivåer selv etter 30 timer (figur 11B) 23.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over konvensjonell alkalisk kometanalyseprosedyre . (i) En encellet suspensjon av dyrkede celler eller en prøve av fullblod blandes med 0,6% (w / v) LMP agarose. (ii) Celle / agaroseblandingen påføres forhåndsbelagte mikroskopglass og dekkes med deksel til størknet. (iii) Cellene lyses ved hjelp av en høy pH-lysebuffer over natten, danner nukleoidlegemer, før (iv) vask med ddH2O. (v) Det cellulære DNA slapper av i den høye pH-elektroforesebufferen. Tilstedeværelsen av strengbrudd gjør at DNA kan slappe av og slappe av, og under elektroforese trekkes DNA ut av nukleoidlegemet og danner en hale. Lysbildene blir deretter (vi) drenert, tørket, (vii) nøytralisert og (viii) vasket med ddH2O før (ix) tørkes over natten. Lysbilder blir deretter (x) rehydrert med ddH2O, (xi) farget, (xii) vasket, og til slutt (xiii) scoret og analysert, vanligvis ved hjelp av fluorescerende mikroskopi og bildeanalyseprogramvare. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Materialene som utgjør kometelektroforesesystemet med høy gjennomstrømning. HTP elektroforesetank, HTP-stativer og oppvasken for lysis, vask, nøytralisering og flekker vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av et kometanalyselysbilde og HTP-rack (mikroskop lysbildebærer). (A) For riktig orientering gjenkjennes den forhåndsbelagte siden av mikroskopglasset av en svart prikk i høyre hjørne av et mikroskoplysbilde. (B) Bildet av HTP-stativet illustrerer hvordan lysbildene holdes i en tett vertikal retning, med faner på bæreren for å fikse orienteringen i elektroforesetanken. Hver transportør har plass til opptil 25 lysbilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representasjon av kjøleplaten med prøvebilder og frysepakker på plass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjermbilde av representative kometer tatt under scoring. HaCaTs (A) uten behandling og (B) behandlet med 1 J/cm2 UVB før HTP ACA ble utført. De fleste programvarepakker kan beregne en rekke kometendepunkter, men de vanligste er % hale DNA (foretrukket) eller halemoment basert på disse bildene (blå: start av hodet, grønn: midten av hodet og lilla: enden av halen). Skalaen er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative grafer som illustrerer effekten av elektroforesespenning på prosentvis hale-DNA, bestemt ved hjelp av HTP ACA. Cellene ble eksponert for (A) 5 eller 10 J/cm 2 UVA, (B) 0,5 eller 1,0 J/cm 2 UVB, eller (C) 50 μM H 2 O 2 før HTP ACA, med elektroforesespenningen ved enten 1, 1,09 eller 1,19 V/cm. Data representerer gjennomsnittet av 200 bestemmelser fra n = 2 dupliserte eksperimenter31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Representative graf- og kometbilder av humant blod analysert av Fpg-modifisert HTP ACA. Humane blodprøver ble bestrålt med 10 J/cm2 UVA eller humbugbestrålt ("ctrl") på is før lysistrinnet. Ulike konsentrasjoner av Fpg (1, 2, 4 eller 8 U/ml) ble brukt til enzymbehandling før elektroforese. (A) Data representerer gjennomsnittlig ± SEM på 300 bestemmelser fra n = 3 eksperimenter. (B) Representative bilder av kometer for hver konsentrasjon av Fpg i 10 J/cm2 UVA-bestrålte blodprøver. Skalaen er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative kometbilder som illustrerer ICL-deteksjon etter cisplatinbehandling. (A) Kontrollceller uten behandling, (B) celler som kun ble behandlet med H 2 O2 (50 μM), (C) celler som ble behandlet med H2O2 (50 μM) og cisplatin (200 μM), som illustrerer at halen er kortere enn i (B), på grunn av tilstedeværelsen av ICL28. Skalaen er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Demonstrasjon av kinetikken til cisplatinindusert ICL-dannelse og reparasjon. A2780-celler ble behandlet med 100 μM cisplatin i kulturmediet i 1 time. Det cisplatinholdige mediet ble deretter fjernet, og cellene ble dyrket for ulike tidspunkter, før analyse ved ICL-modifisert HTP ACA. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM fra n = 3 eksperimenter28. P < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Korrelasjon mellom DNA ICL og platinakonsentrasjon. DNA ICL ble bestemt av ICL-modifisert HTP ACA og platina nivåer ble målt ved ICP-MS (med Single Quad-Kinetic Energy Discrimination, SQ-KED), i tre eggstokkreftcellelinjer. R2 = 0,9235. Se Tilleggsfil for ICP-MS-metodikk for å kvantifisere platinanivåer i DNA28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: En representativ graf som illustrerer DNA-skade og reparasjon, bestemt av hOGG1-modifisert kometanalyse, i Mycoplasma-infiserte versus uinfiserte BE-M17-celler. Etter behandling med 50 μM H 2 O 2 i 30 min, fikk cellene lov til å reparere i forskjellige varigheter (0, 30 min, 1 time,2timer, 6 timer, 24 timer eller 30 timer). Den hOGG1-modifiserte HTP ACA ble brukt til å måle (A) SB / ALS og (B) oksyderte puriner i infiserte (røde datapunkter) og uinfiserte (svarte datapunkter) BE-M17-celler. Data representerer gjennomsnittet av 200 bestemmelser fra n = 2 dupliserte eksperimenter. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra en tidligere publikasjon23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagent Lager Løsning Fungerende løsning
Lysis buffer 100 mM Na 2 EDTA, 2,5 M NaCl og 10 mM Tris Base i ddH2O; juster pH til 10 med 10 M NaOH 1% Triton X-100 i lysis lagerløsning
Elektroforese buffer 10 M NaOH og 200 mM Na 2 EDTA i ddH2O 300 mM NaOH og 1 mM Na2EDTA; pH-> 13
Nøytraliseringsbuffer 0,4 m Tris base i ddH2O; juster pH til 7,5 med HCl
Farging buffer 1 mg/ml propidiumjodid 2,5 μg/ml propidiumjodid i ddH2O

Tabell 1: Sammensetning av reagenser brukt i HTP ACA. Lager og arbeidskonsentrasjoner av lysis, elektroforese, nøytralisering og fargebuffere er vist.

Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne studien demonstrerer allsidigheten som tilbys av det nåværende utstyret, som kan brukes til å oppnå høy gjennomstrømning med en rekke representative, vanlige varianter av kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodifisert, blod og ICL, og andre varianter vil også være egnet). I tillegg bringer den nåværende tilnærmingen med seg flere fordeler 20,21: (a) analysens kjøretid reduseres på grunn av manipulering av flere lysbilder parallelt (håndteringstiden reduseres med60%); b) risikoen for skade på geleer, og dermed reduseres risikoen for forsøket, (c) reagensbehovet reduseres (f.eks. er volumet av elektroforesetanken mindre enn den konvensjonelle tanken); (d) antall lysbilder kjøres økes. En tank kan gi en 20% økning i antall lysbilder som kjøres sammenlignet med en enkelt konvensjonell tank; Imidlertid kan flere elektroforesetanker kjøres eller slaves (dvs. flere tanker styres av en enkelt strømforsyning), parallelt fra samme strømforsyning, og krever fortsatt et stasjonært fotavtrykk mindre enn en enkelt konvensjonell tank med isbrett; og (e) tankavtrykket reduseres på grunn av vertikal orientering av lysbilder og integrert kjøling (sparer laboratorieplass); HTP-tanken består av en keramisk kjølebase med høy ytelse med en glideskuff som kan passe til en frossen kjølepakke for å opprettholde optimal buffertemperatur uten å måtte utføre prosessen i et kaldt rom.

Videre har kjøleplaten utviklet av oss plass til 26 kometsklier, muliggjør rask størkning av det lave smeltepunktet agarose på kometanalysens lysbilder og letter en enkel gjenfinning av lysbildene etter at agarosegelen er størknet. Ovennevnte innovasjoner gjør kometanalyseprosessen enklere og enklere.

Mens andre tilnærminger med høy gjennomstrømning er utviklet (f.eks. 12-gels kometanalyse, CometChip eller 96 mini-gelformater)25, foretrekker mange forskere å bruke de konvensjonelle mikroskoplysbildene (som inkluderer kommersielt tilgjengelige forhåndsbelagte lysbilder eller andre spesialiserte lysbilder). Den nåværende tilnærmingen kan romme alle typer mikroskop lysbilder, slik at eksperimenter ved hjelp av disse lysbildene skal skaleres opp gjennom raskere lysbildebehandling og håndtering. Som nevnt ovenfor gir HTP-kometsystemet mange fordeler, men det er en bemerkelsesverdig begrensning: den nåværende tilnærmingen gir bare en 20% økning i antall prøver som kjøres, sammenlignet med en konvensjonell horisontal tank (selv om behandlingen av lysbilder er mye raskere). CometChip og 96 mini-gel formater kjører et større antall prøver. Til dags dato vet vi ikke om den nåværende tilnærmingen kan imøtekomme CometChip eller 96 mini-gelformater, selv om vi spår at det vil. Som nevnt ovenfor kan antall prøver økes ytterligere ved å slave tanker til en enkelt strømforsyning. Som med alle tilnærminger, er det fortsatt en sjanse for å miste eller skade gelene mens du laster prøver og analyserer dem under mikroskopet, men dette skyldes mer operatørfeil, og sjansene for dette minimeres med dagens tilnærming.

Bruken av HTP-kometsystemet kan i stor grad bidra til å analysere DNA-skade, noe som letter bruken av kometanalysen i et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel molekylær epidemiologi, mannlig reproduktiv vitenskap, gentoksikologistudier og miljøtoksikologi. Dette gjelder spesielt for de brukerne som ønsker å ha alle fordelene med forbedret gjennomstrømning og brukervennlighet, uten å bevege seg bort fra de kjente, kostnadseffektive, konvensjonelle mikroskopglassene.

Disclosures

Dr. Cooke og Dr. Karbaschi er oppfinnere på tre innvilgede patenter knyttet til teknologiene beskrevet her.

Acknowledgments

Arbeidet som ble rapportert i denne publikasjonen ble delvis støttet av National Institute of Environmental Health Sciences ved National Institutes of Health under tildelingsnummer: 1R41ES030274. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 mm glass coverslips Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 631-0124
A2780 ECACC, 
Louis, MO,
 USA		 93112519
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA A467-250
Fluorescence microscope equipped with a camera Zeiss, Jena, Germany
Fresh human whole blood Zen Bio Inc SER-WB10ML Commercial human whole blood sample
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, California Data analysis software
HTP Comet Assay system Cleaver Scientific COMPAC- 50
Human Keratinocyte (HaCaTs) American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Discontinued Can be purchased from another company
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
Cat# T0020001
Hydrogen peroxide (H2O2)
30% in water		 Fisher Scientific, Hampton, NH, USA BP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS system		 Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Image and Data Analysis software Perceptive Instrument,
Bury St Edmunds, England,
UK		 125525 Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ
Internal Standard Mix SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 CL-ISM1-500 Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3
Low melting point Agarose Invitrogen
Waltham, MA, USA		 P4864
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 E5134
NaCl (Sodium chloride) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 S7653
NanoDrop One Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 701-058108 Nanodrop for measuring DNA concentration
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		 D11901 Ultrapure water (16 MΩ cm-1)
NaOH (sodium Hydroxide) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		 E5134
Normal melting point Agarose Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 16520100 For pre-coating slides
OCI-P5X University of Miami,
Miami, FL,
USA		 N/A Live Tumor Culture Core facility provided the cells
Platinum (Pt) reference standard SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 PLPT3-2Y (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch
Propidium Iodide
(1.0 mg/mL in water)		 Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen
Valencia, CA,
USA		 51304 DNA extraction Kit
Single-frosted glass microscope slides Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 12-541B
SKOV3 ECACC,
Louis, MO,
USA		 91091004
Slide box Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 03-448-2 Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye
Slide Chilling plate Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 CSL-CHILLPLATE
Treatment dish Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 STAINDISH4X
Tris-base Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 93362
Triton X-100 Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 BP151-500
Trypsin EDTA (0.5%) Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		 15400054
Vertical Slide Carrier Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 COMPAC-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  3. Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
  4. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
  5. Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
  6. Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
  7. Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
  8. Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
  9. Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
  10. Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
  11. Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
  12. Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
  13. Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
  14. Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
  15. Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
  16. Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
  17. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  18. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  19. Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
  20. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
  21. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
  22. Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
  23. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
  24. Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
  25. Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
  26. Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
  27. Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
  28. Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
  29. Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
  30. Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
  31. Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).

Tags

Biologi utgave 183 Kometanalyse DNA-skade DNA-reparasjon oksidativt stress biomarkør elektroforese
En kometanalysetilnærming med høy gjennomstrømning for å vurdere cellulær DNA-skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, Y., Karbaschi, M., Abdulwahed,… More

Ji, Y., Karbaschi, M., Abdulwahed, A., Quinete, N. S., Evans, M. D., Cooke, M. S. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (183), e63559, doi:10.3791/63559 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter