用于缺血再灌注研究的左前降冠状动脉结扎术：通过技术修改和质量控制改进模型

Summary

在本文中，我们提出了一个专注于左前降冠状动脉结扎术的协议，通过技术上修改大鼠的传统程序进行急性心肌缺血再灌注研究。

Abstract

冠心病是全球死亡的主要原因。冠状动脉血流完全停止会导致 ST 段抬高型心肌梗死 （STEMI），导致心源性休克和致死性心律失常，这与高死亡率有关。用于冠状动脉再通的初级冠状动脉介入治疗（PCI）可显著改善STEMI的结局，但在缩短门到球囊时间方面取得的进展未能降低院内死亡率，这表明需要额外的治疗策略。大鼠左前降冠状动脉（LAD）结扎术是急性心肌IR研究的动物模型，与通过PCI进行快速冠状动脉再通治疗STEMI的临床情况相当;然而，PCI 诱导的 STEMI 是一项技术上具有挑战性且复杂的手术，与高死亡率和梗死大小的巨大差异有关。我们确定了LAD结扎的理想位置，创建了一个控制圈套的小工具，并支持修改的手术操作，从而减少组织损伤，为大鼠建立可靠且可重复的急性心肌缺血再灌注（IR）研究方案。这是一种非生存性手术。我们还提出了一种验证研究结果质量的方法，这是确定后续生化分析准确性的关键步骤。

Introduction

缺血性心脏病是全球死亡的主要原因^1，2。除了控制预防冠心病发展的可改变的危险因素外，急性冠脉综合征3^，4也迫切需要治疗策略。已发现急性 ST 段抬高型心肌梗死 （STEMI） 的心源性休克和致死性心律失常会增加院内死亡的可能性⁵，⁶，^7，8。原发性经皮冠状动脉介入治疗 （PCI） 是 STEMI⁹，^10，11 的首选治疗方法;然而，当门到气球时间为<90分钟^12，13时，治疗效果有一个上限。需要额外的策略来进一步改善疾病的临床结果14，^15，16，¹⁷，^18，19。

涉及大鼠左前降动脉 （LAD） 结扎术的急性心肌缺血再灌注 （IR） 实验是与临床场景相当的动物模型之一，其中 STEMI 患者需要较短的门到球囊时间才能从缺血性损伤中拯救心脏。然而，手术诱导的小动物STEMI在技术上通常具有挑战性，因为它是一项复杂的手术，与高死亡率和梗死大小的高变化有关^20，21，²²，^23，24。为了克服技术挑战，本研究开发了一种全面有效的大鼠动物模型（因为它们比小鼠大），通过技术修改建立了可靠且可重复的急性心肌IR研究方案。拟议的方案导致更少的手术并发症，更少的组织损伤，以及手术期间死亡的可能性。此外，还使用一种程序来测量梗死的大小和风险区域（AAR），从而验证研究结果的质量。所提出的方案可用于研究急性心肌IR应激的病理生理过程，以开发针对损害的新治疗策略。

Protocol

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物编号85-23，1996年修订）进行。该研究方案已获得天主教辅仁大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合其指导方针。

1. 术前准备

1. 盐水湿棉球的制备
   1. 戴上外科口罩和手套。
   2. 捏下一小块无菌棉花，将其卷成球状。重复此过程。
   3. 将棉球浸入无菌的0.9%盐水中，挤出多余的盐水。
   4. 将棉球储存在用75%乙醇消毒的干净盒子中。
2. 准备固定钩。
   1. 戴上外科口罩和手套。
   2. 用75%乙醇对夹子和橡皮筋进行消毒。
   3. 将夹子弯曲成钩子的形状，用于胸壁和组织。
   4. 用一根、两根或三根橡皮筋连接弯曲的夹子，以确保手术窗口伤口的张力足够宽，可以结扎LAD。
   5. 准备并将至少五个自制钩子储存在用 75% 乙醇消毒的干净盒子中。
3. 准备连接环。
   1. 将 7-0 丝线的中间放在锥形非锻造手术针的 1/2 圆圈大小 3 弹簧眼中。
4. 军鼓回路控制器的准备
   1. 用剪刀剪下 5 毫米聚乙烯 （PE）-10 管。
   2. 在火焰下加热和软化管子，使其两个边缘光滑。
5. 准备大鼠
   1. 选择8周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠，最小重量为250g。
   2. 在受控温度（21°C ± 2°C）下在12小时光照/黑暗循环下容纳和维持大鼠，并自由获取食物，标准小鼠颗粒和自来水。
   3. 用戊巴比妥（50mg / kg，腹膜内给药）麻醉大鼠。
      注意：每小时应给予额外的麻醉剂（戊巴比妥，30mg / kg）。
   4. 通过捏住尾巴和后脚来检查大鼠的反应，以确保动物充分麻醉。
   5. 使用剪刀打开声门下方两个墨盒环之间的组织，并插入3厘米PE-10管作为气管^插管25。
   6. 手动将气管插管连接到呼吸机。
   7. 检查动物的胸部运动与呼吸周期同步，以确保肺部充分通气。
   8. 打开颈部区域并插管颈静脉²⁶.

2. LAD 结扎术

1. 戴上外科口罩和手套。
2. 触摸胸部并找到手骨和胸骨角（手骨和胸骨体的交界处）。
3. 通过手动触摸识别与胸骨角连接的左侧肋骨（肋骨 A）。
4. 使用细尖镊子轻轻抬起靠近肋间隙的皮肤，然后使用带刀片的手术刀沿着皮肤张力线从胸骨体左侧约 5 mm 处创建 1 cm 的斜切口。
5. 使用弯曲的镊子轻轻地将皮肤和肌肉层与切口分开。用弯曲的夹子向下钩住左前胸壁外的肌肉层，露出下面的肋骨。
6. 识别肋骨 A 下方的肋骨（肋骨 B）。用钝剪刀从肋软骨中间（距胸骨体约2-3毫米）切开肋骨B。如果出血，用盐水湿棉球轻轻触摸并按压伤口几秒钟。
7. 用四个弯曲的夹子小心地从肋骨 B 的切口打开胸部。每个弯曲的夹子应钩住肋间肌肉和肋骨，以在四个方向（即先上后左、上后右、左下和右下）轻轻地张开胸壁，并形成一个矩形手术窗口。
8. 用另一个弯曲的夹子轻轻钩住左肺和覆盖心包的其他邻近组织，以防止在手术过程中意外损坏组织。
9. 用镊子轻轻取出薄心包，暴露心脏。确定左冠状动脉主动脉 （LMCA） 的第一分支，通常位于肺动脉和左耳之间。LMCA 和 LAD 表现为从左耳廓边缘向顶点延伸的浅表亮红色线。
10. 使用准备好的手术针在LAD下方插入并穿过LAD下方的LAD下，从LAD的左侧向右侧方向靠近LMCA第一分支，以避免意外刺穿左耳廓。通过单缝合，形成开环。如果LAD由于液体或血液覆盖心脏表面而不可见，请轻轻擦拭心脏表面以观察冠状动脉。
11. 握住缝合线的一侧，并使用持针器轻轻地将针头与缝合线分开。
12. 将开环一侧的丝线两端插入另一侧的圆圈中，形成圈套。
13. 在闭环之前，将圈套的丝线的两端插入准备好的圈套控制器中。
14. 沿着真丝缝合线滑动圈套控制器，同时轻轻拉伸真丝以关闭圈套环。停止LAD的冠状动脉流动以诱导暂时性心肌缺血1小时。
15. 一旦环被牢固绑住，握住真丝以用凯利镊子固定圈套控制器的位置。在LAD结扎期间，将凯利镊子的另一端放在手术台上。
16. 在LAD结扎期间用盐水湿棉球覆盖手术窗口。
17. 打开凯利镊子。
18. 释放圈套环控制器以再灌注冠状动脉血流2小时。
19. 沿着基部和血管边界仔细切除心脏，避免抓住组织。
    注意：用CO₂以40%笼体积/分钟的流速对大鼠实施安乐死。

Representative Results

在心肌缺血和再灌注结束时，应在进一步生化或分子分析之前评估LAD结扎的质量。

通过中心静脉导管注射 1 mL 2% Evan 蓝色染料来确定通过结扎 LAD 阻塞的充分性。然后，与未灌注区域相比，冠状动脉灌注的心肌被染成蓝色，该区域保持红色（图1A）。红色区域是心肌梗死的AAR。

通过量化研究动物中AAR百分比的变化，进一步评估LAD连接位置的准确性。水平切片心脏后，通过将AAR除以整个心肌质量来确定AAR百分比（图1B）。研究动物中AAR百分比的低变化表明LAD连接的准确位置。

心肌梗死大小是急性心肌 IR 研究的主要结果。为了量化该参数，将切片的心脏切片在37°C的生理盐水中的1%2，3，5-三苯基氯化四唑（TTC）中孵育30分钟，然后在10%甲醛中孵育3天。梗死区是白色的。梗死大小百分比计算为梗死面积与AAR的比率（图2）。

图 1：用埃文蓝验证 LAD 结扎质量。 （A）心肌梗死的AAR是非灌注的心肌肿块，即使在注射埃文蓝后仍保持红色，从而确认了安全的LAD结扎。（B）通过将AAR（红色区域）除以整个心肌质量（红色和蓝色区域）来计算AAR百分比;研究动物中AAR百分比的低变化表明LAD连接的准确位置。与未治疗组相比，药物治疗组的梗死量较小。AAR，危险地区;LAD，左前降支。请点击此处查看此图的大图。

图2：TTC治疗中心肌梗死大小的量化。 梗死大小估计为LAD结扎组梗死区域（白色区域）与AAR（红色区域）的比率。AAR，危险地区;TTC，三苯基氯化四唑。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

所提出的方案有几个显着的特点，例如识别LAD结扎的确切位置，创建一个小工具来控制单缝合中的圈套环，并支持改进的手术操作以减少组织损伤，从而使研究人员能够准确，安全和一致地连接LAD，以及立即控制圈套的状态以进行急性心肌IR研究。

LAD结扎的位置会影响心肌梗死的面积和大小。通常建议在近端^{LAD 27，28} 的一定距离处进行结扎。忽视冠状动脉分支模式的差异可能会增加心肌梗死的变异性^23，24。在这项研究中，LAD立即结扎在LMCA的第一分支远端，从而防止左回旋动脉或间隔动脉的意外结扎，并导致一致的梗死大小和降低致命性心律失常的可能性²⁹，^30，31。

安全的 LAD 结扎对于 LAD 闭塞至关重要。专家建议，LAD应结扎成一到三个结，或用一小块管子压迫冠状动脉³²，^33，34，^35，36。在本文中，我们建议使用一种带有圈套的可控小工具，将LAD缝合在单缝合线中;这种方法可实现安全的LAD结扎和环闭合和释放的即时控制，同时防止组织撕裂，出血和重复心肌穿刺，动脉结扎和结扎松解期间缝合线强度断裂。因此，该方法可用于急性心肌IR研究中的实验和验证程序。

在手术过程中识别解剖学特征和组织学特性有助于减少组织损伤和改善研究复制。关于胸廓的开口，学者们建议用剪刀、牵开器、镊子、钝镊或缝线将胸肌和胸肌和肋骨拉开³²，33^，35，³⁷，^38，将胸肌和第三或第四肋间肌分开。本研究表明，沿着皮肤张力线（皮肤的结缔组织框架）切开切口³⁹，^40，切割含有无血管柔性结缔组织⁴¹的单根肋骨的软骨，并钩住胸肌和肋骨以打开胸壁。这种方法有助于保持组织完整性并降低出血风险。此外，通过触摸识别可靠的表面制造商来开始该方法意味着使用皮肤切口的外科手术具有高度可重复性和一致性。

确认LAD结扎诱发的心肌梗死的质量是急性心肌IR研究中病理生理变化调查之前的关键步骤。在文献中，LAD结扎后心肌梗死的发生是通过观察心肌突然的区域苍白来证实的^28，33;从基线³³ 抬高心电图的急性 ST 段;血清心肌酶水平升高，例如 CK-MB、肌钙蛋白 I 和肌钙蛋白 T^28，32，42;或梗死区域宏观⁴².LAD连接的一致性应通过使用酞或埃文蓝染料32，³⁵，^37，38确定梗死的AAR来进一步验证。样本中AAR百分比的低变异性证明了急性心肌IR研究程序的一致性和质量。此外，梗死区域可以通过用TTC^28，36划分心肌梗死区域来与AAR区分开来。埃文斯蓝/TTC双染色以前用于评估离体心肌IR研究的质量³⁷。与离体评估要求在Langendorff装置下灌注分离的心脏相比，本研究支持获得结果的体内评估动物方案，并且研究质量立即直接得到验证。

更重要的是，使用埃文蓝和TTC将梗死区域定义为AAR，排除了梗死心肌进行生化分析，这是在急性心肌IR研究中排除混杂因素并获得准确结果的要求。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator