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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg > 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Abstract

Das Newcastle-Disease-Virus (NDV), auch bekannt als Vogelorthoavulavirus-Serotyp-1, ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit negativem Sinn, das sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff entwickelt wurde. NDV ist aufgrund seines gut etablierten reverse-genetischen Systems, seiner starken immunstimulierenden Eigenschaften und seines ausgezeichneten Sicherheitsprofils ein attraktives therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Bei der Verabreichung als onkolytisches Virus oder viral-vektorisierter Impfstoff löst NDV eine robuste Antitumor- oder Antigen-spezifische Immunantwort aus, die sowohl den angeborenen als auch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert.

Angesichts dieser wünschenswerten Eigenschaften wurde NDV in zahlreichen klinischen Studien untersucht und ist eines der am besten untersuchten onkolytischen Viren. Derzeit gibt es zwei registrierte klinische Studien mit NDV: eine zur Bewertung eines rekombinanten NDV-vektorisierten Impfstoffs für SARS-CoV-2 (NCT04871737) und eine zweite zur Bewertung eines rekombinanten NDV, das Interleukin-12 kodiert, in Kombination mit Durvalumab, einem AntiPD-L1-Antikörper (NCT04613492). Um die Weiterentwicklung dieses vielversprechenden viralen Vektors zu erleichtern, sind vereinfachte Methoden zur Erzeugung von rekombinantem NDV (rNDV) mit hohem Titer-, In-vivo-Grad erforderlich.

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Amplifikation von rNDV in spezifizierten pathogenfreien (SPF) embryonierten Hühnereiern und zur Reinigung von rNDV aus Allantoikflüssigkeit mit Verbesserungen zur Verringerung des Verlusts während der Reinigung. Ebenfalls enthalten sind Beschreibungen der empfohlenen Qualitätskontrollassays, die durchgeführt werden sollten, um den Mangel an Kontaminanten und die Virusintegrität zu bestätigen. Insgesamt ermöglicht dieses detaillierte Verfahren die Synthese, Reinigung und Speicherung von hochtiteren, in vivo gradigen, rekombinanten, lentogen und mesogenen NDV für den Einsatz in präklinischen Studien.

Introduction

Newcastle Disease Virus, auch bekannt als Avian Orthoavulavirus-1, ist ein umhülltes aviäres Paramyxovirus mit dem Potenzial, sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff 1,2,3,4,5,6,7 verwendet zu werden. In jüngster Zeit wurde NDV, das zur Expression des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 entwickelt wurde, als wirksamer intranasales Impfstoff in den Maus- und Hamster-Challenge-Modellen 7,8,9 charakterisiert. Wenn es als Krebsimmuntherapie verwendet wird, führt es zur Rekrutierung angeborener Immunzellen, insbesondere natürlicher Killerzellen, zur Produktion von Typ-I-Interferon und zur Erzeugung von antitumorspezifischen T-Zellen10,11,12,13. Zusätzlich zu diesen starken immunstimulierenden Eigenschaften hat NDV ein starkes Sicherheitsprofil und ein gut etabliertes umgekehrtes Genetiksystem14,15. Diese wünschenswerten Eigenschaften haben zur Bewertung von NDV in zahlreichen präklinischen und humanklinischen Studien geführt (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Um diesen vielversprechenden, immunstimulierenden viralen Vektor weiter voranzubringen, sind detaillierte Methoden zur Herstellung und Reinigung von hochtiterem, hochreinem NDV erforderlich, das sicher in vivo verabreicht werden kann.

Da NDV ein Vogelparamyxovirus ist, wird es am häufigsten in embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Während es zellbasierte Systeme zur Vermehrung von NDV gibt, waren die meisten nicht in der Lage, Titer zu produzieren, die denen ähneln, die in embryonierten Hühnereiern18 erreicht wurden. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Herstellung von NDV in Eiern, einschließlich der Tatsache, dass die Produktion auf Eibasis langwierig und nicht leicht skalierbar ist, die Beschaffung großer Mengen von SPF-Hühnereiern problematisch sein kann und das Potenzial für eine Kontamination mit Eiallergenen besteht13,18,19,20 . Kürzlich hat eine Gruppe gezeigt, dass Vero-Zellen, die in Suspension in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, die Replikation von NDV zu Titern unterstützen können, die mit denen vergleichbar sind, die in Eiern vor der Reinigungerreicht wurden 21. Dies erforderte jedoch eine serielle Übertragung des Virus, um das Virus an Vero-Zellen anzupassen, und die Optimierung einer Methode zur Reinigung von NDV aus Suspensions-Vero-Zellen ist immer noch erforderlich21.

Wie bereits erwähnt, variieren die Methoden zur Reinigung von High-Titer-In-vivo-Viren je nach dem betreffenden Virus22. Für die Erzeugung rekombinanter NDV steht ein gut etabliertes System der umgekehrten Genetik zur Verfügung. Dieser Prozess, bei dem ein cDNA-Klon, Helferplasmide und ein Helfervirus verwendet werden, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde zuvor ausführlich beschrieben 15,23. Dieses Protokoll kann entweder auf lentogene oder mesogene NDV angewendet werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Virus ist ein rekombinantes mesogenes NDV, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria kodiert, das zwischen viralen P- und M-Genen als individuelle Transkriptionseinheit eingefügt wurde, da dies zuvor als optimaler Ort für die Insertion von Fremdtransgenen beschrieben wurde24.

Geschlossene Methoden beschreiben die Reinigung von NDV basierend auf seiner Größe, die von 100 bis 500 nm reicht, und seiner Dichte15. Dies ermöglichte die Erzeugung von In-vivo-haltigen, hochtiteren NDV-Beständen in etwa 3 Wochen, beginnend mit dem Empfang der Eier bis hin zu einem endgültigen Titer. Es werden Techniken beschrieben, die häufig bei der großtechnischen Produktion von Viren auf Eibasis verwendet werden, wie z. B. Tangentialflussfiltration, Tiefenfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die die Übertragung dieser Methoden auf die Produktion in größerem Maßstab ermöglichen. Zuvor beschriebene Techniken zur Reinigung von NDV wurden durch den Einbau eines virusstabilisierenden Puffers, die Verwendung von Iodixanol während der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die Beschreibung verschiedener Qualitätskontrollmaßnahmen zur Sicherstellung der In-vivo-Qualität verbessert 15. Dies hat die Reinigung von In-vivo-Qualität NDV ermöglicht, die Titer von bis zu 3 × 1010 PFU / ml von 0,8 bis 1,0 L Allantoikflüssigkeit erreicht.

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Protocol

Alle Arbeiten, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom University of Guelph Animal Care Committee in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care genehmigt. Alle Arbeiten werden in einem Labor für BioSafety Level 2 (BSL2) in Kanada durchgeführt, in dem mesogene NDV ein Erreger der Risikogruppe 2 ist. Alle Schritte zur Amplifikation und Reinigung von NDV sollten aus Sicherheits- und Sterilitätsgründen in einer biologischen Sicherheitswerkbank vom Typ IIA durchgeführt werden.

1. Amplifikation von NDV unter Verwendung spezifizierter pathogenfreier embryonierter Hühnereier

  1. Impfung von SPF embryonierten Hühnereiern
    HINWEIS: Typischerweise werden acht Dutzend SPF-embryonierte Hühnereier verwendet, um eine In-vivo-Charge von NDV zu erzeugen. Bestellen Sie ein oder zwei Dutzend zusätzliche Eier, um Schäden während des Versands sowie Schwankungen in der Lebensfähigkeit zu berücksichtigen. Embryonierte Hühnereier sind biologisches Material und sollten nach institutionellen Richtlinien gehandhabt werden. Da die Embryonen jedoch nicht geschlüpft sind, ist keine Genehmigung des institutionellen Tierpflegeausschusses erforderlich.
    1. Nach Erhalt von SPF-embryonierten Hühnereiern in einem Eierinkubator bei 37 ° C, 60% Luftfeuchtigkeit für 9 Tage inkubieren. Stellen Sie sicher, dass der Inkubator so eingestellt ist, dass er die Eier stündlich automatisch schaukelt / dreht.
      HINWEIS: Eier können bei Raumtemperatur für bis zu 24 h oder 4 °C für bis zu 72 h gelagert werden; Dies kann jedoch die Lebensfähigkeit des Embryos verringern.
    2. Nach 8-11 Tagen Inkubation (idealerweise am 9. Tag) die Eier mit einer Kerze versehen, um die Lebensfähigkeit des Embryos zu bestimmen. Suchen Sie nach netzartigem Gefäßsystem (Abbildung 1A) und Embryobewegung als Indikatoren für lebensfähige Embryonen. Eier ohne diese Merkmale zu entsorgen (Abbildung 1B).
    3. Markieren Sie auf den lebensfähigen Eiern die Schnittstelle zwischen dem Luftsack und dem Embryo mit Bleistift mit einem "X" (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass diese Injektionsstelle keine Perforation des Gefäßsystems verursacht. Geben Sie die markierten Eier in den Inkubator zurück, während das Inokulum vorbereitet ist.
    4. Berechnen Sie die Virusmenge, die erforderlich ist, um alle SPF-embryonierten Hühnereier zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass jedes Ei 100 PFU Virus in einem Volumen von 100 μL erhält; das Virus in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 1 × 103 PFU/ml verdünnen. Bereiten Sie zusätzliche 20% des Inokulums vor, um Ungenauigkeiten bei der Virusverabreichung zu berücksichtigen.
    5. Reinigen Sie mit einem antistatischen Tuch die Spitzen der markierten Eier mit einer 10% igen Jodlösung, die in 70% igem Ethanol verdünnt ist. Warten Sie ca. 1-2 Minuten, bis die Lösung getrocknet ist.
    6. Durchbohren Sie die Schale vorsichtig mit einer sterilen scharfen Pinzette. Desinfizieren Sie die Pinzette in 70% Ethanol zwischen den Eiern.
    7. Mit einer 1-ml-Spritze und einer 25-G-Nadel werden 100 μL des in Schritt 1.1.4 hergestellten Inokulums in die chorioallantoische Höhle injiziert (Abbildung 1C). Nähern Sie sich mit der Nadel in einem Winkel von fast 90° zum Ei. Führen Sie die Nadel direkt in die Oberseite der chorioallantoischen Membran ein.
    8. Verwenden Sie nach der Impfung Nagellack, um die Einstoßstelle abzudecken und die Eier in den Inkubator zurückzubringen. Stellen Sie sicher, dass die Schaukeleinstellung bis 24 Uhr nach der Impfung eingeschaltet ist.
    9. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Eizellen 24 Stunden nach der Impfung. Entsorgen Sie tote Eier, denen das Gefäßsystem in der chorioallantoischen Membran und die Bewegung des Embryos fehlen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Diese Eier sind aufgrund des Impfprozesses und nicht durch NDV gestorben.
    10. Geben Sie die Eier in den Inkubator zurück, wobei die Wippe OFF setzt, um eine Kontamination der Allantoikflüssigkeit mit Eiproteinen zu verhindern.
    11. Überprüfen Sie die Eier alle 12-24 Stunden, wie in Schritt 1.1.9 beschrieben, um tote Eier zu identifizieren. Bewegen Sie die Eier, die nach 24 Stunden nach der Inokulation absterben, auf 4 ° C, um die Autolyse zu minimieren. Ernten Sie die Allantoikflüssigkeit innerhalb von 2-12 Stunden nach dem Abkühlen.
    12. Bebrüten Sie die Eier für mindestens 72 h.
      HINWEIS: Bei der Ausbreitung eines mesogenen NDV-Stammes beträgt die optimale Inkubationszeit 60-72 h, da längere Inkubationszeiten den Reinigungsprozess aufgrund der verminderten Klarheit der Allantoikflüssigkeit beeinträchtigen können. Dieses Problem ist bei der Vermehrung lentogener NDV-Stämme nicht so wichtig, da sie viel länger brauchen, um den Embryo abzutöten.
    13. Nach der entsprechenden Inkubationszeit die verbleibenden Eier für 2-12 h auf 4 ° C stellen, bevor Sie die Allantoikflüssigkeit ernten.
  2. Ernte von NZV-haltiger Allantoenflüssigkeit
    1. Bringen Sie die gekühlten Eier in die Biosicherheitskabine. Reinigen Sie die Spitzen der Eier mit 70% Ethanol.
    2. Verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine chirurgische Schere, um die apikale Seite des Eies aufzubrechen, auf der sich der Luftsack befindet.
    3. Entfernen Sie die Schale, um die chorioallantoische Membran freizulegen (Abbildung 1D).
    4. Durchstechen Sie vorsichtig die Membran und ziehen Sie sie zurück, um die Allantoikhöhle freizulegen (Abbildung 1E). Stellen Sie sicher, dass der Dottersack nicht versehentlich durchstochen wird, da dies das Ei verdirbt.
    5. Verwenden Sie stumpfe Pinzetten, um den Embryo zu greifen und den embryonalen Sack zu öffnen.
      HINWEIS: Die Flüssigkeit im Inneren des Embryonalsacks enthält auch NDV.
    6. Drücken Sie den Embryo mit der Pinzette und sammeln Sie die Allantoikflüssigkeit mit einer serologischen 10-ml-Pipette.
    7. Lagern Sie die allantoische Flüssigkeit auf Eis in 15 ml konischen Röhrchen bis zur Klärung.
      HINWEIS: Wenn die Allantoikflüssigkeit gelb ist, wurde der Dottersack kompromittiert und die Allantoikflüssigkeit sollte verworfen werden.
    8. Zentrifugieren Sie die konischen Röhrchen mit der allantoischen Flüssigkeit bei 1.500 × g für 10 min bei 4 °C.
    9. Pausenpunkt: Aliquot die geklärte Allantoikflüssigkeit in 50 ml konische Röhrchen und lagern Sie sie bei -80 °C für die Langzeitlagerung (z. B. Wochen bis Monate), wobei die Flüssigkeit mit Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 5% ergänzt wird, um das Virus vor den harten Auswirkungen von Frosttauwetter zu schützen. Alternativ können Sie zur kurzfristigen Lagerung (z. B. 1-3 Tage) die Allantoinflüssigkeit mit Saccharose (letzte 5%) oder mit 3x Mannitol-Lysin (ML) Puffer (15% Mannitol, 3% Lysin; siehe Zusatztabelle S1 für Pufferrezepte) ergänzen, um eine Endkonzentration von 1x (5% Mannitol, 1% Lysin) vor der Lagerung bei 4 °C zu erhalten.

2. Reinigung von NDV aus Allantoikflüssigkeit

  1. Tiefenfiltration von Allantoikflüssigkeit
    1. Lagern Sie die geklärte Allantoinflüssigkeit bei -80 °C und tauen Sie sie in der Nacht vor der Reinigung bei 4 °C auf.
    2. Stellen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank den Schlauch und die Peristaltikpumpe wie in Abbildung 2 dargestellt auf.
    3. Falls noch nicht durchgeführt, kombinieren Sie die Allantoinflüssigkeit mit 3x ML-Puffer zu einer Endkonzentration von 1x.
    4. Bevor Sie den Tiefenfilter anbringen, sterilisieren Sie den Schlauch, indem Sie 50 ml 0,5 M NaOH durch das System in ein Abfallbehälter leiten.
    5. Spülen Sie den Schlauch ab, indem Sie 100 ml steriles, molekulares Wasser durch das System und in den Abfallbehälter leiten.
      HINWEIS: Da NaOH NDV inaktiviert, ist es wichtig, dass die Leitungen ausreichend gewaschen werden, bevor die virushaltige Allantoikflüssigkeit eingeführt wird.
    6. Bereiten Sie das System vor, indem Sie 50 ml PBS durch es laufen lassen und die Pumpe stoppen, wenn sich noch etwa 5 ml PBS im Rohr befinden.
    7. Befestigen Sie den Tiefenfilter mit einer Festigkeitsrate von 1-3 μM am Schlauch und entfernen Sie die zweite Kappe auf der apikalen Seite des Tiefenfilters, um den Filter zu entlüften. Beginnen Sie mit dem Betrieb von zusätzlichen 50 ml PBS durch das System.
    8. Sobald PBS beginnt, durch die Entlüftung an der Oberseite des Filters zu fließen, schließen Sie den Anschluss und fahren Sie fort, PBS durch die Leitungen zu fließen.
      HINWEIS: Kleinere Luftblasen sind akzeptabel, aber das Vorhandensein großer Luftmengen erfordert, dass der Filter erneut entlüftet wird, wie in den Schritten 2.1.7 und 2.1.8 beschrieben.
    9. Stoppen Sie die Pumpe, wenn noch ca. 5 ml PBS im Rohr vorhanden sind.
    10. Ersetzen Sie das Abfallgefäß durch ein neues steriles Sammelgefäß und beginnen Sie, allantoische Flüssigkeit durch den Tiefenfilter zu führen.
      HINWEIS: Der Druck sollte 10 psi nicht überschreiten, da dies zu einer Scherung des Virus führt. Der Druck kann manipuliert werden, indem der Durchfluss der Pumpe verringert oder erhöht wird. Wenn der Druck beginnt, 10 psi zu überschreiten und der Durchfluss nicht weiter verringert werden kann, sollte ein neuer Tiefenfilter verwendet werden. In diesem Fall sollten die Schritte 2.1.6-2.1.8 durchgeführt werden, bevor der Fluss der Allantoikflüssigkeit wieder aufgenommen wird.
    11. Sobald die gesamte Allantoikflüssigkeit den Filter passiert hat, führen Sie 50 ml 1x ML-Puffer durch die Leitungen, um die Viruswiederherstellung zu maximieren.
    12. Sammeln Sie die Flüssigkeit, bis die Linien trocken sind. Lagern Sie das Virus über Nacht oder bis zu 36 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Sobald das Virus tiefengefiltert wurde, setzen Sie den Reinigungsprozess innerhalb von 36 Stunden nach Abschluss der Tiefenfiltration fort.
    13. Trennen Sie den Tiefenfilter und desinfizieren Sie den Schlauch, indem Sie 100 ml 0,5 M NaOH, 400 PPM Bleichmittel, das vor der Lagerung in 0,5 M NaOH auf 42 °C vorgewärmt ist, durch das System laufen lassen.
  2. Tangentialströmungsfiltration für die Konzentration von NDV
    1. Montieren Sie die Komponenten der Kassette, wie in Abbildung 3A (und wie zuvor25 gezeigt) in einer biologischen Sicherheitswerkbänke.
      HINWEIS: Der Verteiler und die Endplatte sollten vor Gebrauch im Waschmittel gewaschen und getrocknet werden. Die Siliziumdichtungen sind wiederverwendbar und sollten in 0,5 M NaOH mit der Kassette gelagert werden.
    2. Richten Sie das TFF-System (Tangential Flow Filtration) (auch Cross-Flow-Filtration genannt) in einer "offenen" Konformation ein (Abbildung 3B).
      1. Wenn Sie zum ersten Mal eine Kassette verwenden, montieren Sie die TFF-Kassette in der Elution-Konformation und spülen Sie sie mit 100 ml sterilem, molekularem Wasser (Abbildung 3C).
      2. Sobald nur noch 5 ml Wasser im Reservoirtank vorhanden sind, halten Sie die Pumpe an und ändern Sie die TFF-Systemeinrichtung auf eine geschlossene Konformation (Abbildung 3D).
      3. Fügen Sie dem Reservoir 100 ml 0,5 m NaOH, 400 ppm Bleichmittel, das auf 42 °C vorgewärmt ist, hinzu und durchlaufen Sie das System für 30-60 min.
      4. Pausieren Sie den Durchfluss und bringen Sie das TFF-System zum Elutionsaufbau zurück, wobei der Fluss wieder aufgenommen wird, um die Reinigungslösung zu eluieren.
      5. Wenn sich noch ca. 5 ml im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe und fügen Sie 100 ml steriles, molekulares Wasser hinzu, um das System zu spülen.
      6. Wenn sich noch ca. 5 ml im Reservoir befinden, halten Sie die Pumpe an und setzen Sie das TFF-System in die offene Konformation (Abbildung 3B). Fahren Sie mit Schritt 2.2.3 fort.
    3. Sterilisieren Sie die Kassette und den Schlauch, indem Sie 100 ml 0,5 M NaOH mit der Peristaltikpumpe durch das System leiten. Stellen Sie sicher, dass der Druck 30 psi nicht überschreitet, um die Integrität der Kassette aufrechtzuerhalten.
    4. Pausieren Sie die Pumpe, wenn sich noch ca. 5 ml 0,5 M NaOH im Reservoir befinden.
    5. Geben Sie 100 ml steriles, molekulares Wasser in das Reservoir und setzen Sie das Passieren der Flüssigkeit durch die Kassette fort. Schwenken Sie das Reservoir, um das gesamte NaOH von den Seiten des Reservoirs zu waschen, um eine Inaktivierung des Virus zu verhindern. Wiederholen Sie den Reservoir-Waschschritt.
    6. Wenn sich noch etwa 5 ml steriles, molekulares Wasser im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe.
    7. Geben Sie 100 ml PBS in das Reservoir und wirbeln Sie, um sicherzustellen, dass das sterile, molekulare Wasser von den Seiten gewaschen wird. Nehmen Sie den Flüssigkeitsfluss durch die Kassette wieder auf.
    8. Wenn sich noch etwa 5 ml im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe, fügen Sie dem Reservoir tiefengefilterte Allantoikflüssigkeit hinzu und setzen Sie den Pumpenfluss fort.
    9. Überwachen Sie das Manometer 1 (Abbildung 3B), um sicherzustellen, dass es 10 psi nicht überschreitet, um eine Scherung des Virus zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus der Geschwindigkeit der Peristaltikpumpe und der Verwendung von C-Klemmen, um die Elution zu Abfall zu erhöhen.
      HINWEIS: Die Kombination der Drehzahl der Peristaltikpumpe und der C-Klemmen führt zu einem erhöhten Druck.
    10. Wenn sich noch 50-100 ml allantoische Flüssigkeit im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe, um einen Pufferaustausch durchzuführen, indem Sie 150-200 ml Puffer hinzufügen.
    11. Setzen Sie den Pumpendurchfluss fort und überwachen Sie erneut das Manometer 1 (Abbildung 3B), um sicherzustellen, dass es 10 psi nicht überschreitet.
    12. Wenn sich noch 5-10 ml im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe.
    13. Schließen Sie mit zwei C-Klemmen die beiden Waste-Linien, wie in Abbildung 3C dargestellt.
    14. Entkoppeln Sie die Retentatleitung, die das Reservoir speist, und führen Sie es in ein konisches 50-ml-Rohr ein (Abbildung 3C).
    15. Nehmen Sie den Durchfluss der Pumpe wieder auf und halten Sie an, wenn sich noch ein paar Tropfen Flüssigkeit im Reservoirtank befinden.
    16. Entfernen Sie die C-Klemmen aus den Abfallleitungen, und befestigen Sie die Retentatzufuhrleitung wieder am Behältertank (Abbildung 3B).
    17. Fügen Sie 20-25 ml 1x ML-Puffer hinzu und nehmen Sie den Pumpenfluss wieder auf, bis sich noch ca. 5 ml im Reservoirtank befinden.
    18. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13 bis 2.2.16.
      HINWEIS: Eine 3.Elution kann durch Wiederholen der Schritte 2.2.17 und 2.2.13 bis 2.2.16 durchgeführt werden, um die Virusausbeute zu erhöhen. Der größte Teil des Virus ist jedoch in den ersten beiden Elutions vorhanden.
    19. Nachdem Sie die Elutions beendet haben, legen Sie das Virus auf Eis oder bei 4 ° C.
    20. Um die Leitungen zu reinigen, richten Sie das System so ein, dass es sich um ein geschlossenes Kreislaufformat handelt (Abbildung 3D), bei dem die Abfallleitungen in das Reservoir zurückfließen, wie in Abbildung 3D dargestellt.
    21. Fahren Sie mit der Reinigung des Systems fort, indem Sie 250 ml 0,5 m NaOH, 400 ppm Bleichmittel hinzufügen, das auf 42 °C vorgewärmt ist.
    22. Lassen Sie die Reinigungslösung über Nacht durch das System fließen.
      HINWEIS: Während der Umwälzung der Reinigungslösung, wenn die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/min betrieben wird, sollte ein Druck von etwa 5 psi beobachtet werden. Wenn der Druck dies überschreitet, ist die Kassette verschmutzt, und die Reinigungslösung sollte ersetzt und der Vorgang wiederholt werden.
    23. Eluten Sie die Reinigungslösung, indem Sie sowohl Abfalllinien als auch die Retentatlinie in einen Abfallbehälter leiten.
    24. Geben Sie 400-500 ml steriles Wasser in das Reservoir und lassen Sie es durch das System und in die Abfallbehälter fließen.
    25. Wenn ungefähr 5 ml im Reservoir verbleiben, pausieren Sie die Pumpe und fügen Sie 100-200 ml 0,5 M NaOH in den Reservoirtank hinzu, wobei Sie die Lösung zum Waschen des Reservoirbehälters verwirbeln.
    26. Sobald das Reservoir fast leer ist, wiederholen Sie Schritt 2.2.23 zwei weitere Male.
    27. Zerlegen Sie das TFF-Setup und lagern Sie die TFF-Kassette und die Dichtungen in einem kleinen Volumen von 0,5 M NaOH in einem wiederverschließbaren Plastikbeutel bei 4 °C.
      HINWEIS: Schläuche können bei Raumtemperatur unter 0,5 m NaOH gelagert werden.
  3. Iodixanol-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
    1. Schalten Sie die Ultrazentrifuge ein und stellen Sie sie auf 4 °C vorkühlen. Kühlen Sie den gewünschten Rotor ebenfalls bei 4 °C vor (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Rotoren sollten bei 4 °C gelagert werden.
    2. Verwenden Sie die 60% ige Iodixanollösung (Konzentration zum Zeitpunkt des Kaufs), um 40%, 20% und 10% Iodixanollösungen zu erzeugen, indem Sie mit PBS und 3x ML Buffer auf eine 1x Endkonzentration von ML Buffer verdünnen.
    3. In einem 13,2 ml offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchen überlagern Sie 0,5 ml, 2,5 ml und 2,5 ml der 40%, 20 % bzw. 10 % igen Iodixanollösungen (Abbildung 4A).
      HINWEIS: Wenn Sie das Ultrazentrifugenröhrchen auf die Seite kippen und die Lösung langsam ausstoßen, wird das Risiko einer Vermischung der beiden Gradientenschichten erheblich verringert. Die Trennung jeder Schicht sollte offensichtlich sein, mit einem "Heiligenschein", der zwischen jeder Schicht des Farbverlaufs sichtbar ist.
    4. Verwenden Sie einen Markerstift, um die Schnittstellen der verschiedenen Verlaufsebenen zu markieren.
    5. Schicht 6-6,5 ml des eluierten Virus aus dem TFF-Verfahren über den Dichtegradienten. Fügen Sie den Virus vorsichtig hinzu, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben, um eine Störung des Dichtegradienten zu vermeiden.
    6. Laden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen mit einer offenen Waage in die Einsätze für den schwingenden Schaufelrotor (siehe Materialtabelle), um die Einsätze innerhalb von 0,01 g zueinander auszugleichen. Verwenden Sie PBS oder zusätzlichen Viruseluenten, um die Gewichtsunterschiede zu berücksichtigen.
    7. Sobald die Rohre ausbalanciert sind, verschließen Sie die Rohre und laden Sie sie in den Rotor.
    8. Zentrifuge für 1,5 h bei 125.000 × g bei 4 °C.
      HINWEIS: Dies kann über Nacht durchgeführt werden, wenn eine Ultrazentrifuge mit Delay-Start-Funktion verfügbar ist.
    9. Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Suchen Sie nach dem Zielband – einem großen Band – zwischen den Gradienten von 10 % und 20 % (Abbildung 4B).
    10. Hängen Sie das Rohr mit einem Retortenständer über die Oberseite eines Becherglases.
    11. Befestigen Sie eine 18 G x 1,5 Zoll Nadel an einer 5 ml Spritze und punktieren Sie die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens.
      HINWEIS: Das Rohr sollte leicht unterhalb des Zielbandes punktiert werden, wobei sich die Nadel in einem nach oben gerichteten Winkel befindet und so abgeschrägt wird, dass es in das Zielband wandert.
    12. Verlängern Sie langsam den Kolben, um das Zielband zu entfernen.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Nadel innerhalb des Zielbandes, um das extrahierte Virus zu maximieren. Achten Sie darauf, dass andere Bänder oder Ablagerungen nicht mit dem Zielband vermischt werden, und vermeiden Sie die Einnahme von überschüssiger Lösung, da dies zur Verwendung von mehr Dialysekassetten führt.
    13. Sobald das Zielband extrahiert wurde, entfernen Sie die Nadel und lassen Sie die verbleibende Lösung in das Abfallbecherglas abtropfen. Dosieren Sie das Zielband in ein konisches 50-ml-Röhrchen, bis alle Bänder aus allen anderen Ultrazentrifugenröhrchen extrahiert sind.
    14. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.10-2.3.13, bis alle Zielbänder aus allen Ultrazentrifugenröhrchen extrahiert wurden.
    15. Alternativer Ansatz zum Extrahieren der Zielbänder wie in den Schritten 2.3.10 bis 2.3.13 beschrieben
      1. Entfernen Sie langsam die Flüssigkeit, die das Zielband überlagert, mit einer Pipette. Sobald Sie sich am Zielband befinden, extrahieren Sie es mit einer Pipette und lagern Sie das Virus in einem 50 ml konischen Röhrchen.
        HINWEIS: Dadurch können die Ultrazentrifugenröhrchen wiederverwendet werden.
  4. Entfernung von Iodixanol aus der Viruslösung
    HINWEIS: Das NDV-haltige Band erscheint bei einer Iodixanoldichte zwischen 15% und 16%. Die Konzentration von Iodixanol in der Lösung kann durch Messung der Absorption bei 340 nm in Bezug auf eine Standardkurve bestimmt werden (Ergänzende Abbildung S1). Dieser Schritt kann unterlassen werden, da bei der Verabreichung von Iodixanol-Lösungen dieser Konzentration an C57BL/6-Mäuse keine nachteiligen Wirkungen oder akute Toxizität beobachtet wurden.
    1. Prewet eine 0,5-3 ml 10 kDa Molekulargewichts-Cut-Off-Dialysekassette, indem Sie sie für 1 min in PBS tauchen.
      HINWEIS: Die Dialysemembran sollte von glatt zu einem gerüschten oder holprigen Aussehen wechseln. Wenn das Volumen des extrahierten Virus 10 ml übersteigt, sollten zwei 0,5-3 ml Dialysekassetten oder eine 5-12 ml Dialysekassette verwendet werden.
    2. Verwenden Sie gegebenenfalls entweder eine 5- oder 10-ml-Spritze und eine 18 G x 1,5-Zoll-Nadel mit stumpfer Füllung, um das Virus aus dem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln.
    3. Verwenden Sie die Spritze, um in die Dialysekassette einzudringen, achten Sie darauf, die Membran nicht zu durchstechen, und injizieren Sie das Virus.
      HINWEIS: Die Dialysekassette kann gedreht werden, um die Positionierung der Lufttasche in der Kassette zu manipulieren. Die Lufttasche sollte entfernt werden, bevor die Nadel von der Kassette entfernt wird.
    4. Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit sterilem 1x PBS, legen Sie einen Rührstab und die Dialysekassette hinein und decken Sie es ab. Bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie extrudierten Polystyrolschaum und ein elastisches Band, um die Dialysekassette so zu befestigen, dass sie im PBS schwimmt. Die Kassette kann aufgrund des ML-Puffers leicht anschwellen.
    5. Nach 1-2 h durch frisches 1x PBS ersetzen und bei 4 °C für weitere 8-10 h mit leichtem Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Dies kann auch über Nacht erfolgen.
    6. Ersetzen Sie es erneut durch frisches 1x PBS und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1-2 h.
  5. Konzentration der Viruslösung
    1. Nehmen Sie die Dialysekassette aus dem Dialysepuffer (Abbildung 4C) und legen Sie sie in einen kleinen, verschließbaren Plastikbeutel. Fügen Sie 15-25 ml 40% 20.000 MW Polyethylenglykol hinzu, so dass die Dialysekassette vollständig untergetaucht ist.
    2. Bei Raumtemperatur mit Schaukeln inkubieren. Überprüfen Sie das Virusvolumen in der Kassette regelmäßig mit einer 5- oder 10-ml-Spritze und einer 18 G x 1,5-Zoll-Nadel mit stumpfer Füllung.
      HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um das Virus zu konzentrieren, variiert je nach Startvolumen und gewünschtem Endvolumen. Typischerweise liegt das endgültige gewünschte Volumen zwischen 1 und 1,5 ml, unabhängig vom Ausgangsvolumen der Allantoikflüssigkeit. Achten Sie bei der Überprüfung des Volumes darauf, nicht denselben Port zu verwenden, da dies die Portintegrität beeinträchtigt und zur Vermischung der Polyethylenglykollösung und des Virus führen kann.
    3. Bevor Sie das konzentrierte Virus aus der Dialysekassette entfernen, spülen Sie die Kassette kurz in 1x PBS aus und füllen Sie eine 18 G x 1,5 Zoll große stumpfe Füllnadel mit Luft.
    4. Setzen Sie die luftgefüllte Spritze in die Dialysekassette ein und drücken Sie den Kolben. Drehen Sie das Gerät so, dass das konzentrierte Virus entfernt werden kann, ohne die eingebrachte Luft zu entfernen.
    5. Geben Sie das konzentrierte Virus in ein 50 ml konisches Röhrchen und notieren Sie das abgegebene Volumen.
    6. Injizieren Sie mit derselben Spritze und Nadel eine angemessene Menge 60% Saccharose in die Dialysekassette, so dass sie in Kombination mit dem zuvor entfernten Virus eine Endkonzentration von 5% Saccharose aufweist.
    7. Verwenden Sie behandschuhte Finger, um die Membran zu massieren, um Restviren zu entfernen, die möglicherweise an der Membran haften geblieben sind, und achten Sie darauf, sie nicht zu beschädigen. Entfernen Sie einen Teil der überschüssigen Luft in der Dialysekassette, um den Verdrängungsprozess zu erleichtern.
    8. Kombinieren Sie diese Wäsche mit dem Virus bereits in der 50 ml konischen Röhre.
      HINWEIS: Das Virus ist jetzt in 5% Saccharose und bereit, in 20 μL, 50 μL, 100 μL oder 200 μL Aliquots dosiert und bei -80 °C gelagert zu werden. Alternativ kann NDV zur Langzeitlagerung lyophilisiert und bei 4 °C gelagert werden, wie in Abschnitt 2.6 beschrieben.
  6. Lyophilisation von NDV
    1. Lyophilisieren Sie das Virus alizitiert in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen oder 15 ml konischen Röhrchen bei 44 × 10-3 MBAR und - 52 °C für 16 h.
    2. Lagern Sie die lyophilisierten Proben bei 4 °C ohne signifikante Verringerung des Virustiters.

3. Qualitätskontroll-Assays

  1. Virale RNA-Isolierung und Reverse-Transkriptions-PCR zur Genombestätigung
    1. Tauen Sie ein 20-μL-Virus aliquot auf. Befolgen Sie das mit dem Kit gelieferte virale RNA-Isolationsprotokoll.
    2. Verwenden Sie die isolierte RNA sofort als Vorlage für die Rücktranskription PCR (RT-PCR) oder lagern Sie sie bei -80 °C.
    3. Bereiten Sie die Rücktranskriptionsreaktionen gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll vor.
    4. Verwenden Sie die resultierende cDNA als Vorlage für verschiedene PCR-Reaktionen der Qualitätskontrolle, um den NDV-Pathotyp (Tabelle 1, F-Proteinprimer-Set) und das Vorhandensein der erforderlichen Genkontrollelemente (Tabelle 1, Transgen-Primer-Set) zu bestätigen.
      HINWEIS: Primer sollten basierend auf der Dehnung des auszubreitenden NDV entworfen werden.
      1. Um die F-Proteinspaltungsstelle, die Hauptdeterminante des Pathotyps, zu sequenzieren, verwenden Sie das F-Protein-Primer-Set (Tabelle 1). Suchen Sie nach einem PCR-Produkt mit 435 Basenpaaren in der Länge.
        HINWEIS: Hier wurden die Primer auf Basis der LaSota-Sorte von NDV (Genbank accession AF077761.1) entwickelt. Es ist allgemein bekannt, dass eine optimale Transgenexpression auftritt, wenn ein fremdes Transgen zwischen den P- und M-Geneneingefügt wird 24.
      2. Verwenden Sie das Transgen-Primer-Set, um die Integrität der Genstart- und Genendelemente des Transgens zu bestätigen. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt, um die Integrität des Genstarts und der Genendsequenz zu bestätigen.
    5. Senden Sie die PCR-Produkte für die DNA-Sequenzierung und vergleichen Sie sie mit der Vorlage für die Homologie.
  2. SDS PAGE und Coomassie-Färbung zum Nachweis kontaminierender Proteine
    1. Gießen Sie ein SDS PAGE-Gel mit Dichtegradienten, indem Sie zunächst 6% und 15% Polyacrylamidlösungen herstellen (Zusatztabelle S1). Verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um 5 ml der 15%igen Lösung zu entnehmen, gefolgt von 5 ml der 6%igen Lösung.
    2. Entfernen Sie die Pipette aus der Lösung und erzeugen Sie eine Luftblase, indem Sie kurz Luft ansaugen.
      HINWEIS: Wenn sich die Luftblase nach oben bewegt, wird die Lösung gemischt, um den SDS PAGE-Farbverlauf zu erzeugen.
    3. Verteilen Sie die Lösung in die Gießvorrichtung und lassen Sie sie 30 min erstarren.
    4. Kombinieren Sie in einem Endvolumen von 20 μL ein Aliquot des Virus mit einem 4x reduzierenden Puffer (Supplemental Table S1), so dass die Endkonzentration 1x beträgt, und kochen Sie für 10 min bei 95 ° C in einem Thermocycler. Laden Sie mindestens 1 × 107 PFU des Virus.
    5. Tauchen Sie die SDS-SEITE in den laufenden Puffer (Supplemental Table S1) und laden Sie die Beispiele.
    6. Lassen Sie das Gel bei 120 V für 1-1,5 h laufen.
    7. Entfernen Sie das Gel aus dem laufenden Puffer und geben Sie es in einen kleineren Behälter.
    8. Fügen Sie Coomassie Färbelösung (Supplemental Table S1) hinzu, um das Gel abzudecken. Bei Raumtemperatur für 4-5 h inkubieren.
    9. Entfernen Sie die Färbelösung und fügen Sie Deflecklösung (Beistelltisch S1) hinzu, wobei Sie 4-8 h bei Raumtemperatur mit Rühren inkubieren. Ändern Sie die Destain-Lösung drei- bis viermal.
      HINWEIS: Das Gel sollte klar sein und seine Farbe sollte so sein, wie es vor der Färbung war.
    10. Stellen Sie das Gel auf einer kolorimetrischen Einstellung dar. Siehe Abbildung 5 für ein repräsentatives Bild eines Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gels, das Proben aus Allantoikflüssigkeit und gereinigtem Virus enthält.
  3. Quantifizierung des infektiösen viralen Titers durch mediane Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) und Immunfluoreszenz-Assay
    HINWEIS: Vero-Zellen können als Alternative zu DF1-Zellen verwendet werden. Die zytopathische Wirkung (CPE) ist jedoch in Vero-Zellen weniger ausgeprägt. NDV, das die L289A-Mutation beherbergt, die die Fusogenie erhöht, und die Expression von GFP zwischen den P- und M-Genen wird in diesem Assay verwendet.
    1. Samen Sie eine 96-Well-Platte mit DF1-Zellen bei 20.000 Zellen / Well in einem Volumen von 80 μL am Tag vor der Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) und 125 μg / ml Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2.
    2. Am nächsten Tag tauen Sie ein 20 μL Aliquot Virus auf Eis auf.
    3. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen, um serielle Verdünnungen vorzubereiten. Beginnen Sie mit der Verdünnung von 10 μL des Virus mit 990 μL PBS, um eine 10-2-Verdünnung vorzubereiten. Bereiten Sie alle anderen Verdünnungen bis mindestens 10-10 vor, die mit 900 μL PBS und der Zugabe von 100 μL der vorherigen Verdünnung hergestellt werden.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze, wenn Sie sich zwischen den Verdünnungen bewegen.
    4. Verwenden Sie 20 μL jeder Verdünnung, um jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu infizieren, wie in Abbildung 6 dargestellt.
      HINWEIS: Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung beträgt 100 μL.
    5. Die Platte wird mindestens 48 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor auf CPE/GFP untersucht oder ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFA) durchgeführt wird.
      HINWEIS: Unter diesen Kulturbedingungen ist CPE nach 10 h (Abbildung 7A-D) offensichtlich und steigt in den nächsten 24 h an (Abbildung 7E-H). Die Platte kann länger inkubiert werden, um die Intensität von CPE zu verbessern, wenn sie von GFP oder CPE bewertet wird.
      1. Wenn Sie nach CPE oder GFP bewertet werden und IFA NICHT durchführen, fahren Sie mit Schritt 3.3.18.1 fort.
    6. Wenn Sie IFA durchführen, spülen Sie die Zellen zweimal mit 100 μL 1x PBS.
    7. Fügen Sie 100 μL 4% in PBS verdünntes Paraformaldehyd zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
    8. Waschen Sie die Zellen 3x 5 min mit je 100 μL 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Permeabilisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μL von 0,1% NP-40 in PBS und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
    10. Waschen Sie die Zellen 3x 5 min mit 100 μL von 0,1% PBS-T.
    11. 100 μL Blockierpuffer hinzufügen, bestehend aus 5% (V/V) normalem Ziegenserum, verdünnt in 0,1% PBS-T für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
    12. 100 μL pro Vertiefung des primären Anti-NDV-Ribonukleoprotein-Antikörpers der Maus, verdünnt in 0,1% PBS-T bis 1 μg/ml, inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
    13. Waschen Sie die Zellen 3x für 5 min in 100 μL von 0,1% PBS-T.
    14. Fügen Sie 100 μL eines AlexaFluor 488 Goat Anti-Maus-Sekundärantikörpers, verdünnt in 0,1% PBS-T bis 2 μg/ml, hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    15. Waschen Sie die Zellen 3x für 5 min in 100 μL von 0,1% PBS-T.
    16. Nach der letzten Wäsche lassen Sie die Zellen in 100 μL von 0,1% PBS-T.
    17. Stellen Sie die Vertiefungen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop dar.
    18. Achten Sie bei der Durchführung der IFA auf eine Fluoreszenz, die größer ist als die in den Negativkontrollbohrungen beobachtete, was darauf hindeutet, dass die Vertiefung positiv für NDV ist, wie in Abbildung 8 gezeigt.
      1. Achten Sie auf das Vorhandensein von Synzytie und großen, abgerundeten Zellen, die NDV CPE charakterisieren. Wenn Sie Brunnen bewerten, die mit einem Virus infiziert sind, der GFP exprimiert, achten Sie auf das Vorhandensein von GFP.
    19. Geben Sie die entsprechenden Informationen in den Spearman-Karber-Titerrechner26 ein, um die PFU/ml des Virus zu bestimmen (Tabelle 2). In Abbildung 6 finden Sie ein Beispiel für eine TCID50-Titerplatte.
  4. Quantifizierung des viralen Titers mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR)
    HINWEIS: Ein einstufiges qRT-PCR-Kit wird empfohlen, um Zeit zu sparen und die Manipulation der Proben zu reduzieren. Ein sondenbasierter Assay wird verwendet, um die Spezifität der Erkennung von Virussequenzen zu erhöhen.
    1. Erstellen Sie eine Standardkurve einer bekannten Menge der Virussequenzen (Ergänzende Abbildung S2A,B).
      HINWEIS: Dies kann durch den Kauf eines synthetischen 500 bp doppelsträngigen DNA-Fragments des NDV L-Gens erfolgen. Die Sequenz für ein 500 bp Fragment des NDV L-Gens ist in Supplemental Figure S2C zu sehen.
    2. Konvertieren Sie die Menge des Virus-DNA-Fragments (normalerweise von den Herstellern als Nanogramm oder Femtomole zur Verfügung gestellt) in die Anzahl der Moleküle oder Kopien des DNA-Fragments, indem Sie die Avogadro-Zahl und die Formel Mole zu Molekülen verwenden (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Bereiten Sie die Standardkurvenproben vor, indem Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe bekannter Virus-DNA-Fragmentkopien vorbereiten, beginnend mit 1,00 ×10 10 Kopien bis hin zu 1,00 ×10 0 Kopien.
    4. Um die Menge an NDV-RNA in unbekannten Proben zu bestimmen, extrahieren Sie NDV-RNA mit einem RNA-Extraktionskit. Befolgen Sie das mit dem Kit gelieferte Protokoll. Sobald die RNA extrahiert ist, fahren Sie mit dem empfohlenen Protokoll fort, das im einstufigen qRT-PCR-Kit bereitgestellt wird.
    5. Führen Sie die Reaktionen in einem real-time PCR-Gerät mit den folgenden Temperatur- und Zyklusbedingungen durch: 1) ein Zyklus der umgekehrten Transkription bei 55 °C für 10 min; 2) ein Zyklus der anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 1 min; und 3) 40 Zyklen der Denaturierung (95 °C für 10 s), Erweiterung (60 °C für 30 s) und Fluoreszenzsignalerfassung.
    6. Sobald der qRT-PCR-Assay abgeschlossen ist, generieren Sie die Standardkurve basierend auf den Standardkurvenproben mit der Echtzeit-PCR-Instrumentensoftware (Ergänzende Abbildung S2A,B).
      HINWEIS: Die Software berechnet auch die Menge an NDV-RNA in unbekannten Proben basierend auf der Standardkurve.
  5. Sicherheitsprüfung auf akute Toxizität bei Mäusen
    1. Injizieren Sie 1 ×10 8 PFU Virus intravenös über die Schwanzvene in drei 8 Wochen alte BALB/C-Mäuse, um die akute Toxizität zu beurteilen.
    2. Überwachen Sie die Mäuse auf unerwünschte Ereignisse wie Gewichtsverlust (>20%), gebeugte Haltung, gerüschte Mäntel, Lethargie und Veränderungen der Atmung. Bewerten Sie drei- bis viermal täglich über die ersten 48 h. Da sich die Mäuse nach 48 h zu erholen beginnen sollten, überwachen Sie sie ein- bis zweimal täglich, bis sie sich vollständig erholt haben.
      1. Verabreichen Sie Kochsalzlösung subkutan und unterstützende Pflege nach Bedarf. Ergänzen Sie zum Beispiel mit Recovery-Diät-Gel, Erdnussbutter oder verwenden Sie Hitze-Pucks. Euthanasieren Sie Mäuse, die Endpunktkriterien erreicht haben, wie in den institutionellen Leitlinien für die Tierpflege beschrieben, durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von zervikaler Dislokation.

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Representative Results

Ernte von Allantoikflüssigkeit
Da Allantoikflüssigkeit aus embryonierten Hühnereiern gewonnen wird, sollte sie klar und transparent erscheinen. Wenn die Flüssigkeit undurchsichtig und gelb erscheint, deutet dies auf das Vorhandensein von Verunreinigungen hin. Die Einbeziehung dieser allantoischen Flüssigkeit während der Reinigung behindert den Reinigungsprozess, da der Druck schnell ansteigt und 10 psi überschreitet, was zur Scherung des Virus und zum Verlust des infektiösen Virus führt. Allantoische Flüssigkeit, die blutig erscheint, deutet darauf hin, dass die Eier mit zu viel PFU des Virus geimpft wurden. Der Ertrag aus dieser Charge von Eiern wird deutlich niedriger sein als erwartet und es ist unwahrscheinlich, dass dieses Virus in vivo verwendet werden kann. Eier, die mit lentogener NDV geimpft wurden, sollten nach 72 h immer noch ein Gefäßsystem aufweisen und die Embryonen sollten nicht gestorben sein, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wenn dies der Fall ist, deutet dies darauf hin, dass der Embryo in irgendeiner Weise beschädigt oder kontaminiert wurde.

Iodixanol-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
Nach der Ultrazentrifugation sollte sich ein weißes, NDV-haltiges Band mit hohem Titer zwischen den Gradienten von 10 % und 20 % befinden (Abbildung 4B).

Coomassie-Fleck von SDS-PAGE Gelen
Abbildung 5 zeigt den Unterschied zwischen einem ungereinigten (Lane 2) und einem gereinigten Virusbestand (Lane 3). Ein Vergleich der beiden zeigt eine signifikante Abnahme der Intensität kontaminierender Proteinbanden und das Auftreten dominanter NDV-Banden im gereinigten Virusbestand.

Quantifizierung des viralen Titers mittels TCID50
Bei Verwendung der empfohlenen Bedingungen beim Titern eines konzentrierten NDV-Bestands sollte CPE nach 24 h offensichtlich sein (Abbildung 6). Im Vergleich zu einem lentogenen Stamm NDV mit ähnlichem Titer ist der CPE im mesogenen Stamm zum gleichen Zeitpunkt stärker ausgeprägt.

Akute Toxizitätsanalyse an 8 Wochen alten BALB/C-Mäusen
Wenn 1 × 108 PFU intravenös verabreicht wurden, sollten Mäuse auf Nebenwirkungen wie Gewichtsverlust >20%, gerüschtes Fell, gebeugte Haltung und abnormale Atmung überwacht werden. Innerhalb der ersten 24-36 Stunden beginnen Mäuse Gewicht zu verlieren und entwickeln wahrscheinlich zerzauste Mäntel und eine gebeugte Haltung. Wenn das Virus jedoch ausreichend rein ist, beginnen sich die Mäuse zu erholen, wie durch Gewichtszunahme und Verbesserung der Haltung und des Fellzustands nach 36 h beobachtet wird. Mäuse, die diese Anzeichen einer Erholung nicht bis 36 h zeigen, sollten weiterhin genau auf Endpunktkriterien überwacht werden. Typischerweise ist dies aufgrund eines ungenauen Titters geschehen, möglicherweise aufgrund der Aggregation von Viruspartikeln.

Figure 1
Abbildung 1: Infektion und Ernte von NDV aus spezifizierten pathogenfreien embryonierten Hühnereiern . (A) Web-ähnliches Gefäßsystem (Pfeile), das nach 9 Tagen Inkubation zusätzlich zur Embryobewegung sichtbar sein sollte. "X" bezeichnet die Grenzfläche zwischen der chorioallantoischen Membran und dem Lufthohlraum und wo das Loch für die Beimpfung des Eies geschaffen werden sollte. (B) Bild, das einen toten Embryo darstellt. Beachten Sie das Fehlen eines webartigen Gefäßsystems. Ein Mangel an Embryonenbewegung wird ebenfalls beobachtet. (C) Diagramm der Bestandteile eines embryonierten Hühnereis, das die Standorte der Lufthöhle, des Eigelbsacks, der Fruchtblase, der Chorioallantoikmembran und der Allantoisflüssigkeit zeigt. (D) Entfernung der Schale, um die choriallantoische Membran freizulegen. (E) Veranschaulicht, wie die allantoische Flüssigkeit und der Embryo nach dem Öffnen der Chorioallantoikmembran aussehen sollten. Abkürzung: NDV = Newcastle Disease Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der allgemeinen Montage der für die Tiefenfiltration verwendeten Vorrichtung. Stellen Sie sicher, dass das Manometer vor dem Tiefenfilter installiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Aufbau der Tangentialstromfiltration in den verschiedenen Konfigurationen. Pfeile zeigen die Richtung des Flüssigkeitsflusses. (A) Illustration der Montage der TFF-Kassette. (B) Schematische Darstellung des TFF-Systems in seiner "offenen" Konfiguration, die während der Reinigung und Konzentration der Flüssigkeit verwendet wird. (C) Schematische Darstellung des TFF-Aufbaus, wenn Flüssigkeit aus dem System eluiert wird, wie sie während der Elution von Viren und Reinigungslösung verwendet wird. (D) Schematische Darstellung des TFF-Systems in seiner "geschlossenen" Konfiguration, die während der Reinigung des TFF-Systems verwendet wird. Abkürzung: TFF = Tangential Flow Filtration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Dialyse des konzentrierten Virus aus TFF. (A) Schematische Darstellung der Zusammensetzung des Dichtegradienten von Iodixanol. (B) Virusbanding-Muster nach der Ultrazentrifugation von Viren, die unter Verwendung von ML-Puffer während des Reinigungsprozesses erzeugt wurden. Das virushaltige Hauptband wird durch ein schwarzes Oval gekennzeichnet. (C) Typische Größe einer Dialysekassette, die am Ende des Dialyseverfahrens mit 10 ml Virus beladen ist, die durch einen Iodixanol-Gradienten hergestellt wurde. Abkürzung: TFF = Tangential Flow Filtration; ML = Mannitol-Lysin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE Gel. Gel vergleicht das Vorhandensein von kontaminierenden Proteinen zwischen ungereinigten (Lane 2) und gereinigten (Lane 3) mesogenen NDV-Beständen, wenn 1 × 105 PFU geladen wurden. Bahnen 1 und 4 = Molekulargewichtsleiter (MW). NDV HN, F0 und seine Untereinheiten nach Spaltung, F1 und F2 sowie ihre jeweiligen Molekulargewichte27 werden in weißer Schrift angezeigt. Abkürzungen: SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; NDV = Newcastle-Krankheit-Virus; PFU = plaquebildende Einheiten; HN = Hämagglutinin; F0 = Fusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Beispiel für ein 96-Well-Plattenlayout, das zur Bestimmung des Virustiters durch TCID50 verwendet wird. Die Platte ist in 12 Spalten unterteilt, wobei jede Spalte eine andere serielle Verdünnung darstellt. Positive Wells (wie entweder durch CPE, Transgenexpression oder IFA bestimmt) sind grau angegeben. Angesichts der Anzahl der positiven Vertiefungen in diesem Beispiel wird der erwartete Titer nach Verwendung des Spearman-Karber-Titerrechners (Tabelle 2) sowohl in TCID50/ml als auch in PFU/ml aufgeführt. Abkürzungen: TCID50 = mediane infektiöse Dosis der Gewebekultur; CPE = zytopathische Wirkung; IFA = Immunfluoreszenz-Assay; PFU = plaquebildende Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Vergleich der CPE nach Infektion von DF1-Zellen mit lentogener oder mesogener NDV. Ein MOI von 0,5 wurde nach 10 h Inkubation (A-D) oder 24 h Inkubation (E-H) unter verschiedenen Kulturbedingungen von DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% Allantoic Fluid oder DMEM + 2% FBS + 125 μg/ml Trypsin verwendet. Maßstabsstäbe = 200 μm. Abkürzungen: CPE = zytopathische Wirkung; NDV = Newcastle-Krankheit-Virus; MOI = Multiplizität der Infektion; FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifiziertes Adlermedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Ein Beispiel für eine Situation, in der IFA benötigt wird, um ein lentogenes NDV ohne GFP-Transgen zu titrieren. Vero-Zellen wurden in DMEM kultiviert, das 2% FBS und 125 μg/ml Trypsin enthielt. Die Bilder wurden von der seriellen Verdünnung 10-7 aufgenommen. (A) Hellfeldbild infizierter Zellen. (B) Veranschaulicht das typische Erscheinungsbild von gefärbten Zellen, wenn IFA zum Nachweis von Viren verwendet wird. (C) Ein zusammengeführtes Bild von (A) und (B). Maßstabsstäbe = 100 μm. Abkürzungen: IFA = Immunfluoreszenz-Assay; NDV = Newcastle-Krankheit-Virus; GFP = grün fluoreszierendes Protein; FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifiziertes Adlermedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: PCR- und RT-qPCR-Primer zum Nachweis von Newcastle-Disease-Virus-Gensegmenten. Primer-Sets, die für die spezifische Amplifikation von zwei Regionen des NDV-Genoms verwendet werden. F-Protein-Primer-Set führt zur Amplifikation einer Region des F-Proteins, die die F-Protein-Spaltungsstelle überspannt. Das Transgen-Primer-Set amplifiziert die intergene Region zwischen den Phosphoprotein- und Matrixgengenen, der optimalen Transgen-Insertionsstelle. Diese Tabelle enthält auch die Primersequenzen, die auf das virale L-Gen21 und die im qRT-PCR-Assay verwendete L-Gensonde abzielen. Abkürzungen: PCR = Polymerase-Kettenreaktion; RT-qPCR = quantitative PCR mit Reversetranskription; NDV = Newcastle-Krankheit-Virus. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Spearmann-Karber-Titerrechner Diese interaktive Tabelle enthält den entsprechenden Workflow und die entsprechenden Gleichungen zur Bestimmung der Viruskonzentration anhand von TCID50-Ergebnissen , die auf dem Bohrlochinokulum in ml, dem Verdünnungsschema und der Anzahl der Replikate pro Verdünnung basieren. Die Konzentration wird als Volumen in ml angegeben, das erforderlich ist, um 50% der Gewebekultur (TCID50) und plaquebildenden Einheiten pro ml Virussuspension zu infizieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Bestimmung der Iodixanol-Konzentrationen. (A) Standardkurve, die aus der Absorption von Lösungen mit bekannter Iodixanolkonzentration bei 340 nm erzeugt wird. (B) Die Standardkurve und die Gleichung von (A) wurden verwendet, um die Konzentration von Iodixanol in Lösung nach Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, Dialyse und Polyethylenglykolkonzentration zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Amplifikation und Standardkurve, generiert aus dem qRT-PCR-Assay des synthetischen 500 bp doppelsträngigen DNA-Fragments des NDV L-Gens. Die Amplifikation (A) und die Standardkurve (B) wurden aus Proben erstellt, die eine zehnfache serielle Verdünnung (1,0 × 109 Kopien bis 1,0 × 100 Kopien) des DNA-Fragments enthielten. Für die Amplifikations- und Standardkurve lagen die Proben, die 1,0 × 10 1 Kopien und1,0 ×10 0 Kopien enthielten, unter dem Schwellenwert und ergaben keinen Kreuzungswert unter 35 Cp. Die endgültige Standardkurve wurde auf der Grundlage von Proben erstellt, die 1,0 × 109 Kopien bis 1,0 × 10 2 Kopien des DNA-Fragments enthielten. (C) DNA-Sequenz des 500-Nukleotid-NDV-L-Genfragments, das zur Generierung der Standardkurve im qRT-PCR-Protokoll verwendet wird. Abkürzungen: PCR = Polymerase-Kettenreaktion; RT-qPCR = quantitative PCR mit Reversetranskription; NDV = Newcastle-Krankheit-Virus; Cp = Kreuzungspunkt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzfigur S3: Be- und Entnahme von NDV aus der Dialysekassette. (A) Die typische Größe einer Dialysekassette, nachdem sie mit etwa 10 ml virushaltiger Lösung beladen wurde, die aus einem Saccharosedichtegradienten isoliert und am Ende des Dialyseschritts abgebildet wurde. (B) Ein Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung der Ultrazentrifugation mit Iodixanol-Dichtegradienten ohne ML-Pufferergänzung erzielt wurden. Eingekreist ist das Zielvirusband für die Entfernung. Durch die Pfeile wird ein zusätzliches Band angezeigt, das beschädigte Virionen enthalten kann. Beachten Sie, dass nach der Einbeziehung des ML-Puffers in den Reinigungsprozess dieses Band nicht mehr sichtbar ist. Abkürzungen: NDV = Newcastle Disease Virus; ML = Mannitol-Lysin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Enthält die Schritte, die für die Erzeugung von Western Blot-Lösungen und ML-Puffer erforderlich sind, die während des Reinigungsprozesses verwendet werden. Abkürzungen: SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; TEMED = Tetramethylethylendiamin; ML = Mannitol-Lysin. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Viren, die in präklinischen Studien als Therapeutika verwendet werden, müssen bei der Verabreichung in vivo15 stark gereinigt werden, um Toxizität zu vermeiden. Wenn zufällige Agenzien oder Verunreinigungen nicht entfernt werden, kann dies zu schweren Nebenwirkungen führen, die die therapeutische Wirkung des viralen Wirkstoffszunichte machen 28. Da NDV in embryonierten Hühnereiern hergestellt wird, gibt es mehrere kontaminierende Eiproteine wie Eieralbumin, die vor ihrer Verwendung in vivo in präklinischen oder klinischen Modellen entfernt werdenmüssen 29. Auch nach intensiver Reinigung wird nochOvalbumin gefunden 29. Die Entfernung dieser kontaminierenden Proteine ist ein rigoroser Prozess, der viel Zeit und Ressourcen erfordert15,22. Wenn NDV in einem zellbasierten System mit ausreichend hohen Titern hergestellt werden könnte, die für In-vivo-Anwendungen erforderlich sind, könnte dies den Reinigungsprozess vereinfachen und die Translation von NDV in klinische Umgebungen verbessern. Die eibasierte Produktion von onkolytischem NDV wurde jedoch in zahlreichen klinischen Studien am Menscheneingesetzt 30.

Bei jedem Schritt des Reinigungsprozesses können Proben auf Blutagarplatten als zusätzliche Qualitätskontrollmaßnahme gestreift werden, um sicherzustellen, dass keine bakterielle Kontamination vorliegt.

Der Druck während der Tiefenfiltration sollte sich nicht schnell aufbauen. Dies ist ein Zeichen für eine Proteinkontamination und verlangsamt den Reinigungsprozess erheblich und erfordert den Einsatz zusätzlicher Tiefenfilter. Die Tiefenfiltration sollte nicht schnell abgeschlossen werden. Dieser Schritt dauert in der Regel 1-1,5 Stunden. Normalerweise führt ein schneller Abschluss des Tiefenfiltrationsschritts zu einem niedrigeren Virustiter.

Da sich das Virus konzentriert, sollte ein "trüber Strom" aus der Retentionslinie in das Reservoir gelangen. Dies deutet darauf hin, dass sich in der allantoischen Flüssigkeit ein Virus befindet, das konzentriert wird, wenn es durch die Kassette geht.

Sowohl bei der Tiefenfiltration als auch bei der Tangentialströmungsfiltration sollte der Druck niemals 10 psi überschreiten. Wenn Sie diesen Druck überschreiten, wird das Virus schert. Die Zugabe von ML-Puffer zur Allantoikflüssigkeit wirkt als stabilisierendes Mittel und wird angenommen, um die virale Aggregation zu verhindern, was zu einer erhöhten Erholung des infektiösen Virus führt, ohne die Filterfähigkeit zu beeinträchtigen.

Die obige Methode beschreibt ein geeignetes Verfahren zur Herstellung sowohl lentogener als auch mesogener NDV-Stämme unter BSL-2-Bedingungen, da mesogenes NDV in Kanada kein ausgewähltes Mittel ist. So entstehen High-Titer-Bestände, die für den Einsatz im Tiermodell geeignet sind. Ähnlich wie andere Protokolle in der Literatur, die Größenausschlussreinigungsmethoden wie Tiefenfiltration und TFF verwenden, begrenzen diese Methoden die Verwendung von härteren Ultrazentrifugationstechniken, bei denen die Viruswiederherstellung im Vergleich zu Größenausschlussreinigungsmethodenreduziert wird 15.

Die Verwendung von TFF bietet ein Element der Skalierbarkeit, da TFF im Gegensatz zu Ultrazentrifugationstechniken zur Konzentration großer Startvolumina verwendet werden kann. Bestehende NDV-Reinigungstechniken werden im obigen Protokoll durch die Substitution von Saccharose für Iodixanol im Ultrazentrifugationsschritt verbessert, was die Wahrscheinlichkeit, dass das Virus aufgrund eines Kassettenbruchs am Ende des Dialyseschritts verloren geht, und die Zugabe von ML-Puffer, der die Filtration verbessert und die Ausbeute erhöht, erheblich reduziert.

Die Verwendung von Iodixanol-Gradienten wird gegenüber Saccharosegradienten bevorzugt, da Iodixanol weniger viskos und ungiftig für Zellen ist und ein "saubereres" Endproduktliefert 31,32. Iodixanol reduzierte signifikant die Spiegel von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, die nach der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation des gereinigten Virus33 vorhanden waren. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass Iodixanol bei der Reinigung von NDV verwendet wurde. Die Konzentration von Iodixanol in einer Lösung kann durch Quantifizierung der Absorption bei 340 nm unter Bezugnahme auf eine Standardkurve bestimmt werden. Diese Eigenschaft wurde verwendet, um festzustellen, dass NDV bei etwa 15% Iodixanol bandiert und um zu bestätigen, dass es durch Dialyse entfernt werden kann (Ergänzungsabbildung S1B). Iodixanol wurde ursprünglich als kontrastierendes Bildgebungsmittel entwickelt, und wir beobachteten keine unerwünschten Ereignisse, wenn eine 15%ige Iodixanol-Lösung intravenös und intranasal an C57BL/6-Mäuse verabreicht wurde. Dies deutet darauf hin, dass eine Dialyse zur Entfernung von Iodixanol möglicherweise nicht erforderlich ist, wodurch der Reinigungsprozess um etwa 16 h verkürzt wird. Darüber hinaus ist Saccharose hygroskopisch, wodurch die Dialysekassette deutlich anschwillt, wodurch das injizierbare Volumen begrenzt und das Risiko eines Kassettenbruchs und eines Virusverlustserhöht wird 34,35. Wenn gleiche Volumina von Iodixanol- und Saccharose-präpariertem Virus in Dialysekassetten injiziert wurden, trat beim Iodixanol-präparierten Virus signifikant weniger Schwellungen auf (vgl. Abbildung 4C und Ergänzungsbild S3A). Saccharose ist jedoch ein geeigneteres Stabilisierungsmittel für NDV als Iodixanol. Dies führte zur Supplementierung des Iodixanol-Gradienten mit ML-Puffer. Vor der Zugabe von ML-Puffer zum Reinigungsprozess gab es eine intensivere Bande im 10%igen Iodixanol-Gradienten, die zusätzlich zum Zielband bei 15% beobachtet wurde (Ergänzende Abbildung S3B). Dieses Band enthält wahrscheinlich beschädigte oder unvollständige Virionen, die während des Reinigungsprozesses erzeugt werden. Die Zugabe von ML-Puffer ermöglicht eine bessere Filtration von NDV bei gleichzeitiger Minimierung der hygroskopischen Natur des Dichtegradientenmediums, wodurch das Risiko eines Bruchs der Dialysekassette verringert wird. Die Schwellung der Dialysekassette kann durch Dialysieren in 1x PBS ergänzt mit 5% Saccharose weiter reduziert werden, da letztendlich das Virus darin gespeichert wird.

Da NDV ein negativer Sinn ist, ermöglicht das einzelsträngige RNA-Virus, die Isolierung von RNA und die Erzeugung von cDNA unter Verwendung von zufälligen Primern und spezifischen Primer-Sets für die PCR, die Sequenzierung verschiedener Regionen des Genoms aus einer cDNA-Reaktion (Tabelle 1). Dies ist wichtig, da es ermöglicht, den Pathotyp und die Integrität des Transgens und seiner transkriptionellen regulatorischen Elemente zu bestätigen. Die Spaltstelle des lentogenen NDV F-Proteins sollte eher monobasisch als polybasisch sein, da NDV, die polybasische Spaltungsstellen besitzen, typischerweise mesogene oder velogene Pathotypen sind und als ausgewählte Wirkstoffe36,37 klassifiziert werden. Dieses Protokoll beschreibt auch eine zuverlässige RT-qPCR-Methode zur Hochdurchsatzquantifizierung von NDV-Genomen. Vor der Verwendung in Tiermodellen und nach Abschluss der anderen Qualitätskontrolltests sollte die akute Toxizität bei 8 Wochen alten BALB/C-Mäusen untersucht werden. Dieser Stamm ist dadurch gekennzeichnet, dass er empfindlicher auf virusinduzierte Toxizitäten reagiert als andere Stämme vonMäusen 15. Darüber hinaus gibt dies einen Hinweis auf die Genauigkeit des Virustiters. Zum Beispiel wird ein Gewichtsverlust beobachtet, aber das Gewicht sollte nach 36-48 h zunehmen. Wenn dies nicht der Fall ist, ist es möglich, dass der Virustiter höher ist als ursprünglich berichtet, was auf die Aggregation von Viruspartikeln zurückzuführen sein kann. Dieses erste Ergebnis nach der Reinigung eines rekombinanten NDV führte zur Einbeziehung des ML-Puffers während des gesamten Reinigungsprozesses. Dieser Puffer wurde vorgeschlagen, um die Filterbarkeit und Wiederherstellung des Virus während der Reinigungsprozessezu verbessern 38.

Bei der Quantifizierung der Konzentration des infektiösen Virus durch TCID50 kann die Verwendung von IFA erforderlich sein, um eine NDV-Infektion sichtbar zu machen, insbesondere bei höheren Verdünnungen, wenn CPE möglicherweise nicht offensichtlich ist oder wenn das Virus kein fluoreszierendes Reportergen exprimiert (Abbildung 8). Der primäre Antikörper, der für IFA verwendet wird, ist spezifisch für das Ribonukleoprotein von NDV, einem Proteinkomplex, der während der Genomreplikation mit dem RNA-Genom assoziiert wird. Da NDV ein Vogelvirus ist, ist die Fibroblasten-Zelllinie DF1 des Hühnerembryos eine optimale Zelllinie zur Beurteilung des Virustiters. Typischerweise wird virusnegative allantoische Flüssigkeit als Mittel verwendet, um die Trypsin-ähnlichen Proteasen bereitzustellen, die von lentogenen NDVs für die F-Proteinspaltung39 benötigt werden. Die Verwendung von virusnegativer Allantoinflüssigkeit kann vermieden werden, indem mit 125 μg/ml Trypsin ergänzt wird, während die FBS-Konzentration auf 2% reduziert wird. Dies bietet eine einfache, kostengünstige Alternative zu virusnegativer Allantoikflüssigkeit und bietet gleichzeitig die erforderlichen trypsinähnlichen Proteasen. Vergleicht man diese beiden Kulturbedingungen bei einem MOI von 0,5 über einen Zeitraum von 24 h, scheint es kaum einen Unterschied zwischen den beiden zu geben, wobei das mit Trypsin ergänzte Medium möglicherweise zu mehr CPE führt (Abbildung 7). Andere Zelllinien wie Vero-Zellen können mit den gleichen Kulturbedingungen verwendet werden; Der CPE ist jedoch weniger ausgeprägt. Unter Verwendung des obigen Protokolls mit DF1-Zellen sollte NDV CPE innerhalb von 24 Stunden offensichtlich sein. Insbesondere sollte man die Bildung von Synzytie um 24 h sehen (Abbildung 7E-H). Mit dem beschriebenen Reinigungsverfahren haben wir NDV konsequent zu Titern im Bereich von 1 × 109-3 × 1010 PFU/ml aus einem Ausgangsvolumen von 0,8-1,0 L Allantoikflüssigkeit gereinigt.

Insgesamt verbessert das beschriebene Protokoll die zuvor veröffentlichten NDV-Reinigungsverfahren durch die Verwendung von Iodixanol als Dichtegradientenmedium anstelle von Saccharose und durch die Zugabe von ML-Puffer zur Verbesserung der Filtration. Darüber hinaus beschreiben wir eine ergänzende Methode zur Titration von NDV, schließen eine detaillierte RT-qPCR-Methode zur Bestimmung der NDV-Kopienzahl ein und definieren optimale Bedingungen für die Verwendung von Trypsin anstelle von Allantoikflüssigkeit während der Virustitrierung. Obwohl dieser Prozess hochtitere NDV-Bestände erzeugt, die systemisch in hohen Dosen verabreicht werden können, umfasst dieses Verfahren mehrere Schritte, die die Variabilität zwischen den Benutzern erhöhen und das Potenzial für eine Kontamination einführen können. Eine weitere Einschränkung ist die Anforderung, dass das Ausgangsmaterial von hoher Qualität sein muss. Es ist wichtig, dass die allantoische Flüssigkeit frei von kontaminierendem Eigelb ist, da dies die Effizienz der Filtrations- und Größenausschlussschritte stark reduziert. Insgesamt ist dieser Prozess zeitaufwendig, kann aber durch Wegfall des Dialyseschrittes verkürzt werden. Dieses Verfahren führt zu einer größeren Ausbeute an In-vivo-Viren im Vergleich zu anderen Reinigungsmethoden15,18. Die Fähigkeit, qualitativ hochwertigere, konzentriertere NDV herzustellen, erweitert seine Fähigkeiten, um als onkolytisches Mittel oder Impfstoffvektor in Tiermodellen von Krankheiten sowohl im präklinischen als auch im klinischen Umfeld eingesetzt zu werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

J.G.E.Y erhielt ein PhD-Stipendium des Ontario Veterinary College und ein Ontario Graduate Scholarship. Diese Arbeit wurde durch Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants an SKW (Grant # 304737) und LS (Grant # 401127) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

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References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

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Krebsforschung Ausgabe 183
Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid
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