Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Медикаментозное лечение центральным венозным катетером в мышиной модели аневризмы брюшной аорты, индуцированной ангиотензином II, и мониторинг с помощью 3D-ультразвука

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64124
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 4, 5, 1, 1, 1
1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, Medical University of Vienna and Vienna General Hospital, 2Leeds Institute for Cardiovascular and Metabolic Medicine, School of Medicine, University of Leeds, 3Leeds Vascular Institute, Leeds General Infirmary, 4Department for Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Technical University of Dresden and University Hospital Carl-Gustav Carus, 5Division of Cardiovascular and Interventional Radiology, Division of Molecular and Gender Imaging, Department of Biomedical Imaging and Image Guided Therapy, Medical University of Vienna and Vienna General Hospital

Summary

Этот протокол описывает последовательную имплантацию осмотического насоса для индуцирования аневризмы брюшной аорты путем высвобождения ангиотензина II у мышей с дефицитом аполипопротеина E (ApoE) и сосудистого порта доступа с катетером яремной вены для повторного медикаментозного лечения. Мониторинг развития аневризмы с помощью 3D УЗИ эффективно проводится несмотря на дорсальные имплантаты.

Abstract

Поскольку в клиническом лечении аневризмы брюшной аорты (ААА) отсутствуют варианты фармацевтического лечения, животные модели, в частности мышиные модели, применяются для углубления понимания патогенеза заболевания и выявления потенциальных терапевтических целей. Тестирование новых лекарств-кандидатов для блокирования роста ААА в этих моделях обычно требует повторного введения препарата в течение времени эксперимента. Здесь мы описываем скомпилированный протокол для индукции ААА, введения внутривенного катетера для облегчения длительной терапии и последовательного мониторинга ААА с помощью 3D-ультразвука. Аневризмы индуцируются у мышей с дефицитом аполипопротеина Е (АпоЭ) высвобождением ангиотензина II в течение 28 дней из осмотических мини-насосов, имплантированных подкожно в спину мыши. Впоследствии проводится хирургическая процедура катетеризации наружной яремной вены, чтобы обеспечить ежедневное внутривенное медикаментозное лечение или повторный забор крови с помощью кнопки доступа к подкожно-сосудистой системе. Несмотря на два спинных имплантата, мониторинг развития ААА легко облегчается последовательным полуавтоматизированным 3D-ультразвуковым анализом, который дает исчерпывающую информацию о расширении диаметра и объема аорты и о морфологии аневризмы, что иллюстрируется экспериментальными примерами.

Introduction

Аневризма брюшной аорты (ААА) – это патологическое расширение сосуда вследствие воспалительных и тканеразрушающих процессов в стенке аорты, которые в конечном итоге могут привести к разрыву и смерти пациента. Несмотря на значительные достижения в хирургическом восстановлении ААА, консервативное медикаментозное лечение, блокирующее прогрессирование расширения аневризмы и потенциально снижающее риск разрыва, на сегодняшний день отсутствует. Животные модели были разработаны для выяснения триггеров и медиаторов заболевания и тестирования новых подходов к терапии. Мышиные модели ААА широко применяются и охватывают различные наблюдения за тканями человека. Из-за их патомеханистических различий часто применяется более одной модели для исследования конкретной функции молекул / путей или эффективности потенциальных терапевтических препаратов 1,2. Среди наиболее часто используемых моделей индукции ААА - введение ангиотензина-II (Ang-II) у мышей с дефицитом аполипопротеина Е (ApoE KO)3, которое имеет более хронический патогенез по сравнению с моделями, которые полагаются на формирование аневризмы от острого инсульта до стенки аорты 4,5. Таким образом, модель Ang-II, по-видимому, особенно подходит для мониторинга прогрессирования заболевания и недавно было показано, что она очень похожа на болезнь ААА человека в отношении метаболических и воспалительных реакций6. Примечательно, что модель Ang-II характеризуется не только развитием ААА, но и формированием аневризмы грудной клетки, а также расслоением аорты с образованием интрамурального тромба.

Лечение, направленное на нацеливание на прогрессирование уже установленной ААА, а не на предотвращение начала заболевания, может иметь более высокую трансляционную ценность, поскольку у пациентов присутствует уже существующее состояние, требующее лечения 7,8. Для сопоставимого экспериментального проектирования размер аорты необходимо контролировать до и после индукции ААА, чтобы определить порог развития заболевания и потенциально стратифицировать мышей в группы лечения.

Способ введения препарата зависит от поглощения и стабильности соответствующего вещества. Внутрибрюшинные (т..) инъекции чаще всего используются из-за их простоты применения, не требующей анестетика, и отсутствия ограничений объема инъекций9. Фармакокинетика должна учитываться, однако, при выборе пути введения, поскольку вещества, вводимые в/,, в первую очередь всасываются через печеночный портальный кровоток и могут подвергаться метаболизму печени до достижения циркуляции, что может привести к изменению концентраций в плазме в зависимости от эффекта первого прохода10. Внутривенная (т.в.ч.) инъекция дает самую высокую биодоступность веществ, а проблему повторяющегося внутривенного доступа можно обойти с помощью катетеров и сосудистых портов доступа для ежедневного введения 11,12,13. Что касается установки ААА, распределение лекарственного средства в циркуляции облегчает прямое воздействие аневризмы в определенных концентрациях.

Здесь мы описываем рабочий процесс для индуцирования ААА в мышиной модели Ang-II через подкожную имплантацию осмотического насоса, для ежедневного внутривенного медикаментозного лечения через сосудистый порт доступа, подключенный к катетеру, вставленному во внешнюю яремную вену, а также для мониторинга размера аневризмы с помощью 3D-ультразвука14 , несмотря на наличие двух дорсальных имплантатов.

Protocol

Эксперименты на животных были одобрены местным комитетом по этике и Министерством науки Австрии (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях, и Австрийским законом об экспериментах на животных 2012 года. Гуманные конечные точки были установлены следующим образом: потеря ≥15% массы тела, избегание потребления пищи и / или воды, снижение активности (гипокинезия) или дискинезия или длительное встряхивание, расчесывание, затрудненное дыхание или сгорбленная осанка, несмотря на боль / управление симптомами. При необходимости животное усыпляют под глубоким наркозом, т.е. при передозировке коктейля кетамина (около 100 мг/кг) и ксилазина (около 5 мг/кг), или при вывихе шейки матки. Для хирургических процедур повсеместно используется асептическая техника и стерильные / чистые перчатки.

1. Имплантация насоса

  1. Анестезия
    1. Держите мышей с дефицитом ApoE (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) на нормальной диете и предпочтительно включать 12-14-недельных самцов животных в эксперименты, чтобы представить мужское преобладание в заболевании человека3.
    2. За 1 день до операции (d-1, pre-OP) подготовьте и наполните осмотические насосы желаемой концентрацией ангиотензина II в соответствии с массой мыши в соответствии с протоколом производителя и инкубируйте насосы в физиологическом растворе при 37 °C в течение15 дней.
      Пример: Для мыши весом 25 г, использующей осмотические насосы (см. Таблицу материалов) со скоростью подачи 1000 нг/кг/мин и скоростью насоса 0,25 мкл/ч в течение 28 дней, растворяют 1,8 мг Ang-II в 300 мкл физиологического раствора (концентрация 6000 нг/мкл для доставки 1500 нг/ч Ang-II). Загрузите раствор тупой заполняющей иглой в насос, а затем вставьте замедлитель потока, чтобы закрыть насос.
    3. Поместите мышь в анестезиологическую камеру на 3%-4% изофлурана, смешанного с 2 л/мин O2 до потери сознания. Переместите мышь к нагретому столу (37 °C) в положении лежа и поддерживайте изофлурановую анестезию на уровне 1,8%-2% через носовой конус.
    4. Нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
    5. Вводят мышам 2,5% бупренорфина в физиологическом растворе при 10 мкл/г мыши подкожно и проверяют глубину анестезии щепоткой пальца ноги.
    6. Побрейте небольшую область в верхней левой части мыши обратно через лопатку. Применяют 10% (мас./об.) раствор повидона-йода для дезинфекции бритого участка.
  2. Установка насоса (5-7 мин, выполняется без микроскопа)
    1. Проверьте, что мышь полностью обезболена щипком пальца ноги и сделайте поперечный разрез 1 см в коже верхней части спины скальпелем между средней и левой лопаточной линией.
    2. Держите кожу щипцами и используйте тупые, изогнутые ножницы, чтобы сделать подкожный карман, подталкивая к левой задней конечности. Откройте ножницы, вытащите открытые ножницы из разреза и повторите, чтобы расширить карман.
    3. Осторожно вставьте насос в карман с замедлителем потока к хвосту (чтобы свести к минимуму потенциальное вмешательство высвобождения Ang-II местом разреза).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Карман должен быть не только достаточно широким для введения насоса, но и чтобы кожа не была плотной вокруг насоса, и между насосом и местом разреза должно быть не менее 5 мм, чтобы обеспечить оптимальное заживление ран.
    4. Закройте рану 4-0 рассасывающимися прерванными швами.
    5. Вводят мышам 10% глюкозы в физиологическом растворе при 10 мкл/г мыши подкожно.
    6. Нанесите повидон-йодный раневой спрей на закрытую рану и дайте мыши восстановить сознание под нагревательной лампой, затем верните его в клетку с 7,5 мг пиритрамида (для длительного лечения боли) и 20 мл 5% глюкозы в 200 мл питьевой воды в течение 3 дней после операции.
    7. Проверяйте мышей несколько раз в день на наличие признаков боли или дистресса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку разрывы аорты происходят со скоростью 20-40% и преимущественно в течение первых 3-10 дней после операции, риск длительной сильной боли или дистресса необходимо свести к минимуму путем частого мониторинга животных. Основными показаниями к неизбежному разрыву являются: отделение от группы, сгорбленная осанка, снижение подвижности (вплоть до паралича задних конечностей), а также снижение или отсутствие реакции во время обработки.

2. Катетеризация яремной вены

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта хирургическая процедура требует микроскопа с увеличением 8x-10x.

  1. Используя систему сосудистого доступа (см. Таблицу материалов), подготовьте катетер, разрезав сторону 3Fr на нужную длину (~5-7 мм до силиконового анкера) и протолкнув катетер через металлический разъем 22 G системы сосудистого доступа (VAS) с перекрытием не менее 3 мм. Поместите алюминиевый колпачок на кнопку, чтобы защитить порт.
  2. Приготовьте 1-1,5 см длиной 6-0 шелковых лигатур.
  3. Поместите мышь в анестезиологическую камеру на 3%-4% изофлурана, смешанного с 2 л/мин O2 до потери сознания.
  4. Переместите мышь к нагретому столу (37 °C) в положении лежа на спине и поддерживайте изофлурановую анестезию на уровне 1,8%-2% через носовой конус.
  5. Нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  6. Вводят мышам 2,5% бупренорфина в физиологическом растворе при 10 мкл/г мыши подкожно.
  7. Сбрить мех с правой стороны шеи на вентральной стороне и на правой стороне верхней части спины (левая сторона будет иметь имплантированный осмотический насос).
  8. Применяют повидон-йодный раствор для дезинфекции бритого участка.
  9. Убедитесь, что мышь полностью обезболена щипком пальца ноги.
  10. Подготовка яремной вены (5-10 мин, выполняется под микроскопом)
    1. Сделайте поперечный надключичный разрез кожи длиной 0,5 см с правой стороны шеи над правой ключицей.
    2. Используют тупой микрохирургический пинцет для разделения соединительной ткани и жира, обнажая наружную яремную вену. Избегайте разрыва мелких кровеносных сосудов в жире.
    3. Выделяют не менее 5 мм сосуда, близко к грудным мышцам.
    4. Тупой рассечение ткани под вену с помощью изогнутого микро пинцета и пропускают через 2-3 из 6-0 лигатур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в интересующей области выявлены какие-либо боковые ветви, либо лигатура должна быть вставлена, чтобы быть каудальной к боковой ветви, либо боковая ветвь должна быть постоянно перевязана путем изоляции и связывания лигатурой 6-0.
    5. Подтяните лигатуры и добавьте каплю физиологического раствора в участок.
  11. Имплантация пуговиц (5-7 мин, выполняется без микроскопа)
    1. Переверните мышь и поместите ее в положение лежа; проверить глубину анестезии щипцом пальца ноги и нанести раствор повидона-йода для дезинфекции бритого участка.
    2. Сделайте сагиттальный разрез 1 см на верхней части спины скальпелем между среднеспинальной и правой лопаточной линиями.
    3. Используйте тупые изогнутые ножницы, чтобы сделать круглый карман лишь немного больше размера VAS вокруг места разреза тупым рассечением.
    4. Используйте тупые изогнутые ножницы, чтобы туннелировать краниально через правое плечо к вентральному разрезу на шее, слегка открыв ножницы, затем вытащив открытые ножницы наружу и повторив действие, когда он проталкивается дальше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь можно повернуть на левой стороне для этого шага.
    5. Как только туннель достигнет вентрального разреза, пройдите через хирургические зажимы от вентрального дорсального разреза.
    6. Прикрепите конец катетера 3Fr к зажиму и потяните катетер через туннель так, чтобы он вышел из разреза вентральной шейки, а VAS был на месте в дорсальном разрезе.
    7. Вставьте хирургический войлочный диск VAS подкожно в разрез сзади.
    8. Отстегните катетер и промывайте физиологическим раствором или фосфатно-буферным физиологическим раствором без кальция и магния (PBS-/-), проверьте проходимость, используя вилочный конец инструмента для обработки, чтобы удалить защитный алюминиевый колпачок, а затем используйте магнитный конец, чтобы удерживать кнопку и вводить шприц 1 мл, прикрепленный к соответствующему инжектору, пока жидкость не просочится с конца 1Fr.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Катетерная промывка может быть альтернативно проведена на этапе 2.1.
    9. Нажмите кнопку хвостом в кармане и закройте кожу над войлочным диском VAS, под фланцем VAS, по крайней мере, двумя 4-0 прерванными швами краниально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на коже вокруг кнопки нет натяжения.
  12. Катетеризация вен (7-10 мин, выполняется под микроскопом)
    1. Переверните мышь обратно в положение лежа на спине, проверьте глубину анестезии щепоткой пальца ноги и добавьте каплю физиологического раствора в место разреза.
    2. Завяжите первую лигатуру вокруг катетера и яремной вены на 2-3 узла как можно глубже, чтобы обвязать вену и закрепить катетер наружу. Переместите вторую лигатуру как можно ближе к грудным мышцам.
    3. Укоротите катетер до необходимой длины так, чтобы ~3-5 мм катетера находилось в вене, разрезав микроножниками под диагональным углом для создания острого конца.
    4. Проткните отверстие в вене с помощью иглы 27 Г, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл, заполненному физиологическим раствором, потянув за закрепленную черепную лигатуру и протолкнув иглу параллельно вене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь из обратного потока вытекает из вены, используйте ватный тампон, чтобы надавить до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
    5. Вставьте катетер в вену таким же образом, потянув за закрепленную черепную лигатуру и скользя катетером в вену с помощью изогнутого пинцета. Толкайте катетер до тех пор, пока он не выровняется с веной.
    6. Завяжите вторую лигатуру над областью, где катетер вводится в вену на 2-3 узла и проверьте, чтобы не было утечки крови. Третья лигатура и часть местной жировой ткани могут быть использованы для дополнительного закрепления катетера.
    7. Микроножами отрежьте лишний конец обеих лигатур и добавьте каплю физиологического раствора.
    8. Закройте кожу 4-0 рассасывающимися прерванными швами.
    9. Вводят мышам 10% глюкозы в физиологическом растворе при 10 мкл/г мыши подкожно.
    10. Введите мыши желаемый объем ингибитора или PBS/физиологического раствора, используя вилочный конец инструмента для обработки, чтобы снять защитный алюминиевый колпачок, а затем магнитный конец, чтобы удерживать кнопку и вводить шприц объемом 1 мл, прикрепленный к инжектору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в инжекционном шприце нет воздуха или пузырьков воздуха, нажав на плунжер, пока капля жидкости не выйдет перед инъекцией. Поддерживайте положительное давление на плунжер, отсоединяя шприц с инжектором от VAS, чтобы предотвратить втягивание крови в наконечник катетера и причинение закупорки катетера.
    11. Нанесите повидон-йодный раневой спрей на закрытую рану и дайте мыши восстановить сознание под нагревательной лампой, затем верните его в клетку с 7,5 мг пиритрамида (для длительного лечения боли) и 20 мл 5% глюкозы в 200 мл питьевой воды в течение 3 дней после операции.
    12. Проверяйте мышей несколько раз в день на наличие признаков боли или дистресса.
  13. Ежедневные инъекции (<5 мин)
    1. Для ежедневной инъекции поместите мышь в анестезиологическую камеру на 3%-4% изофлурана, смешанного с 2 л/мин O2 до тех пор, пока она не потеряет сознание и ее дыхание не замедлится, затем вводят как на шаге 2.12.10. Проверьте шею на наличие признаков отека после инъекции, которые будут указывать на то, что катетер больше не вводится в вену. Также обратите внимание, что инъекция будет невозможна, если катетер закрыт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл / г мыши с весом 1 раз в день инъекции хорошо переносится мышами.

3.3D УЗИ

  1. Подготовьте систему ультразвуковой визуализации, нагревательный стол и гель-грелку, присоедините датчик к системе и установите над сценой в поперечное положение (то есть перпендикулярно позвоночнику мыши).
  2. С помощью ультразвукового программного обеспечения настройте параметры на усиление 30 дБ, глубину изображения 9,0 мм и ширину изображения 8,08 мм.
  3. Поместите мышь в анестезиологическую камеру на 3%-4% изофлурана, смешанного с 2 л/мин O2 до потери сознания. Переместите мышь к нагретому столу (37 °C) в положении лежа на спине и поддерживайте изофлурановую анестезию на уровне 1,8%-2% через носовой конус.
  4. Нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  5. Сбрить шерсть на брюшке мыши. При необходимости нанесите крем для удаления волос на 1 мин, затем протрите и очистите влажной марлей.
  6. Добавьте каплю электродного геля к каждому из четырех электродов электрокардиограммы (ЭКГ) на сцене и приклейте к ним конечности мыши.
  7. Нанесите теплый ультразвуковой гель на живот мыши и опустите передатчик, чтобы установить его в контакт с животным.
  8. Определите аорту как круговой быстро пульсирующий сосуд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя полая вена (IVC) будет расположена рядом с аортой, и если зонд сильно прижать, IVC будет сжат, в то время как аорта останется стабильной. Подтверждение того, что анализируемый сосуд является аортой, а не IVC, можно получить с помощью импульсно-волнового доплеровского (PW-режима), с углом 65°. Аорта будет иметь высокую скорость пульсовой волны.
  9. Найдите левую почечную артерию и осмотрите область вручную до 12 мм, чтобы убедиться в отсутствии помех в интересующей области (т. Е. Надпочечниковая аорта). Вернитесь в левую почечную артерию, затем установите зонд на 6 мм краниально от левой почечной артерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-ультразвук будет записывать указанную длину (т.е. 12 мм), начиная с половины (6 мм) каудально от точки происхождения и вверх по указанной длине (12 мм) краниально. Шаги по устранению неполадок при возникновении помех включают небольшое нажатие датчиком, подъем, а затем повторное опускание датчика, нанесение большего количества ультразвукового геля и наклон угла наклона ступени.
  10. 3D ультразвуковая съемка
    1. Установите дыхательную решетку на 25% задержку и окно 50% и триггер ЭКГ (Т1) на 50 мс (для регистрации пикового систолического расширения аорты).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхательная решетка может быть оптимизирована для каждого животного на основе частоты дыхания и усилий, чтобы обеспечить удаление артефактов движения.
    2. Из параметров 3D установите расстояние сканирования на 11,96 мм с размером шага 0,076 мм, что приводит к 157 кадрам.
    3. Программа автоматически получит 157 кадров примерно за 1-2 минуты. Прокрутите, чтобы проверить качество изображения, повторите, если оно не соответствует, а затем сохраните изображение.
  11. Получение 2D диаметра
    1. Выключите дыхательную решетку и триггер ЭКГ и вручную найдите область с наибольшим диаметром в 12-миллиметровом растяжении надпочечниковой аорты.
    2. Получение изображенияB-режима 16.
    3. Кроме того, не перемещая преобразователь, получите изображение килогерцовой визуализации ЭКГ (EKV) со стандартными настройками системы на том же месте.
  12. Завершение сканирования
    1. Вытрите ультразвуковой гель с живота и верните мышь в клетку. Следите за мышью до полного восстановления.

4. Ультразвуковой анализ

  1. Объемный анализ
    1. В аналитическом программном обеспечении откройте изображение в режиме 3D и в меню «Обработка изображений» нажмите «Загрузить в 3D», который скомпилирует 157 2D-кадров в 3D-изображение (т. Е. Куб).
    2. В меню «Измерение объема» выберите «Параллельные и вращательные методы», а затем программное обеспечение отобразит 3D-изображение на одной панели.
    3. В разделе Громкость нажмите кнопку Пуск и нарисуйте первый контур вокруг внутренней стенки аорты, щелкнув, чтобы добавить первую точку, переместив курсор вокруг аорты, а затем щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы завершить контур.
    4. Пропустите 9-10 кадров (0,75-1 мм), затем нарисуйте другой контур таким же образом. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет достигнут последний кадр. Это должно привести к 16-17 контурам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый и последний кадры должны иметь контуры, чтобы можно было рассчитать правильный объем более 12 мм.
    5. Выберите первый контур в меню и выберите Уточнить. Это инициирует алгоритм обнаружения краев, чтобы плотно прилегать линию к стенке сосуда. Переместите точки на контуре, перетащив их в новое положение, чтобы контур точно выровнял внутренний край стенки аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В модели Ang-II может присутствовать внутренний тромб. Поскольку это общая черта данной модели, измерение объема должно включать тромб.
    6. Уточните все контуры и нажмите Finish , чтобы сохранить анализ. Рассчитанный объем будет отображаться в левом нижнем углу.
  2. Анализ диаметра
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения диаметра могут проводиться от внутренней к внутренней стенке, от внешней к внешней стене или от внутренней к внешней стенке, но должны быть последовательными для всех измерений. Однако в модели Ang-II может присутствовать интрамуральный тромб, который должен быть включен в анализ.
    1. Из изображения 3D-режима: Оцените 157 кадров, чтобы определить максимальный диаметр путем визуального осмотра. Затем в меню « Измерение» выберите « Линейный» и нарисуйте несколько линий по всей аорте, чтобы определить наибольший диаметр.
    2. Из изображения B-режима или EKV (ЭКГ-закрытая килогерцовая визуализация): В кинопетле определите максимальное расширение аорты (в систоле) путем визуального осмотра. Затем в меню « Измерение» выберите « Линейный» и нарисуйте несколько линий по всей аорте, чтобы определить наибольший диаметр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ЭКГ может быть использована для определения сердечного цикла, но визуальная идентификация дает точные результаты.

Representative Results

Репрезентативные результаты показывают развитие и прогрессирование надпочечниковых аневризм, контролируемых ультразвуком на исходном уровне, день 8 и день 27 (рисунок 1A). Трихромное пятно (рисунок 1В) 27-го дня аорты на рисунке 1А дополнительно иллюстрирует морфологию образовавшейся аневризмы с рассечением стенки и интрамуральным тромбом. Объем аорты (мм 3) определяли на участке 12 мм14, а максимальный диаметр аорты дополнительно измеряли по изображениям EKV. Для определения начального развития аневризмы был установлен порог роста объема на 125% от исходного уровня до 8-го дня. Исходя из данных, собранных за 2 года (2020-2021 гг., n=157), только 9% животных не смогли сформировать ААА в соответствии с этой отсечкой. Тем не менее, 35% мышей испытали разрывы аорты (грудной или брюшной полости) до имплантации катетера на 9-й день, в результате чего в общей сложности 56% оставшихся животных с установленным заболеванием ААА поддаются стратификации на группы лечения (рисунок 1C). Следует отметить, что среди наших исторических контрольных PBS (n = 21) аневризмы развивались в разной степени (диапазон: 128%-314%, среднее значение 199% ± 55% SD рост объема аорты на 8-й день). Важно отметить, что между начальным расширением и дальнейшим прогрессированием заболевания наблюдалась обратная зависимость, то есть 55% быстро прогрессирующих аневризм (>200% роста объема на 8-й день) не прогрессировали до 27-го дня, в то время как 80% других аневризм (>125% и <200% роста объема на 8-й день) продолжали расширяться до конца эксперимента (рисунок 1D).

Как недавно сообщалось14,17, описанные методы были успешно установлены, валидированы и реализованы, например, для документирования терапевтического эффекта ингибитора гистоновой цитруллинации (GSK484, для ингибирования образования внеклеточной ловушки нейтрофилов) в блокировании прогрессирования установленного ААА. Мыши с дефицитом ApoE получали Ang-II со скоростью 1000 нг/кг/мин с помощью подкожно имплантированных осмотических насосов в течение 28 дней. Животные были стратифицированы от 1:1 до GSK484 (0,2 мкг / г / день) или PBS лечения на основе объема аорты, измеренного на 8-й день, и прошли процедуру катетеризации яремной вены на 9-й день. Инъекции препарата проводили ежедневно в объеме 10 мкл/г веса мыши до конца исследования17. На рисунке 2 показаны примерные (n = 2/группа) результаты ультразвука (временной ход абсолютного и относительного расширения объема или диаметра), показывающие, что лечение GSK484 ингибировало прогрессирование ААА, в то время как аневризмы продолжали увеличиваться у контрольных мышей.

Figure 1
Рисунок 1: Формирование и прогрессирование ААА в мышиной модели Ang-II, обнаруженное с помощью 3D-ультразвука. (A) Супраренальная аорта контролировалась 3D-ультразвуком на исходном уровне (BL), день 8 (d8) и день 27 (d27) после имплантации насоса Ang-II. Объем измерялся на 12-миллиметровом участке надпочечниковой аорты (157 кадров) на основе 3D-реконструированного изображения. Максимальный диаметр аорты определяли по снимкам EKV. (Б) Трихромное пятно поперечного сечения 27-го дня аорты после жертвоприношения мышей и сбора органов. Наличие рассечения аорты обозначается L1/L2 (просвет 1 и просвет 2), а интрамуральный тромб обозначается * в A и B. (C) Частота возникновения ААА (>125% роста объема аорты от BL) на 8-й день и разрывов аорты в течение первых 9 дней (грудной или брюшной) из набора данных, собранных в течение 2 лет (n = 157). (D) Частота прогрессирования с 8-го по 27-й день первоначально быстро формирующихся (>200% роста объема аорты с BL до 8-го дня) по сравнению с умеренно растущими (>125% и <200% роста объема аорты с BL до 8-го дня) аневризм у мышей, получавших контроль PBS (n = 21). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Примерные результаты ингибирования цитруллинизации гистонов для блокирования прогрессирования ААА в модели Ang-II путем внутривенной инъекции GSK484 или PBS через кнопку сосудистого доступа. (A) Объем аорты (мм3), измеренный на 12-миллиметровом участке надпочечниковой аорты. (B) Расчетный рост объема аорты по сравнению с базовым уровнем (BL = 100%). (C) Максимальный диаметр аорты, определенный на изображениях EKV. (D) Расчетный рост диаметра аорты из BL. Данные GSK484 были извлечены из ранее опубликованного исследования17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Модель Ang-II является одной из наиболее часто используемых мышиных моделей AAA из-за ее низких технических требований и особенностей, напоминающих болезнь человека 3,6. Время операции составляет около 10 минут на животное, а имплантация подкожного насоса хорошо переносится мышами, если подкожный карман достаточно широкий и расположен низко на спине животного, вдали от места разреза, чтобы не мешать заживлению ран. Когда кожа плотно прилегает к насосу, может произойти раздражение тканей, которое может вызвать воспаление и ссадины и потенциально нарушить механизм высвобождения насоса осмотическим давлением. Измерение объема Ang-II, оставшегося в насосе во время жертвоприношения животных, дает представление о том, был ли Ang-II успешно выпущен в течение 28 дней.

Недавно было предложено, чтобы модель Ang-II хорошо подходила для изучения аневризмы аорты и прогрессирования расслоения, поскольку она демонстрирует сходство с человеческими особенностями обоих6. Важно отметить, что тестирование кандидатов на лекарства для блокирования расширения аорты и ремоделирования влияния будет соответствовать текущему клиническому спросу. В наших экспериментальных условиях отсечение образования аневризмы было определено до начала лечения на основе 125% роста объема на 8-й день по отношению к исходному уровню, что объясняет естественное изменение абсолютного размера аорты у мышей. Порог и временная точка были получены из начального временного курса, который подтвердил разрушение стенки аорты в гистологии (данные не показаны) и привел к 35% разрывов и 56% наблюдаемых ААА до имплантации катетера. Хотя для включения в исследование был применен минимальный порог установленного заболевания, впоследствии было отмечено, что высокая степень первоначального расширения аорты может также ограничивать экспериментальную применимость. Аневризмы, которые быстро прогрессировали до >200% объема к 8-му дню, не превышали этого размера в 55% случаев (рисунок 1D). Это должно быть учтено при экспериментальном проектировании и расчете размера выборки, так как это может замаскировать истинный эффект лечения. Другим аспектом этой модели являются частые разрывы аорты (грудной или брюшной полости), происходящие со скоростью 20%-40% и в основном в течение первых 10 дней после имплантации насоса Ang-II 3,18,19. Таким образом, выбрав начало лечения на 9-й день, был достигнут высокий уровень установленных аневризм, и катетеризация яремной вены была по существу выполнена на мышах, которые, как ожидалось, доживут до конца эксперимента (только 3/24 мышей в нашей исторической контрольной группе разорвались после 9-го дня), тем самым экономя время, усилия, и стоимость.

Помимо разрывов аорты, которые представляют собой тяжелое состояние, одновременная имплантация катетера с кнопкой сосудистого доступа и осмотическим насосом хорошо переносилась мышами, без заметного влияния на подвижность или поведение после восстановления после операции. Процедура катетеризации яремной вены должна занять около 30 минут для обученных исследователей. Продолжительность воздействия (изофлурановой) анестезии должна быть сведена к минимуму, а частота дыхания животных должна тщательно контролироваться, чтобы предотвратить угнетение дыхания, которое может привести к летальному исходу, если не устранить20. Кровопотеря после прокола яремной вены для введения катетера, приводящая к смерти животных, если она большая, потенциально может произойти, когда яремная вена не перевязана должным образом черепно или боковая ветвь, подаваемая в изолированную область сосуда, не закрыта. В этом случае давление ватным тампоном должно быть приложено к месту прокола до тех пор, пока утечка крови не замедлится или не прекратится, затем введение катетера и перевязку следует сделать как можно быстрее; небольшой кусочек коллагеновой раневой повязки может быть временно использован для помощи при гемостазе.

Проходимость катетера является одним из наиболее важных факторов, так как отключение катетера от вены или кнопки доступа приводит к неправильной доставке препарата, когда препарат просачивается в подкожное пространство. Следуя рекомендации производителя о перекрытии не менее 3 мм между катетером и металлическим соединительным устройством, в течение 3 лет в этой модели (2020-2021 гг., n=73) был зафиксирован только один случай отсоединения катетера со стороны кнопки (обозначенный утечкой введенной жидкости из места разреза на кнопке), который был зафиксирован путем вскрытия раны и восстановления соединения в хирургии. Кроме того, частота неудач проходимости катетера около 10% в нашей исторической контрольной группе PBS (2/21) наблюдалась из-за окклюзии катетера (что делает невозможным введение), отсоединения катетера от вены (о чем свидетельствует очевидный отек в шее во время инъекции) или осложнений заживления ран. Эти проблемы могут быть связаны с травмами, нанесенными самим себе, то есть царапинами или укусами мыши. Примечательно, что медикаментозное лечение, которое препятствует заживлению ран, может повысить частоту неудач. Шаги по устранению неполадок для улучшения проходимости включают увеличение длины катетера, вставленного в вену, обеспечение того, чтобы лигатуры плотно завязывались вокруг катетера и вены, и применение метода положительного давления в соответствии с рекомендацией производителя, как описано в шаге 2.12.10., во время инъекции. Проходимость катетера должна, кроме того, быть проверена во время жертвоприношения животного путем рассечения и визуального осмотра под микроскопом. Следует отметить, что суточный объем раствора инъекционного препарата должен быть тщательно рассмотрен. Поскольку объем плазмы регулирует кровяное давление, объем инъекции может влиять на расширение ААА, и, следовательно, контрольные животные должны получать фиктивную процедуру с объемом носителя. Основываясь на нашем опыте (и неопубликованных наблюдениях), ежедневное количество до 250 мкл PBS, по-видимому, хорошо переносится. Наконец, подобно имплантации насоса, раздражение кожи может возникать вокруг имплантированной кнопки сосудистого доступа. Если наблюдается воспаление, сопровождающееся девитализированной или некротической тканью, следует проводить санацию раны путем удаления нежизнеспособной ткани (некротическая ткань часто естественным образом отделяется от раны), а кожа должна быть зашита при необходимости; если воспаление и некроз обширны, благополучие животного и гуманные конечные точки должны рассматриваться в соответствии с руководящими принципами.

Однократная и двойная дорсальная имплантация осмотического насоса и/или VAS не мешала ни ультразвуковому сигналу, ни закреплению мыши в соответствующем положении на ультразвуковой стадии. Автоматизированное получение 157 кадров более 12 мм для визуализации 3D-изображения аорты для измерения объема является простой и быстрой процедурой14, которая требует только обеспечения того, чтобы аорта была свободна от помех в интересующей области. Одной из ловушек в этом контексте является применение слишком большого давления с датчиком при попытке очистить изображение от помех, что может прервать автоматическое измерение, если на частоту дыхания влияет сжатие ребер при записи изображений черепного конца брюшной аорты. Диаметр традиционно измеряется в изображениях, полученных с помощью B-режима оператором, вручную ищущим область максимального диаметра при проведении ультразвукового анализа. Прогрессом в изображениях B-режима являются изображения EKV, которые могут разрешать небольшие движения аорты для получения высококачественного, замедленного изображения пульсирующей аорты. Кроме того, максимальный диаметр аорты может быть определен по полученным 3D-кадрам, где 157 изображений предлагают всесторонний обзор аорты, взятой в систоле (благодаря установленному триггеру ЭКГ).

В заключение, представленный скомпилированный протокол обеспечивает надежный и воспроизводимый рабочий процесс для в/в введения лекарственного средства в мышиной модели Ang-II индуцированной ААА и для мониторинга размера аорты с помощью 3D-ультразвука. Временные точки мониторинга и работы могут быть скорректированы в соответствии с конкретными потребностями, а катетеризация яремной вены может быть выполнена отдельно для любой экспериментальной установки, требующей доставки конкретных веществ посредством инъекций внутривенного введения. VAS может в качестве альтернативы использоваться для повторного забора крови, если раствор для блокировки катетера используется для предотвращения свертывания. Описанная процедура 3D-ультразвука может быть адаптирована для измерения инфраренальной аорты, где аневризмы развиваются при остром инсульте в эластазе или мышиных моделях ААА на основе CaCl2. В то время как 3D-ультразвуковое получение имеет преимущество в предоставлении обзора пораженной области аорты и морфологии аневризмы, получение изображения занимает больше времени и, следовательно, может быть более дорогостоящим. Другим ограничением протокола, которое следует признать, является необходимость кратковременного обезболивания животных для внутривенных инъекций, в то время как внутрибрюшинное введение обычно выполняется на сознательных мышах.

Disclosures

Авторы не раскрывают информацию.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить команды профессора Подессера и профессора Эллмайера (Департамент биомедицинских исследований и Основной центр лабораторного животноводства и животноводства, Медицинский университет Вены) за помощь в экспериментах на животных. Трихромное окрашивание ААА было любезно выполнено Моникой Вайс и профессором Петером Петцельбауэром (кафедра дерматологии Венского медицинского университета). Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом [проект SFB F 5409-B21]. Марка Бейли лично поддерживает Британский фонд сердца [FS/18/12/33270].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Polysorb sutures Covidien GL-46-MG Braided absorbable suture CV-23 Taper
6-0 Silk sutures Ethicon 639H PERMA-HAND Silk
ALZET 2004 osmotic pumps DURECT Corp 298 Osmotic mini pumps
Angiotensin-II Bachem 4006473.0100 Angiotensin II acetate
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel Parker Labs PUSG-0308 Ultrasound gel
Betadona Wound Spray Mundipharma Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray)
Betaisodona Solution Mundipharma 15973 Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution)
Catheter for mouse femoral vein/artery Instech Laboratories Inc C10PU-MFV1301 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G
Hair removal cream
Handling tool Instech Laboratories Inc VABMG Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons
HYLO NIGHT Eye Oinment URSAPHARM 538922 Eye lubricant cream
Needles and syringes of various sizes 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles
Olympus SZ51 Stereo microscope Olympus Corporation Dissection and inspection microscope
PinPort injectors Instech Laboratories Inc PNP3M-50 Injector for vascular access button
Protective aluminum cap Instech Laboratories Inc VABM1C Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB
Signa Electrode Ultrasound Gel Parker Labs PE-1560 Electrode gel
Small electric shaver
Surigcal and microsurgical equipment
Suprasorb C Lohmann & Rauscher 20482 Collagen wound dressing
Vascular access button (VAB) Instech Laboratories Inc VABM1B/22 Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector
Vevo 3100 Imaging System FUJIFILM VisualSonics Inc 51073-51 Ultrasound system
Vevo Lab 5.6.1 software FUJIFILM VisualSonics Inc Ultrasound analysis software
Vevo MX550D transducer FUJIFILM VisualSonics Inc Linear Array Transducer For Vevo 3100 system
Vevo Mouse Handling Table FUJIFILM VisualSonics Inc 11436 Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
  2. Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
  3. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
  4. Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
  5. Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
  6. Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
  7. Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
  8. Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
  9. Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
  10. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  11. Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
  12. Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
  13. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
  14. Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
  15. Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
  16. Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
  17. Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
  18. Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
  19. Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
  20. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).

Tags

Медицина выпуск 186
Медикаментозное лечение центральным венозным катетером в мышиной модели аневризмы брюшной аорты, индуцированной ангиотензином II, и мониторинг с помощью 3D-ультразвука
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibrahim, N., Klopf, J., Bleichert,… More

Ibrahim, N., Klopf, J., Bleichert, S., Bailey, M. A., Busch, A., Stiglbauer-Tscholakoff, A., Eilenberg, W., Neumayer, C., Brostjan, C. Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound. J. Vis. Exp. (186), e64124, doi:10.3791/64124 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter