Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63561
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الانتشار في كل مكان لركيزة معينة و E3 ubiquitin-ligase في خلايا الثدييات. تم استخدام خطوط الخلايا HEK293T للإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم تنقية الركيزة متعددة التواجدات في كل مكان من تحلل الخلايا عن طريق الترسيب المناعي ، وتم حلها في SDS-PAGE. تم استخدام النشاف المناعي لتصور هذا التعديل بعد الترجمة.

Abstract

في كل مكان هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يحدث في الخلايا حقيقية النواة التي تعتبر حاسمة لتنظيم العديد من المسارات البيولوجية، بما في ذلك بقاء الخلايا، وانتشار، والتمايز. إنها عملية عكسية تتكون من ارتباط تساهمي للأوبيكويتين بالركيزة من خلال تفاعل متتالي لثلاثة إنزيمات مختلفة على الأقل ، تتكون من E1 (إنزيم تنشيط Ubiquitin) ، E2 (إنزيم يوبيكويتين المقترن) ، و E3 (إنزيم Ubiquitin-ligase). يلعب مجمع E3 دورا مهما في التعرف على الركيزة والانتشار في كل مكان. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتقييم انتشار الركيزة في خلايا الثدييات باستخدام النقل المشترك العابر للبلازميد الذي يشفر الركيزة المحددة ، و E3 ubiquitin ligase ، و ubiquitin المعلمة. قبل التحلل ، يتم التعامل مع الخلايا المنقولة باستخدام مثبط البروتيازوم MG132 (كاربوبنزوكسي-لو-لو-ليوسينال) لتجنب تدهور البروتيسومال الركيزة. علاوة على ذلك ، يتم تقديم مستخلص الخلايا إلى الترسيب المناعي على نطاق صغير (IP) لتنقية الركيزة متعددة الكل كل مكان للكشف عنها لاحقا عن طريق النشاف الغربي (WB) باستخدام أجسام مضادة محددة لعلامة ubiquitin. وبالتالي ، يتم وصف بروتوكول متسق وغير معقد لفحص الانتشار في كل مكان في خلايا الثدييات لمساعدة العلماء في معالجة انتشار ركائز محددة وغازات E3 في كل مكان.

Introduction

تعد التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) آلية مهمة فيما يتعلق بتنظيم البروتين ، وهو أمر ضروري لتوازن الخلايا. انتشار البروتين في كل مكان هو تعديل ديناميكي ومعقد يخلق مجموعة متنوعة من الإشارات المختلفة مما يؤدي إلى العديد من النتائج الخلوية في الكائنات حقيقية النواة. في كل مكان هو عملية عكسية تتكون من ربط بروتين يوبيكويتين يحتوي على 76 من الأحماض الأمينية بالركيزة ، ويحدث في سلسلة إنزيمية تتكون من ثلاثة تفاعلات متميزة1. تتميز الخطوة الأولى بتنشيط يوبيكويتين ، والذي يعتمد على التحلل المائي ATP لتشكيل يوبيكويتين عالي الطاقة مرتبط بالثيوستر بين ubiquitin C-terminus وبقايا السيستين الموجودة في الموقع النشط لإنزيم E1. في وقت لاحق ، يتم نقل يوبيكويتين إلى إنزيم E2 الذي يشكل مركبا محبوبا بالثيوستر مع يوبيكوتين. بعد ذلك ، يتم ربط ubiquitin تساهميا بالركيزة بواسطة E2 ، أو في كثير من الأحيان ، بواسطة إنزيم E3 ، الذي يتعرف على الركيزة 2,3 ويتفاعل معها. في بعض الأحيان ، تكون إنزيمات E4 (عوامل استطالة سلسلة Ubiquitin) ضرورية لتعزيز تجميع سلسلة multiubiquitin3.

يحتوي Ubiquitin على سبعة بقايا ليسين (K6 و K11 و K27 و K29 و K33 و K48 و K63) ، مما يسمح بتكوين سلاسل polyubiquitin التي تولد روابط متميزة لإنتاج هياكل ثلاثية الأبعاد مختلفة سيتم التعرف عليها بواسطة العديد من البروتينات المستجيبة 4,5. وبالتالي ، فإن نوع سلسلة polyubiquitin التي تم إدخالها في الركيزة ضروري لتحديد مصير الخلية 6,7,8. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا نشر الركيزة في كل مكان من خلال بقاياها الطرفية N التي تسمى N-degrons. الغازات المتساوية في كل مكان E3 المحددة هي المسؤولة عن التعرف على N-degron ، مما يسمح بتعدد الوعل في كل مكان لبقايا الليسينالقريبة 9.

في الوقت الحاضر ، هناك أكثر من 40 ركيزة مختلفة خاصة ب SCF مميزة. من بين هؤلاء ، يمكن العثور على المنظمين الرئيسيين للعديد من المسارات البيولوجية ، بما في ذلك تمايز الخلايا وتطورها بالإضافة إلى بقاء الخلايا وموتها ،10،11،12،13. وبالتالي ، فإن تحديد ركائز محددة لكل E3 ubiquitin-ligase أمر ضروري لتصميم خريطة شاملة لمختلف الأحداث البيولوجية. على الرغم من أن تحديد الركائز الحقيقية يمثل تحديا كيميائيا حيويا ، إلا أن استخدام الأساليب القائمة على الكيمياء الحيوية مناسب جدا لتقييم خصوصية السلسلة والتمييز بين أحادية ومتعددة في كل مكان14. تصف هذه الدراسة بروتوكولا كاملا لفحص الانتشار في كل مكان باستخدام خط خلية الثدييات HEK293T الذي يبالغ في التعبير عن الركيزة UXT-V2 (التي يتم التعبير عنها في كل مكان مثل المرافقة الشبيهة بالبريفولدين isoform 2) مع مركب E3 ubiquitin-ligase SCF (Fbxo7). UXT-V2 هو عامل مساعد أساسي لإشارات NF-κB ، وبمجرد هدم هذا البروتين في الخلايا ، فإنه يمنع تنشيط NF-κB الناجم عن TNF α11. وبالتالي ، للكشف عن UXT-V2 متعدد الانتشار ، يتم استخدام مثبط البروتيازوم MG132 لأنه لديه القدرة على منع النشاط البروتيني للوحدة الفرعية 26S من مجمع البروتيازوم15. علاوة على ذلك ، يتم تقديم مستخلص الخلايا إلى IP صغير النطاق لتنقية الركيزة ، باستخدام جسم مضاد محدد مثبت إلى راتنج الأغاروز للكشف عنه لاحقا من قبل البنك الدولي باستخدام أجسام مضادة مختارة. هذا البروتوكول مفيد جدا للتحقق من صحة انتشار الركيزة في البيئة الخلوية ، ويمكن أيضا تكييفه مع أنواع مختلفة من خلايا الثدييات وغيرها من مجمعات E3 ubiquitin-ligase. ومع ذلك ، من الضروري التحقق من صحة الركيزة التي تم اختبارها من خلال فحص الانتشار في المختبر أيضا ، لأن كلا البروتوكولين يكملان بعضهما البعض فيما يتعلق بتحديد الركائز الحقيقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم تمثيل نظرة عامة على بروتوكول فحص الانتشار في كل مكان في خلايا الثدييات في الشكل 1.

Figure 1
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء فحص الانتشار في كل مكان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. زراعة الخلايا

  1. قم بزراعة خط الخلايا HEK293T في طبق استزراع معالج بتقنية TC مقاس 100 مم إلى التقاء بنسبة 80٪ -90٪ في وسائط النمو (الجلوكوز العالي من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) والبنسلين (100 وحدة) والستربتومايسين (100 ميكروغرام) والجلوتامين L (0.292 مجم / مل)). احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة بنسبة 5٪ CO2.
  2. لتمرير الخلايا ، استنشق الوسائط من طبق الثقافة باستخدام ماصة مصلية. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 1 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS 1x).
  3. افصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول التربسين / EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك). احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة مصلية في 2 مل من وسائط النمو.
  4. انقل نظام التعليق الخلوي إلى أنبوب جديد ونظيف سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإزالة السوبرناتانت عن طريق سكبه بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف في 3 مل من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق خلوي متجانس.
  5. انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى طبق استزراع معالج بتقنية TC مقاس 100 مم يحتوي على 9 مل من وسائط النمو.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا في ظروف جيدة ، فإن كل طبق استزراع من HEK293T ، حيث يكون الالتقاء 80٪ -90٪ ، يمكن أن يولد ثلاثة أطباق استزراع مع التقاء 80٪ بعد يومين من المرور.

2. نقل الخلايا

ملاحظة: لا ينصح بنقل مزرعة الخلايا إذا كان الالتقاء الذي تم الوصول إليه أقل من 80٪.

  1. قبل النقل ، قم بالتصديق على ما إذا كانت الخلايا خالية من التلوث وعند التقاء مناسب لعمليات النقل العابرة.
  2. لكل عينة نقل ، قم بإعداد مجمعات الحمض النووي - البولي إيثيلينيمين (PEI 1 ميكروغرام / ميكرولتر عند درجة الحموضة 7.2) على النحو التالي:
    1. تمييع 3 ميكروغرام من كل بلازميد في 100 ميكرولتر من opti-MEM I خفضت وسط المصل دون مكملات ومزجها بلطف عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل.
      ملاحظة: هنا ، تم نقل الخلايا مع 4 ميكروغرام من كل بلازميد: ناقلات فارغة (pcDNA3) أو هياكل FLAG-Fbxo7 و UXT-V2-HA ، مع أو بدون 6xHis-myc-ubiquitin. كان إجمالي محتوى الحمض النووي 12 ميكروغرام.
    2. قم بإذابة جزيرة الأمير إدوارد في RT وأضفها إلى المحلول بعد نسبة 3 ميكرولتر من جزيرة الأمير إدوارد لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي. تجانس الحل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم احتضنها لمدة 15 دقيقة في RT للسماح بتكوين مجمعات DNA-PEI.
      ملاحظة: تختلف النسبة المثلى لحجم جزيرة الأمير إدوارد لكل كمية من الحمض النووي وفقا لخط الخلية المحدد.
  3. أضف الحجم الإجمالي لمجمعات DNA-PEI إلى كل طبق يحتوي على مزرعة الخلايا واخلطها بلطف عن طريق هز الطبق ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 5٪ CO2.
  4. استبدل وسط النمو بعد 5 ساعات ، لأن التعرض المطول لجزيرة الأمير إدوارد يمكن أن يكون ساما لخلايا HEK293T. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 5٪ CO2 لمدة 36 ساعة.

3. تحلل الخلايا والترسيب المناعي

  1. بعد فترة الحضانة و 6 ساعات قبل تحلل الخلايا ، عالج الخلايا المنقولة ب 10 ميكرومتر من مثبط البروتيازوم MG-132. مرة أخرى ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة بنسبة 5٪ CO2.
  2. استنشق الوسائط من كل طبق استزراع باستخدام ماصة مصلية واغسلها مرة واحدة باستخدام 1 مل من 1x PBS. افصل الخلايا بإضافة 1 مل من التربسين واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط النمو.
  3. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل جديد ونظيف وقم بطرده مركزيا عند 500 × g لمدة 5 دقائق في RT.
  4. قم بإزالة السوبرناتانت عن طريق سكبه بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل NP-40 البارد (50 mM Tris-HCl pH 7.2 و 225 mM KCl و 1٪ NP-40) ، مع كوكتيل مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (10 mM NaF و 1 mM Na3VO4) ، وانقل المحلول إلى أنبوب دقيق نظيف 1.5 مل.
  5. احتضن الخلية محللة لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلية محللة عند 16900 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. وفي الوقت نفسه ، قم بموازنة حبات الأغاروز المضادة للحمض الهيدروجيني مع المخزن المؤقت للتحلل NP-40 البارد على الجليد. استخدم 15 ميكرولتر من حبات الأغاروز المضادة للحمض الوراثي لكل عينة. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل NP-40 عن طريق نبضه في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق عند 3000 × g لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. مع ماصة ، استنشق وتخلص من supernatant بعناية فائقة ؛ كرر هذه العملية ثلاث مرات. بعد ذلك ، حافظ على توازن الخرز على الثلج حتى الاستخدام.
  7. بعد الطرد المركزي للخلية ، قم باستعادة supernatant. حدد كمية محتوى البروتين في المحلول الكلي باستخدام طريقة برادفورد16.
  8. تأكد من أن كل عينة تخضع لهطول الأمطار المناعية تقدم كمية متساوية من البروتين. احتضن الحجم اللازم من تحلل الخلايا مع حبات الأغاروز المتوازنة المضادة ل HA لمدة 4 ساعات ، مع الدوران بلطف في حاضنة دوارة عند 4 درجات مئوية ، مما يسمح ل UXT-V2-HA بالارتباط بحبات الأغاروز المضادة للحمض النووي.
  9. اجمع حبات الأغاروز المضادة للحمض الوراثي عن طريق نبضها في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق عند 3000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشق بعناية وتخلص من supernatant. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لتحلل الخلايا NP-40 البارد ومرتين باستخدام المخزن المؤقت FLAG / HA البارد (10 mM Hepes pH 7.9 و 15 mM MgCl2 و 225 mM KCl و 0.1٪ NP-40).
  10. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة جميع المواد الفائقة بعناية باستخدام ماصة وقم بالتخلص من البروتين متعدد الكل مع ببتيد HA (300 ميكروغرام / مل) المخفف على المخزن المؤقت FLAG / HA. احتضن حبات الأغاروز المضادة ل HA مع ببتيد HA لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في منصة اهتزاز هزازة.
  11. قم بتدوير الخرز عند 3000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية وقم بماصة السوبر نات التي تحتوي على البروتينات متعددة الكل في كل مكان بعناية. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين اللوات في أنبوب دقيق جديد ونظيف عند -20 درجة مئوية.
  12. حل الإيلوات وتحلل الخلية في 10٪ SDS-PAGE (كبريتات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الكهربائي )17 والنشاف المناعي.
  13. في هذه الدراسة ، تم إجراء نقل رطب WB. لهذا النوع من النقل ، ضع الجل في شطيرة نقل تتكون من ورق ترشيح - هلام - غشاء - ورق ترشيح ، وقم بتبطينه بمنصات ، واضغط عليه معا بواسطة شبكة دعم. ضع هذا النظام عموديا في خزان مملوء بمخزن مؤقت للنقل وبين أقطاب أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ / البلاتين. يحدث النقل لمدة 90 دقيقة عند 150 فولت في مخزن النقل الرطب (الجلايسين 192 مللي متر ، قاعدة التريس 25 ملليمتر ، 0.025٪ SDS ، 20٪ ميثانول).
    ملاحظة: نظرا لأن مستخلصات الخلايا قد تم تحديدها كميا (الخطوة 3.7)، قم بتشغيل SDS-PAGE بكمية متساوية من البروتين لكل عينة. أيضا، لحل التوضيح، قم بتشغيل وحدات تخزين متساوية لكل عينة.
  14. التحقيق في غشاء اللطخة المناعية باستخدام أجسام مضادة مختارة 11. تأكد من اكتشاف إشارة مسحة في اللطاخة من الركيزة متعددة الكل في كل مكان التي تم سحبها في عملية IP باستخدام الأجسام المضادة المضادة للميك في العينات التي تحتوي على ليغاز E3 من النوع البري والركيزة و myc-ub. في محللات الخلية (المدخلات) ، تأكد من اكتشاف الإشارة من الركيزة المختارة ، وبروتين Fbxo7 ، والبروتينات الموجودة في كل مكان ، وبروتين التدبير المنزلي (على سبيل المثال ، GAPDH و β-actin) لضمان نفس الكمية من البروتينات في كل حارة.
    ملاحظة: تم إعداد التخفيف لكل جسم مضاد مستخدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UXT (نسخة يتم التعبير عنها في كل مكان) هو بروتين يشبه ما قبل الفولدين يشكل مجمعات قابلة للطي للبروتين يتم التعبير عنها في كل مكان في أنسجة الفئران والبشر مثل القلب والدماغ والعضلات الهيكلية والمشيمة والبنكرياس والكلى والكبد18. تم وصف شكلين متساويين للربط من UXT ، يطلق عليهما UXT-V1 و UXT-V2 ، يؤديان وظائف متميزة ومواقع دون الخلايا. يتم توطين UXT-V1 في الغالب في السيتوبلازم وداخل الميتوكوندريا ، وهو متورط في موت الخلايا المبرمج الناجم عن TNF-α وتكوين الإشارات المضادة للفيروسات19,20. ركزت معظم الأبحاث على UXT-V2 الذي يتم توطينه بشكل أساسي في النواة ويعمل كعامل مساعد لعوامل النسخ المتعددة المشاركة في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز وفي المسارات الالتهابية. يشارك UXT-V2 في مسار إشارات NF-κB الذي يعمل كمنشط أساسي في محسن NF-κB21. وقد ثبت أن UXT-V2 هو ركيزة أساسية من E3 ubiquitin-ligase SCF (Fbxo7) ، يتوسط في تعدد كل مكان وتدهوره بواسطة البروتيازوم ، وبالتالي تثبيط مسار إشارات NF-κB11.

وقد لوحظ تعدد الأوكتين المحدد ل UXT-V2-HA بوساطة Fbxo7 في الخلايا بعد فحص المحلول من IP المضاد ل HA باستخدام جسم مضاد مضاد للفطريات ، والذي يكتشف myc-ub المترافق مع الركيزة (الشكل 2). تم تصور خصوصية مضاد للميك للركيزة متعددة الكل في الحارات 1 و 2 (الشكل 2) ، حيث لم يتم الكشف عن تشويه البروتينات متعددة الكل في كل مكان عندما تم نقل الخلايا بشكل مشترك مع Fbxo7 و myc-ub في غياب بلازميد UXT-V2-HA (الشكل 2 ، الممر 1). بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم تصور أي مسحة مقابلة لتعدد البروتينات في كل مكان في مزيج من Fbxo7 و UXT-V2-HA بدون بلازميد myc-ub (الشكل 2 ، حارة 2). لإثبات أن تعدد UXT-V2 تم بوساطة Fbxo7 ، تم نقل pcDNA3 متجه فارغ ، من النوع البري Fbxo7 أو Fbxo7-ΔF-box mutant ، غير قادر على تجميع مجمع SCF النشط بسبب عدم وجود مجال F-box المسؤول عن التفاعل مع SKP1 ، بالاقتران مع UXT-V2-HA و myc-ub. ولم تلاحظ إشارة تشويه قوية ل UXT-V2 متعدد الانتشار إلا في وجود Fbxo7 من النوع البري (الشكل 2، الحارة 4)، مما يشير إلى أن UXT-V2 كان متعدد الانتشار بواسطة مركب SCF (Fbxo7) في الخلايا مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 2، الممرات 3 و 5). قد يشير وجود إشارة لطاخة باهتة ل UXT-V2 متعدد الكل في وجود هذه الضوابط السلبية إلى عمل Fbxo7 الداخلي أو أي نشاط آخر من E3 ubiquitin-ligase.

Figure 2
الشكل 2. فحص التواجد في كل مكان في الخلايا: نقل عابر لخلايا HEK293T مع البلازميدات المشار إليها. بعد تحلل الخلايا ، تم ترسيب مستخلصات الخلايا (المدخلات) المناعية بحبات الأغاروز المضادة للحمض الأميني. تم حل العينات المأخوذة والمدخلات بواسطة SDS-PAGE ، وتم فحص اللطخة الغربية بأجسام مضادة محددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد التواجد في كل مكان تعديلا أساسيا بعد الترجمة ينظم مستويات العديد من البروتينات ويلعب دورا حاسما في العديد من مسارات الإشارات والعمليات البيولوجية ، مما يضمن بيئة صحية داخل الخلايا. يعد نظام يوبيكوتين بروتيازوم (UPS) أحد المحاور الرئيسية للبحوث الصيدلانية الحديثة ، مما يوفر إمكانية تثبيت مثبطات الورم أو الحث على تدهور المنتجات السرطانية22. على سبيل المثال، الانتشار الشاذ لأورام خلايا البلازما المسؤولة عن إفراز الغلوبولين المناعي أحادي النسيلة في الورم النقوي المتعدد (MM) يعزز مسارا فسيولوجيا مرضيا بسبب تراكم البروتين غير المطوي و / أو غير المطوي في الشبكة الإندوبلازمية (ER)23. بمجرد حدوث إجهاد ER هذا ، فإنه ينشط العديد من العمليات ، بما في ذلك تنشيط نظام ubiquitin-proteasome. أظهر استخدام مثبطات البروتيازوم (bortezomib و carfilzomib و ixazomib) للحث على تراكم البروتين وما يترتب على ذلك من موت الخلايا لعلاج الورم النقوي المتعدد نتائج واعدة كدواء مضاد للورم عن طريق الحد من تطور المرض في المرضى المعرضين لخطر كبير24,25. علاوة على ذلك ، تهدف الجهود الأخرى التي تركز على استقرار البروتين ، مثل مثبطات E3 ubiquitin-ligase MDM2 التي أظهرت قدرة كبيرة على تجنب انتشار p53 في كل مكان ، وبالتالي منع تدهوره من خلال البروتيازوم26. وهكذا ، نشأ عصر جديد من البحوث الصيدلانية / الطبية الحيوية التي تركز على فهم ومراقبة UPS كوسيلة لمكافحة المرض.

تصف هذه الدراسة طريقة لتحليل انتشار بروتين مستهدف محدد في كل مكان بواسطة E3 ubiquitin-ligase معين في بيئة خلوية. في هذا الفحص ، يتم نقل عدد كبير من الخلايا بشكل عابر مع ترميز البلازميدات المختارة لركيزة البروتين الموسومة ، و E3 ligase ، و ubiquitin المعلمة. قبل التحلل ، يجب معالجة الخلايا بمثبط بروتيازوم للسماح بتراكم البروتينات متعددة الانتشار التي من شأنها أن تخضع للتدهور في البروتيازوم. من أجل الحصول على عينة أقل تعقيدا ، تم ترسيب البروتين المستهدف ، وتم تحليل تعدد كل ما في كل مكان من قبل البنك الدولي باستخدام أجسام مضادة محددة تستند إلى علامة ubiquitin.

يجب تطبيع كمية البروتين في كل عينة وخرز الأغاروز للسماح بمقارنة البيانات بين تلك العينات. تم الكشف عن إشارة لطاخة عالية الكثافة من UXT-V2 polyubiquitylation في وجود النوع البري E3 ubiquitin-ligase. على الرغم من أن الإشارة التي تم الحصول عليها من البروتين المستهدف ، و E3 ligase ، و ubiquitin يمكن أن تكون من أصل داخلي المنشأ ، فإن استخدام البروتينات المؤتلفة له ميزة زيادة الإنتاجية والكشف عن الإشارة في تحليل البنك الدولي. علاوة على ذلك ، فإن استخدام ليغاز E3 من النوع البري ومتحوره يسمح بالتحليل المحدد لنشاطهم في الركيزة ، وهو عنصر تحكم أساسي لهذه التجربة. ولوحظ أن المتحور Fbxo7 (Fbxo7-ΔF-box) لا يمكن أن يعزز تعدد كل مكان ل UXT-V2 ، مما يشير إلى أن إشارة اللطاخة المكتشفة في وجود Fbxo7 من النوع البري كانت محددة. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أنه في حالة عدم وجود الركيزة الموسومة أو myc-ub ، لم يتم الكشف عن اللطاخة متعددة الكل ، مما يشير إلى خصوصية agarose-anti-HA المستخدمة. قد يؤدي استخدام جسم مضاد مضاد لليوبيكويتين لفحص الطرد من IP الركيزة إلى اكتشاف إشارة تشويه متعددة الانتشار حتى في الضوابط السلبية ، حيث يمكن أيضا التخلص من البروتينات غير المحددة أو شركاء البروتين غير المباشرين للهدف مع الركيزة. بمجرد أن تكون هذه البروتينات غير المحددة متعددة الكل في كل مكان ، يمكن للحساسية العالية لمضادات يوبيكويتين اكتشافها.

هناك أيضا بعض الاختلافات لهذا البروتوكول فيما يتعلق بنقل البلازميد ، والمخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، والأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية ، وفحص البنك الدولي. تم تطوير IP المعروض هنا مع الأجسام المضادة المضادة ل HA لترسيب الركيزة ، وتم فحص غشاء WB بجسم مضاد مضاد ل myc لتصور إشارة ubiquitin. إن نقل ubiquitin-HA و IP مع مضاد HA و WB الذي يسبر الغشاء باستخدام علامة مضادة للركيزة أو مضادة للركيزة هو أيضا بديل لهذه المنهجية. ومع ذلك ، فإن الترسيب المناعي لليوبيكويتين قد يجلب عددا كبيرا من البروتينات متعددة الانتشار غير المحددة بالإضافة إلى البروتينات المرتبطة باليوبيكوتين. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام مخزن RIPA المؤقت (المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي) أثناء تحلل الخلايا لتقليل هذه البروتينات غير المرغوب فيها27. ومع ذلك ، من الضروري تقييم ما إذا كان بروتوكول IP متوافقا مع المخزن المؤقت RIPA. علاوة على ذلك ، قد يضعف تعدد الركيزة في كل مكان ارتباط الجسم المضاد بهذا الهدف المحدد عن طريق منع الظهارة المطابقة. وبالتالي ، فإن تطبيق الأجسام المضادة مع العلامة المضادة أكثر موثوقية.

في حين أن هذا النهج مفيد جدا لتنقية البروتين القابل للذوبان ، إلا أنه يقدم بعض القيود. أولا ، يمكن ملاحظة عمل الغازات الداخلية غير المحددة E3 في كل مكان. للتغلب على هذه المشكلة ولتأكيد خصوصية التواجد المستهدف في الخلايا ، من الضروري أيضا إجراء فحص في المختبر في كل مكان باستخدام مركب E3 ligase النقي والركيزة المختارة بالإضافة إلى إنزيمات E1 و E2 و ubiquitin و ubiquitin buffer و ATP ، المتوفرة تجاريا. يحدث قيد آخر لهذه الطريقة عندما يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف إلى تأثير سام للخلايا يبلغ ذروته في انخفاض الجدوى الخلوية. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام هدف البروتين الداخلي لهطول الأمطار المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، كما ذكر أعلاه ، هذا البروتوكول مناسب لاستخراج البروتين القابل للذوبان. لذلك ، لا يمكنه استخراج البروتينات المرتبطة بالغشاء ، على سبيل المثال. سواء كانت الركيزة التي تم اختبارها عبارة عن بروتين غشاء ، يمكن أن يحل المخزن المؤقت RIPA محل المخزن المؤقت لتحلل NP-40 الموضح هنا إذا لم يتم اختراق بروتوكول IP من قبله. في هذا البروتوكول ، ينصب تركيز إزالة البروتين على نظام ubiquitin-proteasome ، مما يفسر أنه تم استخدام مثبط البروتيازوم فقط. ومع ذلك ، فإن العديد من البروتينات القابلة للذوبان تخضع للتحلل من خلال الالتهام الذاتي في الليزوزوم. وبالتالي ، فإن استخدام مثبط الليزوسوم ، مثل bafilomycin A1 ، قد يكون ضروريا أيضا لمنع الالتهام الذاتي في المرحلة المتأخرة بسبب الالتهام المهبلي H + -ATPase28.

نظرا لأن الانتشار في كل مكان هو عملية قابلة للانعكاس ، يمكن إزالة ubiquitin من الركيزة عن طريق النشاط الحفاز ل deubiquitinases (DUBs) ؛ هذه هي واحدة من العقبات الرئيسية عند توصيف ركائز E3 ubiquitin-ligase29. يزيد عمل DUBs من تمييز الركيزة في هذا النوع من التجارب بمجرد أن يقلل من أوقات الإقامة المتعددة في بعض الأهداف30. لذلك ، سيكون من المفيد علاج الخلايا بمثبطات deubiquitinase لتجنب هذه المشكلة. يمكن أن يؤثر الحديث المتبادل الإيجابي أو السلبي أيضا على مصير ركيزة معينة. لقد ثبت بالفعل أن التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) يمكن أن تتحدث في سيناريوهات مختلفة ، ويمكن للفسفرة ، على سبيل المثال ، تنظيم الانتشار في كل مكان عن طريق تعديل نشاط E3 ubiquitin-ligase ، وتعزيز التعرف على الركيزة بواسطة Ligases E3 أو من خلال تنظيم تفاعل الركيزة و E3 ligase من خلال التأثير على توطينها الخلوي31 . قد يكون هذا مشكلة عند اختيار خط الخلية الذي سيتم تنفيذ التجربة فيه. إذا كانت الإشارات التي تعد شروطا مسبقة للانتشار في كل مكان غائبة في خط الخلية المرغوب فيه ، فيجب تحديد خط خلية بديل لإجراء التحليل أو تحفيز الإشارة في خط الخلية المحدد. من المشكلات الشائعة التي قد تحدث في فحوصات التواجد في كل مكان التي يتم إجراؤها في الخلايا موت الخلايا الهائل بعد علاج MG132 ، والذي يحدث في الغالب بسبب توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تحفز موت الخلايا الماصة. بعد عدة اختبارات لتوحيد البروتوكول ، تم العثور على علاج MG132 مثالي لخلايا HEK293T لا يتجاوز 6 ساعات قبل التحلل عند 10 ميكرومتر من التركيز. هذا البروتوكول مناسب أيضا لأنواع خلايا الثدييات الأخرى لتحديد أزواج الركيزة E3 ubiquitin-ligase. على الرغم من أنه من الأهمية بمكان توحيد حجم جزيرة الأمير إدوارد المستخدمة في عملية النقل وفترة معالجة MG132 لخط الخلية المختار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

F.R.T مدعوم بمنحة FAPESP رقم 2020/15771-6 و CNPq Universal 405836/2018-0. يتم دعم P.M.S.P و V.S بواسطة CAPES. تم دعم C.R.S.T.B.C بمنحة FAPESP رقم 2019/23466-1. نشكر ساندرا ر. س. ماروياما (FAPESP 2016/20258-0) على الدعم المادي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Axygen PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish Corning 430167
15 mL tube Corning 430766
96-well plate Cralplast 655111
Agarose-anti-HA beads Sigma-Aldrich E6779
Anti Mouse antibody Seracare 5220-0341 Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody Seracare 5220-0337 Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody Sigma-Aldrich A3853 Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody Sigma-Aldrich SAB1407251 Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody Sigma-Aldrich H3663 Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody Cell Signalling 2272 Dilution used: 1:1000
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500ML
BSA Sigma-Aldrich A9647-100G Bovine Serum Albumin
Cell incubator Nuaire NU-4850
Centrifuge Eppendorf 5804R 500 x g for 5 min
ChemiDoc BioRad
Digital pH meter Kasvi K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning 10-017-CRV High glucose
Fetal bovine serum Gibco F4135 Filtrate prior use
HA peptide Sigma-Aldrich I2149
HEK293T cells ATCC CRL-3216
Hepes Gibco 15630080
KCl VWR Life Science 0365-500G
Kline rotator Global Trade Technology GT-2OIBD
MG-132 Boston Biochem I-130
Microcentrifuge Eppendorf 5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane GE Healthcare 10600016
NP40 (IGEPAL CA-630) Sigma-Aldrich I8896-100ML
Optical microscope OPTIKA microscopes SN510768
Opti-MEM Gibco 31985-070
pcDNA3 Invitrogen V79020 For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x Gibco 10378-016
Phosphate buffered saline 10x AccuGENE 51226 To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6
Ponceau S VWR Life Science 0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST Sigma-Aldrich S8820
Rocking Shaker Kasvi 19010005
SDS-PAGE system BioRad 165-8004
Solution Homogenizer Phoenix Luferco AP-22
Trizma base Sigma-Aldrich T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express) Gibco 12605-028
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 183 ،
تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Passos, P. M. S., Spagnol, V.,… More

dos Passos, P. M. S., Spagnol, V., de Correia, C. R. S. T. B., Teixeira, F. R. Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates. J. Vis. Exp. (183), e63561, doi:10.3791/63561 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter