Summary
Dit protocol beschrijft de opeenvolgende implantatie van een osmotische pomp om abdominaal aorta-aneurysma te induceren door angiotensine II-afgifte in apolipoproteïne E (ApoE) deficiënte muizen en van een vasculaire toegangspoort met een halsaderkatheter voor herhaalde medicamenteuze behandeling. Monitoring van de ontwikkeling van aneurysma's door middel van 3D-echografie wordt effectief uitgevoerd ondanks dorsale implantaten.
Abstract
Aangezien farmaceutische behandelingsopties ontbreken in de klinische behandeling van abdominaal aorta-aneurysma (AAA), worden diermodellen, in het bijzonder muismodellen, toegepast om het begrip van de pathogenese van de ziekte te bevorderen en potentiële therapeutische doelen te identificeren. Het testen van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen om de AAA-groei in deze modellen te blokkeren, vereist over het algemeen herhaalde toediening van geneesmiddelen tijdens het verloop van het experiment. Hier beschrijven we een gecompileerd protocol voor AAA-inductie, het inbrengen van een intraveneuze katheter om langdurige therapie te vergemakkelijken en seriële AAA-monitoring door 3D-echografie. Aneurysma's worden geïnduceerd in apolipoproteïne E (ApoE) deficiënte muizen door angiotensine II-afgifte gedurende 28 dagen van osmotische minipompen die subcutaan in de rug van de muis zijn geïmplanteerd. Vervolgens wordt de chirurgische procedure voor externe halsaderkatheterisatie uitgevoerd om dagelijkse intraveneuze medicamenteuze behandeling of herhaalde bloedafname via een subcutane vasculaire toegangsknop mogelijk te maken. Ondanks de twee dorsale implantaten wordt de monitoring van AAA-ontwikkeling gemakkelijk vergemakkelijkt door sequentiële semi-geautomatiseerde 3D-echografieanalyse, die uitgebreide informatie oplevert over de uitbreiding van de aortadiameter en -volume en over aneurysmamorfologie, zoals geïllustreerd door experimentele voorbeelden.
Introduction
Een abdominaal aorta-aneurysma (AAA) is een pathologische dilatatie van een vat als gevolg van inflammatoire en weefselvernietigende processen in de aortawand die uiteindelijk kunnen leiden tot scheuren en de dood van de patiënt. Ondanks aanzienlijke prestaties in chirurgische AAA-reparatie, ontbreekt tot op heden een conservatieve medicamenteuze behandeling om de progressie van aneurysma-uitbreiding te blokkeren en mogelijk het risico op breuk te verlagen. Diermodellen zijn ontwikkeld om triggers en mediatoren van de ziekte op te helderen en om nieuwe benaderingen van therapie te testen. Muismodellen van AAA worden op grote schaal toegepast en dekken de verschillende waarnemingen van menselijk weefsel. Vanwege hun pathomechanistische verschillen wordt vaak meer dan één model toegepast om de specifieke functie van moleculen / routes of de werkzaamheid van potentiële therapeutische geneesmiddelen te onderzoeken 1,2. Een van de meest gebruikte modellen van AAA-inductie is angiotensine-II (Ang-II) toediening bij apolipoproteïne E-deficiënte (ApoE KO) muizen3, die meer chronisch-achtige pathogenese heeft in vergelijking met modellen die afhankelijk zijn van aneurysmavorming van een acute belediging tot de aortawand 4,5. Het Ang-II-model lijkt dus bijzonder geschikt voor het monitoren van ziekteprogressie en onlangs is aangetoond dat het sterk lijkt op de menselijke AAA-ziekte met betrekking tot metabole en inflammatoire reacties6. Met name het Ang-II-model heeft niet alleen AAA-ontwikkeling, maar ook thoracale aneurysmavorming, evenals aortadissectie met intramurale trombusvorming.
Behandelingen gericht op de progressie van reeds vastgestelde AAA in plaats van het voorkomen van het initiëren van de ziekte kunnen een hogere translationele waarde hebben omdat patiënten zich presenteren met een reeds bestaande aandoening die behandeling vereist 7,8. Voor een vergelijkbaar experimenteel ontwerp moet de aortagrootte vóór en na AAA-inductie worden bewaakt om een drempel voor ziekteontwikkeling te definiëren en mogelijk muizen in behandelingsgroepen te stratificeren.
De wijze van toediening van het geneesmiddel hangt af van de opname en stabiliteit van de respectieve stof. Intraperitoneale (i.p.) injecties worden meestal gebruikt vanwege hun gemak van aanbrengen, het niet vereisen van verdoving en het ontbreken van beperkingen van het injectievolume9. Bij het kiezen van de toedieningsweg moet echter rekening worden gehouden met farmacokinetiek, aangezien stoffen die i.p. worden toegediend, voornamelijk worden geabsorbeerd door de circulatie van het leverportaal en een levermetabolisme kunnen ondergaan voordat ze de circulatie bereiken, wat kan resulteren in variërende plasmaconcentraties afhankelijk van het eerste doorlaateffect10. Intraveneuze (i.v.) injectie levert de hoogste biologische beschikbaarheid van stoffen op, en de uitdaging van repetitieve i.v. toegang kan worden omzeild door het gebruik van katheters en vasculaire toegangspoorten voor dagelijkse toediening 11,12,13. Met betrekking tot de AAA-instelling vergemakkelijkt de distributie van geneesmiddelen in omloop directe blootstelling aan aneurysma's bij gedefinieerde concentraties.
Hier beschrijven we een workflow voor het induceren van AAA in het Ang-II muismodel via de subcutane implantatie van een osmotische pomp, voor dagelijkse i.v. medicamenteuze behandeling via een vasculaire toegangspoort aangesloten op een katheter die in de externe halsader is ingebracht, evenals voor de monitoring van de aneurysmagrootte via 3D-echografie14 ondanks de aanwezigheid van twee dorsale implantaten.
Protocol
Dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie en het Oostenrijkse ministerie van Wetenschap (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en de Oostenrijkse dierproevenwet 2012. Humane eindpunten werden als volgt vastgesteld: verlies van ≥15% lichaamsgewicht, het vermijden van voedsel- en/of waterinname, verminderde activiteit (hypokinesie) of dyskinesie, of langdurig schudden, krabben, moeizame ademhaling of gebogen houding ondanks pijn/symptoombestrijding. Indien nodig wordt een dier geëuthanaseerd onder diepe anesthesie, d.w.z. een overdosis cocktail van ketamine (ca. 100 mg/kg) en xylazine (ca. 5 mg/kg), of door cervicale dislocatie. Voor chirurgische ingrepen worden overal aseptische techniek en steriele/schone handschoenen gebruikt.
1. Pompimplantatie
- Anesthesie
- Houd ApoE-deficiënte muizen (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) op een normaal dieet en neem bij voorkeur 12-14 weken oude mannelijke dieren op in de experimenten om het mannelijke overwicht in menselijke ziekte3 weer te geven.
- Bereid en vul de osmotische pompen 1 dag voor de operatie (d-1, pre-OP) met de gewenste concentratie angiotensine II volgens het muisgewicht volgens het protocol van de fabrikant en incubeer de pompen in zoutoplossing bij 37 °C 's nachts15.
Voorbeeld: Voor een muis van 25 g, met behulp van osmotische pompen (zie Materiaaltabel) met een afgiftesnelheid van 1000 ng/kg/min en een pompsnelheid van 0,25 μL/h gedurende 28 dagen, lost u 1,8 mg Ang-II op in 300 μL zoutoplossing (6000 ng/μL-concentratie voor het leveren van 1500 ng/h Ang-II). Laad de oplossing met de stompe vulnaald in de pomp en plaats vervolgens de stroommoderator om de pomp te sluiten. - Plaats de muis in de anesthesiekamer op 3%-4% isofluraan gemengd met 2 L/min O2 totdat hij bewusteloos is. Verplaats de muis naar een verwarmde tafel (37 °C) in buikligging en handhaaf de isofluraan-anesthesie op 1,8% -2% door een neuskegel.
- Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Injecteer de muis met 2,5% buprenorfine in zoutoplossing bij 10 μL/g muis subcutaan en controleer de diepte van de anesthesie door een teenknufje.
- Scheer een klein gebied linksboven de muis terug over het schouderblad. Breng 10% (w/v) povidon-jodiumoplossing aan voor desinfectie van het geschoren gebied.
- Pompinbrenging (5-7 min, uitgevoerd zonder microscoop)
- Controleer of de muis volledig verdoofd is door teenknijpen en maak een transversale incisie van 1 cm in de huid van de bovenrug met een scalpel tussen de midspinale en linker scapulaire lijn.
- Houd de huid omhoog met een tang en gebruik een stompe, gebogen schaar om een onderhuidse zak te maken door naar de linker achterpoot te duwen. Open de schaar, trek de geopende schaar uit de snede en herhaal dit om de zak te verbreden.
- Steek de pomp voorzichtig in de zak met de stroommoderator naar de staart (om mogelijke interferentie van Ang-II-afgifte door de incisieplaats te minimaliseren).
OPMERKING: De zak moet niet alleen breed genoeg zijn voor het inbrengen van de pomp, maar ook voor de huid om niet strak rond de pomp te zijn, en er moet ten minste 5 mm tussen de pomp en de incisieplaats zitten om optimale wondgenezing mogelijk te maken. - Sluit de wond met 4-0 absorbeerbare onderbroken hechtingen.
- Injecteer de muis met 10% glucose in zoutoplossing bij 10 μL/g muis subcutaan.
- Breng povidon-jodium wondspray aan op de gesloten wond en laat de muis het bewustzijn herstellen onder een verwarmingslamp en breng het vervolgens terug naar de kooi met 7,5 mg piritramide (voor uitgebreide pijnbestrijding) en 20 ml 5% glucose in 200 ml drinkwater gedurende 3 dagen na de operatie.
- Controleer de muizen meerdere keren per dag op tekenen van pijn of angst.
OPMERKING: Aangezien aortarupturen optreden met een snelheid van 20% -40% en voornamelijk binnen de eerste 3-10 dagen na de operatie, moet het risico op langdurige ernstige pijn of angst worden geminimaliseerd door frequente diermonitoring. De belangrijkste indicaties voor dreigende breuk zijn: scheiding van de groep, gebogen houding, verminderde mobiliteit (in de mate van verlamming van de achterpoten) en verminderde of niet-responsiviteit tijdens de hantering.
2. Jugulaire aderkatheterisatie
OPMERKING: Deze chirurgische procedure vereist een microscoop met 8x-10x vergroting.
- Gebruik het vasculaire toegangssysteem (zie Materiaaltabel) bereid de katheter voor door de 3Fr-zijde tot de gewenste lengte te snijden (~5-7 mm vóór het siliconenanker) en de katheter over de metalen connector van 22 G van het vasculaire toegangssysteem (VAS) te duwen met ten minste 3 mm overlap. Plaats de aluminium dop op de knop om de poort te beschermen.
- Bereid 1-1,5 cm lange 6-0 zijden ligaturen.
- Plaats de muis in de anesthesiekamer op 3%-4% isofluraan gemengd met 2 L/min O2 totdat hij bewusteloos is.
- Verplaats de muis naar een verwarmde tafel (37 °C) in rugligging en handhaaf de isofluraanane-anesthesie op 1,8% -2% door een neuskegel.
- Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Injecteer de muis met 2,5% buprenorfine in zoutoplossing bij 10 μL/g muis subcutaan.
- Scheer de vacht vanaf de rechterkant van de nek aan de ventrale kant en aan de rechterkant van de bovenrug (de linkerkant heeft de geïmplanteerde osmotische pomp).
- Breng de povidon-jodiumoplossing aan voor desinfectie van het geschoren gebied.
- Controleer of de muis volledig verdoofd is door teenknijpen.
- Jugulaire aderpreparaat (5-10 min, uitgevoerd onder de microscoop)
- Maak een 0,5 cm transversale supraclaviculaire huidincisie aan de rechterkant van de nek over het rechter sleutelbeen.
- Gebruik een stomp microchirurgisch pincet om het bindweefsel en vet te scheiden, waardoor de externe halsader wordt blootgesteld. Vermijd het verscheuren van kleine bloedvaten in het vet.
- Isoleer ten minste 5 mm van het vat, dicht bij de borstspieren.
- Stomp ontleed weefsel onder de ader met behulp van een gebogen micro-pincet en passeer 2-3 van de 6-0 ligaturen.
OPMERKING: Als er zijtakken worden geïdentificeerd in het interessegebied, moet de ligatuur worden ingebracht om caudaal te zijn aan de zijtak of moet de zijtak permanent worden geligeerd door te isoleren en af te binden met een 6-0 ligatuur. - Stop de ligaturen erin en voeg een druppel zoutoplossing toe aan de site.
- Knopimplantatie (5-7 min, uitgevoerd zonder microscoop)
- Draai de muis om en plaats hem in de buikligging; controleer de diepte van de anesthesie door een teenknufje en breng de povidon-jodiumoplossing aan om het geschoren gebied te desinfecteren.
- Maak een sagittale incisie van 1 cm op de bovenrug met een scalpel tussen de midspinale en rechter scapulaire lijnen.
- Gebruik een stompe gebogen schaar om een cirkelvormige zak te maken die slechts iets groter is dan de grootte van de VAS rond de incisieplaats door stompe dissectie.
- Gebruik de stompe gebogen schaar om craniaal over de rechterschouder naar de ventrale incisie in de nek te tunnelen door de schaar iets te openen, vervolgens de geopende schaar eruit te trekken en de actie te herhalen terwijl deze verder naar binnen wordt geduwd.
OPMERKING: De muis kan voor deze stap aan de linkerkant worden gedraaid. - Zodra de tunnel de ventrale incisie heeft bereikt, gaat u door chirurgische klemmen van de ventrale naar de dorsale incisie.
- Bevestig het 3Fr-uiteinde van de katheter aan de klem en trek de katheter door de tunnel zodat deze uit de ventrale halsincisie komt en de VAS op zijn plaats zit bij de dorsale incisie.
- Plaats de chirurgische viltschijf van de VAS subcutaan aan de incisie aan de achterkant.
- Ontlamp de katheter en spoel met zoutoplossing of fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS-/-), controleer op doorgankelijkheid door het vorkuiteinde van het handlinggereedschap te gebruiken om de beschermende aluminium dop te verwijderen, en gebruik vervolgens het magnetische uiteinde om de knop ingedrukt te houden en injecteer met een spuit van 1 ml die aan de overeenkomstige injector is bevestigd totdat de vloeistof uit het 1Fr-uiteinde lekt.
OPMERKING: Katheter flushing kan ook worden uitgevoerd in stap 2.1. - Druk de knop caudally in de zak en sluit de huid over de viltschijf van de VAS, onder de flens van de VAS, met ten minste twee 4-0 onderbroken hechtingen craniaal.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen spanning op de huid rond de knop komt.
- Aderkatheterisatie (7-10 min, uitgevoerd onder de microscoop)
- Draai de muis terug naar de rugligging, controleer de diepte van de anesthesie door een teenknufje en voeg een druppel zoutoplossing toe aan de snijplaats.
- Bind de eerste ligatuur rond de katheter en de halsader met 2-3 knopen zo ver mogelijk om de ader te ligateeren en de katheter aan de buitenkant te verankeren. Verplaats de tweede ligatuur zo dicht mogelijk bij de borstspieren.
- Verkort de katheter tot de vereiste lengte zodat ~3-5 mm van de katheter in de ader zit door met een microschaar in een diagonale hoek te snijden om een scherp uiteinde te creëren.
- Prik een gat in de ader met behulp van een naald van 27 G die is bevestigd aan een spuit van 1 ml gevuld met zoutoplossing door aan de beveiligde schedelligatuur te trekken en de naald parallel aan de ader te duwen.
OPMERKING: Als bloed uit de terugstroom uit de ader lekt, gebruik dan een wattenstaafje om druk uit te oefenen totdat het bloeden stopt. - Breng de katheter op dezelfde manier in de ader in door aan de beveiligde schedelligatuur te trekken en de katheter in de ader te schuiven met behulp van het gebogen pincet. Druk op de katheter totdat deze is uitgelijnd met de ader.
- Bind de tweede ligatuur met 2-3 knopen over het gebied waar de katheter in de ader wordt ingebracht en controleer of er geen bloedlekkage is. Een derde ligatuur en een deel van het lokale vetweefsel kunnen worden gebruikt om de katheter extra vast te zetten.
- Knip het overtollige uiteinde van beide ligaturen af met een microschaar en voeg een druppel zoutoplossing toe.
- Sluit de huid met 4-0 absorbeerbare onderbroken hechtingen.
- Injecteer de muis met 10% glucose in zoutoplossing bij 10 μL/g muis subcutaan.
- Injecteer de muis met het gewenste volume remmer of PBS/zoutoplossing door het vorkuiteinde van het handlinggereedschap te gebruiken om de beschermende aluminium dop te verwijderen en vervolgens het magnetische uiteinde om de knop vast te houden en te injecteren met een spuit van 1 ml die aan de injector is bevestigd.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen lucht of luchtbellen in de injectiespuit zitten door op de zuiger te drukken totdat er een druppel vloeistof uitkomt voordat u injecteert. Houd positieve druk op de zuiger terwijl u de spuit met de injector loskoppelt van de VAS om te voorkomen dat bloed in de katheterpunt wordt getrokken en katheterblokkade ontstaat. - Breng een povidon-jodium wondspray aan op de gesloten wond en laat de muis het bewustzijn herstellen onder een verwarmingslamp en breng het vervolgens terug naar de kooi met 7,5 mg piritramide (voor langdurige pijnbestrijding) en 20 ml 5% glucose in 200 ml drinkwater gedurende 3 dagen na de operatie.
- Controleer de muizen meerdere keren per dag op tekenen van pijn of angst.
- Dagelijkse injecties (<5 min)
- Plaats voor dagelijkse injectie de muis in de anesthesiekamer op 3% -4% isofluraan gemengd met 2 L / min O2 totdat deze bewusteloos is en de ademhalingsfrequentie wordt vertraagd en injecteer vervolgens zoals in stap 2.12.10. Controleer de nek op tekenen van zwelling na injectie, wat erop zou wijzen dat de katheter niet langer in de ader wordt ingebracht. Houd er ook rekening mee dat injectie niet mogelijk is als de katheter is afgesloten.
OPMERKING: Een injectie van 10 μL/g muisgewicht 1x per dag wordt goed verdragen door de muizen.
- Plaats voor dagelijkse injectie de muis in de anesthesiekamer op 3% -4% isofluraan gemengd met 2 L / min O2 totdat deze bewusteloos is en de ademhalingsfrequentie wordt vertraagd en injecteer vervolgens zoals in stap 2.12.10. Controleer de nek op tekenen van zwelling na injectie, wat erop zou wijzen dat de katheter niet langer in de ader wordt ingebracht. Houd er ook rekening mee dat injectie niet mogelijk is als de katheter is afgesloten.
3.3D echografie
- Bereid het ultrasone beeldvormingssysteem, de verwarmingstafel en de gelwarmer voor, bevestig de transducer aan het systeem en stel deze boven het podium in een dwarse positie (d.w.z. loodrecht op de wervelkolom van de muis).
- Met behulp van de ultrasone software kunt u de instellingen aanpassen op een winst van 30 dB, een beelddiepte van 9,0 mm en een beeldbreedte van 8,08 mm.
- Plaats de muis in de anesthesiekamer op 3%-4% isofluraan gemengd met 2 L/min O2 totdat hij bewusteloos is. Verplaats de muis naar een verwarmde tafel (37 °C) in rugligging en handhaaf de isofluraanane-anesthesie op 1,8% -2% door een neuskegel.
- Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Scheer de vacht op de buik van de muis. Breng indien nodig 1 min ontharingscrème aan, veeg af en maak schoon met vochtig gaas.
- Voeg een druppel elektrodegel toe aan elk van de vier elektrocardiogram (ECG) elektroden op het podium en plak de muizenuiteinden erop.
- Verspreid warme ultrasone gel op de buik van de muis en laat de zender zakken om deze in contact te brengen met het dier.
- Identificeer de aorta als een cirkelvormig snel pulserend vat.
OPMERKING: De inferieure vena cava (IVC) bevindt zich naast de aorta en als de sonde stevig wordt ingedrukt, wordt de IVC gecomprimeerd terwijl de aorta stabiel blijft. Bevestiging dat het geanalyseerde vat de aorta is in plaats van de IVC kan worden verkregen met behulp van de pulsgolf Doppler (PW-modus), met een hoek van 65°. De aorta zal een hoge pulsgolfsnelheid hebben. - Lokaliseer de linker nierslagader en onderzoek het gebied handmatig tot 12 mm schedelvormig om ervoor te zorgen dat er geen interferentie is in het interessegebied (d.w.z. suprarenale aorta). Keer terug naar de linker nierslagader en stel de sonde in op 6 mm schedelvormig van de linker nierslagader.
OPMERKING: De 3D-echografie registreert de opgegeven lengte (d.w.z. 12 mm) vanaf halverwege (6 mm) caudaal vanaf het punt van oorsprong en tot de opgegeven lengte (12 mm) craniaal. Stappen voor het oplossen van problemen voor interferentie zijn onder meer iets naar beneden drukken met de transducer, de transducer optillen en vervolgens weer verlagen, meer ultrasone gel aanbrengen en de hoek van het podium kantelen. - 3D echografie acquisitie
- Stel de ademhalingsgating in op 25% vertraging en een venster van 50% en de ECG-trigger (T1) op 50 ms (om piek systolische dilatatie van de aorta te registreren).
OPMERKING: Respiratoire gating kan voor elk dier worden geoptimaliseerd op basis van de ademhalingsfrequentie en inspanning om ervoor te zorgen dat bewegingsartefacten worden verwijderd. - Stel uit de 3D-opties de scanafstand in op 11,96 mm met een stapgrootte van 0,076 mm, wat resulteert in 157 frames.
- Het programma verwerft automatisch de 157 frames in ongeveer 1-2 minuten. Blader door om te controleren op beeldkwaliteit, herhaal als het ondermaats is en sla de afbeelding op.
- Stel de ademhalingsgating in op 25% vertraging en een venster van 50% en de ECG-trigger (T1) op 50 ms (om piek systolische dilatatie van de aorta te registreren).
- 2D diameter acquisitie
- Schakel de ademhalingsgaten en ECG-trigger uit en lokaliseer handmatig het gebied met de grootste diameter in de 12 mm-strook van de suprarenale aorta.
- Verkrijg een B-modus afbeelding16.
- Bovendien, zonder de transducer te verplaatsen, verwerft u een ECG-gated kilohertz visualisatie (EKV) afbeelding met de standaardinstellingen van het systeem op dezelfde locatie.
- De scan beëindigen
- Veeg de ultrasone gel van de buik en breng de muis terug naar zijn kooi. Controleer de muis totdat deze volledig is hersteld.
4. Ultrasone analyse
- Volume analyse
- Open in de analysesoftware de afbeelding in de 3D-modus en druk in het menu Beeldverwerking op Laden in 3D, waardoor de 157 2D-frames worden gecompileerd in een 3D-afbeelding (d.w.z. kubus).
- Kies in het menu Volumemeting de optie Parallelle & Rotatiemethoden en vervolgens geeft de software de 3D-afbeelding in één deelvenster weer.
- Druk onder Volume op Start en teken de eerste contour rond de binnenwand van de aorta door te klikken om het eerste punt toe te voegen, de cursor rond de aorta te verplaatsen en vervolgens met de rechtermuisknop te klikken om de contour te voltooien.
- Sla 9-10 frames (0,75-1 mm) over en teken vervolgens op dezelfde manier een andere contour. Herhaal deze stappen totdat het laatste frame is bereikt. Dit moet resulteren in 16-17 contouren.
OPMERKING: De eerste en laatste frames moeten contouren hebben getekend om het juiste volume over 12 mm te kunnen berekenen. - Selecteer de eerste contour in het menu en kies Verfijnen. Hiermee wordt het randdetectiealgoritme geïnitieerd om de lijn nauw aan te passen aan de vaatwand. Verplaats de punten op de contour door ze naar een nieuwe positie te slepen, zodat de contour de binnenwandrand van de aorta nauwkeurig uitlijnt.
OPMERKING: In het Ang-II-model kan een intramurale trombus aanwezig zijn. Aangezien dit een gemeenschappelijk kenmerk van dit model is, moet de volumemeting de trombus omvatten. - Verfijn alle contouren en druk op Finish om de analyse op te slaan. Het berekende volume wordt weergegeven in de linkerbenedenhoek.
- Diameter analyse
OPMERKING: Diametermetingen kunnen van binnen naar binnen, buiten naar buitenmuur of binnen naar buitenmuur worden uitgevoerd, maar moeten consistent zijn voor alle metingen. In het Ang-II-model kan echter een intramurale trombus aanwezig zijn, die in de analyse moet worden opgenomen.- Uit de afbeelding in de 3D-modus: evalueer de 157 frames om de maximale diameter te identificeren door visuele inspectie. Kies vervolgens in het menu Meting de optie Lineair en teken meerdere lijnen over de aorta om de grootste diameter te bepalen.
- Uit het B-mode of EKV (ECG-gated kilohertz visualization) beeld: Identificeer in de cine loop de maximale expansie van de aorta (bij systole) door visuele inspectie. Kies vervolgens in het menu Meting de optie Lineair en teken meerdere lijnen over de aorta om de grootste diameter te bepalen.
OPMERKING: Het ECG kan worden gebruikt om de hartcyclus te bepalen, maar visuele identificatie levert nauwkeurige resultaten op.
Representative Results
Representatieve resultaten tonen de ontwikkeling en progressie van de suprarenale aneurysmata zoals gecontroleerd door echografie bij baseline, dag 8 en dag 27 (figuur 1A). Een trichrome vlek (figuur 1B) van de dag 27 aorta in figuur 1A illustreert verder de morfologie van het gevormde aneurysma met wanddissectie en intramurale trombus. Het aortavolume (mm3) werd bepaald over een rek van 12 mm14 en de maximale aortadiameter werd bovendien gemeten op basis van de EKV-beelden. Een drempel van 125% volumegroei van baseline tot dag 8 werd vastgesteld voor het definiëren van de initiële aneurysma-ontwikkeling. Op basis van gegevens verzameld over 2 jaar (2020-2021, n = 157), slaagde slechts 9% van de dieren er niet in om een AAA te vormen volgens deze cutoff. 35% van de muizen ervoer echter aortarupturen (thoracale of abdominale) voorafgaand aan katheterimplantatie op dag 9, wat resulteerde in een totaal van 56% van de resterende dieren met een vastgestelde AAA-ziekte die vatbaar is voor stratificatie in behandelingsgroepen (figuur 1C). Van belang is dat onder onze historische PBS-controles (n = 21) aneurysma's zich in verschillende mate ontwikkelden (bereik: 128% -314%, gemiddelde 199% ± 55% SD-aortavolumegroei op dag 8). Belangrijk is dat een omgekeerde relatie werd waargenomen tussen de initiële expansie en verdere ziekteprogressie, d.w.z. 55% van de snel voortschrijdende aneurysma's (>200% volumegroei op dag 8) vorderde niet verder tot dag 27, terwijl 80% van de andere aneurysma's (>125% en <200% volumegroei op dag 8) bleef groeien tot het einde van het experiment (figuur 1D).
Zoals onlangs gemeld 14,17, zijn de beschreven methoden met succes vastgesteld, gevalideerd en geïmplementeerd, bijvoorbeeld om het therapeutische effect van een histoncitirnatieremmer (GSK484, voor de remming van neutrofiele extracellulaire valvorming) te documenteren bij het blokkeren van de progressie van gevestigde AAA. ApoE-deficiënte muizen kregen Ang-II bij 1000 ng / kg / min door subcutaan geïmplanteerde osmotische pompen gedurende 28 dagen. Dieren werden gestratificeerd 1:1 naar GSK484 (0,2 μg/g/dag) of PBS-behandeling op basis van het aortavolume gemeten op dag 8 en ondergingen de halsaderkatheterisatieprocedure op dag 9. Geneesmiddelinjecties werden dagelijks uitgevoerd in een volume van 10 μL/g muisgewicht tot het einde van het onderzoek17. Figuur 2 toont voorbeeldige (n = 2/groep) echografieresultaten (tijdsverloop van absolute en relatieve volume- of diameter-uitbreiding), waaruit blijkt dat GSK484-behandeling de AAA-progressie remde, terwijl de aneurysma's bleven toenemen bij controlemuizen.
Figuur 1: AAA-vorming en progressie in het Ang-II-muismodel zoals gedetecteerd door 3D-echografie. (A) De suprarenale aorta werd gecontroleerd door 3D-echografie bij baseline (BL), dag 8 (d8) en dag 27 (d27) na Ang-II-pompimplantatie. Het volume werd gemeten over een 12 mm rek van de suprarenale aorta (157 frames) op basis van een 3D gereconstrueerd beeld. De maximale aortadiameter werd bepaald aan de hand van EKV-beelden. (B) Trichrome vlek van een dwarsdoorsnede van de dag 27 aorta na muisoffer en orgaanverzameling. De aanwezigheid van een aortadissectie wordt aangegeven met L1/L2 (lumen 1 en lumen 2) en de intramurale trombus wordt aangeduid met * in A en B. (C) Incidentie van AAA (>125% aortavolumegroei van BL) op dag 8 en aortarupturen binnen de eerste 9 dagen (thoracale of abdominale) uit een dataset verzameld over 2 jaar (n = 157). (D) Progressiefrequentie van dag 8 tot dag 27 van aanvankelijk snel vormende (>200% aortavolumegroei van BL tot dag 8) versus matig groeiende (>125% en <200% aortavolumegroei van BL tot dag 8) aneurysma's bij PBS-controlebehandelde muizen (n = 21). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeldige resultaten van remming van histoncitregllination om AAA-progressie in het Ang-II-model te blokkeren door intraveneuze injectie van GSK484 of PBS via vasculaire toegangsknop. (A) Aortavolume (mm3) zoals gemeten over een 12 mm rek van de suprarenale aorta. (B) Berekende groei van het aortavolume vanaf baseline (BL = 100%). (C) Maximale aortadiameter zoals bepaald op basis van EKV-beelden. (D) Berekende groei van de aortadiameter uit BL. GSK484-gegevens werden geëxtraheerd uit een eerder gepubliceerde studie17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het Ang-II-model is een van de meest gebruikte muismodellen van AAA vanwege de lage technische eisen en specifieke kenmerken die lijken op de ziekte van de mens 3,6. De operatietijd is ongeveer 10 minuten per dier en de implantatie van de onderhuidse pomp wordt goed verdragen door de muizen als de onderhuidse zak voldoende breed is en laag op de rug van het dier wordt geplaatst, weg van de incisieplaats, om de wondgenezing niet te verstoren. Wanneer de huid strak rond de pomp is, kan weefselirritatie optreden, wat ontsteking en scheevorming kan veroorzaken en mogelijk het afgiftemechanisme van de pomp door osmotische druk kan verstoren. Het meten van het volume Ang-II dat in de pomp achterblijft op het moment van dierenoffers geeft inzicht in de vraag of de Ang-II gedurende de 28 dagen met succes is vrijgegeven.
Het Ang-II-model is onlangs voorgesteld om zeer geschikt te zijn om aorta-aneurysma en dissectieprogressie te bestuderen, omdat het gelijkenis vertoont met menselijke kenmerken van beide6. Belangrijk is dat het testen van kandidaat-geneesmiddelen om aorta-expansie te blokkeren en remodellering te beïnvloeden, zou overeenkomen met de huidige klinische vraag. In onze experimentele setting werd voorafgaand aan de start van de behandeling een cutoff voor aneurysmavorming gedefinieerd op basis van 125% volumegroei op dag 8 ten opzichte van baseline, wat de natuurlijke variatie in absolute aortagrootte bij muizen verklaart. De drempel en het tijdstip werden afgeleid van een initieel tijdsverloop dat de vernietiging van de aortawand in de histologie bevestigde (gegevens niet getoond) en resulteerde in 35% breuken en 56% waargenomen AAAs voorafgaand aan katheterimplantatie. Hoewel een minimumdrempel van vastgestelde ziekte werd toegepast voor studie-inclusie, werd vervolgens waargenomen dat een hoge mate van initiële aorta-expansie ook de experimentele toepasbaarheid kan beperken. Aneurysmata die snel evolueerden naar >200% volume op dag 8 groeiden in 55% van de gevallen niet verder dan die grootte (figuur 1D). Hiermee moet rekening worden gehouden bij het experimenteel ontwerp en de berekening van de steekproefgrootte, omdat dit het ware effect van een behandeling kan maskeren. Een ander facet van dit model zijn de frequente aortarupturen (thoracale of abdominale), die optreden met snelheden van 20% -40% en meestal binnen de eerste 10 dagen na Ang-II pompimplantatie 3,18,19. Dus, door het begin van de behandeling te kiezen voor dag 9, werd een hoog percentage gevestigde aneurysma's bereikt en werd de halsaderkatheterisatie in wezen uitgevoerd op muizen waarvan werd verwacht dat ze tot het einde van het experiment zouden overleven (slechts 3/24 muizen in onze historische controlegroep scheurden na dag 9), waardoor tijd en moeite werden bespaard, en kosten.
Afgezien van de aortarupturen, die een ernstige aandoening vormen, werd de gelijktijdige implantatie van de katheter met vasculaire toegangsknop en de osmotische pomp goed verdragen door de muizen, zonder noemenswaardig effect op de mobiliteit of het gedrag na herstel van de operatie. De jugulaire aderkatheterisatieprocedure duurt ongeveer 30 minuten voor getrainde onderzoekers. De duur van de blootstelling aan (isofluraan) anesthesie moet tot een minimum worden beperkt en de ademhalingsfrequentie van het dier moet nauwlettend worden gecontroleerd om ademhalingsdepressie te voorkomen, wat kan leiden tot een fatale afloop als deze niet wordt opgelost20. Bloedverlies na het doorboren van de halsader voor het inbrengen van katheter - wat leidt tot dierensterfte als het ernstig is - kan mogelijk optreden wanneer de halsader niet goed is geligialiseerd of een zijtak die in het geïsoleerde gebied van het vat wordt gevoerd, niet is afgesloten. In dat geval moet druk met een wattenstaafje op de punctieplaats worden uitgeoefend totdat de bloedlekkage vertraagt of stopt, waarna het inbrengen en bruinen van de katheter zo snel mogelijk moet worden uitgevoerd; een klein stukje van het collageen wondverband kan tijdelijk worden gebruikt om te helpen bij hemostase.
Katheterdoorgankelijkheid is een van de belangrijkste factoren, omdat katheterafkoppeling van de ader of de toegangsknop resulteert in onjuiste medicijnafgifte waarbij het medicijn in de onderhuidse ruimte lekt. Naar aanleiding van de aanbeveling van de fabrikant van een overlap van minimaal 3 mm tussen de katheter en de metalen connecter, werd slechts één geval van katheter ontkoppeling aan de knopzijde (aangegeven door de geïnjecteerde vloeistof die lekt uit de incisieplaats bij de knop) gedurende 3 jaar geregistreerd in dit model (2020-2021, n = 73), dat werd verholpen door de wond te openen en de verbinding tijdens de operatie te herstellen. Bovendien werd een doorgankelijkheidspercentage van de katheter van ongeveer 10% in onze historische PBS-controlegroep (2/21) ervaren als gevolg van katheterocclusie (waardoor het onmogelijk werd om te injecteren), katheterafkoppeling van de ader (aangegeven door schijnbare zwelling in de nek tijdens injectie) of wondgenezingscomplicaties. Deze problemen kunnen verband houden met zelf toegebrachte verwondingen, d.w.z. muizenkrabben of -beten. Met name medicamenteuze behandelingen die de wondgenezing verstoren, kunnen het aantal mislukkingen verhogen. Stappen voor probleemoplossing om de doorgankelijkheid te verbeteren, zijn onder meer het vergroten van de lengte van de katheter die in de ader wordt ingebracht, ervoor zorgen dat ligaturen strak rond de katheter en ader worden geknoopt en het toepassen van de positievedruktechniek volgens de aanbeveling van de fabrikant, zoals beschreven in stap 2.12.10., tijdens het injecteren. De doorgankelijkheid van de katheter moet bovendien worden geverifieerd op het moment van het offeren van dieren door middel van dissectie en visuele inspectie onder de microscoop. Van belang is dat het dagelijkse volume van de geïnjecteerde geneesmiddeloplossing zorgvuldig moet worden overwogen. Aangezien het plasmavolume de bloeddruk reguleert, kan het injectievolume de AAA-expansie beïnvloeden en daarom moeten controledieren de schijnprocedure met dragervolume ontvangen. Op basis van onze ervaring (en ongepubliceerde waarnemingen) lijkt een dagelijkse hoeveelheid tot 250 μL PBS goed te worden verdragen. Ten slotte kan, net als bij de pompimplantatie, huidirritatie optreden rond de geïmplanteerde vasculaire toegangsknop. Als ontsteking vergezeld van gedevitaliseerd of necrotisch weefsel wordt waargenomen, moet wonddebridement worden uitgevoerd door niet-levensvatbaar weefsel te verwijderen (necrotisch weefsel zal vaak op natuurlijke wijze van de wond scheiden) en de huid moet indien nodig worden gehecht; als ontsteking en necrose uitgebreid zijn, moeten het welzijn van het dier en de humane eindpunten volgens de richtlijnen worden overwogen.
Enkelvoudige en dubbele dorsale implantatie van de osmotische pomp en/of de VAS interfereerde niet met het ultrasone signaal of met het vastzetten van de muis in een geschikte positie op de echografiefase. De geautomatiseerde verwerving van 157 frames over 12 mm om een 3D-beeld van de aorta weer te geven voor volumemeting is een eenvoudige en snelle procedure14, die alleen vereist dat de aorta vrij is van interferentie over het interessegebied. Een valkuil in deze context is het uitoefenen van te veel druk met de transducer tijdens een poging om het beeld van interferentie te wissen, wat de geautomatiseerde meting kan onderbreken als de ademhalingsfrequentie wordt beïnvloed door de compressie van de ribben wanneer beelden van het schedeleinde van de abdominale aorta worden geregistreerd. Diameter wordt traditioneel gemeten in beelden die zijn verkregen met behulp van B-modus door de operator die handmatig zoekt naar het gebied met de maximale diameter tijdens het uitvoeren van de ultrasone analyse. Een vooruitgang op de B-mode beelden zijn de EKV-beelden, die kleine aortabewegingen kunnen oplossen om een hoogwaardig, vertraagd beeld van de pulserende aorta te produceren. Bovendien kan de maximale aortadiameter worden bepaald aan de hand van de verworven 3D-frames, waarbij de 157 beelden een uitgebreid overzicht bieden van de aorta die bij systole is genomen (vanwege de ingestelde ECG-trigger).
Kortom, het gepresenteerde gecompileerde protocol biedt een betrouwbare en reproduceerbare workflow voor i.v. medicijntoediening in een muismodel van Ang-II geïnduceerde AAA en voor het bewaken van de aortagrootte door 3D-echografie. De tijdstippen van monitoring en werking kunnen worden aangepast aan de specifieke behoeften en de halsaderkatheterisatie kan afzonderlijk worden uitgevoerd voor elke experimentele opstelling die toediening van specifieke stoffen via i.v. injecties vereist. De VAS kan ook worden gebruikt voor herhaalde bloedafname als een kathetervergrendelingsoplossing wordt gebruikt om stolling te voorkomen. De beschreven 3D-echografieprocedure kan worden aangepast om de infraroodaorta te meten, waarbij aneurysma's zich ontwikkelen bij acute belediging in elastase- of CaCl2-gebaseerde muismodellen van AAA. Hoewel 3D-echografie-acquisitie het voordeel heeft dat het een overzicht geeft van het getroffen aortagebied en de aneurysmamorfologie, is de beeldacquisitie tijdrovender en dus mogelijk kostenintensiever. Een andere beperking van het protocol die moet worden erkend, is de noodzaak dat de dieren kort worden verdoofd voor intraveneuze injecties, terwijl intraperitoneale toediening over het algemeen wordt uitgevoerd op bewuste muizen.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
We willen graag de teams van Prof. Podesser en Prof. Ellmeier (Dept. of Biomedical Research and Core Facility for Laboratory Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna) bedanken voor hulp bij de dierproeven. De AAA-trichrome kleuring werd vriendelijk uitgevoerd door Monika Weiss en Prof. Peter Petzelbauer (Afdeling Dermatologie, Medische Universiteit van Wenen). Dit werk werd ondersteund door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds [SFB-project F 5409-B21]. Marc Bailey wordt persoonlijk ondersteund door de British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
