Summary
Kometanalysen er et populært middel til at opdage DNA-skader. Denne undersøgelse beskriver en tilgang til at køre dias i repræsentative varianter af kometanalysen. Denne tilgang øgede antallet af prøver betydeligt, samtidig med at analysens driftstid blev reduceret, antallet af glidemanipulationer og risikoen for skade på geler.
Abstract
Celler udsættes løbende for stoffer, der stammer fra de interne og eksterne miljøer, hvilket kan skade DNA. Denne skade kan forårsage afvigende cellefunktion, og derfor kan DNA-skader spille en kritisk rolle i udviklingen af alle større menneskelige sygdomme, f.eks. kræft, neurodegenerative og hjerte-kar-sygdomme og aldring. Enkeltcellet gelelektroforese (dvs. kometassayet) er en af de mest almindelige og følsomme metoder til at studere dannelsen og reparationen af en lang række typer DNA-skader (f.eks. Enkelt- og dobbeltstrengsbrud, alkali-labile steder, DNA-DNA-tværbindinger og i kombination med visse reparationsenzymer oxiderede puriner og pyrimidiner) både in vitro og in vivo . Systemer. Imidlertid er den lave prøvegennemstrømning af det konventionelle assay og besværlige prøveoparbejdning begrænsende faktorer for dens bredest mulige anvendelse. Med "scoring" af kometer i stigende grad automatiseret, er begrænsningen nu evnen til at behandle et betydeligt antal kometdias. Her er der udviklet en high-throughput (HTP) variant af kometassay (HTP comet assay), som signifikant øger antallet af analyserede prøver, reducerer analysens køretid, antallet af individuelle diasmanipulationer, reagenskrav og risiko for fysisk skade på gelerne. Desuden reduceres elektroforesetankens fodaftryk betydeligt på grund af glidernes lodrette orientering og integreret afkøling. Også rapporteret her er en ny tilgang til chilling komet assay dias, som bekvemt og effektivt letter størkningen af kometgelerne. Her er anvendelsen af disse enheder til repræsentative kometanalysemetoder blevet beskrevet. Disse enkle innovationer understøtter i høj grad brugen af kometanalysen og dens anvendelse på undersøgelsesområder såsom eksponeringsbiologi, økotoksikologi, bioovervågning, toksicitetsscreening/-test sammen med forståelse af patogenese.
Introduction
Celler udsættes løbende for stoffer, der stammer fra de interne og eksterne miljøer, hvilket kan skade DNA 1,2. Denne skade kan forårsage afvigende cellefunktion3, og derfor kan DNA-skader spille en kritisk rolle i udviklingen af mange større menneskelige sygdomme, fx kræft, neurodegenerativ og hjerte-kar-sygdom og aldring4. Kometanalysen (også kaldet enkeltcellet gelelektroforese) er en stadig mere populær metode til påvisning og kvantificering af cellulær DNA-skade.
På sit enkleste registrerer det alkaliske kometassay (ACA) strengbrud (SB; både enkelt og dobbelt) sammen med apuriniske / apyrimidiniske steder og alkali-labile steder (ALS), som begge bliver enkeltstrengede brud under alkaliske forhold5. Det neutrale pH-kometassay kan evaluere ærlige enkelt- og dobbeltstrengede brud6. Desuden kan ACA i kombination med en række DNA-reparationsenzymer detektere en betydelig række typer DNA-skader, f.eks. oxiderede puriner (identificeret ved anvendelse af human 8-oxoguanin DNA-glycosylase 1; hOGG17); oxiderede pyrimidiner (ved anvendelse af Endonuklease III; EndoIII) og cyclobutanpyrimidindimerer (ved anvendelse af T4-endonuklease V; T4endoV)8. Kometanalysen kan også bruges til at evaluere DNA-læsioner induceret af tværbindingsmidler, såsom cisplatin 9,10,11. Som det fremgår af analysens formelle navn, dvs. enkeltcellegelelektroforese, er analysen afhængig af, at de celler, der analyseres, er en enkeltcellesuspension; Oftest er disse dyrkede celler, men kan isoleres fra fuldblod 12,13, eller fuldblod selv kan bruges 14,15. Alternativt kan en enkeltcellesuspension genereres fra fast væv.
Bortset fra nogle få undtagelser, især CometChip-rapporterne fra Engleward-laboratoriet 16, har den overordnede kometassayprotokol ikke ændret sig dramatisk fra den, der oprindeligt blev beskrevet af assayets opfindere (Östling og Johansson17 og Singh etal.18). Kometanalysen involverer adskillige trin (figur 1). Mange af disse trin involverer overførsel af de tynde, celleholdige agarosegeler, et dias ad gangen, og udgør derfor en risiko for skade eller tab af gelen, hvilket bringer eksperimentets succes i fare. Derfor kan kometanalysen være tidskrævende, især hvis der køres et betydeligt antal dias. Typisk køres maksimalt 40 dias i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforesetank, som sidder i en endnu større bakke indeholdende våd is til afkøling. Det er for nylig blevet rapporteret, at analysens driftstid kan forkortes til 1 dag ved at reducere varigheden af lysistrinnet og ikke tørre diasene før farvning19.
De nuværende forfattere har tidligere rapporteret om en ny tilgang til high throughput alkaline comet assay (HTP ACA), hvor flere (batches af 25) kometassay mikroskop dias kan manipuleres samtidigt i hele kometassayprocessen20,21,22. Denne patenterede tilgang minimerer risikoen for skade på eller tab af de prøveholdige geler ved at fjerne behovet for at manipulere mikroskopglassene individuelt og kan anvendes på alle varianter af kometassayet, der bruger mikroskopdias. De diasholdige stativer beskytter gelerne under manipulationerne, og derfor er prøvebehandlingen hurtigere og mere effektiv. Diasene kan også gennemgå elektroforese i stativerne, holdt i lodret snarere end vandret orientering. Dette og integreret afkøling reducerer elektroforesetankens fodaftryk betydeligt og fjerner behovet for våd is. Samlet set udgør dette en betydelig forbedring i forhold til den konventionelle procedure. Det anvendte udstyr er illustreret i figur 2. De her beskrevne protokoller viser ved hjælp af denne nye tilgang den repræsentative anvendelse på dyrkede celler og fuldblod14 til påvisning af alkali-labile steder (ALS), DNA-inter-strengs tværbindinger (ICL) og substraterne af forskellige DNA-reparationsenzymer.
Protocol
Kommercielt tilgængelige blodprøver blev brugt i denne undersøgelse. På vores institution er Institutional Review Board-godkendelse ikke nødvendig for brugen af kommercielt tilgængeligt blod.
1. Forberedelse af materialer til kometanalysen
- Forberedelse af mikroskopdias
- Hæld 1% (w/v) normal smeltepunkt agarose [opløst i dobbeltdestilleret vand (ddH 2 O)]i et 50 ml rør og mikrobølgeovn for at opløse agarosen i ddH2O. Opbevares ved 37 °C for at forhindre størkning inden belægningsskred. Hvis der sker størkning, kasseres og frisk.
- Pre-coat mikroskop glider ved at dyppe diasene i 50 ml røret indeholdende 1% (w / v) normal smeltepunkt agarose.
- Tør bagsiden af diasene hurtigt efter at have dyppet diasene.
BEMÆRK: Manglende sletning af bagsiden af diasene korrekt vil øge baggrundsstøjen fra diasene under analysen trin for mikroskop. - Mærk det coatede dias med en permanent markør i nederste højre hjørne af den frostede sektion (figur 3A). Dette viser, hvilken side af diaset der er forbelagt.
- Lad agarosen sætte sig og tørre natten over ved stuetemperatur.
- Pak de tørrede dias i silkepapir og opbevar dem i en kasse.
2. Forberedelse af prøver
- Dyrkede celler
BEMÆRK: For det første skal du behandle celler med det eller de skadelige midler, inden kometanalysen påbegyndes. Udfør derefter følgende.- Hvis cellerne er klæbende, trypsiniserer cellerne for at frigive dem fra cellekulturkolben eller cellekulturen petriskåle ved passende sammenløb af celler. Neutraliser trypsin ved at tilføje serumholdige medier.
- Overfør cellerne til et 50 ml rør, centrifuge (f.eks. til HaCaTs, centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur), fjern forsigtigt supernatanten, og tilsæt 1 ml PBS til cellepelleten.
- Udfør celletælling.
- Overfør 30.000 celler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge ved 7.607 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt supernatanten, og opbevar cellepelleten på is i mørket, inden kometanalysen udføres.
BEMÆRK: Celler bør regelmæssigt testes for Mycoplasma-kontaminering, inden kometanalysen udføres for blandt andet at forhindre dannelse af artefaktuel DNA-skade og ændret DNA-skaderespons, som rapporteret andetsteds23. Centrifugeringsbetingelserne kan ændres efter behov afhængigt af den anvendte celletype.
- Forberedelse af dyrkede celler til reparationsanalyse
- Kulturceller i cellekulturkolben eller petriskåle.
- Cellerne vaskes med 1 ml PBS to gange, før cellerne behandles med skadelige stoffer (f.eks. for BE-M17-celler, behandles med 50 μM H2O2i 20 min) på is for at forhindre, at reparationen sker under behandlingen.
- Cellerne vaskes forsigtigt med 1 ml PBS to gange for at fjerne eventuelle resterende skadelige stoffer.
- Genindfør cellekulturmediet, og lad cellerne reparere i varierende varighed (f.eks. 0 min, 30 min, 2 timer, 6 timer, 24 timer og 30 timer) i en befugtet inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- På hvert tidspunkt indsamles 30.000 celler i 10% dimethylsulfoxid (DMSO) -indeholdende cellekulturmedium og opbevares ved -80 ° C.
- Før kometanalysen udføres, optøs cellerne hurtigt ved 37 °C i et vandbad og centrifugerer dem ved 7,607 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, og opbevar cellepelleten på is, inden analysen udføres (dvs. fra trin 3).
- Forberedelse af fuldblod
BEMÆRK: Følgende metode drager fordel af (i) at være en minimalt invasiv tilgang til at få en blodprøve, (ii) ikke kræver isolering af PBMC før kometassayet og (iii) tillader blodprøver (med et volumen < 250 μL) at blive opbevaret ved -80 ° C i op til 1 måned (selvom nyere beviser tyder på, at længere opbevaring er mulig), uden behov for kryopræserveringsmidler og uden risiko eller dannelse af artefaktskader14. Etisk godkendelse eller tilsvarende kan være nødvendig, før der tages blodprøver fra patienter eller dyr. Alternativt kan kommercielt tilgængelige blodprøver anvendes som i denne undersøgelse. På vores institution er Institutional Review Board-godkendelse ikke nødvendig for brugen af kommercielt tilgængeligt blod.- Ved hjælp af en pipette overføres fuldblodsprøver (<250 μL) (materialetabel) til et opsamlingsrør indeholdende et minimalt volumen indeholdende 0,4 mg EDTA (pr. 250 μL blod).
- Frys blodprøverne ved -80 °C, før du udfører HTP-kometanalysen.
- Optøning opbevarede blodprøver (<250 μL) ved stuetemperatur uden opvarmning.
- Overfør 5 μL fuldblod til mikrocentrifugerør, inden kometassayet udføres (se trin 3).
3. Cellelyse
BEMÆRK: Udfør alle procedurer på is.
- Brug 12.000 celler eller 2,5 μL fuldblod pr. Gel.
- Der forberedes 0,6 % (w/v) lavt smeltepunkt agarose opløst i PBS ved hjælp af en mikrobølgeovn, og anbringes i et vandbad ved 37 °C for at forhindre, at det størkner.
- Mærk den frostede ende af de præ-coatede dias med efterforskerens navn, dato og behandlingsoplysninger ved hjælp af en permanent markør eller blyant.
- Anbring en køleplade på en flad bænk, og indsæt de to frosne kølepakker i skydeskuffen under metaloverfladen (som vist i figur 4)21.
- Placer diasene på kølepladen, og lad diasene forkøle i 1-2 minutter, før du tilføjer de 0,6% (w / v) lave smeltepunkt agaroseholdige celler (trin 3.7).
BEMÆRK: Hvis du lader diasene stå på kølepladen i mere end 1-2 minutter, kan der dannes kondens på glidefladen på grund af luftfugtighed. Dette kan gøre det lave smeltepunkt agarose geler mindre stabile på diasene. - Pelleten (trin 2.2.7) spredes ved hvirveldannelse. Sørg for, at al supernatant er fjernet fra pelleten. Prøverørene (indeholdende pelleterede celler) lægges straks tilbage på is.
BEMÆRK: Når du placerer de prøveholdige rør i centrifugen, skal du sætte dem med hængslet udad, så pelleten opsamles på denne side af røret. Nogle gange er det svært at se pellet, og det er let at løsne det, mens man fjerner supernatanten. Centrifugering med rørlåget i denne retning vil gøre det muligt for en at vide, hvor cellepelleten vil være. - Resuspender cellepelleten med 200 μL 0,6% lavt smeltepunkt agarose (LMP agarose) og bland ved pipettering op og ned uden at skabe bobler. Overfør derefter hurtigt 80 μL LMP-agaroseholdige celler til et kølet dias og læg hurtigt en dæksel på gelen.
- Lad gelen sætte sig på kølepladen i 1-2 min.
- I mellemtiden fremstilles en 500 ml arbejdsløsning af lysisbuffer (tabel 1) og hældes i lysisskålen (figur 2).
- Når gelerne er indstillet, skal du fjerne dækslikkerne hurtigt ved forsigtigt at holde glideren mellem tommel- og pegefinger og skubbe dækslikket af gelen.
- Placer diasene med prøver inde i glideholderen (alle de sorte "prikmærker" på dias skal vende i samme retning, når de placeres i en bærer) (figur 3B), og placer derefter glideholderen inde i lysisbeholderen (figur 2).
- Luk låget på lysisskålen, og opbevar lysisskålen i køleskabet natten over ved 4 °C eller 30 min ved stuetemperatur, alt efter hvad der passer bedst til operatørens tidsplan19.
4. Elektroforese
- Fjern forsigtigt glideholderen fra lysisskålen. Pas på ikke at forstyrre gelerne.
- Anbring forsigtigt glideholderen i en vaskeplade, der er forudfyldt med iskold ddH2O, og lad den stå i 30 minutter, så dias er helt dækket af ddH2O.
- Indsæt en frossen kølepakke inde i glideskuffen under elektroforesetanken for at opretholde optimal buffertemperatur.
- Tilsæt forsigtigt iskold elektroforesearbejdsløsning (tabel 1) til elektroforesetanken, og overfør glidebæreren til elektroforesetanken. Orienter diasene, så deres klare dele med de celleholdige geler (dvs. IKKE de frostede / mærkningsender) peger mod katoden (rød elektrode).
- Lad lysbillederne sidde i elektroforesetanken i 20 minutter, så DNA'et slapper af og slapper af. Hold strømforsyningen slukket under dette trin.
- Hvis det er nødvendigt, skal du indsætte en ny frossen kølepakke for at maksimere kølingen.
- Udfør elektroforese i 20 min ved 1,19 V/cm, eller hvilke forhold der nu er optimeret.
BEMÆRK: Optimering af elektroforesekørselsforhold og volumen af buffer anbefales til hvert laboratorium24. Brug af kun en enkelt glidebærer under elektroforese forårsager ingen effekt af dias på elektroforesebufferens modstand, og forfatterne så ikke en signifikant effekt i spændingen eller strømmen, da antallet af dias ændrede sig. - Sluk for strømforsyningen, fjern forsigtigt glidebæreren fra elektroforesetanken, og lad den dræne på silkepapir i 30 s.
- Anbring glidebæreren i skålen, der indeholder neutraliseringsbuffer (tabel 1). Lad det stå i 20 min.
- Fjern glideholderen fra neutraliseringsskålen, læg den i vaskefadet, der indeholder iskold ddH2O, og lad den stå i 20 min.
- Fjern glideholderen fra vandet, og lad rutsjebanerne tørre i en inkubator ved 37 °C i 1 time eller ved stuetemperatur natten over eller tør ikke, afhængigt af operatørens skema19.
BEMÆRK: Hvis der ikke er tørring i trin 4.11, skal du udføre farvningstrinnet fra 5.2.
5. Propidiumiodid (PI) farvning
- Overfør glideholderen til en vaskeplade, der indeholder iskold ddH2O for at rehydrere diasene, og lad den stå i 30 minutter.
- Anbring glideholderen i en farvningsskål indeholdende 2,5 μg/ml propidiumiodidopløsning.
BEMÆRK: Propidiumiodid er lysfølsomt, så håndter det i et mørkt område. Det er også giftigt. - Luk låget på farvningsskålen og inkuber det i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Overfør glideholderen til en separat skål, og vask den med iskold ddH2O i 20 min.
- Tag glideholderen ud af beholderen, og tør den helt i mørke, enten i en 37 °C inkubator eller ved stuetemperatur, afhængigt af operatørens tidsplan eller præferencer.
- Når diasene er tørret helt, skal du fjerne dem fra glideholderen og opbevare dem i en diasboks i mørke, indtil de er klar til billedanalyse.
BEMÆRK: Diasene forbliver læsbare på ubestemt tid og kan om nødvendigt farves igen.
6. Enzymmodificeret alkalisk kometassay
BEMÆRK: Det enzymmodificerede alkaliske kometassay anvender et enzymbehandlingstrin efter lyse, men før elektroforese. Enzymets aktivitet forårsager brud i DNA'et på steder, der er substrater for enzymet. Før denne analyse udføres, skal enzymkoncentrationen og varigheden af enzyminkubation optimeres.
- Efter cellelysen (trin 3) glider vasken to gange med iskold ddH2O i 20 minutter hver.
- Fjern glideholderen fra vandet, og overfør diasene til en bakke foret med papirhåndklæder.
- Der tilsættes 80 μL af enzymet i den optimerede koncentration (f.eks. 3,2 U/ml hOGG1 til BE-M17-celler, fortyndet i enzymreaktionsbuffer) og dækkes med en dækslip for at sprede enzymet over den gelholdige prøve.
- Inkuber diasene ved 37 °C i den optimerede varighed (f.eks. 45 minutter for hOGG1).
- Efter inkubation skal du fjerne dækslerne forsigtigt og overføre diasene til transportøren.
BEMÆRK: Vask ikke diasene efter enzymbehandling; Udfør elektroforese direkte fra trin 4.3.
7. DNA inter-streng crosslinks (ICL)-modificeret alkalisk kometassay
BEMÆRK: Konceptet med denne variant af ICL-ACA er, at tilstedeværelsen af ICL i DNA vil forsinke den elektroforetiske migration af beskadiget DNA, induceret efter eksponering for en oxidativt genereret fornærmelse. I dette tilfælde, jo kortere komethalen er, desto større er antallet af ICL25,26,27,28.
- Behandle celler med et reagens, der inducerer ICL (f.eks. cisplatin; se supplerende fil).
- Udsæt de behandlede celler med et af følgende midler for at inducere tilstrækkelige strengbrud til at skabe en komethale af passende størrelse (~ 20% hale-DNA): hydrogenperoxid (50 μMH2O2i 30 minutter), ioniserende stråling (2-5 Gy) eller ultraviolet B (UVB) (0,5 J / cm 2).
- Derudover produceres en streng break positiv kontrol ved at behandle et parti celler med samme middel og dosis, som anvendes i trin 7.2 (dvs. ingen behandling med ICL-inducerende middel).
- Centrifuger cellerne ved 7,607 x g i 5 minutter, kassér supernatanten, vask cellepelleten tre gange med 1 ml PBS, og behandl som for det alkaliske kometassay (trin 3-5).
- Beregn niveauer af DNA-tværstrengskrydsbinding ved hjælp af nedenstående formel.
BEMÆRK: MOTM (Mean Olive Tail Moment) er et kometassayendepunkt, der i vid udstrækning anvendes til beskrivelse af det ICL-modificerede kometassay, og defineres som produktet af halelængden og brøkdelen af det samlede DNA i halen (dvs. halemoment = halelængde x % af DNA i halen)29; TMdi: halemoment for prøver behandlet med både tværbindingsmiddel ogH2O2(eller anden strengbryderinducer); TMcu: halemoment for prøver, der ikke er behandlet med et tværbindingsmiddel og ikke behandlet med H2O2 (ingen behandling), og TMci: halemoment for prøver, der ikke er behandlet med et tværbindingsmiddel, men behandlet medH2O2.
8. Kometscoring og dataanalyse
BEMÆRK: Udtrykket "komet" stammer fra billederne af beskadigede celler, når de ses under et mikroskop, efter at analysen er udført (figur 5). Under elektroforesebetingelser migrerer DNA i de ubeskadigede celler stort set ikke, men forbliver i en sfæroid betegnet som komet "hoved". Tilstedeværelsen af strengbrud gør det imidlertid muligt for cellens DNA at migrere ud af hovedet og danne en "hale", hvilket fører til et udseende som en komet (figur 5). Jo mere DNA i halen, jo mere skade er der til stede.
- Tænd fluorescensmikroskopet med PI -filteret (rødt) (λ = 536/617 nm) og kometanalysesoftwaren.
- Tilsæt en dråbe vand med en Pasteur-pipette til gelen og dæk med en dæksel.
- Placer diasene i fluorescensmikroskopet og "score" kometer.
BEMÆRK: Scoring er et middel, hvormed kometer vurderes, for at bestemme mængden af skade, der er til stede i hver komet. Generelt kan dette opnås ved at bruge to tilgange, alt efter brugerens valgte præference, enten ved øje (måling af størrelsen på kometer på en skala fra nul til fire) eller ved at bruge frit eller kommercielt tilgængeligt software30. Generelt vurderer begge tilgange størrelsen af komethalen, selvom en række kometrelaterede endepunkter kan bestemmes. Hvis du bruger softwaren, skal du klikke på midten af komethovedet og vente, indtil softwaren registrerer kometen automatisk og derefter vurderer det valgte slutpunkt (figur 5). - Score 50 kometer pr. gel og 100 kometer pr. prøve (dvs. hver prøve svarende til forskellige DNA-skadelige behandlinger eller deres replikater).
- Repliker eksperimenterne (n = 2) eller tredoble eksperimenterne (n = 3).
BEMÆRK: Hvis der kun udføres n = 2 replikateksperimenter, kan statistisk analyse ikke udføres, men hvis n = 3, skal du udføre D'agostino normalitetstesten. De fleste kometanalysedata består ikke en normalitetstest. I dette tilfælde skal du bruge en ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis-test med Dunns multiple sammenligningstest, og Mann-Whitney tester signifikans sat til p < 0,05).
Representative Results
Optimering af elektroforesespændingen til HTP ACA
Humane keratinocytter (HaCaTs; Tabel over materialer) blev bestrålet med forskellige doser ultraviolet A-stråling (UVA) (5 eller 10 J/cm2; Figur 6A), UVB (0,5 eller 1 J/cm2; Figur 6B) eller behandlet med 50 μM H2O2 (figur 6C) for at fremkalde skade. Tre forskellige spændinger af elektroforesen blev testet for at bestemme den optimale spænding til elektroforese. Resultaterne fra alle tre DNA-skadelige behandlinger afslørede, at mens alle spændinger genererede lineære dosisresponser, blev det mest følsomme respons opnået med 1,19 V / cm. HaCaTs viste den højeste baseline DNA-skade ved hjælp af 1,19 V / cm under elektroforese sammenlignet med 1 V / cm og 1,09 V / cm (figur 6A-C). Derudover ses det største % hale-DNA ved hjælp af 1,19 V/cm efter alle skadelige behandlinger (figur 6)31.
Påvisning af DNA-skader i humant fuldblod ved hjælp af Fpg-modificeret HTP ACA
Humant vævsblod (materialetabel) blev bestrålet med forskellige doser på 10 J/cm2 UVA for at fremkalde skade. Fire forskellige koncentrationer af Fpg (1, 2, 4 eller 8 U/ml) blev anvendt til at bestemme den optimale koncentration for enzymbehandling i HTP ACA. Resultaterne viste, at de optimale niveauer af DNA-skader blev afsløret med 4 U / ml Fpg (figur 7A). Repræsentative kometbilleder fra UVA-bestrålede blodprøver (figur 7B).
Påvisning af DNA ICL i en repræsentativ ovariecancercellelinje ved hjælp af ICL-modificeret HTP ACA
En cellelinje for kræft i æggestokkene (SKOV-3; Tabel over materialer) blev behandlet med kombinationer af 200 μM cisplatin og/eller efterfølgende behandling med 50 μM H2O2 i 30 minutter på is. Der blev ikke konstateret nævneværdige skader i de ueksponerede celler (figur 8A). Eksponering for H2O2 alene genererede en signifikant MOTM (figur 8B). I modsætning hertil viste cellerne, hvori ICL blev induceret, en nedsat MOTM (figur 8C)28.
Dannelse og reparation af cisplatininduceret DNA ICL i en repræsentativ ovariecancercellelinje
Den ICL-modificerede HTP ACA blev brugt til at bestemme tidsforløbet for DNA ICL dannelse og reparation induceret af cisplatin i en ovariecancer cellelinje (A2780; Tabel over materialer). Cellerne blev behandlet med 100 μM cisplatin i 1 time og derefter inkuberet i cisplatinfrie medier (RPMI 1640 medium suppleret med 10% (v/v) føtalt bovint serum (FBS)) til et efterfølgende tidsforløb. På forskellige tidspunkter blev den ICL-modificerede HTP ACA udført for at fastlægge niveauerne for ICL (figur 9)28. Der blev ikke påvist ICL før behandling med cisplatin. Efter en enkelt behandling med 100 μM cisplatin steg ICL-niveauerne imidlertid betydeligt og toppede ved 12 timer, hvorefter niveauerne faldt tilbage til nul efter 30 timer.
Korrelation mellem DNA ICL og DNA platin niveauer
Tre ovariecancerceller blev behandlet med 100 μM cisplatin for at inducere forskellige niveauer af DNA-ICL, før analyse af ICL-modificeret HTP ACA og induktivt koblet massespektrometri (ICP-MS; se supplerende fil for detaljer). Som vist i figur 10 blev forskellige niveauer af DNA-ICL induceret i de tre cellelinjer sammen med forskellige niveauer af Pt i DNA. En positiv korrelation (R2 = 0,9235) blev observeret mellem DNA ICL-niveauer og platinkoncentrationer, hvilket indikerer sammenhængen mellem DNA-platinniveauer og den tilsvarende ICL28.
Reparation af baseudskæring i Mycoplasma-inficerede og uinficerede BE-M17-celler
Mycoplasma-inficerede og uinficerede BE-M17-celler blev behandlet med 50 μM H2O2i 30 minutter og inkuberet med komplet medium (Dulbeccos modificerede Eagle's medium suppleret med 10% (v / v) FBS) i forskellige varigheder (0 min, 30 min, 1 time, 2 h, 6 h, 24 h eller 30 h), hvor celler fik lov til at reparere. På hvert tidspunkt blev celler opsamlet og frosset ved -80 ° C i et 10% DMSO-indeholdende medium, før de udførte hOGG1-modificeret HTP ACA (trin 6). Efter 30 minutter var niveauet af SB/ALS faldet til 21% TD (procentvis hale-DNA) i de uinficerede celler, mens de inficerede celler viste 49% TD (figur 11A). Efter ~ 15 timer var niveauet af SB / ALS vendt tilbage til baseline i både inficerede og uinficerede celler. For de oxiderede puriner viste den uinficerede BE-M17 oprindeligt en lille stigning i skaden, før den vendte tilbage til baseline inden for 30 timer (figur 11B). I modsætning hertil viste de inficerede celler en vedvarende, signifikant stigning i oxiderede puriner, som forblev forhøjede og ikke vendte tilbage til baseline-niveauer selv efter 30 timer (figur 11B)23.
Figur 1: Oversigt over den konventionelle alkaliske kometassayprocedure . i) En enkeltcellesuspension af dyrkede celler eller en prøve af fuldblod blandes med 0,6 % (w/v) LMP-agarose. ii) Celle/agarose-blandingen påføres præcoatede mikroskopglas og dækkes med dæksel, indtil den er størknet. (iii) Cellerne lyseres ved hjælp af en høj pH-lysisbuffer natten over, der danner nukleoidlegemer, før (iv) vask med ddH2O. (v) Det cellulære DNA afvikles i elektroforesebufferen med høj pH. Tilstedeværelsen af strandbrud gør det muligt for DNA'et at slappe af og slappe af, og under elektroforese trækkes DNA'et ud af nukleoidlegemet og danner en hale. Lysbillederne drænes derefter (vi) drænes, tørres, (vii) neutraliseres og (viii) vaskes med ddH2O, inden (ix) tørres natten over. Dias rehydreres derefter med ddH2O, (xi) farves, (xii) vaskes og til sidst (xiii) scores og analyseres, typisk ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og billedanalysesoftware. Dette tal er gengivet fra en tidligere publikation20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Materialerne i kometelektroforesesystemet med høj kapacitet. HTP elektroforese tank, HTP racks, og opvasken til lyse, vask, neutralisering, og farvning er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af et kometassayglas og HTP-rack (mikroskop-diasbærer). (A) For korrekt orientering genkendes mikroskopets præcoatede overflade af en sort prik i højre hjørne af et mikroskopglas. (B) Billedet af HTP-stativet illustrerer, hvordan diasene holdes i en stram lodret retning med faner på bæreren for at fastgøre dens orientering i elektroforesetanken. Hver operatør kan rumme op til 25 dias. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gengivelse af kølepladen med prøveglas og frysepakker på plads. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skærmbillede af repræsentative kometer taget under scoring. HaCaTs (A) uden behandling og (B) behandlet med 1 J/cm2 UVB før udførelse af HTP ACA. De fleste softwarepakker kan beregne en række kometendepunkter, men de mest almindelige er % hale-DNA (foretrukket) eller halemoment baseret på disse billeder (blå: start af hovedet, grøn: midten af hovedet og lilla: slutningen af halen). Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentative grafer, der illustrerer effekten af elektroforesespænding på procentvis hale-DNA, bestemt ved hjælp af HTP ACA. Celler blev udsat for (A) 5 eller 10 J / cm 2 UVA, (B) 0,5 eller 1,0 J / cm 2 UVB eller (C) 50 μM H 2 O 2 før HTP ACA, med elektroforesespændingen ved enten 1, 1,09 eller 1,19 V / cm. Data repræsenterer gennemsnittet af 200 bestemmelser fra n = 2 duplikateksperimenter31. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Repræsentative graf- og kometbilleder af humant blod analyseret af Fpg-modificeret HTP ACA. Blodprøver fra mennesker blev bestrålet med 10 J/cm2 UVA eller skinbestrålet (»ctrl«) på is forud for lysistrinnet. Forskellige koncentrationer af Fpg (1, 2, 4 eller 8 U/ml) blev anvendt til enzymbehandlingen før elektroforese. (A) Data repræsenterer gennemsnittet ± SEM af 300 bestemmelser fra n = 3 forsøg. (B) Repræsentative billeder af kometer for hver koncentration af Fpg i 10 J/cm2 UVA-bestrålede blodprøver. Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Repræsentative kometbilleder, der illustrerer ICL-detektion efter behandling med cisplatin. (A) Kontrolceller uden behandling, (B) celler, der kun blev behandlet medH2O2(50 μM), (C) celler, der blev behandlet med H2O2 (50 μM) og cisplatin (200 μM), hvilket illustrerer, at halen er kortere end i (B) på grund af tilstedeværelsen af ICL 28. Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Demonstration af kinetikken af cisplatininduceret ICL-dannelse og reparation. A2780-celler blev behandlet med 100 μM cisplatin i dyrkningsmediet i 1 time. Det cisplatinholdige medium blev derefter fjernet, og cellerne blev dyrket i forskellige tidspunkter, før analyse af ICL-modificeret HTP ACA. Data repræsenterer middelværdi ± SEM fra n = 3 eksperimenter28. P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Korrelation mellem DNA ICL og platinkoncentration. DNA ICL blev bestemt af ICL-modificeret HTP ACA og platin niveauer blev målt af ICP-MS (med Single Quad-Kinetic Energy Discrimination, SQ-KED), i tre ovariecancer cellelinjer. R2 = 0,9235. Se supplerende fil for ICP-MS-metode til kvantificering af platinniveauer i DNA28. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: En repræsentativ graf, der illustrerer DNA-skader og reparation, bestemt af det hOGG1-modificerede kometassay, i Mycoplasma-inficerede versus uinficerede BE-M17-celler. Efter behandling med 50 μM H 2 O 2 i 30 minutter fik cellerne lov til at reparere i forskellige varigheder (0, 30 min, 1 time,2h, 6 h, 24 timer eller 30 timer). Den hOGG1-modificerede HTP ACA blev brugt til at måle (A) SB / ALS og (B) oxiderede puriner i inficerede (røde datapunkter) og uinficerede (sorte datapunkter) BE-M17 celler. Data repræsenterer gennemsnittet af 200 bestemmelser fra n = 2 duplikateksperimenter. Dette tal er gengivet med tilladelse fra en tidligere publikation23. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Lagerløsning | Arbejdsløsning | |
| Lysis buffer | 100 mM Na 2 EDTA, 2,5 M NaCl og 10 mM Tris base i ddH2O; juster pH til 10 med 10 M NaOH | 1% Triton X-100 i lysis stamopløsning | |
| Elektroforese buffer | 10 M NaOH og 200 mM Na 2 EDTA i ddH2O | 300 mM NaOH og 1 mM Na2EDTA; pH > 13 | |
| Neutraliseringsbuffer | 0,4 m tris base i ddH2O; juster pH til 7,5 med HCI | ||
| Farvning buffer | 1 mg/ml propidiumiodid | 2,5 μg/ml propidiumiodid i ddH2O | |
Tabel 1: Sammensætning af reagenser anvendt i HTP ACA. Lager- og arbejdskoncentrationerne af lysis, elektroforese, neutralisering og farvningsbuffere vises.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne undersøgelse viser alsidigheden fra det nuværende udstyr, som kan bruges til at opnå høj gennemstrømning med en række repræsentative, almindelige varianter af kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodificeret, blod og ICL, og andre varianter vil også være egnede). Desuden medfører den nuværende tilgang flere fordele 20,21: a) analysens driftstid reduceres på grund af manipulation af flere dias parallelt (håndteringstiden falder med60 %); b) risikoen for beskadigelse af geler og dermed risikoen for forsøget mindskes c) reagenskravene er nedsat (f.eks. er elektroforesetankens volumen mindre end den konventionelle tank) d) antallet af kørsler øges. En tank kan give en 20% stigning i antallet af dias, der køres sammenlignet med en enkelt konventionel tank; Imidlertid kan flere elektroforesetanke køres eller slaves (dvs. flere tanke styret af en enkelt strømforsyning) parallelt fra den samme strømforsyning og kræver stadig et bordfodaftryk, der er mindre end en enkelt konventionel tank med isbakke; og (e) tankens fodaftryk reduceres på grund af lodret orientering af dias og integreret køling (sparer laboratorieplads); HTP-tanken består af en højtydende keramisk kølebase med en glidende skuffe, der kan passe til en frossen kølepakke for at opretholde optimal buffertemperatur uden at skulle udføre processen i et koldt rum.
Desuden rummer den køleplade, vi har udviklet, 26 kometrutsjebaner, muliggør hurtig størkning af det lave smeltepunkt agarose på kometassay-diasene og letter en let hentning af diasene, efter at agarosegelen er størknet. Ovenstående innovationer gør kometanalyseprocessen enklere og lettere.
Mens der er udviklet andre tilgange med høj kapacitet (f.eks. 12-gel kometassay, CometChip eller 96 mini-gelformater)25, foretrækker mange forskere at bruge de konventionelle mikroskopdias (som inkluderer de kommercielt tilgængelige præ-coatede dias eller andre specialiserede dias). Den nuværende tilgang kan rumme alle typer mikroskopdias, hvilket gør det muligt at skalere eksperimenter, der bruger disse dias, op gennem hurtigere diasbehandling og håndtering. Som nævnt ovenfor giver HTP-kometsystemet mange fordele, men der er en bemærkelsesværdig begrænsning: Den nuværende tilgang giver kun en stigning på 20% i antallet af prøver, der køres, sammenlignet med en konventionel vandret tank (selvom behandling af dias er meget hurtigere). CometChip og 96 mini-gel formater kører et større antal prøver. Til dato ved vi ikke, om den nuværende tilgang kan rumme CometChip- eller 96 mini-gel-formaterne, selvom vi forudsiger, at det vil. Som nævnt ovenfor kan antallet af prøver øges yderligere ved at slavebinde tanke til en enkelt strømforsyning. Som med alle tilgange er der stadig en chance for at miste eller beskadige gelerne, mens de indlæser prøver og analyserer dem under mikroskopet, men det skyldes mere operatørfejl, og chancerne for dette minimeres med den nuværende tilgang.
Brugen af HTP komet system kan i høj grad hjælpe med at analysere DNA-skader, lette brugen af komet assay i en bred vifte af applikationer, såsom molekylær epidemiologi, mandlig reproduktiv videnskab, genotoksikologi undersøgelser, og miljøtoksikologi. Dette gælder især for de brugere, der ønsker at have alle fordelene ved forbedret gennemstrømning og brugervenlighed uden at bevæge sig væk fra de velkendte, omkostningseffektive, konventionelle mikroskopdias.
Disclosures
Dr. Cooke og Dr. Karbaschi er opfindere på tre udstedte patenter vedrørende de teknologier, der er beskrevet her.
Acknowledgments
Det arbejde, der er rapporteret i denne publikation, blev delvist støttet af National Institute of Environmental Health Sciences fra National Institutes of Health under tildelingsnummer: 1R41ES030274. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle opfattelse af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
| A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
| Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
| Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
| Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
| HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
| Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
| Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
| ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
| Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
| Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
| Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
| Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
| Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
| NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
| OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
| Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
| Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
| Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
| SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
| Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
| Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
| Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
| Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
| Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
| Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L.
- Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
- Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
- Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
- Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
- Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
- Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
- Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
- Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
- Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
- Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
- Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
- Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
- Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
- Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
- Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
- Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
- Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
- Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
- Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
- Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
- Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
- Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
- Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
- Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
