Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för en ubiquitylationsanalys av ett specifikt substrat och en E3 ubiquitin-ligas i däggdjursceller. HEK293T-cellinjer användes för proteinöveruttryck, det polyubiquitylerade substratet renades från celllysater genom immunoprecipitation och löstes i SDS-PAGE. Immunoblotting användes för att visualisera denna post-translationella modifiering.
Abstract
Ubiquitylation är en post-translationell modifiering som sker i eukaryota celler som är avgörande för flera biologiska vägars reglering, inklusive cellöverlevnad, proliferation och differentiering. Det är en reversibel process som består av en kovalent bindning av ubiquitin till substratet genom en kaskadreaktion av minst tre olika enzymer, bestående av E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerande enzym) och E3 (Ubiquitin-ligasenzym). E3-komplexet spelar en viktig roll i substratigenkänning och allestädes närvarande. Här beskrivs ett protokoll för att utvärdera substrat ubiquitylation i däggdjursceller med hjälp av övergående samtransfektion av en plasmid som kodar för det valda substratet, en E3 ubiquitinligas och en taggad ubiquitin. Före lysen behandlas de transfekterade cellerna med proteasomhämmaren MG132 (karbensoxi-leu-leu-leucinal) för att undvika substratproteasomal nedbrytning. Vidare utsätts cellextraktet för småskalig immunoprecipitation (IP) för att rena det polyubiquitylerade substratet för efterföljande detektion genom western blotting (WB) med användning av specifika antikroppar för ubiquitintagg. Därför beskrivs ett konsekvent och okomplicerat protokoll för ubiquitylationsanalys i däggdjursceller för att hjälpa forskare att ta itu med ubiquitylation av specifika substrat och E3-ubiquitin-ligaser.
Introduction
Post-translationella modifieringar (PTM) är en viktig mekanism för proteinreglering, vilket är viktigt för cellhomeostas. Protein ubiquitylation är en dynamisk och invecklad modifiering som skapar ett sortiment av olika signaler som resulterar i flera cellulära resultat i eukaryota organismer. Ubiquitylation är en reversibel process som består i bindning av ett ubiquitinprotein innehållande 76 aminosyror till substratet, som förekommer i en enzymatisk kaskad sammansatt av tre distinkta reaktioner1. Det första steget kännetecknas av ubiquitinaktivering, som beror på en ATP-hydrolys för att bilda ett tioesterbundet ubiquitin med hög energi mellan ubiquitin C-terminalen och cysteinresten som finns i det aktiva stället för E1-enzymet. Därefter överförs ubiquitinet till E2-enzymet som bildar ett tioester-gillat komplex med ubiquitinet. Därefter är ubiquitinet kovalent bundet till substratet av E2, eller oftare, av E3-enzymet, som känner igen och interagerar med substratet 2,3. Ibland är E4-enzymer (Ubiquitin-kedjeförlängningsfaktorer) nödvändiga för att främja multiubiquitinkedjemontering3.
Ubiquitin har sju lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 och K63), vilket möjliggör bildandet av polyubiquitinkedjor som genererar distinkta kopplingar för att producera olika tridimensionella strukturer som kommer att erkännas av flera effektorproteiner 4,5. Därför är den typ av polyubiquitinkedja som införs i substratet avgörande för att bestämma dess cellöde 6,7,8. Dessutom kan substratet också allestädes närvarande genom dess N-terminala rester som kallas N-degroner. Specifika E3-ubiquitin-ligaser är ansvariga för N-degronigenkänning, vilket möjliggör polyubiquitylation av närliggande lysinrester9.
Numera finns det mer än 40 olika SCF-specifika substrat som karakteriseras. Bland dessa kan viktiga regulatorer av flera biologiska vägar, inklusive celldifferentiering och utveckling samt cellöverlevnad och död, hittas 10,11,12,13. Således är identifieringen av specifika substrat för varje E3-ubiquitin-ligas avgörande för att utforma en omfattande karta över olika biologiska händelser. Även om identifieringen av sanna substrat är biokemiskt utmanande, är användningen av biokemibaserade metoder mycket lämplig för att utvärdera kedjespecificitet och skillnaden mellan mono- och polyubiquitylation14. Denna studie beskriver ett komplett protokoll för ubiquitylationsanalys med hjälp av däggdjurscellinjen HEK293T som överuttrycker substratet UXT-V2 (allestädes närvarande uttryckt prefoldinliknande chaperonisoform 2) med E3-ubiquitin-ligaskomplexet SCF (Fbxo7). UXT-V2 är en viktig co-faktor för NF-κB-signalering, och när detta protein slås ner i celler hämmar det TNF-α-inducerad NF-κB-aktivering11. För att detektera polyubiquitylerad UXT-V2 används proteasomhämmaren MG132 eftersom den har förmågan att blockera den proteolytiska aktiviteten hos 26S-underenheten i proteasomkomplexet15. Vidare skickas cellextraktet till en småskalig IP för att rena substratet, med användning av en specifik antikropp immobiliserad till agarosharts för efterföljande detektion av WB med användning av utvalda antikroppar. Detta protokoll är mycket användbart för att validera substrat ubiquitylation i den cellulära miljön, och det kan också anpassas för olika typer av däggdjursceller och andra E3 ubiquitin-ligaskomplex. Det är emellertid nödvändigt att validera substratet som testats genom en in vitro-ubiquitylationsanalys också, eftersom båda protokollen kompletterar varandra när det gäller identifiering av sanna substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: En översikt över ubiquitylation assay protokoll i däggdjursceller representeras i figur 1.
Figur 1. Översikt över ubiquitylationsanalysproceduren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Cellodling
- Odla HEK293T-cellinjen i en 100 mm TC-behandlad odlingsskål till 80% -90% sammanflöde i tillväxtmedier (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hög glukos kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin (100 enheter), streptomycin (100 μg) och L-glutamin (0,292 mg / ml)). Inkubera kulturen vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator vid 5 %CO2.
- För att passera cellerna, aspirera media från odlingsskålen med en serologisk pipett. Tvätta cellerna en gång med 1 ml steriliserad 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS 1x).
- Lösgör cellerna genom att tillsätta 1 ml trypsin/EDTA-lösning (etylendiamintetraättiksyra). Inkubera skålen vid 37 °C i 5 min. Resuspendera cellerna med hjälp av en serologisk pipett i 2 ml tillväxtmedium.
- Överför cellsuspensionen till ett friskt och rent 15 ml rör och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Ta bort supernatanten genom att hälla ut den försiktigt. Återsuspendera försiktigt cellpelleten i 3 ml tillväxtmedium genom pipettering upp och ner för att erhålla en homogen cellsuspension.
- Överför 1 ml av cellsuspensionen till en 100 mm TC-behandlad odlingsskål innehållande 9 ml tillväxtmedier.
OBS: Om cellerna är i goda förhållanden kan varje odlingsskål av HEK293T, där sammanflödet är 80% -90%, generera tre odlingsrätter med 80% sammanflöde 2 dagar efter passagen.
2. Cell transfektion
OBS: Det rekommenderas inte att transfektera cellkulturen om sammanflödet som uppnås är mindre än 80%.
- Före transfektion, intyga om cellerna är fria från kontaminering och vid en tillräcklig sammanflöde för övergående transfektioner.
- För varje transfektionsprov, bered DNA-polyetylenimine (PEI 1 μg/μl vid pH 7,2) komplex enligt följande:
- Späd 3 μg av varje plasmid i 100 μL opti-MEM I reducerat serummedium utan tillskott och blanda det försiktigt genom att pipettera lösningen upp och ner.
OBS: Här transfekterades cellerna med 4 μg av varje plasmid: Tom vektor (pcDNA3) eller FLAG-Fbxo7-konstruktioner och UXT-V2-HA, med eller utan 6xHis-myc-ubiquitin. Den totala DNA-halten var 12 μg. - Tina PEI vid RT och tillsätt det i lösningen efter en andel av 3 μL PEI per 1 μg DNA. Homogenisera lösningen genom att pipettera upp och ner. Inkubera det sedan i 15 minuter vid RT för att möjliggöra bildandet av DNA-PEI-komplex.
OBS: Den optimala andelen PEI-volym per DNA-kvantitet skiljer sig beroende på vald cellinje.
- Späd 3 μg av varje plasmid i 100 μL opti-MEM I reducerat serummedium utan tillskott och blanda det försiktigt genom att pipettera lösningen upp och ner.
- Tillsätt den totala volymen DNA-PEI-komplex till varje skål som innehåller cellkulturen och blanda den försiktigt genom att gunga plattan fram och tillbaka. Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator vid 5 %CO2.
- Byt ut tillväxtmediet efter 5 timmar, eftersom långvarig PEI-exponering kan vara giftig för HEK293T-celler. Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator vid 5 %CO2 i 36 timmar.
3. Celllys och immunoprecipitation
- Efter inkubationsperioden och 6 timmar före celllys, behandla de transfekterade cellerna med 10 μM av proteasomhämmaren MG-132. Inkubera återigen cellerna vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator vid 5 %CO2.
- Aspirera media från varje odlingsskål med en serologisk pipett och tvätta den en gång med 1 ml 1x PBS. Lossa cellerna genom att tillsätta 1 ml trypsin och inkubera skålen vid 37 °C i 5 minuter. Resuspendera cellerna i 1 ml tillväxtmedia.
- Överför cellsuspensionen till ett friskt och rent 15 ml rör och centrifugera det vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten genom att hälla ut den försiktigt. Återsuspendera försiktigt cellpelleten i 200 μL iskall NP-40-lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl och 1% NP-40), kompletterad med proteas- och fosfatashämmarecocktail (10 mM NaF och 1 mM Na3VO4) och överför lösningen till ett rent 1,5 ml mikrorör.
- Inkubera celllysaten i 30 min på is. Efter inkubation centrifugera celllysaterna vid 16 900 x g i 20 minuter vid 4 °C.
- Under tiden balanserar du agaros-anti-HA-pärlorna med iskall NP-40-lysbuffert. Använd 15 μl agaros-anti-HA-pärlor för varje prov. Tvätta pärlorna med 200 μl NP-40-lysbuffert genom att pulsera den i ett mikrocentrifugrör vid 3 000 x g i 1 min vid 4 °C. Med en pipett, aspirera och kassera supernatanten mycket noggrant; upprepa denna process tre gånger. Håll sedan pärlorna likvärdiga på is tills de används.
- Efter centrifugering av celllysaten, återställ supernatanten. Kvantifiera proteinhalten i den totala lysaten med Bradford-metoden16.
- Se till att varje prov som utsätts för immunprecipitation presenterar en lika stor mängd protein. Inkubera den nödvändiga volymen celllysat med de ekvilibrerade agaros-anti-HA-pärlorna i 4 timmar, försiktigt roterande i en roterande inkubator vid 4 °C, vilket gör att UXT-V2-HA kan binda till agaros-anti-HA-pärlorna.
- Samla upp agaros-anti-HA-pärlorna genom att pulsera dem i ett mikrocentrifugrör vid 3 000 x g i 1 min vid 4 °C. Aspirera försiktigt och kassera supernatanten. Tvätta pärlorna tre gånger med iskall NP-40 celllysbuffert och två gånger med iskall FLAG/HA-buffert (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl och 0,1% NP-40).
- Efter den sista tvätten, ta bort all supernatant försiktigt med en pipett och eluera det polyubiquitylerade proteinet med HA-peptid (300 μg / ml) utspädd på FLAG / HA-buffert. Inkubera agaros-anti-HA-pärlorna med HA-peptid i 1 timme vid 4 °C i en gungande skakplattform.
- Snurra ner pärlorna vid 3 000 x g i 2 minuter vid 4 °C och pipettera försiktigt supernatanten som innehåller de polyubiquitinerade proteinerna. Förvara vid behov eluatet i ett friskt och rent mikrorör vid -20 °C.
- Lös eluaterna och celllysaterna i 10% SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores)17 och immunoblotting.
- I denna studie utfördes en våt överföring WB. För denna typ av överföring, placera gelén i en överföringssmörgås bestående av filterpapper-gel-membran-filterpapper, dämpa den med dynor och tryck ihop den med ett stödgaller. Placera detta system vertikalt i en tank fylld med överföringsbuffert och mellan trådelektroder av rostfritt stål / platina. Överföringen sker i 90 min vid 150 V i våt överföringsbuffert (glycin 192 mM, trisbas 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol).
OBS: Eftersom cellextrakten kvantifierades (steg 3.7), kör en SDS-PAGE med lika stor mängd protein för varje prov. För att lösa eluatet kör du också lika stora volymer för varje exempel. - Sondera immunoblotmembranet med hjälp av utvalda antikroppar 11. Se till att en smetsignal detekteras i eluatet från det polyubiquitylerade substratet som dras i IP-processen genom att använda anti-myc-antikropp i proverna som innehåller E3-ligasen av vild typ, substratet och myc-ub. I celllysat (ingång), se till att signalen från det valda substratet, Fbxo7-proteinet, ubiquitylerade proteiner och ett hushållningsprotein (t.ex. GAPDH och β-aktin) detekteras för att garantera samma mängd proteiner i varje körfält.
OBS: Utspädningen för varje använd antikropp bereddes enligt tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UXT (allestädes närvarande uttryckt transkript) är ett prefoldinliknande protein som bildar allestädes närvarande uttryckta proteinveckningskomplex i mus- och mänskliga vävnader som hjärta, hjärna, skelettmuskel, placenta, bukspottkörtel, njure och lever18. Två skarvande isoformer av UXT, som heter UXT-V1 och UXT-V2, har beskrivits utföra distinkta funktioner och subcellulära platser. UXT-V1 är övervägande lokaliserad i cytoplasman och inuti mitokondrierna, och det är inblandat i TNF-α-inducerad apoptos och antiviral signalosombildning19,20. Den mesta forskningen har fokuserat på UXT-V2 som huvudsakligen är lokaliserad i kärnan och fungerar som en co-faktor för flera transkriptionsfaktorer som är involverade i cellproliferationsreglering, differentiering och i inflammatoriska vägar. UXT-V2 är involverad i NF-κB-signalvägen som fungerar som en viktig kovaktivator i NF-κB-förstärkaresomen21. Det visades att UXT-V2 är ett kanoniskt substrat av E3 ubiquitin-ligasen SCF (Fbxo7), som förmedlar dess polyubiquitylation och nedbrytning av proteasomen och följaktligen hämmar NF-κB-signalvägen11.
Den specifika polyubiquitylationen av UXT-V2-HA medierad av Fbxo7 i celler observerades efter att ha undersökt eluatet från anti-HA IP med en anti-myc-antikropp, som detekterar myc-ub konjugerad till substratet (Figur 2). Specificiteten av anti-myc för polyubiquitylerat substrat visualiserades i körfält 1 och 2 (figur 2), där smet av polyubiquitylerade proteiner inte detekterades när celler samtransinfekterades med Fbxo7 och myc-ub i frånvaro av UXT-V2-HA-plasmid (figur 2, körfält 1). Dessutom visualiserades inget smet motsvarande proteinpolyubiquitination i kombinationen av Fbxo7 och UXT-V2-HA utan myc-ub-plasmiden (figur 2, körfält 2). För att bevisa att UXT-V2 polyubiquitylation medierades av Fbxo7, transfekterades en tom vektor pcDNA3, vild typ Fbxo7 eller Fbxo7-ΔF-box mutant, som inte kan montera aktivt SCF-komplex på grund av frånvaron av F-boxdomänen som är ansvarig för interaktion med SKP1, i kombination med UXT-V2-HA och myc-ub. En stark smetsignal av polyubiquitylerad UXT-V2 observerades endast i närvaro av den vilda typen Fbxo7 (figur 2, körfält 4), vilket tyder på att UXT-V2 polyubiquitylerades av SCF (Fbxo7) -komplexet i celler jämfört med kontrollerna (figur 2, körfält 3 och 5). Förekomsten av en svag smetsignal av polyubiquitylerad UXT-V2 i närvaro av dessa negativa kontroller kan indikera verkan av endogen Fbxo7 eller annan E3-ubiquitin-ligasaktivitet.
Figur 2. Ubiquitylationsanalys i celler: Övergående transfektion av HEK293T-celler med de angivna plasmiderna. Efter celllys immunoprecipiterades cellextrakten (ingångarna) med agaros-anti-HA-pärlor. De eluerade och ingående proverna löstes av SDS-PAGE, och den västra fläcken undersöktes med specifika antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ubiquitylation är en viktig post-translationell modifiering som reglerar nivåerna av flera proteiner och spelar en avgörande roll i många signalvägar och biologiska processer, vilket säkerställer en hälsosam intracellulär miljö. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) är ett av huvudfokuserna för den senaste farmaceutiska forskningen, vilket ger möjlighet att stabilisera tumörsuppressorer eller inducera nedbrytningen av onkogena produkter22. Till exempel främjar den avvikande spridningen av plasmacellsneoplasmer som är ansvariga för monoklonal immunoglobulinsekretion vid multipelt myelom (MM) en patofysiologisk väg på grund av felveckad och / eller utfälld proteinackumulering i endoplasmatisk retikulum (ER)23. När denna ER-stress inträffar aktiverar den flera processer, inklusive aktiveringen av ubiquitin-proteasomsystemet. Användningen av proteasomhämmare (bortezomib, karfilzomib och ixazomib) för att inducera proteinackumulering och därmed celldöd för behandling med multipelt myelom visade lovande resultat som ett läkemedel mot tumörer genom att minska sjukdomsprogressionen hos högriskpatienter24,25. Dessutom riktas andra ansträngningar fokuserade på proteinstabilitet, såsom hämmare för E3 ubiquitin-ligas MDM2 som visade stor förmåga att undvika allestädes närvarande p53, vilket förhindrar dess nedbrytning genom proteasomen26. Således har en ny era av farmaceutisk / biomedicinsk forskning centrerad på att förstå och kontrollera UPS som en metod för att bekämpa sjukdomen uppstått.
Denna studie beskriver en metod för att analysera ubiquitylationen av ett specifikt målprotein med en given E3-ubiquitin-ligas i en cellulär miljö. I denna analys är ett betydande antal celler övergående samtransfekterade med utvalda plasmider som kodar för ett taggat proteinsubstrat, en E3-ligas och ett taggat ubiquitin. Före lys måste cellerna behandlas med en proteasomhämmare för att möjliggöra ackumulering av polyubiquitylerade proteiner som skulle genomgå nedbrytning i proteasomen. För att erhålla ett mindre komplext prov immunoprecipiterades målproteinet och dess polyubiquitylation analyserades av WB med användning av specifika antikroppar baserade på ubiquitintaggen.
Mängden protein i varje prov och agarospärlor måste normaliseras för att möjliggöra datajämförelse mellan dessa prover. En högintensiv smetsignal av UXT-V2 polyubiquitylation i närvaro av vildtyp E3 ubiquitin-ligas detekterades. Även om signalen erhållen från målproteinet, E3-ligan och ubiquitinet kan komma från ett endogent ursprung, har användningen av rekombinanta proteiner fördelen av högre utbyte och signaldetektering i WB-analys. Dessutom möjliggör användning av vildtyp E3-ligasen och dess mutant den specifika analysen av deras aktivitet i substratet, vilket är en väsentlig kontroll för detta experiment. Det observerades att Fbxo7-mutanten (Fbxo7-ΔF-box) inte kunde främja polyubiquitylationen av UXT-V2, vilket tyder på att smetsignalen som detekterades i närvaro av fbxo7 av vild typ var specifik. Dessutom är det viktigt att observera att i frånvaro av det taggade substratet eller myc-ub detekterades inte det polyubiquitylerade smetet, vilket indikerar specificiteten hos agaros-anti-HA som används. Att använda en anti-ubiquitin-antikropp för att undersöka eluatet från substrat-IP kan upptäcka en polyubiquitylerad smetsignal även i de negativa kontrollerna, eftersom ospecifika proteiner eller indirekta proteinpartners till målet också kan elueras tillsammans med substratet. När dessa ospecifika proteiner kan vara polyubiquitylerade kan den höga känsligheten hos anti-ubiquitin upptäcka dem.
Det finns också några variationer för detta protokoll angående plasmidtransfektion, celllysbuffert, immunoprecipitationsantikropp och WB-sondering. IP som presenteras här utvecklades med anti-HA-antikropp för att fälla ut substratet, och WB-membranet undersöktes med anti-myc-antikropp för att visualisera ubiquitinsignalen. Transfektionen av ubiquitin-HA och IP med anti-HA och WB som undersöker membranet med en anti-substrat eller anti-substrattagg är också ett alternativ för denna metod. Immunoprecipitationen av ubiquitin kan emellertid ge ett stort antal ospecifika polyubiquitylerade proteiner förutom ubiquitinbindande proteiner. I detta fall rekommenderas att använda RIPA-buffert (radioimmunoprecipitationsanalysbuffert) under celllys för att minimera dessa oönskade proteiner27. Det är dock viktigt att utvärdera om IP-protokollet är kompatibelt med RIPA-buffert. Dessutom kan substratpolyubiquitylation försämra antikroppens bindning till detta specifika mål genom att blockera konformationsepittopen. Således är appliceringen av antikroppar med anti-tag mer tillförlitlig.
Även om detta tillvägagångssätt är mycket användbart för löslig proteinrening, presenterar det vissa begränsningar. Först kunde verkan av ospecifika endogena E3-ubiquitin-ligaser observeras. För att lösa detta problem och för att bekräfta specificiteten hos mål-ubiquitylationen i celler är det viktigt att också utföra en in vitro-ubiquitylationsanalys med renat E3-ligaskomplex och valt substrat utöver E1- och E2-enzymer, ubiquitin, ubiquitinbuffert och ATP, som är kommersiellt tillgängliga. En annan begränsning av denna metod inträffar när överuttrycket av målproteinet orsakar en cytotoxisk effekt som kulminerar i minskad cellulär livskraft. I denna situation rekommenderas användning av det endogena proteinmålet för immunoprecipitation. Dessutom, som nämnts ovan, är detta protokoll lämpligt för löslig proteinutvinning; därför kan det till exempel inte extrahera membranbundna proteiner. Oavsett om det testade substratet är ett membranprotein kan RIPA-bufferten ersätta NP-40-lysbufferten som beskrivs här om IP-protokollet inte äventyras av det. I detta protokoll är fokus för proteinclearance ubiquitin-proteasomsystemet, vilket förklarar att endast proteasomhämmaren användes. Emellertid genomgår många lösliga proteiner nedbrytning genom autofagi i lysosomen. Följaktligen kan användning av en lysosomhämmare, såsom bafilomycin A1, också vara nödvändigt för att blockera autofagi i sen fas på grund av vakuolär H+-ATPas28.
Eftersom ubiquitylation är en reversibel process kan ubiquitin avlägsnas från substratet genom den katalytiska aktiviteten hos deubiquitinaser (DUB); detta är ett av de största hindren vid karakterisering av E3 ubiquitin-ligassubstrat29. Dubs verkan ökar substratdiskrimineringen i denna typ av experiment när det minskar polyubiquitylation uppehållstider på vissa mål30. Därför skulle det vara fördelaktigt att behandla cellerna med deubiquitinashämmare för att undvika detta problem. Positiv eller negativ överhörning kan också påverka ödet för ett specifikt substrat. Det är redan etablerat att post-translationella modifieringar (PTM) kan överhöra i olika scenarier, och fosforylering kan till exempel reglera ubiquitylation genom modulering av E3 ubiquitin-ligasaktivitet, främja substratigenkänning av E3-ligaser eller genom att reglera substrat och E3-ligasinteraktion genom att påverka dess cellulära lokalisering31 . Detta kan vara ett problem när du väljer den cellinje där experimentet ska utföras. Om signalerna som är förutsättningar för ubiquitylation saknas i den önskvärda cellinjen, är det nödvändigt att välja en alternativ cellinje för att utföra analysen eller inducera signalen i den valda cellinjen. Ett vanligt problem som kan uppstå vid ubiquitylationsanalyser som utförs i celler är massiv celldöd efter MG132-behandling, vilket oftast orsakas av generering av reaktiva syrearter (ROS) som inducerar apoptotisk celldöd. Efter flera tester för att standardisera protokollet fann man en idealisk MG132-behandling för HEK293T-celler att inte överstiga 6 timmar före lys vid 10 μM koncentration. Detta protokoll är också lämpligt för andra däggdjurscelltyper för att identifiera substrat-E3 ubiquitin-ligaspar; även om det är avgörande att standardisera volymen PEI som används i transfektionen och MG132-behandlingsperioden för den valda cellinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
F.R.T stöds av FAPESP-bidragsnummer 2020/15771-6 och CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P och V.S stöds av CAPES. C.R.S.T.B.C stöddes av FAPESP-stipendienummer 2019/23466-1. Vi tackar Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) för det materiella stödet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
References
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J.
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T.
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M.
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
