Summary
Este protocolo describe la implantación consecutiva de una bomba osmótica para inducir aneurisma aórtico abdominal mediante la liberación de angiotensina II en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE) y de un puerto de acceso vascular con un catéter de vena yugular para tratamiento farmacológico repetido. El monitoreo del desarrollo del aneurisma por ultrasonido 3D se lleva a cabo de manera efectiva a pesar de los implantes dorsales.
Abstract
Dado que faltan opciones de tratamiento farmacéutico en el tratamiento clínico del aneurisma aórtico abdominal (AAA), se aplican modelos animales, en particular modelos de ratón, para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad e identificar posibles objetivos terapéuticos. La prueba de nuevos candidatos a fármacos para bloquear el crecimiento de AAA en estos modelos generalmente requiere la administración repetida de fármacos durante el curso del experimento. Aquí, describimos un protocolo compilado para la inducción de AAA, la inserción de un catéter intravenoso para facilitar la terapia prolongada y el monitoreo serial de AAA mediante ultrasonido 3D. Los aneurismas son inducidos en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE) por la liberación de angiotensina II durante 28 días de minibombas osmóticas implantadas por vía subcutánea en la espalda del ratón. Posteriormente, se realiza el procedimiento quirúrgico para el cateterismo de la vena yugular externa para permitir el tratamiento diario con medicamentos intravenosos o el muestreo repetido de sangre a través de un botón de acceso vascular subcutáneo. A pesar de los dos implantes dorsales, el monitoreo del desarrollo de AAA se facilita fácilmente mediante el análisis secuencial de ultrasonido 3D semiautomatizado, que proporciona información completa sobre la expansión del diámetro y el volumen aórtico y sobre la morfología del aneurisma, como se ilustra con ejemplos experimentales.
Introduction
Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una dilatación patológica de un vaso debido a procesos inflamatorios y destructivos de tejidos en la pared aórtica que finalmente pueden conducir a la ruptura y la muerte del paciente. A pesar de los logros considerables en la reparación quirúrgica de AAA, hasta la fecha falta un tratamiento farmacológico conservador para bloquear la progresión de la expansión del aneurisma y potencialmente reducir el riesgo de ruptura. Se han desarrollado modelos animales para dilucidar los desencadenantes y mediadores de la enfermedad y para probar nuevos enfoques de terapia. Los modelos de ratón de AAA se aplican ampliamente y cubren las diferentes observaciones del tejido humano. Debido a sus diferencias pathomechanísticas, a menudo se aplica más de un modelo para investigar la función particular de las moléculas/vías o la eficacia de posibles fármacos terapéuticos 1,2. Entre los modelos más utilizados de inducción de AAA se encuentra la administración de angiotensina-II (Ang-II) en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE KO)3, que tiene una patogénesis más crónica en comparación con los modelos que se basan en la formación de aneurismas a partir de un insulto agudo a la pared aórtica 4,5. Por lo tanto, el modelo Ang-II parece particularmente adecuado para monitorear la progresión de la enfermedad y recientemente se demostró que se parece mucho a la enfermedad AAA humana en lo que respecta a las respuestas metabólicas e inflamatorias6. En particular, el modelo Ang-II presenta no solo el desarrollo de AAA, sino también la formación de aneurismas torácicos, así como la disección aórtica con formación de trombos intramurales.
Los tratamientos dirigidos a atacar la progresión de AAA ya establecido en lugar de prevenir el inicio de la enfermedad pueden tener mayor valor traslacional ya que los pacientes presentan una condición preexistente que requiere tratamiento 7,8. Para un diseño experimental comparable, el tamaño aórtico debe ser monitoreado antes y después de la inducción AAA para definir un umbral de desarrollo de la enfermedad y potencialmente estratificar a los ratones en grupos de tratamiento.
El modo de administración del fármaco depende de la absorción y estabilidad de la sustancia respectiva. Las inyecciones intraperitoneales (i.p.) se utilizan con mayor frecuencia debido a su facilidad de aplicación, no requieren anestesia y la falta de restricciones de volumen de inyección9. Sin embargo, la farmacocinética debe tenerse en cuenta al elegir la vía de administración, ya que las sustancias administradas i.p. se absorben principalmente a través de la circulación portal hepática y pueden sufrir metabolismo hepático antes de alcanzar la circulación, lo que podría dar lugar a concentraciones plasmáticas variables dependiendo del efecto de primer paso10. La inyección intravenosa (i.v.) produce la mayor biodisponibilidad de sustancias, y el desafío del acceso intravenoso repetitivo puede ser evitado por el uso de catéteres y puertos de acceso vascular para la administración diaria11,12,13. Con respecto al entorno AAA, la distribución del fármaco en circulación facilita la exposición directa al aneurisma a concentraciones definidas.
Aquí, describimos un flujo de trabajo para inducir AAA en el modelo de ratón Ang-II a través de la implantación subcutánea de una bomba osmótica, para el tratamiento diario de medicamentos intravenosos a través de un puerto de acceso vascular conectado a un catéter insertado en la vena yugular externa, así como para el monitoreo del tamaño del aneurisma a través de ultrasonido 3D14 a pesar de la presencia de dos implantes dorsales.
Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética local y el Ministerio de Ciencia de Austria (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), de conformidad con la Directiva Europea 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos y la Ley de Experimentación con Animales de Austria de 2012. Los criterios de valoración humanos se establecieron de la siguiente manera: pérdida del ≥15% del peso corporal, evitar la ingesta de alimentos y/o agua, actividad reducida (hipocinesia) o discinesia, o temblores prolongados, rascados, dificultad para respirar o postura encorvada a pesar del manejo del dolor / síntomas. Si es necesario, un animal es sacrificado bajo anestesia profunda, es decir, un cóctel de sobredosis de ketamina (aprox. 100 mg / kg) y xilazina (aprox. 5 mg / kg), o por dislocación cervical. Para los procedimientos quirúrgicos, se utilizan técnicas asépticas y guantes estériles / limpios en todas partes.
1. Implantación de la bomba
- Anestesia
- Mantener ratones deficientes en ApoE (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) con una dieta normal y preferiblemente incluir animales machos de 12-14 semanas de edad en los experimentos para representar el predominio masculino en la enfermedad humana3.
- 1 día antes de la cirugía (d-1, pre-OP), preparar y llenar las bombas osmóticas con la concentración deseada de angiotensina II según el peso del ratón siguiendo el protocolo del fabricante e incubar las bombas en solución salina a 37 °C durante la noche15.
Ejemplo: Para un ratón de 25 g, utilizando bombas osmóticas (consulte la Tabla de materiales) con una velocidad de suministro de 1000 ng / kg / min y una velocidad de bombeo de 0.25 μL / h durante 28 días, disuelva 1.8 mg de Ang-II en 300 μL de solución salina (concentración de 6000 ng / μL para administrar 1500 ng / h de Ang-II). Cargue la solución con la aguja de llenado romo en la bomba y luego inserte el moderador de flujo para cerrar la bomba. - Coloque el ratón en la cámara de anestesia al 3% -4% de isoflurano mezclado con 2 L / min O2 hasta que esté inconsciente. Mueva el ratón a una mesa calentada (37 °C) en posición prona y mantenga la anestesia con isoflurano al 1,8%-2% a través de un cono nasal.
- Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad.
- Inyectar al ratón con buprenorfina al 2,5% en solución salina a 10 μL/g de ratón por vía subcutánea y verificar la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie.
- Afeite un área pequeña en la parte superior izquierda del mouse hacia atrás sobre el omóplato. Aplique una solución de povidona yodada al 10% (p/v) para la desinfección del área afeitada.
- Inserción de la bomba (5-7 min, realizada sin microscopio)
- Compruebe que el ratón está completamente anestesiado por pinzamiento del dedo del pie y haga una incisión transversal de 1 cm en la piel de la parte superior de la espalda con un bisturí entre la línea escapular media y la línea escapular izquierda.
- Sostenga la piel con fórceps y use tijeras romas y curvas para hacer un bolsillo subcutáneo empujando hacia la extremidad posterior izquierda. Abra las tijeras, saque las tijeras abiertas del corte y repita para ensanchar el bolsillo.
- Inserte suavemente la bomba en el bolsillo con el moderador de flujo hacia la cola (para minimizar la posible interferencia de la liberación de Ang-II por el sitio de la incisión).
NOTA: El bolsillo no solo debe ser lo suficientemente ancho para la inserción de la bomba, sino también para que la piel no esté apretada alrededor de la bomba, y debe haber al menos 5 mm entre la bomba y el sitio de la incisión para permitir una cicatrización óptima de la herida. - Cerrar la herida con suturas interrumpidas absorbibles 4-0.
- Inyectar al ratón con 10% de glucosa en solución salina a 10 μL/g de ratón por vía subcutánea.
- Aplique el aerosol de povidona yodada para heridas en la herida cerrada y permita que el ratón recupere la conciencia bajo una lámpara de calentamiento, luego devuélvalo a la jaula con 7.5 mg de piritramida (para el manejo prolongado del dolor) y 20 ml de glucosa al 5% en 200 ml de agua potable durante 3 días después de la operación.
- Revise a los ratones varias veces al día para detectar signos de dolor o angustia.
NOTA: Dado que las rupturas aórticas ocurren a una tasa del 20% -40% y predominantemente dentro de los primeros 3-10 días después de la operación, el riesgo de dolor severo prolongado o angustia debe minimizarse mediante el monitoreo frecuente de los animales. Las principales indicaciones de ruptura inminente incluyen: separación del grupo, postura encorvada, disminución de la movilidad (hasta el punto de parálisis de las extremidades posteriores) y disminución o falta de respuesta durante la manipulación.
2. Cateterismo de vena yugular
NOTA: Este procedimiento quirúrgico requiere un microscopio con un aumento de 8x-10x.
- Usando el sistema de acceso vascular (consulte la Tabla de materiales), prepare el catéter cortando el lado 3Fr a la longitud deseada (~ 5-7 mm antes del anclaje de silicona) y empujando el catéter sobre el conector metálico 22 G del sistema de acceso vascular (VAS) con al menos 3 mm de superposición. Coloque la tapa de aluminio en el botón para proteger el puerto.
- Prepare ligaduras de seda 6-0 de 1-1.5 cm de largo.
- Coloque el ratón en la cámara de anestesia al 3% -4% de isoflurano mezclado con 2 L / min O2 hasta que esté inconsciente.
- Mover el ratón a una mesa caliente (37 °C) en posición supina y mantener la anestesia con isoflurano al 1,8%-2% a través de un cono nasal.
- Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad.
- Inyectar al ratón con buprenorfina al 2,5% en solución salina a 10 μL/g de ratón por vía subcutánea.
- Afeite el pelaje desde el lado derecho del cuello en el lado ventral y en el lado derecho de la parte superior de la espalda (el lado izquierdo tendrá la bomba osmótica implantada).
- Aplique la solución de povidona yodada para la desinfección del área afeitada.
- Compruebe que el ratón está completamente anestesiado por pellizco del dedo del pie.
- Preparación de la vena yugular (5-10 min, realizada bajo el microscopio)
- Haga una incisión cutánea supraclavicular transversal de 0,5 cm en el lado derecho del cuello sobre la clavícula derecha.
- Use pinzas microquirúrgicas romas para separar el tejido conectivo y la grasa, exponiendo la vena yugular externa. Evite desgarrar pequeños vasos sanguíneos en la grasa.
- Aislar al menos 5 mm del vaso, cerca de los músculos pectorales.
- Disección roma del tejido debajo de la vena usando micro pinzas dobladas y pasa a través de 2-3 de las ligaduras 6-0.
NOTA: Si se identifican ramas laterales en el área de interés, la ligadura debe insertarse para que sea caudal a la rama lateral o la rama lateral debe ligarse permanentemente aislando y atando con una ligadura 6-0. - Meter las ligaduras y añadir una gota de solución salina al sitio.
- Implantación de botón (5-7 min, realizada sin microscopio)
- Voltee el ratón y colóquelo en posición prona; Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie y aplique la solución de povidona yodada para desinfectar el área afeitada.
- Haga una incisión sagital de 1 cm en la parte superior de la espalda con un bisturí entre las líneas escapular media y derecha.
- Use tijeras curvas romas para hacer un bolsillo circular solo un poco más grande que el tamaño del VAS alrededor del sitio de la incisión mediante disección roma.
- Use las tijeras curvas romas para hacer un túnel craneal sobre el hombro derecho hacia la incisión ventral en el cuello abriendo ligeramente las tijeras, luego sacando las tijeras abiertas y repitiendo la acción a medida que se empuja más adentro.
NOTA: El ratón se puede girar en su lado izquierdo para este paso. - Una vez que el túnel ha alcanzado la incisión ventral, pase a través de pinzas quirúrgicas desde la incisión ventral hasta la incisión dorsal.
- Conecte el extremo 3Fr del catéter a la pinza y tire del catéter a través del túnel para que quede fuera de la incisión ventral del cuello y el EVA esté en su lugar en la incisión dorsal.
- Inserte el disco de fieltro quirúrgico del VAS por vía subcutánea en la incisión en la parte posterior.
- Desenganche el catéter y enjuague con solución salina o solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS-/-), verifique la permeabilidad usando el extremo de la horquilla de la herramienta de manipulación para quitar la tapa protectora de aluminio y luego use el extremo magnético para mantener presionado el botón e inyecte con una jeringa de 1 ml conectada al inyector correspondiente hasta que el líquido se escape del extremo 1Fr.
NOTA: El lavado del catéter puede realizarse alternativamente en el paso 2.1. - Presione el botón caudalmente en el bolsillo y cierre la piel sobre el disco de fieltro del VAS, debajo de la brida del VAS, con al menos dos suturas 4-0 interrumpidas cranealmente.
NOTA: Asegúrese de que no haya tensión en la piel alrededor del botón.
- Cateterismo venoso (7-10 min, realizado bajo el microscopio)
- Voltea el mouse hacia atrás a la posición supina, verifica la profundidad de la anestesia pellizcando un dedo del pie y agrega una gota de solución salina al sitio del corte.
- Ate la primera ligadura alrededor del catéter y la vena yugular con 2-3 nudos lo más cranealmente posible para ligar la vena y anclar el catéter al exterior. Mueva la segunda ligadura lo más cerca posible de los músculos pectorales.
- Acorte el catéter a la longitud requerida para que ~ 3-5 mm del catéter esté en la vena cortando con microtijeras en un ángulo diagonal para crear un extremo afilado.
- Perfore un orificio en la vena con una aguja de 27 G conectada a una jeringa de 1 ml llena de solución salina tirando de la ligadura craneal asegurada y empujando la aguja paralela a la vena.
NOTA: Si la sangre del reflujo se filtra de la vena, use un hisopo de algodón para aplicar presión hasta que el sangrado se detenga. - Inserte el catéter en la vena de la misma manera tirando de la ligadura craneal asegurada y deslizando el catéter en la vena con las pinzas dobladas. Empuje el catéter hasta que esté alineado con la vena.
- Ate la segunda ligadura sobre la región donde se inserta el catéter en la vena con 2-3 nudos y verifique que no haya fugas de sangre. Se puede usar una tercera ligadura y parte del tejido graso local para asegurar adicionalmente el catéter.
- Cortar el extremo sobrante de ambas ligaduras con microtijeras y añadir una gota de solución salina.
- Cerrar la piel con suturas interrumpidas absorbibles 4-0.
- Inyectar al ratón con 10% de glucosa en solución salina a 10 μL/g de ratón por vía subcutánea.
- Inyecte al ratón el volumen deseado de inhibidor o PBS/solución salina utilizando el extremo de la horquilla de la herramienta de manipulación para quitar la tapa protectora de aluminio y luego el extremo magnético para sostener el botón e inyectar con una jeringa de 1 ml conectada al inyector.
NOTA: Asegúrese de que no haya aire ni burbujas de aire en la jeringa de inyección presionando el émbolo hasta que salga una gota de líquido antes de inyectar. Mantenga la presión positiva sobre el émbolo mientras desconecta la jeringa con el inyector del VAS para evitar que la sangre entre en la punta del catéter y cause la obstrucción del catéter. - Aplique un aerosol de povidona yodada para heridas en la herida cerrada y permita que el ratón recupere la conciencia bajo una lámpara de calentamiento, luego devuélvalo a la jaula con 7.5 mg de piritramida (para el manejo prolongado del dolor) y 20 ml de glucosa al 5% en 200 ml de agua potable durante 3 días después de la operación.
- Revise a los ratones varias veces al día para detectar signos de dolor o angustia.
- Inyecciones diarias (<5 min)
- Para la inyección diaria, coloque el ratón en la cámara de anestesia al 3% -4% de isoflurano mezclado con 2 L / min O 2 hasta que esté inconsciente y su frecuencia respiratoria disminuya, luego inyecte como en el paso 2.12.10. Revise el cuello para detectar signos de hinchazón después de la inyección, lo que indicaría que el catéter ya no está insertado en la vena. Además, tenga en cuenta que la inyección no será posible si el catéter está ocluido.
NOTA: Una inyección de 10 μL/g de peso de ratón 1x por día es bien tolerada por los ratones.
- Para la inyección diaria, coloque el ratón en la cámara de anestesia al 3% -4% de isoflurano mezclado con 2 L / min O 2 hasta que esté inconsciente y su frecuencia respiratoria disminuya, luego inyecte como en el paso 2.12.10. Revise el cuello para detectar signos de hinchazón después de la inyección, lo que indicaría que el catéter ya no está insertado en la vena. Además, tenga en cuenta que la inyección no será posible si el catéter está ocluido.
3.3D ultrasonido
- Prepare el sistema de imágenes de ultrasonido, la mesa de calentamiento y el calentador de gel, conecte el transductor al sistema y colóquelo por encima del escenario en una posición transversal (es decir, perpendicular a la columna vertebral del ratón).
- Con el software de ultrasonido, ajuste la configuración para obtener una ganancia de 30 dB, una profundidad de imagen de 9,0 mm y un ancho de imagen de 8,08 mm.
- Coloque el ratón en la cámara de anestesia al 3% -4% de isoflurano mezclado con 2 L / min O2 hasta que esté inconsciente. Mover el ratón a una mesa caliente (37 °C) en posición supina y mantener la anestesia con isoflurano al 1,8%-2% a través de un cono nasal.
- Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad.
- Afeite el pelaje en el abdomen del ratón. Aplique crema depilatoria durante 1 minuto si es necesario, luego limpie y limpie con una gasa húmeda.
- Agregue una gota de gel de electrodo a cada uno de los cuatro electrodos de electrocardiograma (ECG) en el escenario y pegue las extremidades del ratón a ellos.
- Extienda gel de ultrasonido tibio en el abdomen del ratón y baje el transmisor para ponerlo en contacto con el animal.
- Identifique la aorta como un vaso circular de pulsación rápida.
NOTA: La vena cava inferior (VCI) se ubicará junto a la aorta, y si la sonda se presiona firmemente, la VCI se comprimirá mientras la aorta permanece estable. La confirmación de que el vaso analizado es la aorta en lugar de la VCI se puede obtener utilizando el Doppler de onda de pulso (modo PW), con un ángulo de 65°. La aorta tendrá una alta velocidad de onda de pulso. - Localice la arteria renal izquierda y examine el área manualmente hasta 12 mm cranealmente para asegurarse de que no haya interferencia en el área de interés (es decir, aorta suprarrenal). Regrese a la arteria renal izquierda y luego coloque la sonda a 6 mm cranealmente desde la arteria renal izquierda.
NOTA: La ecografía 3D registrará la longitud especificada (es decir, 12 mm) comenzando a mitad de camino (6 mm) caudalmente desde el punto de origen y hasta la longitud especificada (12 mm) cranealmente. Los pasos de solución de problemas para la interferencia incluyen presionar ligeramente hacia abajo con el transductor, levantar y luego bajar el transductor nuevamente, aplicar más gel de ultrasonido e inclinar el ángulo del escenario. - Adquisición de ultrasonido 3D
- Ajuste la puerta respiratoria al 25% de retraso y una ventana del 50% y el disparador del ECG (T1) a 50 ms (para registrar la dilatación sistólica máxima de la aorta).
NOTA: La activación respiratoria se puede optimizar para cada animal en función de la frecuencia respiratoria y el esfuerzo para garantizar que se eliminen los artefactos de movimiento. - Desde las opciones 3D, establezca la distancia de escaneo en 11,96 mm con un tamaño de paso de 0,076 mm, lo que da como resultado 157 fotogramas.
- El programa adquirirá automáticamente los 157 fotogramas en aproximadamente 1-2 minutos. Desplácese para verificar la calidad de la imagen, repita si es deficiente y luego guarde la imagen.
- Ajuste la puerta respiratoria al 25% de retraso y una ventana del 50% y el disparador del ECG (T1) a 50 ms (para registrar la dilatación sistólica máxima de la aorta).
- Adquisición de diámetro 2D
- Desactive la activación respiratoria y el desencadenante del ECG, y localice manualmente el área con el diámetro más grande en el tramo de 12 mm de la aorta suprarrenal.
- Adquirir una imagen en modo B16.
- Además, sin mover el transductor, adquiera una imagen de visualización de kilohercios (EKV) activada por ECG con la configuración estándar del sistema en el mismo sitio.
- Finalización del análisis
- Limpie el gel de ultrasonido del abdomen y devuelva el ratón a su jaula. Supervise el ratón hasta que se recupere por completo.
4. Análisis ecográfico
- Análisis de volumen
- En el software de análisis, abra la imagen en modo 3D y, en el menú Procesamiento de imágenes , presione Cargar en 3D, que compilará los 157 fotogramas 2D en una imagen 3D (es decir, cubo).
- En el menú Medición de volumen , elija Métodos paralelos y rotacionales, y luego el software mostrará la imagen 3D en un solo panel.
- En Volumen, presione Inicio y dibuje el primer contorno alrededor de la pared interna de la aorta haciendo clic para agregar el primer punto, moviendo el cursor alrededor de la aorta y, a continuación, haciendo clic con el botón secundario para completar el contorno.
- Omita 9-10 fotogramas (0,75-1 mm) y, a continuación, dibuje otro contorno de la misma manera. Repita estos pasos hasta que se alcance el último fotograma. Esto debería resultar en 16-17 contornos.
NOTA: El primer y el último fotograma deben tener contornos dibujados para que se calcule el volumen correcto sobre 12 mm. - Seleccione el primer contorno del menú y elija Refinar. Esto iniciará el algoritmo de detección de bordes para ajustar estrechamente la línea a la pared del recipiente. Mueva los puntos en el contorno arrastrándolos a una nueva posición para que el contorno recubra con precisión el borde de la pared interna de la aorta.
NOTA: En el modelo Ang-II, un trombo intramural podría estar presente. Dado que esta es una característica común de este modelo, la medición del volumen debe incluir el trombo. - Refine todos los contornos y pulse Finalizar para guardar el análisis. El volumen calculado se mostrará en la esquina inferior izquierda.
- Análisis de diámetro
NOTA: Las mediciones de diámetro pueden realizarse de pared interna a interna, pared externa a exterior o pared interna a externa, pero deben ser consistentes para todas las mediciones. Sin embargo, en el modelo Ang-II, podría haber un trombo intramural, que debe incluirse en el análisis.- Desde la imagen en modo 3D: Evalúe los 157 fotogramas para identificar el diámetro máximo mediante inspección visual. A continuación, en el menú Medición , elija Lineal y dibuje varias líneas a través de la aorta para determinar el diámetro más grande.
- De la imagen en modo B o EKV (visualización de kilohercios con ECG): En el bucle de cine, identifique la expansión máxima de la aorta (en sístole) mediante inspección visual. A continuación, en el menú Medición , elija Lineal y dibuje varias líneas a través de la aorta para determinar el diámetro más grande.
NOTA: El ECG se puede utilizar para determinar el ciclo cardíaco, pero la identificación visual produce resultados precisos.
Representative Results
Los resultados representativos muestran el desarrollo y la progresión de los aneurismas suprarrenales monitoreados por ultrasonido al inicio del estudio, día 8 y día 27 (Figura 1A). Una tinción tricrómica (Figura 1B) de la aorta del día 27 en la Figura 1A ilustra aún más la morfología del aneurisma formado con disección de pared y trombo intramural. El volumen aórtico (mm3) se determinó en un tramo de 12 mm14, y el diámetro aórtico máximo se midió adicionalmente a partir de las imágenes EKV. Se estableció un umbral de crecimiento del volumen del 125% desde el inicio hasta el día 8 para definir el desarrollo inicial del aneurisma. Según los datos recopilados durante 2 años (2020-2021, n = 157), solo el 9% de los animales no lograron formar un AAA de acuerdo con este límite. Sin embargo, el 35% de los ratones experimentaron rupturas aórticas (torácicas o abdominales) antes de la implantación del catéter el día 9, lo que resultó en un total del 56% de los animales restantes con enfermedad AAA establecida susceptible de estratificación en grupos de tratamiento (Figura 1C). Cabe destacar que entre nuestros controles históricos de PBS (n = 21), los aneurismas se desarrollaron en diversos grados (rango: 128% -314%, promedio 199% ± 55% de crecimiento del volumen aórtico SD en el día 8). Es importante destacar que se observó una relación inversa entre la expansión inicial y la progresión posterior de la enfermedad, es decir, el 55% de los aneurismas de progresión rápida (>200% de crecimiento del volumen en el día 8) no progresaron más hasta el día 27, mientras que el 80% de los otros aneurismas (>125% y <200% de crecimiento del volumen en el día 8) continuaron expandiéndose hasta el final del experimento (Figura 1D).
Como se informó recientemente 14,17, los métodos descritos se han establecido, validado e implementado con éxito, por ejemplo, para documentar el efecto terapéutico de un inhibidor de la citrulinación de histonas (GSK484, para la inhibición de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos) en el bloqueo de la progresión de AAA establecido. Los ratones deficientes en ApoE recibieron Ang-II a 1000 ng / kg / min mediante bombas osmóticas implantadas por vía subcutánea durante 28 días. Los animales fueron estratificados 1:1 a GSK484 (0,2 μg/g/día) o tratamiento PBS basado en el volumen aórtico medido el día 8 y se sometieron al procedimiento de cateterismo de vena yugular el día 9. Las inyecciones de drogas se realizaron diariamente en un volumen de 10 μL/g de peso de ratón hasta el final del estudio17. La Figura 2 muestra resultados ecográficos ejemplares (n = 2/grupo) (curso temporal de volumen absoluto y relativo o expansión del diámetro), revelando que el tratamiento con GSK484 inhibió la progresión del AAA, mientras que los aneurismas continuaron agrandándose en ratones control.
Figura 1: Formación y progresión de AAA en el modelo de ratón Ang-II detectado por ultrasonido 3D. (A) La aorta suprarrenal se monitorizó mediante ecografía 3D al inicio (BL), día 8 (d8) y día 27 (d27) después de la implantación de la bomba Ang-II. El volumen se midió en un tramo de 12 mm de la aorta suprarrenal (157 cuadros) basado en una imagen reconstruida en 3D. El diámetro aórtico máximo se determinó a partir de imágenes EKV. (B) Tinción tricrómica de una sección transversal de la aorta del día 27 después del sacrificio del ratón y la recolección de órganos. La presencia de una disección de aorta está indicada por L1/L2 (lumen 1 y lumen 2), y el trombo intramural se denota por * en A y B. (C) Tasa de incidencia de AAA (>125% de crecimiento del volumen aórtico a partir de BL) en el día 8 y roturas aórticas dentro de los primeros 9 días (torácica o abdominal) a partir de un conjunto de datos recopilados durante 2 años (n = 157). (D) Frecuencia de progresión desde el día 8 hasta el día 27 de formación inicial rápida (crecimiento del volumen aórtico del >200% desde BL hasta el día 8) versus aneurismas de crecimiento moderado (crecimiento del volumen aórtico del >125% y <200% desde BL hasta el día 8) en ratones tratados con PBS (n = 21). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados ejemplares de la inhibición de la citrulinación de histonas para bloquear la progresión de AAA en el modelo Ang-II mediante inyección intravenosa de GSK484 o PBS a través del botón de acceso vascular . (A) Volumen aórtico (mm3) medido en un tramo de 12 mm de la aorta suprarrenal. (B) Crecimiento calculado del volumen aórtico desde el inicio (BL = 100%). (C) Diámetro aórtico máximo determinado a partir de imágenes EKV. (D) El crecimiento calculado del diámetro aórtico a partir de BL. Los datos de GSK484 se extrajeron de un estudio previamente publicado17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El modelo Ang-II es uno de los modelos de ratón AAA más utilizados debido a sus bajas exigencias técnicas y características particulares que se asemejan a la enfermedad humana 3,6. El tiempo de cirugía es de aproximadamente 10 minutos por animal, y la implantación de la bomba subcutánea es bien tolerada por los ratones si el bolsillo subcutáneo es lo suficientemente ancho y se coloca bajo en la espalda del animal, lejos del sitio de la incisión, para no interferir con la cicatrización de la herida. Cuando la piel está apretada alrededor de la bomba, puede producirse irritación tisular, lo que puede causar inflamación y costras y potencialmente interrumpir el mecanismo de liberación de la bomba por presión osmótica. La medición del volumen de Ang-II que queda en la bomba en el momento del sacrificio de animales da una idea de si el Ang-II se liberó con éxito durante los 28 días.
El modelo Ang-II ha sido propuesto recientemente para ser muy adecuado para estudiar el aneurisma aórtico y la progresión de la disección, ya que exhibe semejanza con las características humanas de ambos6. Es importante destacar que probar candidatos a fármacos para bloquear la expansión aórtica e influir en la remodelación coincidiría con la demanda clínica actual. En nuestro entorno experimental, se definió un límite para la formación de aneurismas antes del inicio del tratamiento basado en un crecimiento de volumen del 125% en el día 8 en relación con la línea de base, lo que explica la variación natural en el tamaño absoluto de la aorta en ratones. El umbral y el punto de tiempo se derivaron de un curso de tiempo inicial que confirmó la destrucción de la pared de la aorta en histología (datos no mostrados) y resultó en rupturas del 35% y 56% de AAA observados antes de la implantación del catéter. Si bien se aplicó un umbral mínimo de enfermedad establecida para la inclusión en el estudio, posteriormente se observó que un alto grado de expansión inicial de la aorta también puede limitar la aplicabilidad experimental. Los aneurismas que progresaron rápidamente a >200% de volumen para el día 8 no crecieron más allá de ese tamaño en el 55% de los casos (Figura 1D). Esto debe tenerse en cuenta durante el diseño experimental y el cálculo del tamaño de la muestra, ya que podría enmascarar el verdadero efecto de un tratamiento. Otra faceta de este modelo son las frecuentes roturas aórticas (torácicas o abdominales), que ocurren a tasas del 20%-40% y en su mayoría dentro de los primeros 10 días después de la implantación de la bomba Ang-II 3,18,19. Por lo tanto, al elegir el inicio del tratamiento para el día 9, se logró una alta tasa de aneurismas establecidos, y el cateterismo de la vena yugular se realizó esencialmente en ratones que se esperaba que sobrevivieran hasta el final del experimento (solo 3/24 ratones en nuestro grupo de control histórico se rompieron después del día 9), ahorrando así tiempo, esfuerzo, y costo.
Aparte de las roturas de la aorta, que constituyen una condición grave, la implantación concurrente del catéter con botón de acceso vascular y la bomba osmótica fue bien tolerada por los ratones, sin efecto notable sobre la movilidad o el comportamiento después de la recuperación de la cirugía. El procedimiento de cateterismo de la vena yugular debe tomar aproximadamente 30 minutos para los investigadores capacitados. La duración de la exposición a la anestesia (isoflurano) debe mantenerse al mínimo, y la frecuencia respiratoria del animal debe ser monitoreada de cerca para prevenir la depresión respiratoria, que puede conducir a un desenlace fatal si no se resuelve20. La pérdida de sangre después de perforar la vena yugular para la inserción del catéter, lo que lleva a la muerte del animal si es importante, podría ocurrir potencialmente cuando la vena yugular no está ligada adecuadamente cranealmente o una rama lateral que alimenta el área aislada del vaso no está cerrada. En ese caso, se debe aplicar presión con un hisopo de algodón al sitio de punción hasta que la fuga de sangre disminuya o se detenga, luego la inserción y ligadura del catéter debe hacerse lo más rápido posible; Una pequeña porción del apósito de colágeno para heridas se puede utilizar temporalmente para ayudar con la hemostasia.
La permeabilidad del catéter es uno de los factores más importantes, ya que la desconexión del catéter de la vena o del botón de acceso da como resultado una administración inadecuada del fármaco donde el fármaco se filtra en el espacio subcutáneo. Siguiendo la recomendación del fabricante de una superposición mínima de 3 mm entre el catéter y el conector metálico, solo se registró un caso de desconexión del catéter en el lado del botón (indicado por el líquido inyectado que se escapa del sitio de la incisión en el botón) durante 3 años en este modelo (2020-2021, n = 73), que se solucionó abriendo la herida y restableciendo la conexión en la cirugía. Además, se experimentó una tasa de fracaso de la permeabilidad del catéter de alrededor del 10% en nuestro grupo de control histórico de PBS (2/21) debido a la oclusión del catéter (lo que hace imposible la inyección), la desconexión del catéter de la vena (indicada por hinchazón aparente en el cuello durante la inyección) o complicaciones de cicatrización de heridas. Estos problemas pueden estar relacionados con lesiones autoinfligidas, es decir, arañazos o mordeduras de ratón. En particular, los tratamientos farmacológicos que interfieren con la cicatrización de heridas pueden aumentar las tasas de fracaso. Los pasos de solución de problemas para mejorar la tasa de permeabilidad incluyen aumentar la longitud del catéter insertado en la vena, asegurarse de que las ligaduras estén firmemente anudadas alrededor del catéter y la vena, y aplicar la técnica de presión positiva siguiendo la recomendación del fabricante, como se describe en el paso 2.12.10., durante la inyección. Además, la permeabilidad del catéter debe verificarse en el momento del sacrificio del animal mediante disección e inspección visual bajo el microscopio. Cabe destacar que el volumen diario de solución inyectada de drogas debe considerarse cuidadosamente. Como el volumen plasmático regula la presión arterial, el volumen de inyección puede afectar la expansión de AAA y, por lo tanto, los animales de control deben recibir el procedimiento simulado con volumen portador. Según nuestra experiencia (y observaciones no publicadas), una cantidad diaria de hasta 250 μL de PBS parece ser bien tolerada. Finalmente, similar a la implantación de la bomba, la irritación de la piel puede ocurrir alrededor del botón de acceso vascular implantado. Si se observa inflamación acompañada de tejido desvitalizado o necrótico, el desbridamiento de la herida debe llevarse a cabo mediante la eliminación de tejido no viable (el tejido necrótico a menudo se separará naturalmente de la herida), y la piel debe suturarse si es necesario; Si la inflamación y la necrosis son extensas, el bienestar del animal y los criterios de valoración humanitarios deben considerarse de acuerdo con las pautas.
La implantación dorsal simple y doble de la bomba osmótica y/o el VAS no interfirió con la señal de ultrasonido ni con la fijación del ratón en una posición adecuada en la etapa de ultrasonido. La adquisición automatizada de 157 fotogramas de más de 12 mm para renderizar una imagen 3D de la aorta para la medición del volumen es un procedimiento simple y rápido14, que solo requiere garantizar que la aorta esté libre de interferencias sobre el área de interés. Una trampa en este contexto es aplicar demasiada presión con el transductor mientras se intenta limpiar la imagen de interferencia, lo que puede interrumpir la medición automatizada si la frecuencia respiratoria se ve afectada por la compresión de las costillas cuando se registran imágenes del extremo craneal de la aorta abdominal. El diámetro se mide tradicionalmente en imágenes adquiridas mediante el modo B por el operador buscando manualmente el área de diámetro máximo mientras realiza el análisis de ultrasonido. Un avance en las imágenes en modo B son las imágenes EKV, que pueden resolver pequeños movimientos aórticos para producir una imagen lenta y de alta calidad de la aorta pulsante. Además, el diámetro aórtico máximo se puede determinar a partir de los fotogramas 3D adquiridos, donde las 157 imágenes ofrecen una visión general completa de la aorta tomada en sístole (debido al desencadenante del ECG establecido).
En conclusión, el protocolo compilado presentado proporciona un flujo de trabajo confiable y reproducible para la administración de fármacos intravenosos en un modelo de ratón de AAA inducido por Ang-II y para monitorear el tamaño aórtico por ultrasonido 3D. Los puntos de tiempo de monitoreo y operación se pueden ajustar a las necesidades específicas, y el cateterismo de la vena yugular se puede realizar por separado para cualquier configuración experimental que requiera la administración de sustancias específicas a través de inyecciones intravenosas. El VAS se puede usar alternativamente para muestreos de sangre repetidos si se usa una solución de bloqueo de catéter para prevenir la coagulación. El procedimiento de ultrasonido 3D descrito puede adaptarse para medir la aorta infrarrenal, donde se desarrollan aneurismas tras una lesión aguda en elastasa o modelos de ratón basados en CaCl2 de AAA. Si bien la adquisición de ultrasonido 3D tiene la ventaja de brindar una visión general de la región de la aorta afectada y la morfología del aneurisma, la adquisición de imágenes requiere más tiempo y, por lo tanto, puede ser más costosa. Otra limitación del protocolo que debe reconocerse es la necesidad de que los animales sean anestesiados brevemente para inyecciones intravenosas, mientras que la administración intraperitoneal generalmente se realiza en ratones conscientes.
Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los equipos del Prof. Podesser y del Prof. Ellmeier (Departamento de Investigación Biomédica e Instalación Central para la Cría y Cría de Animales de Laboratorio, Universidad Médica de Viena) por su asistencia en los experimentos con animales. La tinción tricrómica AAA fue realizada amablemente por Monika Weiss y el Prof. Peter Petzelbauer (Departamento de Dermatología, Universidad Médica de Viena). Este trabajo fue apoyado por el Austrian Science Fund [SFB project F 5409-B21]. Marc Bailey cuenta con el apoyo personal de la British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
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