Summary
Vi tilbyr en detaljert protokoll for en ubiquityleringsanalyse av et bestemt substrat og en E3 ubiquitin-ligase i pattedyrceller. HEK293T-cellelinjer ble brukt til proteinoverekspresjon, det polyubiquitylerte substratet ble renset fra cellelysater ved immunprecipitasjon og løst i SDS-PAGE. Immunoblotting ble brukt til å visualisere denne posttranslasjonelle modifikasjonen.
Abstract
Ubiquitylering er en posttranslasjonell modifikasjon som skjer i eukaryote celler som er kritisk for regulering av flere biologiske veier, inkludert celleoverlevelse, proliferasjon og differensiering. Det er en reversibel prosess som består av en kovalent festing av ubiquitin til substratet gjennom en kaskadereaksjon av minst tre forskjellige enzymer, sammensatt av E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerende enzym) og E3 (Ubiquitin-ligase enzym). E3-komplekset spiller en viktig rolle i substratgjenkjenning og ubiquitylering. Her beskrives en protokoll for å evaluere substrat ubiquitylering i pattedyrceller ved hjelp av forbigående koinfeksjon av et plasmid som koder for det valgte substratet, en E3 ubiquitin-ligase og et merket ubiquitin. Før lysis behandles de transfekterte cellene med proteasomhemmeren MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) for å unngå substratproteasomal nedbrytning. Videre sendes celleekstraktet til småskala immunoprecipitation (IP) for å rense det polyubiquitylerte substratet for påvisning ved vestlig blotting (WB) ved bruk av spesifikke antistoffer for ubiquitin-tag. Derfor er en konsistent og ukomplisert protokoll for ubiquityleringsanalyse i pattedyrceller beskrevet for å hjelpe forskere med å adressere ubiquitylering av spesifikke substrater og E3 ubiquitin ligaser.
Introduction
Posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) er en viktig mekanisme for proteinregulering, noe som er viktig for cellehomeostase. Protein ubiquitylation er en dynamisk og intrikat modifikasjon som skaper et utvalg av forskjellige signaler som resulterer i flere cellulære utfall i eukaryote organismer. Ubiquitylering er en reversibel prosess som består i feste av et ubiquitinprotein som inneholder 76 aminosyrer til substratet, som forekommer i en enzymatisk kaskade sammensatt av tre forskjellige reaksjoner1. Det første trinnet er karakterisert ved ubiquitinaktivering, som avhenger av en ATP-hydrolyse for å danne et høyenergi-tioesterbundet ubiquitin mellom ubiquitin C-terminalen og cysteinresten som er tilstede i det aktive stedet for E1-enzymet. Deretter overføres ubiquitinet til E2-enzymet og danner et thioester-lignende kompleks med ubiquitin. Etterpå er ubiquitin kovalent festet til substratet av E2, eller oftere, av E3-enzymet, som gjenkjenner og interagerer med substratet 2,3. Av og til er E4-enzymer (Ubiquitin-kjedeforlengelsesfaktorer) nødvendige for å fremme multiubiquitinkjedemontering3.
Ubiquitin har syv lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63), noe som tillater dannelsen av polyubiquitinkjeder som genererer forskjellige koblinger for å produsere forskjellige tredimensjonale strukturer som kommer til å bli gjenkjent av flere effektorproteiner 4,5. Derfor er den typen polyubiquitinkjede som introduseres i substratet avgjørende for å bestemme celleskjebta 6,7,8. Videre kan substratet ogsåubiquitineres gjennom sine N-terminale rester kalt N-degroner. Spesifikke E3 ubiquitin-ligaser er ansvarlige for N-degron-gjenkjenning, noe som tillater polyubiquitylering av nærliggende lysinrester9.
I dag er det mer enn 40 forskjellige SCF-spesifikke substrater karakterisert. Blant disse kan nøkkelregulatorer av flere biologiske veier, inkludert celledifferensiering og utvikling, samt celleoverlevelse og død, bli funnet 10,11,12,13. Dermed er identifisering av spesifikke substrater for hver E3 ubiquitin-ligase avgjørende for å designe et omfattende kart over ulike biologiske hendelser. Selv om identifisering av ekte substrater er biokjemisk utfordrende, er bruk av biokjemibaserte metoder svært godt egnet til å evaluere kjedespesifisitet og skillet mellom mono- og polyubiquitylering14. Denne studien beskriver en komplett protokoll for ubiquityleringsanalyse ved bruk av pattedyrcellelinjen HEK293T som overuttrykker substratet UXT-V2 (allestedsnærværende uttrykt prefoldinlignende chaperone isoform 2) med E3 ubiquitin-ligasekomplekset SCF (Fbxo7). UXT-V2 er en viktig kofaktor for NF-κB-signalering, og når dette proteinet er slått ned i celler, hemmer det TNF-α-indusert NF-κB-aktivering11. For å oppdage polyubiquitylert UXT-V2 brukes proteasomhemmeren MG132 siden den har evnen til å blokkere den proteolytiske aktiviteten til 26S-underenheten i proteasomkomplekset15. Videre sendes celleekstraktet til en liten IP for å rense substratet, ved å bruke et spesifikt antistoff immobilisert til agaroseharpiks for påfølgende påvisning av WB ved bruk av utvalgte antistoffer. Denne protokollen er svært nyttig for å validere substrat ubiquitylation i det cellulære miljøet, og den kan også tilpasses for forskjellige typer pattedyrceller og andre E3 ubiquitin-ligase komplekser. Det er imidlertid nødvendig å validere substratet som er testet gjennom en in vitro ubiquityleringsanalyse også, siden begge protokollene utfyller hverandre med hensyn til identifisering av sanne substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En oversikt over ubiquityleringsanalyseprotokollen i pattedyrceller er representert i figur 1.
Figur 1. Oversikt over ubiquitylation assay prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Cellekultur
- Dyrk HEK293T cellelinje i en 100 mm TC-behandlet kulturskål til 80% -90% sammenløp i vekstmedier (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) høy glukose supplert med 10% føtalt storfeserum (FBS) og penicillin (100 enheter), streptomycin (100 μg) og L-glutamin (0,292 mg / ml)). Inkuber kulturen ved 37 °C i en fuktet cellekulturinkubator ved 5 % CO2.
- For å passere cellene, aspirer media fra kulturskålen ved hjelp av en serologisk pipette. Vask cellene en gang med 1 ml sterilisert 1x fosfatbufret saltvann (PBS 1x).
- Løsne cellene ved å tilsette 1 ml trypsin / EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) løsning. Rug parabolen ved 37 °C i 5 min. Resuspender cellene ved hjelp av en serologisk pipette i 2 ml vekstmedier.
- Overfør cellesuspensjonen til et friskt og rent 15 ml rør og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Fjern supernatanten ved å helle den forsiktig ut. Resuspender cellepelleten forsiktig i 3 ml vekstmedier ved å pipettere opp og ned for å oppnå en homogen cellesuspensjon.
- Overfør 1 ml av cellesuspensjonen til en 100 mm TC-behandlet kulturskål som inneholder 9 ml vekstmedier.
MERK: Hvis cellene er i gode forhold, kan hver kulturskål av HEK293T, hvor sammenløpet er 80% -90%, generere tre kulturretter med 80% sammenløp 2 dager etter passasjen.
2. Cell transfeksjon
MERK: Det anbefales ikke å transfektere cellekulturen hvis samløpet som er nådd er mindre enn 80%.
- Før transfeksjon, sertifiser om cellene er fri for forurensning og ved tilstrekkelig sammenløp for forbigående transfeksjoner.
- For hver transfeksjonsprøve, klargjør DNA-polyetylenimine (PEI 1 μg / μL ved pH 7,2) komplekser som følger:
- Fortynn 3 μg av hvert plasmid i 100 μL opti-MEM I redusert serummedium uten tilskudd og bland det forsiktig ved å pipettere løsningen opp og ned.
MERK: Her ble cellene transfisert med 4 μg av hvert plasmid: Tom vektor (pcDNA3) eller FLAG-Fbxo7 konstruksjoner og UXT-V2-HA, med eller uten 6xHis-myc-ubiquitin. Det totale DNA-innholdet var 12 μg. - Tin PEI ved RT og legg den inn i løsningen etter en andel på 3 μL PEI per 1 μg DNA. Homogeniser løsningen ved å pipettere opp og ned. Inkuber den deretter i 15 minutter ved RT for å tillate dannelse av DNA-PEI-komplekser.
MERK: Den optimale andelen PEI-volum per DNA-mengde varierer i henhold til den valgte cellelinjen.
- Fortynn 3 μg av hvert plasmid i 100 μL opti-MEM I redusert serummedium uten tilskudd og bland det forsiktig ved å pipettere løsningen opp og ned.
- Tilsett det totale volumet av DNA-PEI-komplekser til hver tallerken som inneholder cellekulturen, og bland det forsiktig ved å vugge platen frem og tilbake. Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet cellekulturinkubator ved 5 % CO2.
- Bytt ut vekstmediet etter 5 timer, siden langvarig PEI-eksponering kan være giftig for HEK293T-celler. Inkuber cellene ved 37 °C i en inkubator for fuktet cellekultur ved 5 % CO2 i 36 timer.
3. Cellelyse og immunprecipitasjon
- Etter inkubasjonsperioden og 6 timer før cellelyse, behandle de transfiserte cellene med 10 μM av proteasomhemmeren MG-132. Igjen, inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet cellekulturinkubator ved 5% CO2.
- Aspirer media fra hver kulturskål ved hjelp av en serologisk pipette og vask den en gang med 1 ml 1x PBS. Løsne cellene ved å tilsette 1 ml trypsin og ruge i parabolen ved 37 °C i 5 minutter. Resuspender cellene i 1 ml vekstmedier.
- Overfør cellesuspensjonen til et friskt og rent 15 ml rør og sentrifuger det ved 500 x g i 5 minutter ved RT.
- Fjern supernatanten ved å helle den forsiktig ut. Resuspender cellepelleten forsiktig i 200 μL iskald NP-40 lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl og 1% NP-40), supplert med protease- og fosfatasehemmercocktailen (10 mM NaF og 1 mM Na3VO4), og overfør løsningen til et rent 1,5 ml mikrorør.
- Inkuber cellelysatet i 30 minutter på is. Etter inkubering sentrifugerer cellelysatene ved 16 900 x g i 20 minutter ved 4 °C.
- I mellomtiden balanserer agarose-anti-HA-perlene med iskald NP-40 lysisbuffer. Bruk 15 μL agarose-anti-HA-perler for hver prøve. Vask perlene med 200 μL NP-40 lysisbuffer ved å pulsere den i et mikrosentrifugerør ved 3000 x g i 1 min ved 4 °C. Med en pipette, aspirer og kast supernatanten veldig forsiktig; Gjenta denne prosessen tre ganger. Etterpå holder du perlene likevektet på is til bruk.
- Etter sentrifugering av cellelysatene, gjenopprett supernatanten. Kvantifiser proteininnholdet i det totale lysatet ved hjelp av Bradford-metoden16.
- Sørg for at hver prøve som utsettes for immunprecipitasjon presenterer en lik mengde protein. Inkuber det nødvendige volumet av cellelysat med de likevektede agarose-anti-HA-perlene i 4 timer, roterer forsiktig i en roterende inkubator ved 4 ° C, noe som gjør at UXT-V2-HA kan binde seg til agarose-anti-HA-perlene.
- Samle agarose-anti-HA-perlene ved å pulsere dem i et mikrosentrifugerør ved 3000 x g i 1 minutt ved 4 °C. Aspirer forsiktig og kast supernatanten. Vask perlene tre ganger med iskald NP-40 cellelysebuffer og to ganger med iskald FLAG/HA-buffer (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl og 0,1 % NP-40).
- Etter den siste vasken fjernes all supernatant forsiktig med en pipette og eluerer det polyubiquitylerte proteinet med HA-peptid (300 μg/ml) fortynnet på FLAG/HA-buffer. Inkuber agarose-anti-HA-perlene med HA-peptid i 1 time ved 4 °C i en gyngende shakerplattform.
- Spinn perlene ved 3000 x g i 2 minutter ved 4 °C og pipetter forsiktig supernatanten som inneholder de polyubiquitinerte proteinene. Oppbevar eventuelt eluatet i et friskt og rent mikrorør ved -20 °C.
- Løs eluatene og cellelysatene i 10 % SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese)17 og immunblotting.
- I denne studien ble det utført en våt overføring WB. For denne typen overføring, legg gelen i en overføringssandwich sammensatt av filterpapir-gel-membranfilterpapir, pute det med pads og trykke det sammen med et støttegitter. Plasser dette systemet vertikalt i en tank fylt med overføringsbuffer og mellom rustfritt stål / platinatrådelektroder. Overføringen skjer i 90 min ved 150 V i våt overføringsbuffer (glycin 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanol).
MERK: Siden celleekstraktene ble kvantifisert (trinn 3.7), kjør en SDS-SIDE med lik mengde protein for hver prøve. For å løse eluatet, kjør også like volumer av hver prøve. - Sonder immunblotmembranen ved hjelp av utvalgte antistoffer 11. Sørg for at det oppdages et smøresignal i eluatet fra det polyubiquitylerte substratet trukket i IP-prosessen ved å bruke anti-myc antistoff i prøvene som inneholder villtype E3-ligasen, substratet og myc-ub. I cellelysatet (inngang), sørg for at signalet fra det valgte substratet, Fbxo7-proteinet, ubiquitylerte proteiner og et rengjøringsprotein (f.eks. GAPDH og β-aktin) oppdages for å garantere samme mengde proteiner i hver bane.
MERK: Fortynningen for hvert antistoff som ble brukt ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UXT (allestedsnærværende uttrykt transkripsjon) er et prefoldinlignende protein som danner allestedsnærværende uttrykte proteinfoldende komplekser i mus og menneskelig vev som hjerte, hjerne, skjelettmuskulatur, morkake, bukspyttkjertel, nyre og lever18. To spleisingsisoformer av UXT, som heter UXT-V1 og UXT-V2, har blitt beskrevet å utføre forskjellige funksjoner og subcellulære steder. UXT-V1 er hovedsakelig lokalisert i cytoplasma og inne i mitokondriene, og det er involvert i TNF-α-indusert apoptose og antiviral signalosomdannelse19,20. De fleste undersøkelser har fokusert på UXT-V2 som hovedsakelig er lokalisert i kjernen og fungerer som en medfaktor for flere transkripsjonsfaktorer involvert i celleproliferasjonsregulering, differensiering og i inflammatoriske veier. UXT-V2 er involvert i NF-κB-signalveien som fungerer som en viktig koaktivator i NF-κB-enhanceosomet21. Det ble vist at UXT-V2 er et kanonisk substrat av E3 ubiquitin-ligase SCF (Fbxo7), som medierer dets polyubiquitylering og nedbrytning av proteasomet, og følgelig hemmer NF-κB-signalveien11.
Den spesifikke polyubiquityleneringen av UXT-V2-HA mediert av Fbxo7 i celler ble observert etter sondering av eluatet fra anti-HA IP med et anti-myc antistoff, som påviser myc-ub konjugert til substratet (figur 2). Spesifisiteten til anti-myc for polyubiquitylert substrat ble visualisert i baner 1 og 2 (figur 2), hvor smøring av polyubiquitylerte proteiner ikke ble påvist når celler ble transfisert samtidig med Fbxo7 og myc-ub i fravær av UXT-V2-HA-plasmid (figur 2, lane 1). I tillegg ble det ikke visualisert utstryk tilsvarende proteinpolyubiquitinasjon i kombinasjonen Fbxo7 og UXT-V2-HA uten myc-ub-plasmidet (figur 2, bane 2). For å bevise at UXT-V2 polyubiquitylering ble formidlet av Fbxo7, ble en tom vektor pcDNA3, vill type Fbxo7 eller Fbxo7-ΔF-box mutant, som ikke er i stand til å sette sammen aktivt SCF-kompleks på grunn av fraværet av F-box-domenet som er ansvarlig for interaksjon med SKP1, transfisert i kombinasjon med UXT-V2-HA og myc-ub. Et sterkt smøresignal av polyubiquitylert UXT-V2 ble kun observert i nærvær av villtype Fbxo7 (figur 2, bane 4), noe som tyder på at UXT-V2 var polyubiquitylert av SCF (Fbxo7) kompleks i celler sammenlignet med kontrollene (figur 2, baner 3 og 5). Tilstedeværelsen av et svakt smøresignal av polyubiquitylert UXT-V2 i nærvær av disse negative kontrollene kan indikere virkningen av endogen Fbxo7 eller annen E3 ubiquitin-ligaseaktivitet.
Figur 2. Ubiquityleringsanalyse i celler: Forbigående transfeksjon av HEK293T-celler med de angitte plasmidene. Etter cellelyse ble celleekstraktene (inngangene) immunprecipitert med agarose-anti-HA-perler. Eluterte og inngangsprøver ble løst av SDS-PAGE, og western blot ble probet med spesifikke antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ubiquitylering er en viktig posttranslasjonell modifikasjon som regulerer nivåene av flere proteiner og spiller en avgjørende rolle i mange signalveier og biologiske prosesser, og sikrer et sunt intracellulært miljø. Ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) er et av hovedfokusene i nyere farmasøytisk forskning, og gir mulighet for å stabilisere tumorundertrykkere eller indusere nedbrytning av onkogene produkter22. For eksempel fremmer avvikende proliferasjon av plasmacelle-neoplasmer som er ansvarlige for monoklonal immunglobulinsekresjon i myelomatose (MM) en patofysiologisk vei på grunn av feilfoldet og/eller utfoldet proteinakkumulering i endoplasmatisk retikulum (ER)23. Når dette ER-stresset skjer, aktiverer det flere prosesser, inkludert aktiveringen av ubiquitin-proteasomsystemet. Bruk av proteasomhemmere (bortezomib, karfilzomib og iksazomib) for å indusere proteinakkumulering og påfølgende celledød for myelomatosebehandling viste lovende resultater som antitumormedikament ved å redusere sykdomsprogresjon hos høyrisikopasienter24,25. Videre er andre anstrengelser fokusert på proteinstabilitet rettet, for eksempel hemmere for E3 ubiquitin-ligase MDM2 som viste stor evne til å unngå ubiquitylering av p53, og dermed forhindre nedbrytning gjennom proteasomet26. Dermed har det oppstått en ny epoke med farmasøytisk/biomedisinsk forskning sentrert rundt å forstå og kontrollere UPS som en metode for å bekjempe sykdommen.
Denne studien beskriver en metode for å analysere ubiquitylering av et spesifikt målprotein ved en gitt E3 ubiquitin-ligase i et cellulært miljø. I denne analysen blir et betydelig antall celler forbigående samtransfisert med utvalgte plasmider som koder for et merket proteinsubstrat, en E3-ligase og et merket ubiquitin. Før lysis må cellene behandles med en proteasomhemmer for å tillate akkumulering av polyubiquitylerte proteiner som vil gjennomgå nedbrytning i proteasomet. For å oppnå en mindre kompleks prøve ble målproteinet immunoprecipitert, og dets polyubiquitylering ble analysert av WB ved hjelp av spesifikke antistoffer basert på ubiquitin-taggen.
Mengden protein i hver prøve og agaroseperler må normaliseres for å tillate datasammenligning blant disse prøvene. Et høyintensivt smøresignal av UXT-V2 polyubiquitylering i nærvær av villtype E3 ubiquitin-ligase ble påvist. Selv om signalet oppnådd fra målproteinet, E3-ligasen og ubiquitinet kan være fra en endogen opprinnelse, har bruken av rekombinante proteiner fordelen av høyere utbytte og signaldeteksjon i WB-analyse. Videre tillater bruk av wild-type E3 ligase og dens mutant den spesifikke analysen av deres aktivitet i substratet, noe som er en viktig kontroll for dette eksperimentet. Det ble observert at Fbxo7-mutanten (Fbxo7-ΔF-boksen) ikke kunne fremme polyubiquitylering av UXT-V2, noe som tyder på at smøresignalet oppdaget i nærvær av villtypen Fbxo7 var spesifikt. I tillegg er det viktig å observere at i fravær av det merkede substratet eller myc-ub ble det polyubiquitylerte smøret ikke oppdaget, noe som indikerer spesifisiteten til agarose-anti-HA som ble brukt. Bruk av et anti-ubiquitin antistoff for å undersøke eluatet fra substrat IP kan oppdage et polyubiquitylert smøresignal selv i de negative kontrollene, siden uspesifikke proteiner eller indirekte proteinpartnere av målet også kan elueres sammen med substratet. Når disse uspesifikke proteinene kan være polyubiquitylerte, kan den høye følsomheten til anti-ubiquitin oppdage dem.
Det er også noen variasjoner for denne protokollen angående plasmidtransfeksjon, cellelysebuffer, immunoprecipitasjonsantistoff og WB-sondering. IP-en som presenteres her ble utviklet med anti-HA-antistoff for å utfelle substratet, og WB-membranen ble probet med anti-myc antistoff for å visualisere ubiquitin-signalet. Transfeksjon av ubiquitin-HA og IP med anti-HA og WB som undersøker membranen med en anti-substrat eller anti-substratmerke er også et alternativ for denne metoden. Imidlertid kan immunprecipitasjonen av ubiquitin bringe et stort antall uspesifikke polyubiquitylerte proteiner i tillegg til ubiquitinbindende proteiner. I dette tilfellet anbefales det å bruke RIPA-buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer) under cellelyse for å minimere disse uønskede proteiner27. Det er imidlertid viktig å vurdere om IP-protokollen er kompatibel med RIPA-buffer. Videre kan substratpolyubiquitylering svekke bindingen av antistoffet til dette spesifikke målet ved å blokkere den konformasjonelle epitopen. Dermed er anvendelsen av antistoffer med anti-tag mer pålitelig.
Selv om denne tilnærmingen er svært nyttig for løselig proteinrensing, presenterer den noen begrensninger. For det første kunne virkningen av uspesifikke endogene E3 ubiquitin-ligaser observeres. For å overvinne dette problemet og for å bekrefte spesifisiteten til mål ubiquitylering i celler, er det viktig å også utføre en in vitro ubiquitylation-analyse ved bruk av renset E3-ligasekompleks og valgt substrat i tillegg til E1- og E2-enzymer, ubiquitin, ubiquitinbuffer og ATP, som er kommersielt tilgjengelige. En annen begrensning av denne metoden oppstår når overekspresjonen av målproteinet forårsaker en cytotoksisk effekt som kulminerer i redusert cellulær levedyktighet. I denne situasjonen anbefales bruk av det endogene proteinmålet for immunprecipitasjon. I tillegg, som nevnt ovenfor, er denne protokollen egnet for løselig proteinekstraksjon; derfor kan den ikke trekke ut membranbundne proteiner, for eksempel. Hvorvidt substratet som testes er et membranprotein, kan RIPA-bufferen erstatte NP-40 lysisbufferen beskrevet her hvis IP-protokollen ikke blir kompromittert av den. I denne protokollen er fokuset på proteinclearance ubiquitin-proteasomsystemet, noe som forklarer at bare proteasomhemmeren ble brukt. Imidlertid gjennomgår mange oppløselige proteiner nedbrytning gjennom autofagi i lysosomet. Følgelig kan bruk av en lysosomhemmer, som bafilomycin A1, også være nødvendig for å blokkere senfase autofagi på grunn av vakuolar H + -ATPase28.
Siden ubiquitylering er en reversibel prosess, kan ubiquitin fjernes fra substratet ved den katalytiske aktiviteten til deubiquitinaser (DUB); dette er en av de største hindringene når man karakteriserer E3 ubiquitin-ligase substrater29. Virkningen av DUB øker substratdiskriminering i denne typen eksperiment når den reduserer polyubiquitylerings oppholdstider på noen mål30. Derfor vil det være fordelaktig å behandle cellene med deubiquitinasehemmere for å unngå dette problemet. Positiv eller negativ crosstalk kan også påvirke skjebnen til et bestemt substrat. Det er allerede fastslått at posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) kan krysstalke i ulike scenarier, og fosforylering, for eksempel, kan regulere ubiquitylering ved modulering av E3 ubiquitin-ligaseaktivitet, fremme substratgjenkjenning av E3-ligaser eller gjennom regulering av substrat- og E3-ligaseinteraksjon ved å påvirke dens cellulære lokalisering31 . Dette kan være et problem når du velger cellelinjen der eksperimentet skal utføres. Hvis signalene som er forutsetninger for ubiquitylering er fraværende i den ønskelige cellelinjen, er det nødvendig å velge en alternativ cellelinje for å utføre analysen eller indusere signalet i den valgte cellelinjen. Et vanlig problem som kan oppstå i allestedsnærværende analyser utført i celler er massiv celledød etter MG132-behandling, som hovedsakelig skyldes generering av reaktive oksygenarter (ROS) som induserer apoptotisk celledød. Etter flere tester for å standardisere protokollen, ble det funnet en ideell MG132-behandling for HEK293T-celler for ikke å overstige 6 timer før lysis ved 10 μM konsentrasjon. Denne protokollen er også egnet for andre pattedyrcelletyper for å identifisere substrat-E3 ubiquitin-ligasepar; selv om det er avgjørende å standardisere volumet av PEI som brukes i transfeksjonen og MG132-behandlingsperioden for den valgte cellelinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
F.R.T støttes av FAPESP-tilskuddsnummer 2020/15771-6 og CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P og V.S støttes av CAPES. C.R.S.T.B.C ble støttet av FAPESP-stipendnummer 2019/23466-1. Vi takker Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) for den materielle støtten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
References
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J.
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T.
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M.
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
