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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente > 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Abstract

Il virus della malattia di Newcastle (NDV), noto anche come sierotipo 1 dell'ortoavulavirus aviario, è un virus a RNA a singolo filamento a senso negativo che è stato sviluppato sia come virus oncolitico che come vaccino vettore virale. NDV è un attraente agente terapeutico e profilattico grazie al suo consolidato sistema di genetica inversa, potenti proprietà immunostimolanti e un eccellente profilo di sicurezza. Quando somministrato come virus oncolitico o vaccino vettore virale, NDV suscita una robusta risposta immunitaria antitumorale o antigene-specifica, attivando sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario.

Date queste caratteristiche desiderabili, NDV è stato valutato in numerosi studi clinici ed è uno dei virus oncolitici più ben studiati. Attualmente, ci sono due studi clinici registrati che coinvolgono NDV: uno che valuta un vaccino ricombinante NDV-vectored per SARS-CoV-2 (NCT04871737), e un secondo che valuta un NDV ricombinante che codifica per Interleuchina-12 in combinazione con Durvalumab, un anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Per facilitare l'ulteriore avanzamento di questo vettore virale altamente promettente, sono necessari metodi semplificati per generare NDV ricombinante (rNDV) ad alto titolo, di grado vivo.

Questo documento descrive una procedura dettagliata per amplificare l'rNDV in uova di gallina embrionate prive di patogeni specifici (SPF) e purificare l'rNDV dal liquido allantoico, con miglioramenti per ridurre la perdita durante la purificazione. Sono incluse anche le descrizioni dei test di controllo di qualità raccomandati, che dovrebbero essere eseguiti per confermare la mancanza di contaminanti e l'integrità del virus. Nel complesso, questa procedura dettagliata consente la sintesi, la purificazione e la conservazione di NDV ad alto titolo, di grado vivo, ricombinante, lentogeno e mesogenico per l'uso in studi preclinici.

Introduction

Newcastle Disease Virus, noto anche come Avian Orthoavulavirus-1, è un paramixovirus aviario avvolto con il potenziale per essere utilizzato sia come virus oncolitico che come vaccino viralevettore 1,2,3,4,5,6,7. Più recentemente, NDV progettato per esprimere la proteina spike di SARS-CoV-2 è stato caratterizzato come un vaccino intranasale efficace nei modellidi sfida di topo e criceto 7,8,9. Se usato come immunoterapia del cancro, si traduce nel reclutamento di cellule immunitarie innate, in particolare cellule natural killer, produzione di interferone di tipo I e generazione di cellule T antitumorali specifiche 10,11,12,13. Oltre a queste potenti proprietà immunostimolanti, NDV ha un forte profilo di sicurezza e un sistema di genetica inversa ben consolidato 14,15. Queste caratteristiche desiderabili hanno spinto la valutazione di NDV in numerosi studi clinici preclinici e umani (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Per far progredire ulteriormente questo vettore virale immunostimolante molto promettente, sono necessari metodi dettagliati per produrre e purificare NDV ultra-puro ad alto titolo che può essere somministrato in modo sicuro in vivo.

Poiché NDV è un paramyxovirus aviario, è più frequentemente amplificato nelle uova di gallina embrionate. Mentre ci sono sistemi basati su cellule disponibili per la propagazione di NDV, la maggior parte non è stata in grado di produrre titoli simili a quelli ottenuti nelle uova di gallina embrionate18. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti nella produzione di NDV nelle uova, incluso il fatto che la produzione a base di uova è lunga e non facilmente scalabile, l'approvvigionamento di grandi quantità di uova di gallina SPF può essere problematico ed esiste il potenziale di contaminazione con allergeni dell'uovo 13,18,19,20 . Recentemente, un gruppo ha dimostrato che le cellule Vero cresciute in sospensione in mezzo privo di siero possono supportare la replicazione di NDV in titoli paragonabili a quelli ottenuti nelle uova, prima della purificazione21. Tuttavia, ciò ha richiesto il passaggio seriale del virus per adattare il virus alle cellule Vero e l'ottimizzazione di un metodo per purificare NDV dalle cellule Vero in sospensione è ancora richiesta21.

Come evidenziato in precedenza, i metodi utilizzati per purificare il virus di alto titolo e di grado in vivo variano a seconda del virus in questione22. Esiste un sistema di genetica inversa ben consolidato disponibile per la generazione di NDV ricombinante. Questo processo, che prevede l'uso di un clone di cDNA, plasmidi helper e un virus helper che esprime T7 RNA polimerasi, è stato precedentemente descritto in dettaglio 15,23. Questo protocollo può essere applicato a NDV lentogeno o mesogenico. Il virus descritto in questo protocollo è un NDV mesogenico ricombinante che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria inserita tra i geni virali P e M come unità di trascrizione individuale, poiché questo è stato precedentemente descritto come il sito ottimale per l'inserimento di transgeni estranei24.

I metodi allegati delineano la purificazione di NDV in base alle sue dimensioni, che vanno da 100 a 500 nm, e alla sua densità15. Ciò ha permesso la generazione di stock NDV in vivo e ad alto titolo in circa 3 settimane, a partire da quando le uova vengono ricevute fino ad avere un titolo finale. Vengono descritte le tecniche frequentemente utilizzate nella produzione su larga scala di virus a base di uova come la filtrazione a flusso tangenziale, la filtrazione di profondità e l'ultracentrifugazione del gradiente di densità, consentendo la traduzione di questi metodi in una produzione su larga scala. Le tecniche precedentemente descritte per la purificazione dell'NDV sono state migliorate mediante l'incorporazione di un tampone stabilizzante del virus, l'uso di iodixanolo durante l'ultracentrifugazione del gradiente di densità e la descrizione di varie misure di controllo della qualità per garantire la qualità in vivo 15. Ciò ha permesso la purificazione di NDV di grado in vivo raggiungendo titoli fino a 3 × 1010 PFU/mL da 0,8 a 1,0 L di liquido allantoico.

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Protocol

Tutto il lavoro che coinvolge l'uso di animali è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Guelph in conformità con il Canadian Council on Animal Care. Tutto il lavoro viene eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) in Canada, dove l'NDV mesogenico è un agente patogeno del gruppo di rischio 2. Tutte le fasi coinvolte nell'amplificazione e purificazione di NDV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di tipo IIA per scopi di sicurezza e sterilità.

1. Amplificazione di NDV mediante uova di gallina embrionate esenti da agenti patogeni specifici

  1. Inoculazione di uova di gallina embrionate SPF
    NOTA: In genere, otto dozzine di uova di gallina embrionate SPF vengono utilizzate per generare un lotto di NDV di grado vivo. Ordina una o due dozzine di uova extra per tenere conto dei danni durante la spedizione e della variabilità della redditività. Le uova di gallina embrionate sono materiale biologico e dovrebbero essere maneggiate secondo le linee guida istituzionali. Tuttavia, poiché gli embrioni non sono nati, non è richiesta l'approvazione del comitato istituzionale per la cura degli animali.
    1. Dopo aver ricevuto uova di gallina embrionate SPF, incubare in un'incubatrice di uova a 37 ° C, 60% di umidità per 9 giorni. Assicurarsi che l'incubatrice sia impostata per oscillare / ruotare automaticamente le uova ogni ora.
      NOTA: le uova possono essere conservate a temperatura ambiente fino a 24 ore o 4 °C fino a 72 ore; tuttavia, ciò può ridurre la vitalità dell'embrione.
    2. Dopo 8-11 giorni di incubazione (idealmente il giorno 9), candela le uova per determinare la vitalità dell'embrione. Cerca la vascolarizzazione simile al web (Figura 1A) e il movimento degli embrioni come indicatori di embrioni vitali. Smaltire le uova prive di queste caratteristiche (Figura 1B).
    3. Sulle uova vitali, contrassegnare l'interfaccia tra la sacca d'aria e l'embrione a matita con una "X" (Figura 1A). Assicurarsi che questo sito di iniezione non causi perforazione della vascolarizzazione. Restituire le uova contrassegnate all'incubatrice mentre l'inoculo è preparato.
    4. Calcola la quantità di virus necessaria per iniettare tutte le uova di gallina embrionate SPF. Assicurarsi che ogni uovo riceva 100 PFU di virus in un volume di 100 μL; diluire il virus in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 1 × 103 PFU/mL. Preparare un ulteriore 20% dell'inoculo per tenere conto delle imprecisioni nella somministrazione del virus.
    5. Utilizzando una salvietta antistatica, pulire le parti superiori delle uova contrassegnate con una soluzione di iodio al 10%, diluita in etanolo al 70%. Attendere circa 1-2 minuti affinché la soluzione si asciughi.
    6. Forare con cura il guscio usando un paio di pinzette affilate sterili. Disinfettare le pinzette in etanolo al 70% tra le uova.
    7. Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 25 G, iniettare 100 μL dell'inoculo preparato al punto 1.1.4 nella cavità corioallantoica (Figura 1C). Avvicinarsi con l'ago con un angolo di quasi 90° rispetto all'uovo. Inserire l'ago appena nella parte superiore della membrana corioallantoica.
    8. Dopo l'inoculazione, utilizzare lo smalto per unghie per coprire il sito di puntura e restituire le uova all'incubatrice. Assicurarsi che l'impostazione a dondolo sia ON fino a 24 ore dopo l'inoculazione.
    9. Controllare la vitalità delle uova 24 ore dopo l'inoculazione. Scartare le uova morte che mancano di vascolarizzazione nella membrana corioallantoica e nel movimento dell'embrione (Figura 1B).
      NOTA: Queste uova sono morte a causa del processo di inoculazione e non da NDV.
    10. Restituire le uova all'incubatrice, con il bilanciere che si avvia OFF per prevenire la contaminazione del liquido allantoico con le proteine dell'uovo.
    11. Controllare le uova ogni 12-24 ore come descritto al punto 1.1.9 per identificare le uova morte. Spostare le uova che muoiono dopo 24 ore dopo l'inoculazione a 4 ° C per ridurre al minimo l'autolisi. Raccogliere il liquido allantoico entro 2-12 ore dalla refrigerazione.
    12. Incubare le uova per almeno 72 ore.
      NOTA: Se si propaga un ceppo mesogenico di NDV, il tempo di incubazione ottimale è di 60-72 ore, poiché tempi di incubazione prolungati possono compromettere il processo di purificazione a causa della ridotta chiarezza del fluido allantoico. Questo problema non è così importante quando si propagano ceppi NDV lentogeni in quanto impiegano molto più tempo per uccidere l'embrione.
    13. Dopo il periodo di incubazione appropriato, spostare le uova rimanenti a 4 °C per 2-12 ore prima di raccogliere il liquido allantoico.
  2. Raccolta di fluido allantoico contenente NDV
    1. Spostare le uova refrigerate nell'armadio di biosicurezza. Pulire le parti superiori delle uova con il 70% di etanolo.
    2. Utilizzare pinzette sterili e forbici chirurgiche per aprire il lato apicale dell'uovo dove si trova la sacca d'aria.
    3. Rimuovere il guscio per rivelare la membrana corioallantoica (Figura 1D).
    4. Forare con attenzione la membrana e staccarla per esporre la cavità allantoica (Figura 1E). Assicurarsi che il sacco vitellino non venga forato accidentalmente e che questo rovini l'uovo.
    5. Usa una pinza smussata per afferrare l'embrione e aprire il sacco embrionale.
      NOTA: Il fluido all'interno del sacco embrionale contiene anche NDV.
    6. Deprimere l'embrione con la pinza e raccogliere il liquido allantoico usando una pipetta sierologica da 10 ml.
    7. Conservare il fluido allantoico su ghiaccio in tubi conici da 15 ml fino alla chiarificazione.
      NOTA: Se il liquido allantoico è giallo, il sacco vitellino è stato compromesso e il liquido allantoico deve essere scartato.
    8. Centrifugare i tubi conici contenenti il fluido allantoico a 1.500 × g per 10 min a 4 °C.
    9. Punto di pausa: aliquotare il liquido allantoico chiarificato in tubi conici da 50 ml e conservarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine (ad esempio, settimane o mesi), integrando il fluido con saccarosio fino a una concentrazione finale del 5% per proteggere il virus dai duri effetti del congelamento-disgelo. In alternativa, per la conservazione a breve termine (ad esempio, 1-3 giorni), integrare il liquido allantoico con saccarosio (ultimo 5%) o con 3x tampone mannitolo-lisina (ML) (15% mannitolo, 3% lisina; vedere Tabella supplementare S1 per le ricette tampone) per ottenere una concentrazione finale di 1x (5% mannitolo, 1% lisina) prima della conservazione a 4 °C.

2. Purificazione di NDV dal fluido allantoico

  1. Filtrazione in profondità del fluido allantoico
    1. Conservare il liquido allantoico chiarificato a -80 °C e scongelarlo a 4 °C la sera prima della purificazione.
    2. In un armadio di sicurezza biologica, impostare il tubo e la pompa peristaltica come mostrato nella Figura 2.
    3. Se non è già stato eseguito, combinare il fluido allantoico con 3x ml tampone ad una concentrazione finale di 1x.
    4. Prima di fissare il filtro di profondità, sterilizzare il tubo facendo passare 50 ml di 0,5 M NaOH attraverso il sistema in un contenitore per rifiuti.
    5. Risciacquare il tubo facendo passare 100 ml di acqua sterile di grado molecolare attraverso il sistema e nel contenitore dei rifiuti.
      NOTA: Poiché NaOH inattiverà NDV, è importante che le linee siano adeguatamente lavate prima di introdurre il fluido allantoico contenente virus.
    6. Innescare il sistema facendo passare 50 mL di PBS attraverso di esso, arrestando la pompa quando nel tubo sono rimasti circa 5 mL di PBS.
    7. Collegare il filtro di profondità con un grado di ritenzione di 1-3 μM al tubo e rimuovere il secondo cappuccio sul lato apicale del filtro di profondità per sfiatare il filtro. Iniziare a eseguire altri 50 ml di PBS attraverso il sistema.
    8. Una volta che PBS inizia a fluire attraverso lo sfiato nella parte superiore del filtro, chiudere la porta e continuare a far fluire PBS attraverso le linee.
      NOTA: le bolle d'aria minori sono accettabili, ma la presenza di grandi quantità d'aria richiederà che il filtro venga nuovamente ventilato come descritto nei passaggi 2.1.7 e 2.1.8.
    9. Arrestare la pompa quando nel tubo rimangono circa 5 ml di PBS.
    10. Sostituire il recipiente per i rifiuti con un nuovo recipiente di raccolta sterile e iniziare a far scorrere il fluido allantoico attraverso il filtro di profondità.
      NOTA: la pressione non deve superare i 10 psi in quanto ciò comporta la tosatura del virus. La pressione può essere manipolata diminuendo o aumentando la portata della pompa. Se la pressione inizia a superare i 10 psi e la portata non può essere ulteriormente diminuita, è necessario utilizzare un nuovo filtro di profondità. In questo caso, i passaggi 2.1.6-2.1.8 devono essere eseguiti prima di riprendere il flusso di liquido allantoico.
    11. Una volta che tutto il fluido allantoico è passato attraverso il filtro, eseguire 50 ml di 1x ML buffer attraverso le linee per massimizzare il recupero del virus.
    12. Raccogliere il liquido fino a quando le linee non si asciugano. Conservare il virus durante la notte o fino a 36 ore a 4 °C.
      NOTA: Una volta che il virus è stato filtrato in profondità, continuare il processo di purificazione entro 36 ore dal completamento della filtrazione di profondità.
    13. Scollegare il filtro di profondità e disinfettare il tubo facendo scorrere 100 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C attraverso il sistema prima dello stoccaggio in 0,5 M NaOH.
  2. Filtrazione a flusso tangenziale per la concentrazione di NDV
    1. Assemblare i componenti della cassetta come illustrato nella Figura 3A (e come mostrato in precedenza25) in un armadio di sicurezza biologica.
      NOTA: Il collettore e la piastra terminale devono essere lavati in detergente e asciugati prima dell'uso. Le guarnizioni in silicio sono riutilizzabili e devono essere conservate in 0,5 M NaOH con la cassetta.
    2. Impostare il sistema di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) (noto anche come filtrazione a flusso incrociato) in una conformazione "aperta" (Figura 3B).
      1. Se si utilizza una cassetta per la prima volta, assemblare la cassetta TFF nella conformazione Elution e lavare con 100 ml di acqua sterile di grado molecolare (Figura 3C).
      2. Una volta che ci sono solo 5 ml di acqua rimanenti nel serbatoio del serbatoio, mettere in pausa la pompa e modificare la configurazione del sistema TFF in una conformazione chiusa (Figura 3D).
      3. Aggiungere 100 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C al serbatoio e passare attraverso il sistema per 30-60 min.
      4. Sospendere il flusso e riportare il sistema TFF alla configurazione dell'eluizione, riprendendo il flusso per eluire la soluzione detergente.
      5. Quando rimangono circa 5 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100 ml di acqua sterile di grado molecolare per risciacquare il sistema.
      6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 ml, mettere in pausa la pompa e posizionare il sistema TFF nella conformazione aperta (Figura 3B). Continuare con il passaggio 2.2.3.
    3. Sterilizzare la cassetta e il tubo facendo passare 100 mL di 0,5 M NaOH attraverso il sistema utilizzando la pompa peristaltica. Assicurarsi che la pressione non superi i 30 psi per mantenere l'integrità della cassetta.
    4. Mettere in pausa la pompa quando nel serbatoio sono rimasti circa 5 mL di 0,5 M NaOH.
    5. Aggiungere 100 ml di acqua sterile di grado molecolare al serbatoio e riprendere a far passare il fluido attraverso la cassetta. Ruotare il serbatoio per lavare tutto il NaOH dai lati del serbatoio per prevenire l'inattivazione del virus. Ripetere la fase di lavaggio del serbatoio.
    6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 ml di acqua sterile di grado molecolare, mettere in pausa la pompa.
    7. Aggiungere 100 ml di PBS al serbatoio, ruotando per garantire che l'acqua sterile di grado molecolare venga lavata dai lati. Riprendere il flusso di liquido attraverso la cassetta.
    8. Quando rimangono circa 5 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa, aggiungere fluido allantoico filtrato in profondità al serbatoio e riprendere il flusso della pompa.
    9. Monitorare il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi per prevenire la tosatura del virus. Utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e l'uso di morsetti a C per aumentare l'eluizione in rifiuti.
      NOTA: la combinazione della velocità della pompa peristaltica e dei morsetti a C comporterà un aumento della pressione.
    10. Quando nel serbatoio sono rimasti 50-100 mL di liquido allantoico, mettere in pausa la pompa per eseguire uno scambio tampone aggiungendo 150-200 mL di 1x buffer ML.
    11. Riprendere il flusso della pompa, monitorando nuovamente il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi.
    12. Quando rimangono 5-10 ml nel serbatoio, mettere in pausa la pompa.
    13. Utilizzando due morsetti a C, chiudere le due linee di scarico come mostrato nella Figura 3C.
    14. Disaccoppiare la linea di retentate che alimenta il serbatoio e inserirla in un tubo conico da 50 ml (Figura 3C).
    15. Riprendere il flusso della pompa, fermandosi quando rimangono alcune gocce di liquido nel serbatoio del serbatoio.
    16. Rimuovere i morsetti a C dalle linee di scarico e ricollegare la linea di alimentazione del retentato al serbatoio del serbatoio (Figura 3B).
    17. Aggiungere 20-25 mL di 1x ML buffer e riprendere il flusso della pompa fino a quando non rimangono circa 5 mL nel serbatoio del serbatoio.
    18. Ripetere i passaggi da 2.2.13 a 2.2.16.
      NOTA: unaterza eluizione può essere eseguita ripetendo i passaggi 2.2.17 e da 2.2.13 a 2.2.16 per aumentare la resa del virus. Tuttavia, la maggior parte del virus è presente nelle prime due eluizioni.
    19. Dopo aver terminato le eluizioni, posizionare il virus sul ghiaccio o a 4 °C.
    20. Per pulire le linee, impostare il sistema in modo che sia un formato a circuito chiuso (Figura 3D) con le linee di scarico che alimentano il serbatoio come illustrato nella Figura 3D.
    21. Procedere alla pulizia del sistema aggiungendo 250 mL di 0,5 M NaOH, 400 PPM di candeggina preriscaldata a 42 °C.
    22. Far scorrere la soluzione detergente attraverso il sistema durante la notte.
      NOTA: durante il ricircolo della soluzione detergente, se la pompa viene azionata ad una velocità di 50 ml/min, deve essere osservata una pressione di circa 5 psi. Se la pressione supera questa, la cassetta è sporca e la soluzione detergente deve essere sostituita e il processo ripetuto.
    23. Eluire la soluzione detergente dirigendo sia le linee di scarico che la linea di ripetizione in un contenitore per rifiuti.
    24. Aggiungere 400-500 ml di acqua sterile al serbatoio e farla scorrere attraverso il sistema e nei contenitori dei rifiuti.
    25. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100-200 mL di 0,5 M NaOH al serbatoio del serbatoio, facendo roteare la soluzione per lavare il contenitore del serbatoio.
    26. Una volta che il serbatoio è quasi vuoto, ripetere il passaggio 2.2.23 altre due volte.
    27. Smontare la configurazione TFF, conservando la cassetta TFF e le guarnizioni in un piccolo volume di 0,5 M NaOH in un sacchetto di plastica richiudibile a 4 °C.
      NOTA: i tubi possono essere conservati a temperatura ambiente immersi in 0,5 M NaOH.
  3. Ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo
    1. Accendere l'ultracentrifuga e impostarlo su preraffreddamento a 4 °C. Preraffreddare anche il rotore desiderato a 4 °C (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: i rotori devono essere conservati a 4 °C.
    2. Utilizzare la soluzione di iodixanolo al 60% (concentrazione al momento dell'acquisto) per generare soluzioni di iodixanolo al 40%, 20% e 10% diluendo con PBS e 3x ML Buffer a una concentrazione finale di 1x di ML buffer.
    3. In un tubo ultracentrifuga a parete sottile da 13,2 mL, sovrapporre 0,5 mL, 2,5 mL e 2,5 mL delle soluzioni di iodixanolo al 40%, 20% e 10% rispettivamente (Figura 4A).
      NOTA: inclinare il tubo ultracentrifuga su un lato ed espellere lentamente la soluzione ridurrà significativamente il rischio di mescolare i due strati sfumati. La separazione di ogni strato dovrebbe essere evidente, con un "alone" visibile tra ogni strato del gradiente.
    4. Utilizzate un pennarello per contrassegnare le interfacce dei vari livelli sfumatura.
    5. Strato 6-6,5 mL del virus eluito dalla procedura TFF sul gradiente di densità. Aggiungere il virus con attenzione come descritto al punto 2.3.3 per evitare di disturbare il gradiente di densità.
    6. Caricare i tubi ultracentrifuga negli inserti per il rotore della benna oscillante (vedere la tabella dei materiali) utilizzando una scala aperta per bilanciare gli inserti entro 0,01 g l'uno dall'altro. Utilizzare PBS o eluente antivirus extra per tenere conto delle differenze di peso.
    7. Una volta bilanciati i tubi, tappare i tubi e caricarli nel rotore.
    8. Centrifuga per 1,5 ore a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: questa operazione può essere eseguita durante la notte se è disponibile un'ultracentrifuga con funzionalità di avvio ritardato.
    9. Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi utilizzando un paio di pinze sterili. Cercare la banda target, una banda di grandi dimensioni, compresa tra i gradienti del 10% e del 20% (Figura 4B).
    10. Sospendere il tubo sopra la parte superiore di un becher usando un supporto per storta.
    11. Collegare un ago da 18 G x 1,5 pollici a una siringa da 5 ml e perforare il lato del tubo ultracentrifuga.
      NOTA: il tubo deve essere forato leggermente al di sotto della banda target, con l'ago su un angolo verso l'alto e smussato in modo tale da viaggiare nella banda target.
    12. Estendere lentamente lo stantuffo per rimuovere la banda di destinazione.
      NOTA: Spostare l'ago all'interno della banda target per massimizzare il virus estratto. Fare attenzione che altre bande o detriti non si mescolino con la banda target ed evitare di assumere una soluzione in eccesso in quanto ciò porterà all'uso di più cassette per dialisi.
    13. Una volta estratta la fascia target, rimuovere l'ago e lasciare che la soluzione rimanente scarichi nel becher di scarto. Erogare la fascia target in un tubo conico da 50 ml fino a quando tutte le bande di tutti gli altri tubi ultracentrifuga sono state estratte.
    14. Ripetere i passaggi 2.3.10-2.3.13 fino a quando tutte le bande target sono state estratte da tutti i tubi ultracentrifuga.
    15. Approccio alternativo all'estrazione delle bande target come descritto nei passaggi da 2.3.10 a 2.3.13
      1. Rimuovere lentamente il liquido che si sovrappone alla fascia target usando una pipetta. Una volta nella banda bersaglio, estrarre utilizzando una pipetta e conservare il virus in un tubo conico da 50 ml.
        NOTA: ciò consente di riutilizzare i tubi ultracentrifuga.
  4. Rimozione di iodixanol dalla soluzione di virus
    NOTA: la banda contenente NDV appare ad una densità di iodixanolo compresa tra il 15% e il 16%. La concentrazione di iodixanolo nella soluzione può essere determinata misurando l'assorbanza a 340 nm in riferimento ad una curva standard (Figura supplementare S1). Questa fase può essere omessa in quanto non sono stati osservati effetti avversi o tossicità acuta quando le soluzioni di iodixanolo di questa concentrazione sono state somministrate a topi C57BL/6.
    1. Prewet una cassetta di dialisi cut-off a peso molecolare da 0,5-3 mL 10 kDa immergendola in PBS per 1 min.
      NOTA: La membrana per dialisi dovrebbe cambiare da liscia ad avere un aspetto arruffato o irregolare. Se il volume del virus estratto supera i 10 ml, devono essere utilizzate due cassette per dialisi da 0,5-3 ml o una cassetta per dialisi da 5-12 mL.
    2. A seconda dei casi, utilizzare una siringa da 5 o 10 mL e un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici per raccogliere il virus dal tubo conico da 50 ml.
    3. Utilizzare la siringa per entrare nella cassetta di dialisi, facendo attenzione a non perforare la membrana e iniettare il virus.
      NOTA: la cassetta per dialisi può essere ruotata per manipolare il posizionamento della sacca d'aria nella cassetta. La sacca d'aria deve essere rimossa prima di rimuovere l'ago dalla cassetta.
    4. Riempire un becher da 1 L con 1 PBS sterile, posizionare una barra di agitazione e la cassetta di dialisi all'interno e coprire. Incubare a 4 °C mescolando delicatamente.
      NOTA: utilizzare polistirene espanso estruso e una fascia elastica per fissare la cassetta di dialisi in modo che galleggi nel PBS. La cassetta potrebbe gonfiarsi leggermente a causa del buffer ML.
    5. Dopo 1-2 ore, sostituire con 1 pbS fresco e continuare a incubare a 4 °C per altre 8-10 ore con un leggero rimescolamento.
      NOTA: Questo può essere fatto anche durante la notte.
    6. Sostituire con 1x PBS fresco ancora una volta, incubando a temperatura ambiente per 1-2 ore.
  5. Concentrazione della soluzione virale
    1. Rimuovere la cassetta per dialisi dal tampone di dialisi (Figura 4C) e inserirla in un piccolo sacchetto di plastica sigillabile. Aggiungere 15-25 ml di polietilenglicole al 40% da 20.000 MW in modo che la cassetta di dialisi sia completamente sommersa.
    2. Incubare a temperatura ambiente con dondolo. Controllare periodicamente il volume del virus nella cassetta utilizzando una siringa da 5 o 10 ml e un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici.
      NOTA: la quantità di tempo necessaria per concentrare il virus varia in base al volume iniziale e al volume finale desiderato. In genere, il volume finale desiderato è compreso tra 1 e 1,5 ml indipendentemente dal volume iniziale del fluido allantoico. Quando si controlla il volume, fare attenzione a non utilizzare la stessa porta in quanto ciò comprometterebbe l'integrità della porta e potrebbe comportare la miscelazione della soluzione di polietilenglicole e del virus.
    3. Prima di rimuovere il virus concentrato dalla cassetta di dialisi, sciacquare brevemente la cassetta in 1x PBS e riempire d'aria un ago smussato da 18 G x 1,5 pollici.
    4. Inserire la siringa riempita d'aria nella cassetta di dialisi e premere lo stantuffo. Ruotare l'apparecchio in modo che il virus concentrato possa essere rimosso senza rimuovere l'aria introdotta.
    5. Erogare il virus concentrato in un tubo conico da 50 ml, annotando il volume erogato.
    6. Utilizzando la stessa siringa e ago, iniettare una quantità appropriata di saccarosio al 60% nella cassetta di dialisi in modo che, se combinato con il virus precedentemente rimosso, sia ad una concentrazione finale del 5% di saccarosio.
    7. Utilizzare le dita guantate per massaggiare la membrana per rimuovere il virus residuo che potrebbe aver aderito alla membrana, facendo attenzione a non danneggiarlo. Rimuovere parte dell'aria in eccesso nella cassetta di dialisi per facilitare il processo di spostamento.
    8. Combinare questo lavaggio con il virus già nel tubo conico da 50 ml.
      NOTA: il virus è ora in saccarosio al 5% e pronto per essere dispensato in aliquote da 20 μL, 50 μL, 100 μL o 200 μL e conservato a -80 °C. In alternativa, per la conservazione a lungo termine, l'NDV può essere liofilizzato e conservato a 4 °C come descritto al paragrafo 2.6.
  6. Liofilizzazione di NDV
    1. Liofilizzare il virus aliquotato in tubi centrifughi da 1,5 mL o tubi conici da 15 mL a 44 × 10-3 MBAR e -52 °C per 16 ore.
    2. Conservare i campioni liofilizzati a 4 °C senza riduzione significativa del titolo virale.

3. Saggi di controllo qualità

  1. Isolamento dell'RNA virale e PCR a trascrizione inversa per la conferma del genoma
    1. Scongelare un'aliquota virale di 20 μL. Seguire il protocollo di isolamento dell'RNA virale fornito con il kit.
    2. Utilizzare immediatamente l'RNA isolato come modello per la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) o memorizzarlo a -80 °C.
    3. Preparare le reazioni di trascrizione inversa come descritto nel protocollo fornito dal produttore.
    4. Utilizzare il cDNA risultante come modello per varie reazioni PCR di controllo qualità per confermare il patotipo NDV (Tabella 1, set di primer proteico F) e la presenza di elementi di controllo genico richiesti (Tabella 1, Set di primer Transgene).
      NOTA: i primer devono essere progettati in base al ceppo di NDV che viene propagato.
      1. Per sequenziare il sito di scissione della proteina F, il principale determinante del patotipo, utilizzare il set di primer della proteina F (Tabella 1). Cerca un prodotto PCR di 435 paia di basi di lunghezza.
        NOTA: Qui, i primer sono stati progettati sulla base del ceppo LaSota di NDV (adesione Genbank AF077761.1). È ben noto che l'espressione ottimale del transgene si verifica quando un transgene estraneo viene inserito tra i geni P e M24.
      2. Utilizzare il set di primer transgenico per confermare l'integrità degli elementi di inizio del gene e degli elementi finali del gene del transgene. Sequenziare il prodotto PCR per confermare l'inizio del gene e l'integrità della sequenza di fine genica.
    5. Invia i prodotti PCR per il sequenziamento del DNA e confrontali con il modello per l'omologia.
  2. Colorazione SDS PAGE e Coomassie per rilevare proteine contaminanti
    1. Fondere un gel SDS PAGE con gradiente di densità preparando prima soluzioni di poliacrilammide al 6% e al 15% (Tabella supplementare S1). Utilizzare una pipetta da 10 mL per prelevare 5 mL della soluzione al 15%, seguiti da 5 mL della soluzione al 6%.
    2. Rimuovere la pipetta dalla soluzione e generare una bolla d'aria aspirando brevemente l'aria.
      NOTA: quando la bolla d'aria viaggia verso l'alto, la soluzione viene miscelata per creare la sfumatura SDS PAGE.
    3. Erogare la soluzione nell'apparato di fusione e lasciarla solidificare per 30 minuti.
    4. In un volume finale di 20 μL, combinare un'aliquota del virus con un tampone riducente 4x (Tabella supplementare S1) in modo che la concentrazione finale sia 1x e far bollire per 10 minuti a 95 °C in un termociclatore. Caricare almeno 1 × 107 PFU del virus.
    5. Immergere la pagina SDS nel buffer in esecuzione (tabella supplementare S1) e caricare i campioni.
    6. Eseguire il gel a 120 V per 1-1,5 ore.
    7. Rimuovere il gel dal buffer in esecuzione e trasferirlo in un contenitore più piccolo.
    8. Aggiungere la soluzione colorante Coomassie (Tabella supplementare S1) per coprire il gel. Incubare a temperatura ambiente per 4-5 ore.
    9. Rimuovere la soluzione colorante e aggiungere la soluzione di destain (Tabella supplementare S1), incubando per 4-8 ore a temperatura ambiente con agitazione. Modificare la soluzione destain da tre a quattro volte.
      NOTA: Il gel deve essere chiaro e il suo colore deve essere come era prima della colorazione.
    10. Immagine del gel su un'impostazione colorimetrica. Vedere la Figura 5 per un'immagine rappresentativa di un gel SDS PAGE macchiato con Coomassie contenente campioni di liquido allantoico e virus purificato.
  3. Quantificazione del titolo virale infettivo mediante dose infettiva di coltura tissutale mediana (TCID50) e saggio di immunofluorescenza
    NOTA: le celle Vero possono essere utilizzate come alternativa alle celle DF1; tuttavia, l'effetto citopatico (CPE) è meno pronunciato nelle cellule Vero. NDV che ospita la mutazione L289A, che migliora la fusogenicità, ed esprime GFP tra i geni P e M viene utilizzato in questo test.
    1. Seminare una piastra a 96 pozzetti di cellule DF1 a 20.000 cellule/pozzetto in un volume di 80 μL il giorno prima di utilizzare DMEM integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) e 125 μg/mL di tripsina. Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2.
    2. Il giorno dopo, scongelare un'aliquota di virus di 20 μL sul ghiaccio.
    3. Utilizzare tubi da 1,5 ml per preparare diluizioni seriali. Iniziare diluendo 10 μL del virus con 990 μL di PBS per preparare una diluizione 10-2 . Preparare tutte le altre diluizioni, fino a 10-10 al minimo, realizzate con 900 μL di PBS e l'aggiunta di 100 μL della diluizione precedente.
      NOTA: utilizzare una nuova punta della pipetta quando ci si sposta tra le diluizioni.
    4. Utilizzare 20 μL di ogni diluizione per infettare ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti come mostrato nella Figura 6.
      NOTA: Il volume finale in ogni pozzo sarà di 100 μL.
    5. Incubare la piastra per almeno 48 ore a 37 °C e 5% di CO2, prima di esaminare la presenza di CPE/GFP o eseguire un test di immunofluorescenza indiretta (IFA).
      NOTA: In queste condizioni di coltura, la CPE è evidente dopo 10 ore (Figura 7A-D), aumentando nelle successive 24 ore (Figura 7E-H). La piastra può essere incubata più a lungo per migliorare l'intensità del CPE se segnata da GFP o CPE.
      1. Se si assegna un punteggio per CPE o GFP e NON si esegue IFA, andare al passaggio 3.3.18.1.
    6. Se si esegue IFA, sciacquare le cellule due volte con 100 μL di 1x PBS.
    7. Aggiungere 100 μL di paraformaldeide al 4% diluita in PBS a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
    8. Lavare le celle 3x 5 min ciascuna con 100 μL di 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
    9. Permeabilizzare le cellule con l'aggiunta di 100 μL di NP-40 allo 0,1% in PBS e incubarle a temperatura ambiente per 10 min.
    10. Lavare le celle 3x 5 min con 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
    11. Aggiungere 100 μL di tampone bloccante composto da siero di capra normale al 5% (V/V) diluito in PBS-T allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
    12. Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo ribonucleoproteico anti-NDV primario di topo diluito in PBS-T allo 0,1% a 1 μg/mL, incubando per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
    13. Lavare le celle 3x per 5 min in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
    14. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario anti-topo AlexaFluor 488 Goat diluito in PBS-T allo 0,1% a 2 μg/mL. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    15. Lavare le celle 3x per 5 min in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
    16. Dopo il lavaggio finale, lasciare le cellule in 100 μL di PBS-T allo 0,1%.
    17. Immagina i pozzetti usando un microscopio fluorescente invertito.
    18. Quando si esegue IFA, cercare una fluorescenza maggiore di quella osservata nei pozzetti di controllo negativi, indicando che il pozzo è positivo per NDV come mostrato nella Figura 8.
      1. Cerca la presenza di sincizia e grandi cellule arrotondate che caratterizzano NDV CPE. Se si segnano pozzi infettati da un virus che esprime GFP, cercare la presenza di GFP.
    19. Inserire le informazioni appropriate nel calcolatore del titolo Spearman-Karber26 per determinare la PFU/mL del virus (Tabella 2). Vedere la Figura 6 per un esempio di piastra dititolazione TCID 50.
  4. Quantificazione del titolo virale mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
    NOTA: si consiglia un kit qRT-PCR in un solo passaggio per risparmiare tempo e ridurre la manipolazione dei campioni. Un test basato su sonda viene utilizzato per aumentare la specificità di rilevamento per le sequenze di virus.
    1. Creare una curva standard di una quantità nota delle sequenze virali (Figura supplementare S2A,B).
      NOTA: Questo può essere fatto acquistando un frammento sintetico di DNA a doppio filamento da 500 bp del gene NDV L. La sequenza per un frammento di 500 bp del gene NDV L può essere vista nella Figura supplementare S2C.
    2. Convertire la quantità del frammento di DNA del virus (di solito fornito come nanogrammi o femtomoli dai produttori) nel numero di molecole o copie del frammento di DNA utilizzando il numero di Avogadro e la formula delle moli in molecole (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Preparare i campioni della curva standard preparando una serie di diluizione decuplicata di copie di frammenti di DNA di virus noti, a partire da 1,00 ×10 10 copie fino a 1,00 × 100 copie.
    4. Per determinare la quantità di NDV RNA in campioni sconosciuti, estrarre l'RNA NDV utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Seguire il protocollo fornito con il kit. Una volta estratto l'RNA, procedere con il protocollo raccomandato fornito nel kit qRT-PCR one-step.
    5. Eseguire le reazioni in uno strumento PCR in tempo reale con le seguenti condizioni di temperatura e ciclo: 1) un ciclo di trascrizione inversa a 55 °C per 10 min; 2) un ciclo di denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; e 3) 40 cicli di denaturazione (95 °C per 10 s), estensione (60 °C per 30 s) e acquisizione del segnale fluorescente.
    6. Una volta completato il test qRT-PCR, generare la curva standard basata sui campioni di curva standard utilizzando il software dello strumento PCR in tempo reale (Figura supplementare S2A,B).
      NOTA: Il software calcolerà anche la quantità di NDV RNA in campioni sconosciuti in base alla curva standard.
  5. Test di sicurezza per la tossicità acuta nei topi
    1. Iniettare 1 × 108 PFU del virus per via endovenosa attraverso la vena della coda in tre topi BALB/C di 8 settimane per valutare la tossicità acuta.
    2. Monitorare i topi per eventi avversi come perdita di peso (>20%), postura curva, cappotti arruffati, letargia e cambiamenti nella respirazione. Valutare da tre a quattro volte al giorno nelle prime 48 ore. Poiché i topi dovrebbero iniziare a riprendersi dopo 48 ore, monitorarli una o due volte al giorno fino a quando non si sono completamente ripresi.
      1. Somministrare cure saline per via sottocutanea e di supporto secondo necessità. Ad esempio, integrare con gel dietetico di recupero, burro di arachidi o utilizzare puck di calore. Eutanasia topi che hanno raggiunto criteri endpoint, come delineato dalle linee guida istituzionali per la cura degli animali, per sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale.

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Representative Results

Raccolta del fluido allantoico
Poiché il liquido allantoico viene raccolto da uova di gallina embrionate, dovrebbe apparire chiaro e trasparente. Se il fluido appare opaco e giallo, questo indica la presenza di contaminanti. L'inclusione di questo fluido allantoico durante la purificazione impedirà il processo di purificazione, poiché la pressione aumenterà rapidamente e supererà i 10 psi, con conseguente taglio del virus e perdita del virus infettivo. Il liquido allantoico che appare sanguinante suggerisce che le uova sono state inoculate con troppi PFU di virus. La resa di questo lotto di uova sarà significativamente inferiore al previsto ed è improbabile che questo virus possa essere utilizzato in vivo. Gli ovuli inoculati con NDV lentogeno dovrebbero avere ancora una vascolarizzazione evidente dopo 72 ore e gli embrioni non dovrebbero essere morti, come visualizzato nella Figura 1. Se lo hanno fatto, questo suggerisce che l'embrione è stato danneggiato o contaminato in qualche modo.

Ultracentrifugazione del gradiente di densità dello iodixanolo
Dopo l'ultracentrifugazione, una banda bianca contenente NDV ad alto titolo deve essere posizionata tra i gradienti del 10% e del 20% (Figura 4B).

Colorazione Coomassie di gel SDS-PAGE
La Figura 5 mostra la differenza tra uno stock di virus non purificato (Lane 2) e uno stock di virus purificato (Lane 3). Un confronto tra i due mostra una significativa diminuzione dell'intensità delle bande proteiche contaminanti e l'emergere di bande NDV dominanti nello stock di virus purificato.

Quantificazione del titolo virale mediante TCID50
Se si utilizzano le condizioni raccomandate quando si tiziona uno stock concentrato di NDV, il CPE dovrebbe essere evidente dopo 24 ore (Figura 6). Rispetto a un ceppo lentogeno NDV di titolo simile, il CPE è più pronunciato nel ceppo mesogenico nello stesso punto temporale.

Analisi di tossicità acuta in topi BALB/C di 8 settimane
Quando 1 × 108 PFU sono stati somministrati per via endovenosa, i topi devono essere monitorati per effetti avversi come perdita di peso >20%, pelo arruffato, postura curva e respirazione anormale. Entro le prime 24-36 ore, i topi inizieranno a perdere peso e probabilmente svilupperanno cappotti arruffati e una postura curva. Tuttavia, se il virus è sufficientemente puro, i topi iniziano a riprendersi, come osservato dall'aumento di peso e dal miglioramento della postura e delle condizioni del mantello dopo 36 ore. I topi che non mostrano questi segni di recupero entro 36 ore devono continuare a essere attentamente monitorati per i criteri endpoint. In genere, ciò è accaduto a causa di un tittering impreciso, potenzialmente dovuto all'aggregazione di particelle virali.

Figure 1
Figura 1: Infezione e raccolta di NDV da uova di gallina embrionate esenti da agenti patogeni specificati. (A) Vascolarizzazione simile a una rete (frecce) che dovrebbe essere evidente dopo 9 giorni di incubazione oltre al movimento dell'embrione. 'X' indica l'interfaccia tra la membrana corioallantoica e la cavità dell'aria, e dove il foro dovrebbe essere creato per l'inoculazione dell'uovo. (B) Immagine raffigurante un embrione morto. Si noti l'assenza di vascolarizzazione weblike. Si osserverà anche una mancanza di movimento dell'embrione. (C) Diagramma dei componenti di un uovo di gallina embrionato che mostra le posizioni della cavità dell'aria, del sacco vitellino, del sacco amniotico, della membrana corioallantoica e del liquido allantoico. (D) Rimozione del guscio per esporre la membrana coriallantoica. (E) Illustra come dovrebbero apparire il liquido allantoico e l'embrione dopo l'apertura della membrana corioallantoica. Abbreviazione: NDV = virus della malattia di Newcastle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Schema che delinea l'assemblaggio generale dell'apparecchio utilizzato per la filtrazione in profondità. Assicurarsi che il manometro sia installato a monte del filtro di profondità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Configurazione della filtrazione a flusso tangenziale nelle sue diverse configurazioni. Le frecce mostrano la direzione del flusso del fluido. (A) Illustrazione di come viene assemblata la cassetta TFF. (B) Schema del sistema TFF nella sua configurazione "aperta" utilizzata durante la purificazione e la concentrazione del fluido. (C) Schema della configurazione del TFF quando il fluido viene eluito dal sistema, come utilizzato durante l'eluizione del virus e della soluzione detergente. (D) Schema del sistema TFF nella sua configurazione "chiusa", che viene utilizzato durante la pulizia del sistema TFF. Abbreviazione: TFF = Filtrazione a flusso tangenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Ultracentrifugazione e dialisi del gradiente di densità del virus concentrato da TFF. (A) Schema che mostra la composizione del gradiente di densità dello iodixanolo. (B) Modello di bande virale a seguito di ultracentrifugazione del virus prodotto utilizzando il tampone ML durante il processo di purificazione. La banda principale contenente virus è indicata da un ovale nero. (C) Dimensioni tipiche di una cassetta di dialisi caricata con 10 mL di virus preparata attraverso un gradiente di iodixanolo al termine della procedura di dialisi. Abbreviazione: TFF = Filtrazione a flusso tangenziale; ML = Mannitolo-Lisina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Gel SDS-PAGE tinto con Coomassie. Gel confronta la presenza di proteine contaminanti tra scorte NDV mesogeniche non purificate (corsia 2) e purificate (corsia 3) quando sono stati caricati 1 × 105 PFU. Corsie 1 e 4 = scala a peso molecolare (MW). NDV HN, F0 e le sue subunità successive alla scissione, F1 e F2, insieme ai rispettivi pesi molecolari27 sono mostrati in carattere bianco. Abbreviazioni: SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; NDV = virus della malattia di Newcastle; PFU = unità formanti placche; HN = emoagglutinina; F0 = Fusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Esempio di un layout di piastra a 96 pozzetti utilizzato per determinare il titolo del virus da TCID50. La piastra è divisa in 12 colonne, con ogni colonna che rappresenta una diversa diluizione seriale. I pozzetti positivi (determinati da CPE, espressione transgenica o IFA) sono indicati in grigio. Dato il numero di pozzi positivi in questo esempio, il titolo previsto dopo aver utilizzato il calcolatore del titolo Spearman-Karber (Tabella 2) è elencato sia in TCID50/mL che in PFU/mL. Abbreviazioni: TCID50 = dose infettiva mediana di coltura tissutale; CPE = effetto citopatico; IFA = saggio di immunofluorescenza; PFU = unità formanti placche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Confronto del CPE a seguito di infezione di cellule DF1 con NDV lentogeno o mesogenico. Un MOI di 0,5 è stato utilizzato dopo 10 ore di incubazione (A-D) o 24 ore di incubazione (E-H) in diverse condizioni di coltura di DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% liquido allantoico, o DMEM + 2% FBS + 125 μg / mL di tripsina. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: CPE = effetto citopatico; NDV = virus della malattia di Newcastle; MOI = molteplicità di infezione; FBS = siero bovino fetale; DMEM = il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Un esempio di una situazione in cui l'IFA è necessario per titer un NDV lentogeno privo di un transgene GFP. Le cellule Vero sono state coltivate in DMEM contenente il 2% di FBS e 125 μg/mL di tripsina. Le immagini sono state prese dalla diluizione seriale 10-7 . (A) Immagine Brightfield di cellule infette. (B) Illustra l'aspetto tipico delle cellule colorate quando l'IFA viene utilizzato per rilevare il virus. (C) Un'immagine unita di (A) e (B). Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: IFA = saggio di immunofluorescenza; NDV = virus della malattia di Newcastle; GFP = proteina fluorescente verde; FBS = siero bovino fetale; DMEM = il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Primer PCR e RT-qPCR per il rilevamento di segmenti genici del virus della malattia di Newcastle. Set di primer utilizzati per l'amplificazione specifica di due regioni del genoma NDV. Il set di primer della proteina F provoca l'amplificazione di una regione della proteina F che si estende sul sito di scissione della proteina F. Il set di primer transgenici amplifica la regione intergenica tra i geni della fosfoproteina e della matrice, il sito di inserimento transgenico ottimale. Questa tabella contiene anche le sequenze di primer che prendono di mira il gene virale L21 e la sonda del gene L utilizzata nel test qRT-PCR. Abbreviazioni: PCR = reazione a catena della polimerasi; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; NDV = virus della malattia di Newcastle. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Calcolatrice del titolo Spearmann-Karber. Questo foglio di calcolo interattivo contiene il flusso di lavoro e le equazioni appropriate per determinare la concentrazione del virus utilizzando i risultati TCID50 basati sull'inoculo del pozzo in ml, sullo schema di diluizione e sul numero di repliche per diluizione. La concentrazione è riportata come volume in ml necessari per infettare il 50% della coltura tissutale (TCID50) e unità di formazione della placca per mL di sospensione virale. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Determinazione delle concentrazioni di iodixanolo. (A) Curva standard generata dall'assorbanza di soluzioni di concentrazione nota di iodixanolo a 340 nm. (B) La curva standard e l'equazione di (A) sono state utilizzate per determinare la concentrazione di iodixanolo in soluzione dopo ultracentrifugazione del gradiente di densità, dialisi e concentrazione di polietilenglicole. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Amplificazione e curva standard generata dal saggio qRT-PCR di frammento sintetico di DNA a doppio filamento da 500 bp del gene NDV L. L'amplificazione (A) e la curva standard (B) sono state create da campioni contenenti una diluizione seriale decuplicata (1,0 × 109 copie a 1,0 × 100 copie) del frammento di DNA. Per l'amplificazione e la curva standard, i campioni contenenti 1,0 × 101 copie e 1,0 × 100 copie erano al di sotto della soglia e non producevano un valore del punto di incrocio inferiore a 35 Cp. La curva standard finale è stata generata sulla base di campioni contenenti 1,0 × 109 copie a 1,0 × 102 copie del frammento di DNA. (C) Sequenza del DNA del frammento del gene 500 nucleotide NDV L utilizzato per generare la curva standard nel protocollo qRT-PCR. Abbreviazioni: PCR = reazione a catena della polimerasi; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; NDV = virus della malattia di Newcastle; Cp = punto di attraversamento. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Caricamento ed estrazione di NDV dalla cassetta di dialisi. (A) La dimensione tipica di una cassetta per dialisi dopo essere stata caricata con circa 10 ml di soluzione contenente virus isolata da un gradiente di densità di saccarosio e ripresa alla fine della fase di dialisi. (B) Un esempio dei risultati ottenuti utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità di iodixanolo senza integrazione del tampone ML. Encircled è la banda del virus di destinazione per la rimozione. Indicato dalle frecce è una banda aggiuntiva che può contenere virioni danneggiati. Si noti che dopo l'incorporazione del buffer ML nel processo di purificazione, questa banda non è più evidente. Abbreviazioni: NDV = virus della malattia di Newcastle; ML = mannitolo-lisina. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: fornisce i passaggi necessari per generare soluzioni western blot e buffer ML utilizzati durante il processo di purificazione. Abbreviazioni: SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; TEMED = tetrametiletilendiammina; ML = Mannitolo-lisina. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

I virus utilizzati come agenti terapeutici negli studi preclinici devono essere altamente purificati per evitare tossicità quando somministrati in vivo15. Se agenti avventizi o contaminanti non vengono rimossi, ciò può portare a gravi reazioni avverse che negano l'effetto terapeutico dell'agente virale28. Poiché l'NDV è prodotto in uova di gallina embrionate, ci sono diverse proteine dell'uovo contaminanti, come l'ovalbumina, che devono essere rimosse prima del suo uso in vivo in modelli preclinici o clinici29. Anche dopo un'intensa purificazione, l'ovalbumina si trova ancora29. La rimozione di queste proteine contaminanti è un processo rigoroso che richiede tempo e risorse significativi15,22. Se l'NDV potesse essere prodotto in un sistema basato su cellule a titoli sufficientemente elevati richiesti per applicazioni in vivo, ciò potrebbe semplificare il processo di purificazione e migliorare la traduzione di NDV in contesti clinici. Tuttavia, la produzione a base di uova di NDV oncolitico è stata utilizzata in numerosi studi clinici sull'uomo30.

In ogni fase del processo di purificazione, i campioni possono essere striati su piastre di agar di sangue come ulteriore misura di controllo della qualità per garantire l'assenza di contaminazione batterica.

La pressione durante la filtrazione in profondità non dovrebbe accumularsi rapidamente. Questo è un segno di contaminazione proteica e rallenterà significativamente il processo di purificazione e richiederà l'uso di filtri di profondità aggiuntivi. La filtrazione di profondità non deve essere completata rapidamente; questo passaggio richiede in genere 1-1,5 ore. Di solito, il rapido completamento della fase di filtrazione di profondità si traduce in un titolo virale inferiore.

Mentre il virus è concentrato, un "flusso nuvoloso" dovrebbe emergere nel serbatoio dalla linea di retentato. Ciò suggerisce che c'è un virus nel liquido allantoico che viene concentrato mentre passa attraverso la cassetta.

Sia durante la filtrazione di profondità che durante le fasi di filtrazione a flusso tangenziale, la pressione non deve mai superare i 10 psi. Superare questa pressione taglierà il virus. L'aggiunta di tampone ML al liquido allantoico agisce come agente stabilizzante ed è ipotizzata per prevenire l'aggregazione virale, con conseguente aumento del recupero del virus infettivo senza compromettere la filtrabilità.

Il metodo di cui sopra delinea una procedura adatta per produrre ceppi sia lentogeni che mesogenici di NDV in condizioni BSL-2, poiché l'NDV mesogenico non è un agente selezionato in Canada. Ciò si traduce nella generazione di stock ad alto titolo adatti all'uso in modelli animali. Analogamente ad altri protocolli in letteratura che utilizzano metodi di purificazione ad esclusione dimensionale, come la filtrazione in profondità e il TFF, questi metodi limitano l'uso di tecniche di ultracentrifugazione più dure in cui il recupero del virus è ridotto rispetto ai metodi di purificazione ad esclusione di dimensioni15.

L'uso di TFF fornisce un elemento di scalabilità in quanto TFF può essere utilizzato per concentrare grandi volumi di partenza, in contrasto con le tecniche di ultracentrifugazione. Le tecniche di purificazione NDV esistenti sono migliorate nel protocollo di cui sopra attraverso la sostituzione del saccarosio con lo iodixanolo nella fase di ultracentrifugazione, che riduce notevolmente la possibilità di perdere il virus a causa della rottura della cassetta alla fine della fase di dialisi e l'aggiunta di tampone ML, che migliora la filtrazione e aumenta la resa.

L'uso di gradienti di iodixanolo è preferito rispetto ai gradienti di saccarosio in quanto lo iodixanolo è meno viscoso e non tossico per le cellule e fornisce un prodotto finale "più pulito"31,32. Lo iodixanolo ha ridotto significativamente i livelli di citochine proinfiammatorie e chemochine presenti dopo l'ultracentrifugazione del gradiente di densità del virus purificato33. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che lo iodixanolo è stato utilizzato nella purificazione di NDV. La concentrazione di iodixanolo in una soluzione può essere determinata quantificando l'assorbanza a 340 nm con riferimento ad una curva standard. Questa caratteristica è stata utilizzata per determinare che le bande NDV a circa il 15% di iodixanolo e per confermare che può essere rimosso mediante dialisi (Figura supplementare S1B). Lo iodixanolo è stato inizialmente sviluppato come agente di imaging a contrasto e non abbiamo osservato eventi avversi quando una soluzione di iodixanolo al 15% è stata somministrata per via endovenosa e intranasale a topi C57BL/6. Ciò suggerisce che la dialisi per rimuovere lo iodixanolo potrebbe non essere necessaria, accorciando il processo di purificazione di circa 16 ore. Inoltre, il saccarosio è igroscopico, causando un rigonfiamento significativo della cassetta per dialisi, limitando il volume che può essere iniettato e aumentando il rischio di rottura della cassetta e perdita del virus34,35. Quando volumi uguali di virus preparato con iodixanolo e saccarosio sono stati iniettati nelle cassette di dialisi, si è verificato un gonfiore significativamente inferiore nel virus preparato con iodixanolo (confrontare figura 4C e figura supplementare S3A). Tuttavia, il saccarosio è un agente di stabilizzazione più adatto per NDV rispetto allo iodixanolo. Ciò ha portato all'integrazione del gradiente di iodixanolo con il tampone ML. Prima dell'aggiunta del tampone ML al processo di purificazione, c'era una banda più intensa nel gradiente di iodixanolo del 10% osservato oltre alla banda target al 15% (Figura supplementare S3B). Questa fascia probabilmente contiene virioni danneggiati o incompleti generati durante il processo di purificazione. L'aggiunta del tampone ML consente una migliore filtrazione dell'NDV riducendo al minimo la natura igroscopica del mezzo del gradiente di densità, riducendo il rischio di rottura della cassetta di dialisi. Il gonfiore della cassetta di dialisi può essere ulteriormente ridotto dializzando in 1x PBS integrato con saccarosio al 5%, poiché alla fine questo è ciò in cui verrà immagazzinato il virus.

Poiché l'NDV è un senso negativo, il virus a RNA a singolo filamento, isolando l'RNA e generando cDNA utilizzando primer casuali e set di primer specifici per la PCR consente il sequenziamento di varie regioni del genoma da una reazione di cDNA (Tabella 1). Ciò è importante in quanto consente di confermare il patotipo e l'integrità del transgene e dei suoi elementi regolatori trascrizionali. Il sito di scissione della proteina lentogena NDV F dovrebbe essere monobasico piuttosto che polibasico, poiché i siti di scissione polibasica che possiedono NDV sono tipicamente patotipi mesogenici o velogenici e classificati come agenti selezionati36,37. Questo protocollo descrive anche un metodo RT-qPCR affidabile per la quantificazione ad alto rendimento dei genomi NDV. Prima del suo utilizzo in modelli animali e dopo il completamento degli altri test di controllo qualità, la tossicità acuta deve essere valutata in topi BALB/C di 8 settimane. Questo ceppo è caratterizzato come più sensibile alle tossicità indotte dal virus rispetto ad altri ceppi di topi15. Inoltre, questo darà qualche indicazione sull'accuratezza del titolo del virus. Ad esempio, si osserverà la perdita di peso, ma il peso dovrebbe iniziare ad aumentare dopo 36-48 ore. Se questo non è il caso, allora è possibile che il titolo del virus sia superiore a quello inizialmente riportato, il che potrebbe essere dovuto all'aggregazione di particelle virali. Questo risultato iniziale a seguito della purificazione di un NDV ricombinante ha portato all'incorporazione del tampone ML durante tutto il processo di purificazione. Questo tampone è stato suggerito per migliorare la filtrabilità e il recupero del virus durante i processi di purificazione38.

Quando si quantifica la concentrazione di virus infettivo da parte di TCID50, l'uso di IFA può essere necessario per visualizzare l'infezione da NDV, specialmente a diluizioni più elevate quando CPE potrebbe non essere evidente o se il virus non esprime un gene reporter fluorescente (Figura 8). L'anticorpo primario utilizzato per l'IFA è specifico per la ribonucleoproteina di NDV, un complesso proteico che si associa al genoma dell'RNA durante la replicazione del genoma. Poiché NDV è un virus aviario, la linea cellulare di fibroblasti embrionali di pollo, DF1, è una linea cellulare ottimale per la valutazione del titolo del virus. Tipicamente, il liquido allantoico virus-negativo viene utilizzato come mezzo per fornire le proteasi simili alla tripsina richieste dagli NDV lentogeni per la scissione della proteina F39. L'uso di liquido allantoico virus-negativo può essere evitato integrando con 125 μg / mL di tripsina riducendo la concentrazione di FBS al 2%. Ciò fornisce un'alternativa semplice ed economica al liquido allantoico negativo al virus, pur fornendo le proteasi simili alla tripsina richieste. Quando si confrontano queste due condizioni di coltura a un MOI di 0,5 in un arco di tempo di 24 ore, sembra esserci poca differenza tra le due, con il mezzo integrato con tripsina potenzialmente con conseguente aumento del CPE (Figura 7). Altre linee cellulari come le cellule Vero possono essere utilizzate con le stesse condizioni di coltura; tuttavia, il CPE è meno pronunciato. Utilizzando il protocollo di cui sopra con celle DF1, NDV CPE dovrebbe essere evidente entro 24 ore. In particolare, si dovrebbe vedere la formazione di sincizia entro 24 ore (Figura 7E-H). Utilizzando la procedura di purificazione descritta, abbiamo costantemente purificato NDV a titoli che vanno da 1 × 109-3 × 1010 PFU / mL da un volume iniziale di 0,8-1,0 L di liquido allantoico.

Nel complesso, il protocollo descritto migliora le procedure di purificazione NDV precedentemente pubblicate utilizzando lo iodixanolo come mezzo gradiente di densità invece del saccarosio e con l'aggiunta di un tampone ML per migliorare la filtrazione. Inoltre, descriviamo un metodo complementare per il titering NDV, includiamo un metodo RT-qPCR dettagliato per determinare il numero di copie NDV e definiamo le condizioni ottimali per l'uso della tripsina al posto del liquido allantoico durante la titolazione del virus. Sebbene questo processo generi scorte NDV ad alto titolo che possono essere somministrate sistemicamente a dosi elevate, questa procedura comporta più passaggi, che possono aumentare la variabilità tra gli utenti e introdurre il potenziale di contaminazione. Un'ulteriore limitazione è il requisito che il materiale di partenza sia di alta qualità. È fondamentale che il fluido allantoico sia privo di tuorlo contaminante in quanto ciò riduce notevolmente l'efficienza delle fasi di filtrazione e di esclusione delle dimensioni. Nel complesso, questo processo richiede molto tempo, ma può essere abbreviato omettendo la fase di dialisi. Questa procedura si traduce in una maggiore resa di virus di grado in vivo rispetto ad altri metodi di purificazione15,18. La capacità di produrre NDV di qualità superiore e più concentrato estende le sue capacità di essere utilizzato come agente oncolitico o vettore di vaccino in modelli animali di malattia sia in ambito preclinico che clinico.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

J.G.E.Y è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dell'Ontario Veterinary College e di una borsa di studio per laureati dell'Ontario. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

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Ricerca sul cancro numero 183
Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico
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