Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من سائل ألانتويك

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

نقدم هنا إجراء مفصلا لإنتاج وتنقية وتحديد كمية فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار. ينتج عن هذا البروتوكول باستمرار > 6 × 109 وحدات لتشكيل اللويحات / مل ، مما يوفر كميات الفيروس المناسبة للدراسات الحيوانية في الجسم الحي . يتم وصف اختبارات مراقبة الجودة الإضافية لضمان السلامة في الجسم الحي .

Abstract

فيروس مرض نيوكاسل (NDV) ، المعروف أيضا باسم النمط المصلي لفيروس orthoavulavirus الطيور -1 ، هو فيروس RNA سلبي ، وحيد تقطعت به السبل تم تطويره كفيروس محلل للأورام ولقاح ناقل للفيروسات. NDV هو عامل علاجي ووقائي جذاب بسبب نظامه الوراثي العكسي الراسخ ، وخصائص التحفيز المناعي القوية ، وملف تعريف السلامة الممتاز. عندما يتم إعطاؤه كفيروس محلل للأورام أو لقاح ناقل للفيروسات ، يثير NDV استجابة مناعية قوية مضادة للورم أو مستضد خاص ، مما ينشط كل من الأذرع الفطرية والتكيفية لجهاز المناعة.

بالنظر إلى هذه الخصائص المرغوبة ، تم تقييم NDV في العديد من التجارب السريرية وهو واحد من أكثر الفيروسات المحللة للأورام التي تمت دراستها جيدا. حاليا، هناك تجربتان سريريتان مسجلتان تشملان NDV: واحدة تقيم لقاحا مؤتفيا ناقلا من NDV ل SARS-CoV-2 (NCT04871737)، والثانية تقيم ترميز NDV المؤتلف Interleukin-12 بالاشتراك مع Durvalumab، وهو جسم مضاد مضاد PD-L1 (NCT04613492). ولتيسير إحراز مزيد من التقدم في هذا الناقل الفيروسي الواعد للغاية، هناك حاجة إلى أساليب مبسطة لتوليد NDV المؤتلف من الدرجة العالية في الجسم الحي (rNDV).

تصف هذه الورقة إجراء مفصلا لتضخيم rNDV في بيض دجاج جنيني محدد خال من مسببات الأمراض (SPF) وتنقية rNDV من سائل الألانتويك ، مع تحسينات لتقليل الخسارة أثناء التنقية. وتشمل أيضا وصفا لاختبارات مراقبة الجودة الموصى بها، والتي ينبغي إجراؤها للتأكد من نقص الملوثات وسلامة الفيروسات. بشكل عام ، يتيح هذا الإجراء التفصيلي توليف وتنقية وتخزين NDV عالي العيار ، في درجة الجسم الحي ، المؤتلف ، lentogenic ، و mesogenic NDV للاستخدام في الدراسات قبل السريرية.

Introduction

فيروس مرض نيوكاسل ، المعروف أيضا باسم Avian Orthoavulavirus-1 ، هو فيروس باراميكسو الطيور المغلف مع إمكانية استخدامه كفيروس محلل للأورام أو لقاح ناقل للفيروسات1،2،3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم NDV للتعبير عن بروتين سبايك من SARS-CoV-2 وقد تم وصفه بأنه لقاح فعال داخل الأنف في نماذج تحدي الفئران والهامستر7،8،9. عند استخدامه كعلاج مناعي للسرطان ، فإنه يؤدي إلى تجنيد الخلايا المناعية الفطرية ، وتحديدا الخلايا القاتلة الطبيعية ، وإنتاج الإنترفيرون من النوع الأول ، وتوليد الخلايا التائية المضادة للأورام10،11،12،13. بالإضافة إلى هذه الخصائص المناعية القوية ، فإن NDV لديه ملف تعريف أمان قوي ونظام وراثي عكسي راسخ14,15. وقد دفعت هذه الخصائص المرغوبة إلى تقييم NDV في العديد من التجارب السريرية قبل السريرية والبشرية (NCT04871737 ، NCT01926028 ، NCT04764422) 16,17. وللمضي قدما في هذا الناقل الفيروسي الواعد للغاية والمحفز للمناعة، هناك حاجة إلى طرق مفصلة لإنتاج وتنقية NDV عالي العيار وفائق النقاء الذي يمكن إعطاؤه بأمان في الجسم الحي.

نظرا لأن NDV هو فيروس باراميكسو للطيور ، فإنه يتم تضخيمه في أغلب الأحيان في بيض الدجاج الجنيني. في حين أن هناك أنظمة قائمة على الخلايا متاحة لنشر NDV ، إلا أن معظمها لم يتمكن من إنتاج عيارات مماثلة لتلك التي تحققت في بيض الدجاج الجنيني18. ومع ذلك ، هناك بعض العيوب في إنتاج NDV في البيض ، بما في ذلك حقيقة أن الإنتاج القائم على البيض طويل وغير قابل للتطوير بسهولة ، ويمكن أن يكون الحصول على كميات كبيرة من بيض الدجاج SPF مشكلة ، وهناك احتمال للتلوث بمسببات الحساسية للبيض 13،18،19،20 . في الآونة الأخيرة ، أظهرت إحدى المجموعات أن خلايا Vero المزروعة في تعليق في وسط خال من المصل يمكن أن تدعم تكرار NDV إلى عيارات مماثلة لتلك التي تحققت في البيض ، قبل التنقية21. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب مرورا تسلسليا للفيروس لتكييف الفيروس مع خلايا Vero ، ولا يزال تحسين طريقة لتنقية NDV من خلايا Vero المعلقة مطلوبا21.

كما هو موضح سابقا ، تختلف الطرق المستخدمة لتنقية العيار العالي ، في الفيروس الحي ، اعتمادا على الفيروس في السؤال22. هناك نظام وراثي عكسي راسخ متاح لتوليد NDV المؤتلف. هذه العملية ، التي تنطوي على استخدام استنساخ cDNA ، والبلازميدات المساعدة ، وفيروس مساعد يعبر عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، تم وصفها مسبقا بالتفصيل15,23. يمكن تطبيق هذا البروتوكول إما على NDV العدسي أو الميزوجيني. الفيروس الموصوف في هذا البروتوكول هو NDV ميزوجينيك مؤتلف يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من قنديل البحر Aequorea victoria المدرج بين جينات P و M الفيروسية كوحدة نسخ فردية ، حيث تم وصف هذا سابقا بأنه الموقع الأمثل لإدخال الجينات المحورة الأجنبية24.

تحدد الطرق المرفقة تنقية NDV بناء على حجمها ، الذي يتراوح من 100 إلى 500 نانومتر ، وكثافته15. وقد سمح ذلك بتوليد مخزون NDV عالي العيار من الجسم الحي في حوالي 3 أسابيع ، بدءا من وقت استلام البيض إلى الحصول على عيار نهائي. يتم وصف التقنيات المستخدمة بشكل متكرر في الإنتاج الواسع النطاق للفيروسات القائمة على البيض مثل ترشيح التدفق العرضي ، وترشيح العمق ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يتيح ترجمة هذه الأساليب إلى إنتاج على نطاق أوسع. تم تحسين التقنيات الموصوفة سابقا لتنقية NDV من خلال دمج مخزن مؤقت مثبت للفيروسات ، واستخدام اليوديكسانول أثناء الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، ووصف مختلف تدابير مراقبة الجودة لضمان الجودة في الجسم الحي 15. وقد سمح ذلك بتنقية NDV في الجسم الحي وصولا إلى عيارات تصل إلى 3 × 1010 PFU / mL من 0.8 إلى 1.0 لتر من السائل الألانتويك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال التي تنطوي على استخدام الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات بجامعة جيلف وفقا للمجلس الكندي لرعاية الحيوانات. يتم تنفيذ جميع الأعمال في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) في كندا حيث NDV الميزوجيني هو أحد مسببات الأمراض من مجموعة المخاطر الثانية. يجب تنفيذ جميع الخطوات المشاركة في تضخيم وتنقية NDV في خزانة السلامة البيولوجية من النوع IIA لأغراض السلامة والعقم.

1. تضخيم NDV باستخدام بيض دجاج جنيني محدد خال من مسببات الأمراض

  1. تلقيح بيض الدجاج الجنيني SPF
    ملاحظة: عادة ، يتم استخدام ثمانية عشر بيض دجاج جنيني SPF لتوليد دفعة واحدة من NDV من فئة الجسم الحي. اطلب واحدة أو عشرين بيضة إضافية لحساب الضرر أثناء الشحن وكذلك التباين في قابلية البقاء. بيض الدجاج الجنيني هو مادة بيولوجية ويجب التعامل معه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. ومع ذلك ، نظرا لأن الأجنة لا تفقس ، فإن موافقة لجنة رعاية الحيوان المؤسسية غير مطلوبة.
    1. بعد تلقي بيض الدجاج الجنيني SPF ، احتضن في حاضنة البيض عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 60٪ لمدة 9 أيام. تأكد من ضبط الحاضنة على صخرة / تدوير البيض تلقائيا كل ساعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة أو 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة. ومع ذلك ، قد يقلل هذا من صلاحية الجنين.
    2. بعد 8-11 يوما من الحضانة (من الناحية المثالية في اليوم 9) ، شمع البيض لتحديد صلاحية الجنين. ابحث عن الأوعية الدموية الشبيهة بالويب (الشكل 1A) وحركة الأجنة كمؤشرات على الأجنة القابلة للحياة. تخلص من البيض الذي يفتقر إلى هذه الميزات (الشكل 1 ب).
    3. على البيض القابل للحياة ، ضع علامة على الواجهة بين الكيس الهوائي والجنين بقلم رصاص بعلامة "X" (الشكل 1A). تأكد من أن موقع الحقن هذا لن يسبب ثقب الأوعية الدموية. أعد البيض المميز إلى الحاضنة أثناء تحضير اللقاح.
    4. احسب كمية الفيروس المطلوبة لحقن جميع بيض الدجاج الجنيني SPF. تأكد من أن كل بيضة تتلقى 100 PFU من الفيروس بحجم 100 ميكرولتر ؛ تمييع الفيروس في المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) إلى تركيز 1 × 103 PFU / mL. قم بإعداد 20٪ إضافية من اللقاح لحساب عدم الدقة في إدارة الفيروس.
    5. باستخدام منديل مضاد للكهرباء الساكنة ، قم بتنظيف قمم البيض المميز بمحلول يود 10٪ ، مخفف في 70٪ إيثانول. انتظر حوالي 1-2 دقيقة حتى يجف المحلول.
    6. اخترق القشرة بعناية باستخدام زوج من الملقط الحاد المعقم. تعقيم الملقط في 70 ٪ من الإيثانول بين البيض.
    7. باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 25 غرام ، حقن 100 ميكرولتر من اللقاح المحضر في الخطوة 1.1.4 في تجويف chorioallantoic (الشكل 1C). اقترب بالإبرة بزاوية 90 درجة تقريبا من البيضة. أدخل الإبرة فقط في الجزء العلوي من الغشاء المشيمي.
    8. بعد التلقيح ، استخدم طلاء الأظافر لتغطية موقع الثقب وإعادة البيض إلى الحاضنة. تأكد من أن إعداد الهزاز قيد التشغيل حتى 24 ساعة بعد التلقيح.
    9. تحقق من صلاحية البيض 24 ساعة بعد التلقيح. تخلص من البويضات الميتة التي تفتقر إلى الأوعية الدموية في الغشاء المشيمي وحركة الجنين (الشكل 1B).
      ملاحظة: ماتت هذه البويضات بسبب عملية التلقيح وليس بسبب NDV.
    10. أعد البيض إلى الحاضنة ، مع إطلاق الروك لمنع تلوث السائل الألانتوي ببروتينات البيض.
    11. تحقق من البيض كل 12-24 ساعة كما هو موضح في الخطوة 1.1.9 لتحديد البيض الميت. انقل البيض الذي يموت بعد 24 ساعة بعد التلقيح إلى 4 درجات مئوية لتقليل التحلل الذاتي. حصاد السائل allantoic في غضون 2-12 ساعة من التبريد.
    12. احتضن البيض لمدة 72 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: في حالة نشر سلالة متوسطة المنشأ من NDV ، فإن وقت الحضانة الأمثل هو 60-72 ساعة ، حيث أن أوقات الحضانة المطولة يمكن أن تضعف عملية التنقية بسبب انخفاض وضوح السائل اللانتويك. هذه المسألة ليست بنفس الأهمية عند نشر سلالات NDV العدسية لأنها تستغرق وقتا أطول بكثير لقتل الجنين.
    13. بعد فترة الحضانة المناسبة ، حرك البيض المتبقي إلى 4 درجات مئوية لمدة 2-12 ساعة قبل حصاد السائل اللانطوي.
  2. حصاد السائل الألانتويك الذي يحتوي على NDV
    1. انقل البيض المبرد إلى خزانة السلامة الأحيائية. تنظيف قمم البيض مع 70 ٪ من الإيثانول.
    2. استخدم ملاقط معقمة ومقص جراحي لفتح الجانب القمي من البويضة حيث يوجد الكيس الهوائي.
    3. قم بإزالة القشرة للكشف عن الغشاء المشيمي (الشكل 1D).
    4. ثقب الغشاء بعناية وقشره مرة أخرى لفضح التجويف الألانتوي (الشكل 1E). تأكد من عدم ثقب كيس الصفار عن طريق الخطأ لأن هذا سيفسد البيضة.
    5. استخدم ملقط حاد للاستيلاء على الجنين وفتح الكيس الجنيني.
      ملاحظة: يحتوي السائل الموجود داخل الكيس الجنيني أيضا على NDV.
    6. اخفض الجنين باستخدام الملقط وجمع السائل الألانتويك باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
    7. قم بتخزين السائل الألانتوي على الجليد في أنابيب مخروطية سعة 15 مل حتى التوضيح.
      ملاحظة: إذا كان السائل الألانتويك أصفر، فقد تعرض كيس صفار البيض للخطر ويجب التخلص من السائل اللانتويك.
    8. جهاز طرد مركزي للأنابيب المخروطية التي تحتوي على سائل الألانتويك عند 1500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. نقطة التوقف: Aliquot السائل الألانتويك الموضح في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل (على سبيل المثال ، أسابيع إلى أشهر) ، مع استكمال السائل بالسكروز إلى تركيز نهائي قدره 5٪ لحماية الفيروس من الآثار القاسية لذوبان الجليد. بدلا من ذلك ، للتخزين على المدى القصير (على سبيل المثال ، 1-3 أيام) ، استكمل سائل الألانتويك بالسكروز (النهائي 5٪) أو مع 3x Mannitol-Lysine (ML) المخزن المؤقت (15٪ Mannitol ، 3٪ Lysine ؛ انظر الجدول التكميلي S1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت) لإنتاج تركيز نهائي من 1x (5٪ Mannitol ، 1٪ Lysine) قبل التخزين عند 4 درجات مئوية.

2. تنقية NDV من السائل الألانتويك

  1. الترشيح العميق للسائل الألانتويك
    1. قم بتخزين السائل الأنطوي المصفى عند -80 درجة مئوية وقم بإذابته عند 4 درجات مئوية في الليلة السابقة للتنقية.
    2. في خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإعداد الأنابيب والمضخة التمعجية كما هو موضح في الشكل 2.
    3. إذا لم يتم تنفيذه بالفعل ، فقم بدمج السائل الألانتوي مع المخزن المؤقت 3x ML إلى تركيز نهائي قدره 1x.
    4. قبل توصيل مرشح العمق ، قم بتعقيم الأنابيب عن طريق تمرير 50 مل من 0.5 مليون NaOH عبر النظام إلى وعاء نفايات.
    5. شطف الأنابيب عن طريق تمرير 100 مل من المياه المعقمة من الدرجة الجزيئية من خلال النظام وإلى وعاء النفايات.
      ملاحظة: نظرا لأن NaOH سيؤدي إلى تعطيل NDV ، فمن المهم أن يتم غسل الخطوط بشكل كاف قبل إدخال سائل allantoic المحتوي على الفيروس.
    6. قم بتشغيل النظام عن طريق تشغيل 50 مل من PBS من خلاله ، وإيقاف المضخة عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل من PBS المتبقية في الأنبوب.
    7. قم بتوصيل مرشح العمق مع تصنيف الاحتفاظ 1-3 ميكرومتر بالأنبوب وإزالة الغطاء الثاني على الجانب القمي من مرشح العمق لتهوية الفلتر. ابدأ تشغيل 50 مل إضافية من PBS من خلال النظام.
    8. بمجرد أن يبدأ PBS في التدفق عبر فتحة التهوية الموجودة أعلى الفلتر ، أغلق المنفذ واستمر في تدفق PBS عبر الخطوط.
      ملاحظة: فقاعات الهواء الصغيرة مقبولة ولكن وجود كميات كبيرة من الهواء سيتطلب تنفيس المرشح مرة أخرى كما هو موضح في الخطوتين 2-1-7 و 2-1-8.
    9. أوقف المضخة عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل من PBS المتبقية في الأنبوب.
    10. استبدل وعاء النفايات بوعاء تجميع معقم جديد وابدأ في تشغيل سائل الألانتويك من خلال مرشح العمق.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الضغط 10 رطل لكل بوصة مربعة لأن هذا يؤدي إلى قص الفيروس. يمكن التلاعب بالضغط عن طريق تقليل أو زيادة معدل تدفق المضخة. إذا بدأ الضغط يتجاوز 10 رطل لكل بوصة مربعة ولا يمكن تقليل معدل التدفق أكثر من ذلك ، فيجب استخدام مرشح عمق جديد. في هذه الحالة ، يجب تنفيذ الخطوات 2.1.6-2.1.8 قبل استئناف تدفق السائل اللانتويك.
    11. بمجرد مرور كل السائل الألانتويك عبر المرشح ، قم بتشغيل 50 مل من المخزن المؤقت 1x ML عبر الخطوط لتحقيق أقصى قدر من التعافي من الفيروس.
    12. اجمع السائل حتى تجف الخطوط. تخزين الفيروس بين عشية وضحاها أو حتى 36 ساعة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: بمجرد تصفية الفيروس في العمق، استمر في عملية التنقية في غضون 36 ساعة من إكمال ترشيح العمق.
    13. افصل فلتر العمق وقم بتعقيم الأنابيب عن طريق تشغيل 100 مل من 0.5 مليون NaOH ، وتبييض 400 جزء في المليون تم تسخينه مسبقا إلى 42 درجة مئوية من خلال النظام قبل التخزين في 0.5 M NaOH.
  2. ترشيح التدفق العرضي لتركيز NDV
    1. قم بتجميع مكونات الكاسيت كما هو موضح في الشكل 3A (وكما هو موضح سابقا25) في خزانة السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: يجب غسل المشعب واللوحة الطرفية في المنظفات وتجفيفها قبل الاستخدام. حشيات السيليكون قابلة لإعادة الاستخدام ويجب تخزينها في 0.5 M NaOH مع الكاسيت.
    2. قم بإعداد نظام ترشيح التدفق العرضي (TFF) (المعروف أيضا باسم الترشيح عبر التدفق) في تشكيل "مفتوح" (الشكل 3B).
      1. في حالة استخدام كاسيت لأول مرة، قم بتجميع كاسيت TFF في تشكيل Elution واغسله ب 100 مل من الماء المعقم الجزيئي (الشكل 3C).
      2. بمجرد بقاء 5 مل فقط من الماء في خزان الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا وغير إعداد نظام TFF إلى تشكيل مغلق (الشكل 3D).
      3. أضف 100 مل من 0.5 مليون NaOH ، ومبيض 400 جزء في المليون تم تسخينه مسبقا إلى 42 درجة مئوية إلى الخزان وقم بالدوران عبر النظام لمدة 30-60 دقيقة.
      4. أوقف التدفق مؤقتا وأعد نظام TFF إلى إعداد الإزالة ، واستأنف التدفق لإلغاء محلول التنظيف.
      5. عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل متبقية في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا وأضف 100 مل من الماء المعقم الجزيئي لشطف النظام.
      6. عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل متبقية في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا وضع نظام TFF في التشكيل المفتوح (الشكل 3B). تابع مع الخطوة 2.2.3.
    3. قم بتعقيم الكاسيت والأنابيب عن طريق تمرير 100 مل من 0.5 مليون NaOH من خلال النظام باستخدام المضخة التمعجية. تأكد من أن الضغط لا يتجاوز 30 رطل لكل بوصة مربعة للحفاظ على سلامة الكاسيت.
    4. أوقف المضخة مؤقتا عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل من 0.5 مليون NaOH المتبقية في الخزان.
    5. أضف 100 مل من الماء المعقم الجزيئي إلى الخزان واستأنف تمرير السائل عبر الكاسيت. قم بتدوير الخزان لغسل جميع NaOH من جوانب الخزان لمنع تعطيل الفيروس. كرر خطوة غسل الخزان.
    6. عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل من المياه المعقمة ذات الدرجة الجزيئية المتبقية في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا.
    7. أضف 100 مل من PBS إلى الخزان ، وقم بالدوران لضمان غسل الماء المعقم الجزيئي من الجانبين. استئناف تدفق السائل من خلال الكاسيت.
    8. عندما يكون هناك ما يقرب من 5 مل متبقية في الخزان ، قم بإيقاف المضخة مؤقتا ، وأضف سائل الألانتويك المصفى بعمق إلى الخزان ، واستأنف تدفق المضخة.
    9. راقب مقياس الضغط 1 (الشكل 3B) لضمان عدم تجاوزه 10 رطل لكل بوصة مربعة لمنع قص الفيروس. استخدم مزيجا من سرعة المضخة التمعجية واستخدام المشابك C لزيادة التخلص من النفايات.
      ملاحظة: سيؤدي الجمع بين سرعة المضخة التمعجية والمشابك C إلى زيادة الضغط.
    10. عندما يكون هناك 50-100 مل من سائل الألانتويك المتبقي في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا لإجراء تبادل مؤقت عن طريق إضافة 150-200 مل من المخزن المؤقت 1x ML.
    11. استأنف تدفق المضخة، وراقب مرة أخرى مقياس الضغط 1 (الشكل 3B) لضمان عدم تجاوزه 10 رطل لكل بوصة مربعة.
    12. عندما يكون هناك 5-10 مل متبقية في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا.
    13. باستخدام اثنين من المشابك C ، أغلق خطي النفايات كما هو موضح في الشكل 3C.
    14. قم بفصل خط الارتداد الذي يغذي الخزان وأدخله في أنبوب مخروطي سعة 50 مل (الشكل 3C).
    15. استئناف تدفق المضخة ، والتوقف مؤقتا عندما يكون هناك بضع قطرات من السوائل المتبقية في خزان الخزان.
    16. قم بإزالة المشابك C من خطوط النفايات وأعد توصيل خط التغذية المعاد تثبيته بخزان الخزان (الشكل 3B).
    17. أضف 20-25 مل من المخزن المؤقت 1x ML واستأنف تدفق المضخة حتى يتبقى حوالي 5 مل في خزان الخزان.
    18. كرر الخطوات من 2.2.13 إلى 2.2.16.
      ملاحظة: يمكن إجراء عملية إزالةثلاثية عن طريق تكرار الخطوات 2.2.17 و 2.2.13 إلى 2.2.16 لزيادة عائد الفيروسات. ومع ذلك ، فإن معظم الفيروس موجود في أول اثنين من الخروجات.
    19. بعد الانتهاء من عمليات الإزالة ، ضع الفيروس على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.
    20. لتطهير الخطوط ، قم بإعداد النظام بحيث يكون تنسيق حلقة مغلقة (الشكل 3D) مع خطوط النفايات التي تغذي الخزان مرة أخرى كما هو موضح في الشكل 3D.
    21. تابع تنظيف النظام بإضافة 250 مل من 0.5 مليون NaOH ، 400 جزء في المليون من المبيض المسخن مسبقا إلى 42 درجة مئوية.
    22. تدفق محلول التنظيف من خلال النظام بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: أثناء إعادة تدوير محلول التنظيف ، إذا تم تشغيل المضخة بسرعة 50 مل / دقيقة ، فيجب ملاحظة ضغط يبلغ حوالي 5 رطل لكل بوصة مربعة. إذا تجاوز الضغط هذا ، فإن الكاسيت متسخ ، ويجب استبدال محلول التنظيف ، وتكرار العملية.
    23. قم بالتخلص من محلول التنظيف عن طريق توجيه كل من خطوط النفايات وخط الارتداد إلى حاوية نفايات.
    24. أضف 400-500 مل من الماء المعقم إلى الخزان واتدفقه عبر النظام وفي أوعية النفايات.
    25. عندما يتم ترك حوالي 5 مل في الخزان ، أوقف المضخة مؤقتا وأضف 100-200 مل من 0.5 مليون NaOH إلى خزان الخزان ، مع تدوير المحلول لغسل حاوية الخزان.
    26. بمجرد أن يصبح الخزان فارغا تقريبا ، كرر الخطوة 2.2.23 مرتين إضافيتين.
    27. قم بتفكيك إعداد TFF ، وتخزين كاسيت TFF والحشوات في حجم صغير يبلغ 0.5 M NaOH في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة مغمورة في 0.5 M NaOH.
  3. اليوديكسانول كثافة التدرج الطرد المركزي الفائق
    1. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق واضبطه على التبريد المسبق على 4 درجات مئوية. قم بتبريد الدوار المطلوب مسبقا عند 4 درجات مئوية أيضا (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب تخزين الدوارات عند 4 درجات مئوية.
    2. استخدم محلول اليوديكسانول 60٪ (التركيز في وقت الشراء) لتوليد 40٪ و 20٪ و 10٪ من حلول اليوديكسانول عن طريق التخفيف باستخدام PBS و 3x ML Buffer إلى تركيز نهائي 1x من ML buffer.
    3. في أنبوب طرد مركزي فائق الجدار مفتوح السطح ومفتوح السطح ورقيق الجدار ، تراكب 0.5 مل و 2.5 مل و 2.5 مل من حلول 40٪ و 20٪ و 10٪ من يوديكسانول ، على التوالي (الشكل 4A).
      ملاحظة: إمالة أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق على جانبه وطرد المحلول ببطء سيقلل بشكل كبير من خطر خلط طبقتي التدرج. يجب أن يكون فصل كل طبقة واضحا ، مع وجود "هالة" مرئية بين كل طبقة من التدرج.
    4. استخدم قلم تمييز لوضع علامة على واجهات طبقات التدرج المختلفة.
    5. طبقة 6-6.5 مل من الفيروس المنزوع من إجراء TFF فوق تدرج الكثافة. أضف الفيروس بعناية كما هو موضح في الخطوة 2.3.3 لتجنب إزعاج تدرج الكثافة.
    6. قم بتحميل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة في الإدخالات الخاصة بدوار الجرافة المتأرجح (انظر جدول المواد) باستخدام مقياس مفتوح لموازنة الإدخالات في حدود 0.01 جم من بعضها البعض. استخدم PBS أو فيروس إضافي لحساب الاختلافات في الوزن.
    7. بمجرد توازن الأنابيب ، قم بتغطية الأنابيب وتحميلها في الدوار.
    8. جهاز طرد مركزي لمدة 1.5 ساعة عند 125000 × جم عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إجراء ذلك بين عشية وضحاها إذا كان جهاز طرد مركزي فائق مع إمكانية تأخير بدء التشغيل متوفرة.
    9. بعد الطرد المركزي الفائق، قم بإزالة الأنابيب باستخدام زوج من الملقط المعقم. ابحث عن النطاق المستهدف - وهو نطاق كبير - بين التدرجات 10٪ و 20٪ (الشكل 4B).
    10. الأنبوب فوق الجزء العلوي من الكأس باستخدام حامل معوجة.
    11. قم بتوصيل إبرة 18 جم × 1.5 بوصة بحقنة سعة 5 مل وثقب جانب أنبوب الطرد المركزي الفائق.
      ملاحظة: يجب ثقب الأنبوب أسفل الشريط المستهدف بقليل ، مع وجود الإبرة بزاوية تصاعدية وشطبها بحيث تنتقل إلى النطاق المستهدف.
    12. قم بتمديد المكبس ببطء لإزالة النطاق المستهدف.
      ملاحظة: حرك الإبرة داخل النطاق المستهدف لزيادة الفيروس المستخرج إلى أقصى حد. كن حذرا من عدم خلط العصابات أو الحطام الآخر مع النطاق المستهدف ، وتجنب تناول محلول زائد لأن هذا سيؤدي إلى استخدام المزيد من أشرطة غسيل الكلى.
    13. بمجرد استخراج الشريط المستهدف ، قم بإزالة الإبرة ، واسمح للمحلول المتبقي بالتصريف في وعاء النفايات. قم بتوزيع النطاق المستهدف في أنبوب مخروطي سعة 50 مل حتى يتم استخراج جميع النطاقات من جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الأخرى.
    14. كرر الخطوات 2.3.10-2.3.13 حتى يتم استخراج جميع النطاقات المستهدفة من جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
    15. نهج بديل لاستخراج النطاقات المستهدفة على النحو المبين في الخطوات 2-3-10 إلى 2-3-13
      1. قم بإزالة السائل الذي يغطي الشريط المستهدف ببطء باستخدام ماصة. بمجرد الوصول إلى النطاق المستهدف ، استخرجه باستخدام ماصة وخزن الفيروس في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
        ملاحظة: يسمح هذا بإعادة استخدام أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
  4. إزالة اليوديكسانول من محلول الفيروسات
    ملاحظة: يظهر النطاق المحتوي على NDV بكثافة يوديكسانول تتراوح بين 15٪ و 16٪. يمكن تحديد تركيز اليوديكسانول في المحلول عن طريق قياس الامتصاص عند 340 نانومتر في إشارة إلى منحنى قياسي (الشكل التكميلي S1). ويمكن حذف هذه الخطوة لعدم ملاحظة أي آثار ضارة أو سمية حادة عندما أعطيت محاليل اليوديكسانول لهذا التركيز للفئران C57BL/6.
    1. Prewet 0.5-3 مل 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع كاسيت غسيل الكلى عن طريق غمره في PBS لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يتغير غشاء غسيل الكلى من مظهر ناعم إلى مظهر كشكش أو وعرة. إذا تجاوز حجم الفيروس المستخرج 10 مل ، فيجب استخدام شريطين لغسيل الكلى سعة 0.5-3 مل أو كاسيت غسيل الكلى سعة 5-12 مل.
    2. حسب الاقتضاء ، استخدم إما حقنة 5 أو 10 مل وإبرة تعبئة حادة 18 جم × 1.5 بوصة لجمع الفيروس من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
    3. استخدم المحقنة لدخول كاسيت غسيل الكلى ، مع الحرص على عدم اختراق الغشاء ، وحقن الفيروس.
      ملاحظة: يمكن تدوير كاسيت غسيل الكلى لمعالجة موضع الجيب الهوائي في الكاسيت. يجب إزالة الجيب الهوائي قبل إزالة الإبرة من الكاسيت.
    4. املأ دورقا سعة 1 لتر ب 1x PBS معقم ، وضع قضيب تحريك وكاسيت غسيل الكلى في الداخل ، وغطى. يحضن في 4 درجات مئوية مع التحريك اللطيف.
      ملاحظة: استخدم رغوة البوليسترين المبثوقة وشريط مرن لإرفاق كاسيت غسيل الكلى بحيث يطفو في PBS. قد ينتفخ الكاسيت قليلا بسبب المخزن المؤقت ML.
    5. بعد 1-2 ساعة ، استبدل ب 1x PBS طازج واستمر في الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 8-10 ساعات أخرى مع تحريك طفيف.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك أيضا بين عشية وضحاها.
    6. استبدل ب 1x PBS طازج مرة أخرى ، مع احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة.
  5. تركيز محلول الفيروس
    1. قم بإزالة كاسيت غسيل الكلى من المخزن المؤقت لغسيل الكلى (الشكل 4C) وضعه في كيس بلاستيكي صغير قابل للإغلاق. أضف 15-25 مل من 40٪ 20000 ميجاوات من البولي إيثيلين جلايكول بحيث يتم غمر كاسيت غسيل الكلى بالكامل.
    2. حضانة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز. تحقق من حجم الفيروس في الكاسيت بشكل دوري باستخدام حقنة 5 أو 10 مل وإبرة تعبئة حادة 18 جم × 1.5 بوصة.
      ملاحظة: يختلف مقدار الوقت اللازم لتركيز الفيروس بناء على حجم البدء وحجم النهاية المطلوب. عادة ما يتراوح الحجم النهائي المطلوب بين 1 و 1.5 مل بغض النظر عن حجم بدء السائل الألانتويك. عند التحقق من مستوى الصوت ، احرص على عدم استخدام نفس المنفذ لأن هذا سيضر بسلامة المنفذ وقد يؤدي إلى خلط محلول البولي إيثيلين جلايكول والفيروس.
    3. قبل إزالة الفيروس المركز من كاسيت غسيل الكلى ، اشطف الكاسيت لفترة وجيزة في 1x PBS واملأ إبرة تعبئة حادة 18 جم × 1.5 بوصة بالهواء.
    4. أدخل المحقنة المملوءة بالهواء في كاسيت غسيل الكلى وقم بخفض المكبس. قم بتدوير الجهاز بحيث يمكن إزالة الفيروس المركز دون إزالة أي من الهواء المدخل.
    5. قم بتوزيع الفيروس المركز في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، مع ملاحظة الحجم الذي تم توزيعه.
    6. باستخدام نفس المحقنة والإبرة ، قم بحقن كمية مناسبة من السكروز بنسبة 60٪ في كاسيت غسيل الكلى بحيث يكون ، عند دمجه مع الفيروس الذي تمت إزالته مسبقا ، عند تركيزه النهائي من السكروز 5٪.
    7. استخدم أصابع القفاز لتدليك الغشاء لإزاحة الفيروس المتبقي الذي ربما التصق بالغشاء ، مع الحرص على عدم إتلافه. إزالة بعض الهواء الزائد في كاسيت غسيل الكلى لتخفيف عملية الإزاحت.
    8. الجمع بين هذا الغسيل مع الفيروس بالفعل في أنبوب مخروطي 50 مل.
      ملاحظة: الفيروس الآن في 5٪ من السكروز وجاهز للتوزيع في 20 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر وتخزينه عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، بالنسبة للتخزين على المدى الطويل ، يمكن تجميد NDV وتخزينه عند 4 درجات مئوية كما هو موضح في القسم 2.6.
  6. التجفيد من NDV
    1. قم بتكبير الفيروس في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل أو أنابيب مخروطية سعة 15 مل عند 44 × 10-3 ميجا بار و - 52 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    2. تخزين العينات المجمدة بالتجميد في 4 درجات مئوية دون انخفاض كبير في العيار الفيروسي.

3. اختبارات مراقبة الجودة

  1. عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي لتأكيد الجينوم
    1. إذابة فيروس 20 ميكرولتر aliquot. اتبع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي المقدم مع المجموعة.
    2. استخدم الحمض النووي الريبي المعزول على الفور كقالب للنسخ العكسي PCR (RT-PCR) أو قم بتخزينه عند -80 درجة مئوية.
    3. قم بإعداد تفاعلات النسخ العكسي كما هو موضح في البروتوكول المقدم من الشركة المصنعة.
    4. استخدم cDNA الناتج كقالب لمختلف تفاعلات PCR لمراقبة الجودة لتأكيد النمط المرضي NDV (الجدول 1 ، مجموعة التمهيدي للبروتين F) ووجود عناصر التحكم في الجينات المطلوبة (الجدول 1 ، مجموعة التمهيدي Transgene).
      ملاحظة: يجب تصميم الاشعال على أساس سلالة NDV التي يتم نشرها.
      1. لتسلسل موقع انقسام البروتين F ، المحدد الرئيسي للنمط المرضي ، استخدم مجموعة التمهيدي بروتين F (الجدول 1). ابحث عن منتج PCR من 435 زوجا أساسيا في الطول.
        ملاحظة: هنا ، تم تصميم الاشعال على أساس سلالة LaSota من NDV (انضمام Genbank AF077761.1). من الثابت أن التعبير الأمثل عن الجينات المحورة يحدث عندما يتم إدخال جين متحول أجنبي بين جينات P و M24.
      2. استخدم مجموعة التمهيدي للجين المتحول لتأكيد سلامة عناصر بداية الجين ونهايته الجينية للجين العابر. تسلسل منتج PCR لتأكيد بداية الجين وسلامة تسلسل نهاية الجينات.
    5. أرسل منتجات PCR لتسلسل الحمض النووي وقارنها بقالب التماثل.
  2. SDS PAGE وتلطيخ Coomassie للكشف عن البروتينات الملوثة
    1. قم بصب جل SDS PAGE متدرج الكثافة عن طريق إعداد حلول بولي أكريلاميد بنسبة 6٪ و 15٪ (الجدول التكميلي S1). استخدم ماصة 10 مل لرسم 5 مل من محلول 15٪ ، تليها 5 مل من محلول 6٪.
    2. قم بإزالة الماصة من المحلول وتوليد فقاعة هواء عن طريق سحب الهواء لفترة وجيزة.
      ملاحظة: أثناء انتقال فقاعة الهواء إلى أعلى، يؤدي ذلك إلى مزج الحل لإنشاء تدرج صفحة SDS.
    3. قم بتوزيع المحلول في جهاز الصب واتركه يتصلب لمدة 30 دقيقة.
    4. في حجم نهائي من 20 ميكرولتر ، اجمع بين أليكوت من الفيروس مع مخزن مؤقت مختزل 4x (الجدول التكميلي S1) بحيث يكون التركيز النهائي 1x ، ويغلي لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية في دورة حرارية. تحميل ما لا يقل عن 1 × 107 PFU من الفيروس.
    5. قم بغمر صفحة SDS في المخزن المؤقت قيد التشغيل (الجدول التكميلي S1) وقم بتحميل العينات.
    6. قم بتشغيل الجل على 120 فولت لمدة 1-1.5 ساعة.
    7. قم بإزالة الجل من المخزن المؤقت الجاري وانقله إلى حاوية أصغر.
    8. أضف محلول تلطيخ Coomassie (الجدول التكميلي S1) لتغطية الجل. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-5 ساعات.
    9. قم بإزالة محلول التلطيخ وإضافة محلول destain (الجدول التكميلي S1) ، المحتضن لمدة 4-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة. تغيير حل destain ثلاث إلى أربع مرات.
      ملاحظة: يجب أن يكون الجل واضحا ويجب أن يكون لونه كما كان قبل التلطيخ.
    10. قم بتصوير الجل على إعداد قياس الألوان. انظر الشكل 5 للحصول على صورة تمثيلية لهلام SDS PAGE ملطخ ب Coomassie يحتوي على عينات من سائل allantoic وفيروس منقى.
  3. تحديد كمية عيار الفيروسات المعدية عن طريق متوسط الجرعة المعدية لزراعة الأنسجة (TCID50) وفحص التألق المناعي
    ملاحظة: يمكن استخدام خلايا Vero كبديل لخلايا DF1 ؛ ومع ذلك ، فإن تأثير اعتلال الخلايا (CPE) أقل وضوحا في خلايا فيرو. يتم استخدام NDV الذي يؤوي طفرة L289A ، التي تعزز الاضطراب ، ويعبر عن GFP بين جينات P و M في هذا الفحص.
    1. زرع صفيحة 96 بئر من خلايا DF1 في 20000 خلية / بئر في حجم 80 ميكرولتر في اليوم السابق لاستخدام DMEM تستكمل مع 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 125 ميكروغرام / مل التربسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. في اليوم التالي ، قم بإذابة أليكوت 20 ميكرولتر من الفيروس على الجليد.
    3. استخدم أنابيب 1.5 مل لإعداد التخفيفات التسلسلية. ابدأ بتخفيف 10 ميكرولتر من الفيروس مع 990 ميكرولتر من PBS لإعداد تخفيف 10-2 . قم بإعداد جميع التخفيفات الأخرى ، حتى 10-10 كحد أدنى ، مصنوعة من 900 ميكرولتر من PBS وإضافة 100 ميكرولتر من التخفيف السابق.
      ملاحظة: استخدم طرف ماصة جديد عند التنقل بين التخفيفات.
    4. استخدم 20 ميكرولتر من كل تخفيف لإصابة كل بئر من صفيحة 96 بئرا كما هو موضح في الشكل 6.
      ملاحظة: سيكون الحجم النهائي في كل بئر 100 ميكرولتر.
    5. احتضن اللوحة لمدة 48 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، قبل فحص وجود CPE / GFP أو إجراء فحص التألق المناعي غير المباشر (IFA).
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف الثقافية، يكون CPE واضحا بعد 10 ساعات (الشكل 7A-D)، ويزداد خلال ال 24 ساعة التالية (الشكل 7E-H). يمكن احتضان اللوحة لفترة أطول لتحسين شدة CPE إذا تم تسجيلها بواسطة GFP أو CPE.
      1. إذا كان التسجيل بواسطة CPE أو GFP ولا يقوم بتنفيذ IFA، فانتقل إلى الخطوة 3.3.18.1.
    6. إذا كنت تؤدي IFA ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBS.
    7. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde المخفف في PBS إلى كل بئر واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. اغسل الخلايا 3 × 5 دقائق لكل منها ب 100 ميكرولتر من 1x PBS ، 0.1٪ Tween 20 (0.1٪ PBS-T).
    9. تخلل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.1٪ NP-40 في PBS واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق .
    10. اغسل الخلايا 3 × 5 دقائق مع 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T.
    11. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يتكون من مصل الماعز العادي بنسبة 5٪ (V / V) المخفف في 0.1٪ PBS-T لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    12. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الأجسام المضادة للبروتين الريبي النووي الريبي NDV الأولية للفأر المخفف بنسبة 0.1٪ PBS-T إلى 1 ميكروغرام / مل ، مع احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    13. اغسل الخلايا 3x لمدة 5 دقائق في 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T.
    14. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للماعز AlexaFluor 488 المخفف بنسبة 0.1٪ PBS-T إلى 2 ميكروغرام / مل. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    15. اغسل الخلايا 3x لمدة 5 دقائق في 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T.
    16. بعد الغسيل النهائي ، اترك الخلايا في 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T.
    17. صور الآبار باستخدام مجهر فلورسنت مقلوب.
    18. عند إجراء IFA ، ابحث عن التألق الأكبر من ذلك الذي شوهد في آبار التحكم السلبية ، مما يشير إلى أن البئر إيجابي ل NDV كما هو موضح في الشكل 8.
      1. ابحث عن وجود syncytia وخلايا كبيرة مستديرة تميز NDV CPE. إذا سجلت آبارا مصابة بفيروس يعبر عن GFP ، فابحث عن وجود GFP.
    19. أدخل المعلومات المناسبة في حاسبة عيار سبيرمان-كاربر26 لتحديد PFU/mL للفيروس (الجدول 2). انظر الشكل 6 للحصول على مثال على لوحة عيار TCID50 .
  4. القياس الكمي للعيار الفيروسي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
    ملاحظة: يوصى باستخدام مجموعة qRT-PCR من خطوة واحدة لتوفير الوقت وتقليل التلاعب بالعينات. يتم استخدام الفحص القائم على المسبار لزيادة خصوصية الكشف عن تسلسل الفيروسات.
    1. إنشاء منحنى قياسي لكمية معروفة من تسلسلات الفيروسات (الشكل التكميلي S2A,B).
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك عن طريق شراء جزء من الحمض النووي المزدوج الاصطناعي 500 نقطة أساس من جين NDV L. يمكن رؤية تسلسل جزء 500 نقطة أساس من جين NDV L في الشكل التكميلي S2C.
    2. قم بتحويل كمية جزء الحمض النووي للفيروس (عادة ما يتم توفيرها على شكل نانوغرام أو فيمتومول من قبل الشركات المصنعة) إلى عدد الجزيئات أو نسخ من جزء الحمض النووي باستخدام عدد Avogadro وصيغة الشامات إلى جزيئات (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. قم بإعداد عينات المنحنى القياسية من خلال إعداد سلسلة تخفيف عشرة أضعاف من نسخ أجزاء الحمض النووي المعروفة للفيروس ، بدءا من 1.00 × 10 10 نسخ وصولا إلى 1.00 ×10 0 نسخة.
    4. لتحديد كمية الحمض النووي الريبي NDV في عينات غير معروفة، قم باستخراج الحمض النووي الريبي NDV باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. اتبع البروتوكول المقدم مع المجموعة. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي ، تابع البروتوكول الموصى به المقدم في مجموعة qRT-PCR المكونة من خطوة واحدة.
    5. قم بتشغيل التفاعلات في أداة PCR في الوقت الفعلي مع ظروف درجة الحرارة وركوب الدراجات التالية: 1) دورة واحدة من النسخ العكسي عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 2) دورة واحدة من تمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ و 3) 40 دورة من تمسخ (95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان) ، والتمديد (60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) والحصول على إشارة الفلورسنت.
    6. بمجرد اكتمال فحص qRT-PCR ، قم بإنشاء المنحنى القياسي استنادا إلى عينات المنحنى القياسية باستخدام برنامج أداة PCR في الوقت الفعلي (الشكل التكميلي S2A ، B).
      ملاحظة: سيقوم البرنامج أيضا بحساب كمية الحمض النووي الريبي NDV في عينات غير معروفة بناء على المنحنى القياسي.
  5. اختبار السلامة للسمية الحادة في الفئران
    1. حقن 1 × 10 8 PFU من الفيروس عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل في ثلاثة فئران BALB / C عمرها8 أسابيع لتقييم السمية الحادة.
    2. راقب الفئران بحثا عن الأحداث السلبية مثل فقدان الوزن (>20٪) ، والموقف المنحني ، والمعاطف الكشكشة ، والخمول ، والتغيرات في التنفس. قم بالتقييم ثلاث إلى أربع مرات يوميا خلال ال 48 ساعة الأولى. عندما تبدأ الفئران في التعافي بعد 48 ساعة ، راقبها مرة إلى مرتين يوميا حتى تتعافى تماما.
      1. إدارة المياه المالحة تحت الجلد والرعاية الداعمة حسب الحاجة. على سبيل المثال ، تكملة مع هلام النظام الغذائي الانتعاش ، زبدة الفول السوداني ، أو استخدام الكرات الحرارة. القتل الرحيم للفئران التي وصلت إلى معايير نقطة النهاية ، على النحو المبين في المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات ، عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران تليها خلع عنق الرحم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حصاد السائل الألانتويك
عندما يتم حصاد السائل الألانتوي من بيض الدجاج الجنيني ، يجب أن يبدو واضحا وشفافا. إذا ظهر السائل غير شفاف وأصفر ، فهذا يشير إلى وجود ملوثات. إن إدراج هذا السائل الألانتوي أثناء التنقية سيعيق عملية التنقية ، حيث سيرتفع الضغط بسرعة ويتجاوز 10 رطل لكل بوصة مربعة ، مما يؤدي إلى قص الفيروس وفقدان الفيروس المعدي. يشير السائل الألانتوي الذي يبدو دمويا إلى أن البيض تم تطعيمه بالكثير من PFU من الفيروسات. سيكون العائد من هذه الدفعة من البيض أقل بكثير من المتوقع ومن غير المرجح أن يكون هذا الفيروس قادرا على استخدامه في الجسم الحي. يجب أن يكون للبيض الذي تم تلقيحه ب NDV العدسي واضح بعد 72 ساعة ويجب ألا تكون الأجنة قد ماتت ، كما هو موضح في الشكل 1. إذا كان لديهم ، فهذا يشير إلى أن الجنين قد تضرر أو تلوث بطريقة ما.

اليوديكسانول كثافة التدرج الطرد المركزي الفائق
بعد الطرد المركزي الفائق ، يجب وضع شريط عالي العيار أبيض يحتوي على NDV بين التدرجات 10٪ و 20٪ (الشكل 4B).

كوماسي وصمة عار من المواد الهلامية SDS-PAGE
يوضح الشكل 5 الفرق بين مخزون الفيروسات غير المنقى (Lane 2) ومخزون الفيروسات المنقى (Lane 3). وتظهر المقارنة بين الاثنين انخفاضا كبيرا في شدة نطاقات البروتين الملوثة وظهور نطاقات NDV المهيمنة في مخزون الفيروسات النقية.

تحديد كمية عيار الفيروسية بواسطة TCID50
إذا كنت تستخدم الشروط الموصى بها عند معايرة مخزون مركز من NDV ، فيجب أن يكون CPE واضحا بعد 24 ساعة (الشكل 6). بالمقارنة مع سلالة NDV lentogenic من عيار مماثل ، فإن CPE أكثر وضوحا في السلالة المتوسطة المنشأ في نفس النقطة الزمنية.

تحليل السمية الحادة في الفئران BALB / C البالغة من العمر 8 أسابيع
عندما يتم إعطاء 1 × 108 PFU عن طريق الوريد ، يجب مراقبة الفئران بحثا عن الآثار الضارة مثل فقدان الوزن >20٪ ، معطف كشكش ، موقف منحني ، والتنفس غير الطبيعي. خلال أول 24-36 ساعة ، ستبدأ الفئران في إنقاص الوزن ومن المحتمل أن تتطور معاطف كشكش وموقف منحني. ومع ذلك ، إذا كان الفيروس نقيا بما فيه الكفاية ، تبدأ الفئران في التعافي ، كما لوحظ من خلال زيادة الوزن والتحسن في الموقف وحالة المعطف بعد 36 ساعة. وينبغي مواصلة رصد الفئران التي لا تظهر عليها علامات التعافي هذه بحلول 36 ساعة عن كثب من أجل معايير نقطة النهاية. عادة ، حدث هذا بسبب التذبذب غير الدقيق ، وربما بسبب تراكم جزيئات الفيروس.

Figure 1
الشكل 1: عدوى وحصاد NDV من بيض دجاج جنيني محدد خال من مسببات الأمراض . (أ) الأوعية الدموية الشبيهة بالويب (السهام) التي يجب أن تكون واضحة بعد 9 أيام من الحضانة بالإضافة إلى حركة الجنين. يشير "X" إلى الواجهة بين الغشاء المشيمي وتجويف الهواء ، وحيث يجب إنشاء الثقب لتلقيح البويضة. (ب) صورة تصور جنينا ميتا. لاحظ عدم وجود الأوعية الدموية على شبكة الإنترنت. كما سيتم ملاحظة نقص في حركة الجنين. (ج) رسم تخطيطي لمكونات بيضة دجاج جنينية يوضح مواقع تجويف الهواء وكيس صفار البيض والكيس الأمنيوسي والغشاء المشيمي والسائل الأنطوي. (د) إزالة القشرة لفضح الغشاء المشيمي. (ه) يوضح كيف ينبغي أن يبدو السائل الألانتوي والجنين بعد فتح الغشاء المشيمي. اختصار: NDV = فيروس مرض نيوكاسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط يحدد الجمعية العامة للجهاز المستخدم في ترشيح العمق. تأكد من تثبيت مقياس الضغط في المنبع من مرشح العمق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد ترشيح التدفق العرضي في تكويناته المختلفة. تظهر الأسهم اتجاه تدفق السوائل. (أ) توضيح لكيفية تجميع كاسيت TFF. (ب) مخطط نظام TFF في تكوينه "المفتوح" المستخدم أثناء تنقية وتركيز السوائل. (ج) مخطط لإعداد TFF عند إخراج السائل من النظام ، كما هو مستخدم أثناء إزالة الفيروسات ومحلول التنظيف. (د) مخطط نظام TFF في تكوينه "المغلق" ، والذي يستخدم أثناء تنظيف نظام TFF. اختصار: TFF = ترشيح التدفق العرضي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الطرد المركزي الفائق التدرج في الكثافة وغسيل الكلى للفيروس المركز من TFF . (A) تخطيطي يوضح تكوين تدرج كثافة اليوديكسانول. (ب) نمط نطاقات الفيروسات بعد الطرد المركزي الفائق للفيروس المنتج باستخدام مخزن ML المؤقت أثناء عملية التنقية. يشار إلى الفرقة الرئيسية المحتوية على الفيروسات ببيضاوية سوداء. (ج) الحجم النموذجي لكاسيت غسيل الكلى المحمل ب 10 مل من الفيروس المحضر من خلال تدرج يوديكسانول في نهاية إجراء غسيل الكلى. اختصار: TFF = ترشيح التدفق العرضي. ML = مانيتول-ليسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: جل SDS-PAGE الملون بالكوماسي. يقارن Gel وجود البروتينات الملوثة بين مخزونات NDV غير النقية (حارة 2) ومنقية (حارة 3) عندما تم تحميل 1 × 105 PFU. الممرات 1 و 4 = سلم الوزن الجزيئي (MW). يتم عرض NDV HN و F0 ووحداتها الفرعية بعد الانقسام ، F1 و F2 ، إلى جانب أوزانها الجزيئية27 بخط أبيض. الاختصارات: SDS-PAGE = كبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الكهربائي ؛ NDV = فيروس مرض نيوكاسل; PFU = وحدات تشكيل اللويحات. HN = الهيماجلوتينين. F0 = الانصهار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مثال على تخطيط لوحة 96 بئرا يستخدم لتحديد عيار الفيروسات بواسطة TCID50. تنقسم اللوحة إلى 12 عمودا ، حيث يمثل كل عمود تخفيفا تسلسليا مختلفا. يشار إلى الآبار الإيجابية (كما هو محدد إما بواسطة CPE أو التعبير الجيني المتحول أو IFA) باللون الرمادي. وبالنظر إلى عدد الآبار الموجبة في هذا المثال، فإن العيار المتوقع بعد استخدام حاسبة عيار سبيرمان-كاربر (الجدول 2) مدرج في كل من TCID50/mL وPFU/mL. الاختصارات: TCID50 = الجرعة المعدية المتوسطة لزراعة الأنسجة ؛ CPE = تأثير الاعتلال الخلوي. IFA = فحص التألق المناعي; PFU = وحدات تشكيل اللويحات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: مقارنة CPE بعد إصابة خلايا DF1 مع NDV العدسي أو الميزوجيني. تم استخدام MOI من 0.5 بعد 10 ساعات من الحضانة (A-D) أو 24 ساعة من الحضانة (E-H) في ظل ظروف ثقافة مختلفة من DMEM + 15٪ FBS ، DMEM + 15٪ FBS + 5٪ سائل allantoic ، أو DMEM + 2٪ FBS + 125 ميكروغرام / مل التربسين. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: CPE = تأثير اعتلال الخلايا. NDV = فيروس مرض نيوكاسل; MOI = تعدد العدوى; FBS = مصل البقر الجنيني; DMEM = وسط النسر المعدل من دولبيكو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: مثال على حالة حيث تكون هناك حاجة إلى IFA لعيار NDV العدسي الذي يفتقر إلى جين GFP المحوري. تم استزراع خلايا فيرو في DMEM تحتوي على 2٪ FBS و 125 ميكروغرام / مل التربسين. تم التقاط الصور من التخفيف التسلسلي 10-7 . (أ) صورة برايت فيلد للخلايا المصابة. (ب) يوضح المظهر النموذجي للخلايا الملطخة عند استخدام IFA للكشف عن الفيروس. (ج) صورة مدمجة للمادتين (أ) و(ب). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: IFA = فحص التألق المناعي. NDV = فيروس مرض نيوكاسل; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; FBS = مصل البقر الجنيني; DMEM = وسط النسر المعدل من دولبيكو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الاشعال PCR و RT-qPCR للكشف عن قطاعات جينات فيروس مرض نيوكاسل. مجموعات التمهيدي المستخدمة للتضخيم المحدد لمنطقتين من جينوم NDV. ينتج عن مجموعة التمهيدي للبروتين F تضخيم منطقة من بروتين F تمتد عبر موقع انقسام البروتين F. تعمل مجموعة التمهيدي Transgene على تضخيم المنطقة بين الجينات بين جينات البروتين الفوسفوبروتين والمصفوفة ، وهو موقع إدخال الجينات المحورة الأمثل. يحتوي هذا الجدول أيضا على تسلسلات التمهيدي التي تستهدف الجين L الفيروسي21 ومسبار الجين L المستخدم في فحص qRT-PCR. الاختصارات: PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل. RT-qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي ؛ NDV = فيروس مرض نيوكاسل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: حاسبة عيار سبيرمان-كاربر. يحتوي جدول البيانات التفاعلي هذا على سير العمل والمعادلات المناسبة لتحديد تركيز الفيروس باستخدام نتائج TCID50 استنادا إلى التلقيح الجيد في مل ، ومخطط التخفيف ، وعدد النسخ المتماثلة لكل تخفيف. يتم الإبلاغ عن التركيز كحجم في مل مطلوب لإصابة 50٪ من زراعة الأنسجة (TCID50) ووحدات تشكيل اللويحات لكل مل من تعليق الفيروس. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي S1: تحديد تركيزات اليوديكسانول. (أ) المنحنى القياسي الناتج عن امتصاص المحاليل ذات تركيز اليوديكسانول المعروف عند 340 نانومتر. (ب) استخدم المنحنى القياسي والمعادلة من (أ) لتحديد تركيز اليوديكسانول في المحلول بعد الطرد المركزي الفائق التدرج في الكثافة، وغسيل الكلى، وتركيز البولي إيثيلين غليكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: التضخيم والمنحنى القياسي الناتج عن فحص qRT-PCR لجزء الحمض النووي المزدوج الاصطناعي 500 bp من جين NDV L. تم إنشاء التضخيم (A) والمنحنى القياسي (B) من عينات تحتوي على تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف (1.0 × 109 نسخ إلى 1.0 × 100 نسخة) من جزء الحمض النووي. وفيما يتعلق بالتضخيم والمنحنى القياسي، كانت العينات التي تحتوي على 1.0 × 10 نسخواحدة و1.0 ×10 نسخ أقل من العتبة ولم تنتج قيمة نقطة عبور أقل من 35 Cp. تم إنشاء المنحنى القياسي النهائي بناء على عينات تحتوي على 1.0 × 109 نسخ إلى 1.0 × 102 نسخة من جزء الحمض النووي. (ج) تسلسل الحمض النووي لجزء جين 500 نيوكليوتيد NDV L المستخدم لتوليد المنحنى القياسي في بروتوكول qRT-PCR. الاختصارات: PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل. RT-qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي ؛ NDV = فيروس مرض نيوكاسل; Cp = نقطة العبور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: تحميل واستخراج NDV من كاسيت غسيل الكلى. (أ) الحجم النموذجي لكاسيت غسيل الكلى بعد تحميله بحوالي 10 مل من المحلول المحتوي على الفيروس المعزول من تدرج كثافة السكروز وتصويره في نهاية خطوة غسيل الكلى. (ب) مثال على النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول دون مكملات المخزن المؤقت ML. محاط هو نطاق الفيروس المستهدف للإزالة. يشار إليها بالأسهم إلى شريط إضافي قد يحتوي على فيروسات تالفة. لاحظ أنه بعد دمج المخزن المؤقت ML في عملية التنقية ، لم يعد هذا النطاق واضحا. الاختصارات: NDV = فيروس مرض نيوكاسل. ML = مانيتول-ليسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: يوفر الخطوات اللازمة لتوليد حلول اللطخة الغربية والمخزن المؤقت ML المستخدم أثناء عملية التنقية. الاختصارات: SDS-PAGE = كبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الكهربائي ؛ TEMED = رباعي ميثيل إيثيلين ديامين; ML = مانيتول-ليسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يجب أن تكون الفيروسات المستخدمة كعوامل علاجية في الدراسات قبل السريرية عالية النقاء لتجنب السمية عند إعطائها في الجسم الحي15. إذا لم تتم إزالة العوامل أو الملوثات المغامرة ، فقد يؤدي ذلك إلى ردود فعل سلبية شديدة تنفي التأثير العلاجي للعامل الفيروسي28. نظرا لأن NDV يتم إنتاجه في بيض الدجاج الجنيني ، فهناك العديد من بروتينات البيض الملوثة ، مثل ovalbumin ، والتي يجب إزالتها قبل استخدامها في الجسم الحي في النماذج قبل السريرية أو السريرية29. حتى بعد التنقية المكثفة ، لا يزال يوجد ovalbumin29. إزالة هذه البروتينات الملوثة هي عملية صارمة تتطلب وقتا وموارد كبيرة15,22. إذا كان من الممكن إنتاج NDV في نظام قائم على الخلايا بعيارات عالية بما فيه الكفاية مطلوبة للتطبيقات في الجسم الحي ، فقد يؤدي ذلك إلى تبسيط عملية التنقية وتحسين ترجمة NDV إلى إعدادات سريرية. ومع ذلك ، فقد تم استخدام الإنتاج القائم على البيض من NDV الأورام في العديد من التجارب السريرية البشرية30.

في كل خطوة من خطوات عملية التنقية ، يمكن وضع العينات على ألواح أجار الدم كإجراء إضافي لمراقبة الجودة لضمان عدم وجود تلوث بكتيري.

يجب ألا يتراكم الضغط أثناء ترشيح العمق بسرعة. هذه علامة على تلوث البروتين وستبطئ عملية التنقية بشكل كبير وتتطلب استخدام مرشحات عمق إضافية. لا ينبغي إكمال ترشيح العمق بسرعة ؛ تستغرق هذه الخطوة عادة من 1 إلى 1.5 ساعة. عادة ما يؤدي الإكمال السريع لخطوة الترشيح العميق إلى انخفاض العيار الفيروسي.

ومع تركز الفيروس، ينبغي أن يظهر "تيار غائم" في الخزان من خط التوقف. هذا يشير إلى أن هناك فيروسا في السائل الألانتوي الذي يتم تركيزه أثناء مروره عبر الكاسيت.

خلال كل من خطوات ترشيح العمق وترشيح التدفق العرضي ، يجب ألا يتجاوز الضغط أبدا 10 رطل لكل بوصة مربعة. تجاوز هذا الضغط سوف يقص الفيروس. تعمل إضافة المخزن المؤقت ML إلى السائل الألانتوي كعامل استقرار ويفترض أنه يمنع التراكم الفيروسي ، مما يؤدي إلى زيادة استرداد الفيروس المعدي دون المساس بقابلية التصفية.

تحدد الطريقة المذكورة أعلاه إجراء مناسبا لإنتاج كل من سلالات NDV العدسية والميزوجينية في ظل ظروف BSL-2 ، نظرا لأن NDV الميزوجينيك ليس عاملا مختارا في كندا. وهذا يؤدي إلى توليد مخزونات عالية العيار مناسبة للاستخدام في النماذج الحيوانية. على غرار البروتوكولات الأخرى في الأدبيات التي تستخدم طرق تنقية استبعاد الحجم ، مثل ترشيح العمق و TFF ، تحد هذه الطرق من استخدام تقنيات الطرد المركزي الأكثر قسوة حيث يتم تقليل استرداد الفيروس مقارنة بطرق تنقية استبعاد الحجم15.

يوفر استخدام TFF عنصرا من عناصر قابلية التوسع حيث يمكن استخدام TFF لتركيز أحجام البدء الكبيرة ، على عكس تقنيات الطرد المركزي الفائق. يتم تحسين تقنيات تنقية NDV الحالية في البروتوكول أعلاه من خلال استبدال السكروز باليوديكسانول في خطوة الطرد المركزي الفائق ، مما يقلل بشكل كبير من فرصة فقدان الفيروس بسبب تمزق الكاسيت في نهاية خطوة غسيل الكلى ، وإضافة مخزن ML المؤقت ، مما يحسن الترشيح ويزيد من الغلة.

يفضل استخدام تدرجات اليوديكسانول على تدرجات السكروز لأن اليوديكسانول أقل لزوجة وغير سامة للخلايا ويوفر منتجا نهائيا "أنظف"31,32. قلل اليوديكسانول بشكل كبير من مستويات السيتوكينات المحفزة للالتهابات والكيموكينات الموجودة بعد الطرد المركزي الفائق التدرج المكثف للفيروس النقي33. على حد علمنا ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام اليوديكسانول في تنقية NDV. يمكن تحديد تركيز اليوديكسانول في محلول عن طريق تحديد كمية الامتصاص عند 340 نانومتر مع الإشارة إلى منحنى قياسي. تم استخدام هذه الخاصية لتحديد أن نطاقات NDV عند حوالي 15٪ من اليوديكسانول وللتأكد من أنه يمكن إزالتها عن طريق غسيل الكلى (الشكل التكميلي S1B). تم تطوير Iodixanol في البداية كعامل تصوير تباين ، ولم نلاحظ أي أحداث سلبية عندما تم إعطاء محلول iodixanol بنسبة 15٪ عن طريق الوريد وداخل الأنف إلى الفئران C57BL / 6. هذا يشير إلى أن غسيل الكلى لإزالة اليوديكسانول قد لا تكون هناك حاجة ، مما يقلل من عملية التنقية بحوالي 16 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، السكروز استرطابي ، مما يتسبب في تضخم كاسيت غسيل الكلى بشكل كبير ، مما يحد من الحجم الذي يمكن حقنه ويزيد من خطر تمزق الكاسيت وفقدان الفيروس34,35. عندما تم حقن كميات متساوية من الفيروس المحضر باليود والسكروز في أشرطة غسيل الكلى ، حدث تورم أقل بكثير في الفيروس المحضر باليود (قارن الشكل 4C والشكل التكميلي S3A). ومع ذلك ، فإن السكروز هو عامل استقرار أكثر ملاءمة ل NDV من اليوديكسانول. هذا أدى إلى استكمال تدرج اليوديكسانول مع المخزن المؤقت ML. قبل إضافة المخزن المؤقت ML إلى عملية التنقية ، كان هناك نطاق أكثر كثافة في تدرج اليوديكسانول بنسبة 10٪ الذي لوحظ بالإضافة إلى النطاق المستهدف عند 15٪ (الشكل التكميلي S3B). من المحتمل أن يحتوي هذا النطاق على فيروسات تالفة أو غير مكتملة تم إنشاؤها أثناء عملية التنقية. تسمح إضافة المخزن المؤقت ML بترشيح NDV بشكل أفضل مع تقليل الطبيعة الاسترطابية لوسط تدرج الكثافة ، مما يقلل من خطر تمزق كاسيت غسيل الكلى. يمكن تقليل تورم كاسيت غسيل الكلى عن طريق الديالي في 1x PBS مع استكمال 5٪ من السكروز ، لأن هذا هو في النهاية ما سيتم تخزين الفيروس فيه.

نظرا لأن NDV هو إحساس سلبي ، فإن فيروس الحمض النووي الريبي أحادي الخيط ، وعزل الحمض النووي الريبي وتوليد cDNA باستخدام الاشعال العشوائي ومجموعات التمهيدي المحددة ل PCR يسمح بتسلسل مناطق مختلفة من الجينوم من تفاعل cDNA واحد (الجدول 1). هذا مهم لأنه يسمح بتأكيد النمط المرضي وسلامة الجين المحول وعناصره التنظيمية النسخية. يجب أن يكون موقع الانقسام لبروتين NDV F العدسي أحادي القاعدة وليس متعدد الأساسيات ، حيث أن NDV الذي يمتلك مواقع الانقسام متعدد الأساسيات عادة ما يكون نمطا مرضيا ميسوجينيا أو فيلوجينيا ، ويصنف على أنه عوامل مختارة36,37. يصف هذا البروتوكول أيضا طريقة RT-qPCR موثوقة للقياس الكمي عالي الإنتاجية لجينومات NDV. قبل استخدامه في النماذج الحيوانية وبعد الانتهاء من اختبارات مراقبة الجودة الأخرى ، يجب تقييم السمية الحادة في فئران BALB / C البالغة من العمر 8 أسابيع. تتميز هذه السلالة بأنها أكثر حساسية للسمية التي يسببها الفيروس من السلالات الأخرى من الفئران15. بالإضافة إلى ذلك ، سيعطي هذا بعض المؤشرات على دقة عيار الفيروس. على سبيل المثال ، سيتم ملاحظة فقدان الوزن ، ولكن يجب أن يبدأ الوزن في الزيادة بعد 36-48 ساعة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فمن الممكن أن يكون عيار الفيروس أعلى مما تم الإبلاغ عنه في البداية ، والذي قد يكون بسبب تراكم الجسيمات الفيروسية. أدت هذه النتيجة الأولية بعد تنقية NDV المؤتلف إلى دمج المخزن المؤقت ML طوال عملية التنقية. وقد اقترح هذا المخزن المؤقت لتحسين قابلية تصفية الفيروس واستعادته أثناء عمليات التنقية38.

عند تحديد تركيز الفيروس المعدي بواسطة TCID50 ، قد يكون استخدام IFA ضروريا لتصور عدوى NDV ، خاصة عند التخفيفات العالية عندما لا يكون CPE واضحا ، أو إذا كان الفيروس لا يعبر عن جين مراسل الفلورسنت (الشكل 8). الجسم المضاد الأساسي المستخدم في IFA خاص بالبروتين النووي الريبي ل NDV ، وهو مركب بروتيني يرتبط بجينوم الحمض النووي الريبي أثناء تكرار الجينوم. نظرا لأن NDV هو فيروس طائر ، فإن خط الخلايا الليفية لجنين الدجاج ، DF1 ، هو خط خلية مثالي لتقييم عيار الفيروس. عادة ، يتم استخدام سائل الألانتويك السلبي للفيروس كوسيلة لتوفير البروتياز الشبيه بالتريبسين الذي تتطلبه NDVs lentogenic لانقسام البروتين F39. يمكن تجنب استخدام سائل الألانتويك السلبي للفيروس عن طريق تناول مكملات 125 ميكروغرام / مل من التربسين مع تقليل تركيز FBS إلى 2٪. وهذا يوفر بديلا بسيطا وفعالا من حيث التكلفة لسائل الألانتويك السلبي للفيروسات مع الاستمرار في توفير البروتياز الشبيه بالتريبسين المطلوب. عند مقارنة هذين الشرطين الثقافيين في MOI من 0.5 على مدى فترة زمنية 24 ساعة ، يبدو أن هناك فرقا طفيفا بين الاثنين ، مع احتمال أن يؤدي الوسط المكمل بالتريبسين إلى المزيد من CPE (الشكل 7). يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى مثل خلايا Vero بنفس ظروف الثقافة. ومع ذلك ، فإن CPE أقل وضوحا. باستخدام البروتوكول أعلاه مع خلايا DF1 ، يجب أن يكون NDV CPE واضحا في غضون 24 ساعة. على وجه التحديد ، ينبغي للمرء أن يرى تشكيل syncytia بواسطة 24 h (الشكل 7E-H). باستخدام إجراء التنقية الموصوف ، قمنا باستمرار بتنقية NDV إلى عيارات تتراوح من 1 × 109-3 ×10 10 PFU / mL من حجم يبدأ من 0.8-1.0 لتر من السائل الألانتويك.

بشكل عام ، يحسن البروتوكول الموصوف إجراءات تنقية NDV المنشورة مسبقا باستخدام اليوديكسانول كوسط تدرج كثافة بدلا من السكروز وإضافة مخزن ML المؤقت لتحسين الترشيح. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة تكميلية لمعايرة NDV ، وتضمين طريقة RT-qPCR مفصلة لتحديد رقم نسخة NDV ، وتحديد الظروف المثلى لاستخدام التربسين بدلا من السائل الألانتويك أثناء معايرة الفيروسات. وعلى الرغم من أن هذه العملية تولد مخزونات NDV عالية العيار يمكن إعطاؤها بشكل منهجي بجرعات عالية، فإن هذا الإجراء ينطوي على خطوات متعددة، والتي يمكن أن تزيد من التباين بين المستخدمين وتعرض إمكانية التلوث. هناك قيد إضافي هو شرط أن تكون المواد الأولية ذات جودة عالية. من الأهمية بمكان أن يكون السائل الألانتوي خاليا من صفار البيض الملوث لأن هذا يقلل بشكل كبير من كفاءة خطوات الترشيح واستبعاد الحجم. بشكل عام ، تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ولكن يمكن تقصيرها عن طريق حذف خطوة غسيل الكلى. ينتج عن هذا الإجراء عائد أكبر من الفيروسات من الدرجة الحية مقارنة بطرق التنقية الأخرى15,18. إن القدرة على إنتاج NDV أعلى جودة وأكثر تركيزا توسع قدراتها لاستخدامها كعامل محلل للأورام أو ناقل لقاح في النماذج الحيوانية للأمراض في كل من الإعدادات قبل السريرية والسريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

حصل J.G.E.Y على منحة دكتوراه من كلية أونتاريو البيطرية ومنحة دراسية للدراسات العليا في أونتاريو. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا Discovery Grants إلى SKW (المنحة رقم 304737) و LS (المنحة رقم 401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 183،
إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من سائل ألانتويك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter