Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64650
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השימוש בשברים מיקרו-וסקולריים שבודדו מרקמת מכרסם או מרקמת שומן אנושית כגישה פשוטה להנדסת רקמת שומן פונקציונלית בצבע בז' וסקולרית.

Abstract

רקמת שומן תרמוגנית הנדסית (למשל, רקמות שומן בצבע בז' או חום) נחקרה כטיפול פוטנציאלי למחלות מטבוליות או לתכנון מיקרו-רקמות מותאמות אישית לבדיקת בריאות ובדיקות סמים. האסטרטגיות הנוכחיות הן לעתים קרובות מורכבות למדי ואינן מצליחות לתאר במדויק את התכונות הרב-תאיות והתפקודיות של רקמת השומן התרמוגנית. שברים מיקרו-וסקולריים, מיקרו-כלים קטנים ושלמים המורכבים מעורקים, ורידים ונימים שבודדו מרקמת השומן, משמשים כמקור אוטולוגי יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן. מאמר זה מתאר שיטות לאופטימיזציה של תנאי תרבית כדי לאפשר יצירה של רקמות שומן תרמוגניות תלת-ממדיות, וסקולריות ומתפקדות ממקטעים מיקרו-וסקולריים, כולל פרוטוקולים לבידוד מקטעים מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן ומתנאי תרבית. בנוסף, נדונות שיטות עבודה מומלצות, כמו גם טכניקות לאפיון הרקמות המהונדסות, ותוצאות דגימה הן ממכרסמים והן מקטעים מיקרו-וסקולריים אנושיים מסופקות. לגישה זו יש פוטנציאל לשמש להבנה ופיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה לפיתוח רקמת שומן בז' וסקולרית ממקור יחיד, שעשוי להיות אוטולוגי, מקטע מיקרו-וסקולרי (MVF). רקמות שומן חומות ובז' הוכחו כבעלות תכונות מועילות הקשורות לוויסות מטבולי; עם זאת, הנפח הקטן של מחסני רקמת שומן אלה במבוגרים מגביל את ההשפעה הפוטנציאלית על חילוף החומרים המערכתי, במיוחד במצבים חולים כגון השמנת יתר או סוכרת מסוג 2 1,2,3,4,5,6,7. קיים עניין משמעותי בשומן חום/בז' כיעד טיפולי למניעת ההשפעות המטבוליות המזיקות הקשורות להשמנת יתר ותחלואה נלווית 8,9,10,11,12.

MVFs הם מבני כלי דם שניתן לבודד ישירות מרקמת השומן, לגדל בתרבית ולתחזק אותם בתצורה תלת ממדית לפרקי זמן ממושכים 13,14,15. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו, ואחרות, החלו לנצל את היכולת הרב-תאית והרב-פוטנטית של MVFs, במיוחד בכל הנוגע להיווצרות רקמת שומן16,17,18. כהצטברות של עבודה זו, הדגמנו לאחרונה כי MVFs שמקורם במודלים של מכרסמים של סוכרת בריאה ומסוג 219 ומנבדקים אנושיים (מבוגרים מעל גיל 50)20 הכילו תאים המסוגלים לקבל השראה ליצירת רקמת שומן תרמוגנית, או בז'.

זוהי גישה חדשנית שממנה נעשה שימוש ב-MVF ממקור יחיד, המסוגל לא רק ליצור רקמת שומן בצבע בז' אלא גם את מרכיב כלי הדם הקשור והקריטי שלה21. השימוש בטכניקה זו יכול להיות בעל ערך רב עבור מחקרים המחפשים גישה פשוטה מהונדסת רקמות להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית. בניגוד לשיטות אחרות השואפות להנדס רקמת שומן בצבע בז' 22,23,24,25,26,27,28, התהליך המתואר במחקר זה אינו דורש שימוש במספר סוגי תאים או משטרי אינדוקציה מורכבים. ניתן ליצור מודלים של שומן ובז' ולבן עם MVFs שמקורם במכרסמים ובמקורות אנושיים, מה שמדגים פוטנציאל תרגום גדול. התוצר הסופי של פרוטוקול זה הוא רקמת שומן תרמוגנית בצבע בז' מהונדס, בעלת מבנה ותפקוד מטבולי הדומים לרקמת שומן חומה. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג את הרעיון כי MVF מקור נגיש ואולי אוטולוגי עשוי להיות התערבות טיפולית ראויה וכלי לחקר הפרעות מטבוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.

הערה: עבור השלבים המתוארים להלן, עכברושי לואיס זכרים משמשים. יש לבצע התאמות פרוטוקול קלות עבור נקבה, כמו גם אוסף מקטע כלי דם עכבר (MVF)29. עבור פרוטוקולים המשתמשים ב- MVFs אנושיים (h-MVFs), השלבים היחידים הנדרשים הם השעיית h-MVFs בעקבות פרוטוקול היצרן, הכנת מדיה גדילה (1.3), היווצרות הידרוג'ל פיברין (5) ותרבית (6). לקבלת סקירה כללית של הפרוטוקול, ראה איור 1.

Figure 1
איור 1: מתווה ניסויי. פירוט של שישה שלבים מרכזיים, לפני ניתוח, להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית באמצעות MVF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת מגיב

הערה: ריאגנטים להלן מתאימים לחולדה אחת, נשקלת ומיוצרת בתוך ביו-הוד.

  1. הכינו אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS.
    1. הכינו 10 מ"ג/מ"ל (1.0%) BSA ב-PBS לדילול לשלבי שטיפה (1 מ"ג/מ"ל, 0.1%) ועיכול (4 מ"ג/מ"ל, 0.4%).
    2. הכינו ריכוזים שונים של BSA, כמתואר בשלב 1.1.1, לפי שלבים 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (1% BSA ב-PBS)
      1. הוסף 500 מ"ג של BSA ו 500 מ"ל של PBS לצינור חרוטי 50 מ"ל מערבולת את הפתרון להמסת BSA.
      2. אם נוצרות בועות מוגזמות, צנטריפוגו את התמיסה ב 350 x גרם למשך 2 דקות. סנן לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
    4. 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.1% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:10 עם PBS על ידי הוספת 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS ל-135 מ"ל PBS בבקבוק סטרילי של 500 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
    5. 4 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.4% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:2.5 עם PBS על ידי הוספת 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS + 57.5 מ"ל של PBS בבקבוק סטרילי של 100 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
  2. הכינו collagenase ב BSA לעיכול של כריות שומן טחון.
    1. הכינו 6 מ"ג/מ"ל קולגנאז.
      1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, שוקלים 72 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Epi").
      2. בשלושה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל, שוקלים 144 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Ing 1", "עבור Ing 2", ו "עבור SubQ") כל אחד.
      3. יש לאחסן את ה-collagenase השקוקל ב-4°C עד לשימוש.
        הערה: אין להוסיף BSA/PBS עד ממש לפני העיכול.
      4. הוסף 12 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינור המכיל 72 מ"ג של collagenase.
      5. הוסף 24 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינורות המכילים 144 מ"ג של collagenase.
      6. נערו את הצינורות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
  3. הכינו מצע גדילה בתוספת חומצה אמינוקפרואית (ACA) כדי להאכיל/להבדיל את ה-MVF המבודד.
    1. מצע גדילה (GM): תוסף DMEM עם 20% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (סטרפטוקוקוס עט), 0.2% מיקופלסמה מניעתית, ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
    2. הכינו מדיה אדיפוגנית לבנה (WAM).
      1. השראת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, בנוסף, להוסיף 125 מיקרומטר של indomethacin.
      2. תחזוקת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל.
    3. הכינו מדיה אדיפוגנית בצבע בז' (BAM).
      1. השראת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, 1 מיקרומטר של רוזיגליטזון, 20 ננומטר 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine (T3), ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את הריכוז של T3 ל- 120 ננומטר.
      2. תחזוקת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר פורסקולין, 1 מיקרומטר רוזיגליטזון, 20 ננומטר T3 ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
        הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל ואת ריכוז T3 ל -120 ננומטר.
  4. הכינו טרומבין (רק צריך להיות מיוצר אם הפתרון aliquoted מלאי אינו זמין) כדי להפוך את סוכן קרישה לשמש ג'ל פיברין.
    1. תרומבין 10 U/mL ב- ddH2O:
      1. להשהות אבקת טרומבין באמצעות 1-5 מ"ל של ddH2O בבקבוקון מהיצרן ולהעביר את ההשעיה ל 250 מ"ל כד.
      2. להעלות את התמיסה ל 100 מ"ל ו pipet את הפתרון למעלה ולמטה פעמים רבות כדי להבטיח תערובת הומוגנית. Aliquot התמיסה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (~ 10 מ"ל / צינור) ולאחסן את aliquots במקפיא -20 ° C.
        הערה: כדי להשתמש, הפשיר את הטרומבין בטמפרטורת החדר (RT).

2. הכנת כלים/חומרים

הערה: כל המכשור צריך להיות autoclaved/מעוקר לפני השימוש.

  1. בידוד שומן אפידימלי/מפשעתי/תת עורי (ניתוח שייעשה באזור כירורגי מוגדר)
    1. ודא את זמינותם של תחתיכות חד פעמיות, שני מספריים, hemostat אחד (אופציונלי), שני מלקחיים, וארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל עם 10-15 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA (0.1%) ב- PBS.
  2. בידוד מקטע כלי דם
    1. לטחינה (שתיעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של שלוש צלחות פטרי סטריליות 100 מ"מ לא מצופות, זוג מלקחיים אחד וזוג מספריים מעוקלים.
    2. לעיכול ובידוד (שייעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של זוג מספריים אחד, זוג מלקחיים אחד, שמונה צלחות פטרי סטריליות לא מצופות בקוטר 100 מ"מ, שלוש צלחות פטרי סטריליות 35 מ"מ לא מצופות, קולגנאז במשקל ובטמפרטורה של 4°C, ארבע צלוחיות 250 מ"ל, מחזיק פלסטיק אחד עם חור במרכז, 4 רשתות 500 מיקרומטר (חתוכות ל-3 בריבועים מעוגלים), ארבעה מסכים 37 מיקרומטר (לחתוך ל 3 ריבועים מעוגלים), ו 11 50 מ"ל צינורות חרוטיים.
  3. תרחיף פיברין
    1. עבור הידרוג'ל פיברין (להיעשות בביוהוד), ודא כי פיברינוגן, תרומבין ומדיה גדילה (שנעשו במהלך הכנת מגיב) זמינים.

3. פרוטוקול בידוד שומן

  1. צעדים מקדימים
    1. מלא עם אתנול כדי לשטוף ולחטא את כלי הניתוח לפני השימוש בהם. לאחר מכן, הכינו את השולחן לטיפול בחולדה והכינו ואקום מוכן לשאוף את הפרווה שנוצרה במהלך שלב הגילוח.
    2. הכינו דלי עם קרח שבו יוצבו צינורות חרוטי 50 מ"ל שהוכנו בעבר, שכל אחד מהם מכיל 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA. תייגו את הצינורות בהתאם.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בשני צינורות חרוטיים נפרדים עבור השומן המפשעה, שכן יש לחלץ שני צדדים וכמות השומן שנאספה מאזור זה נוטה להיות הגדולה ביותר בהשוואה לאפידידימלית ותת עורית אחורית.
    3. התחילו עם חולדה מורדמת באזור הכירורגי המוגדר עם כלי הניתוח הנדרשים. באופן כללי, CO2 משמש להרדים את החולדות בהתאם לפרוטוקולים של IACUC.
    4. בעזרת קוצצי שיער, לגלח את החולדה סביב האזור המעניין. באופן ספציפי, יש להתגלח בין המפשעות למחצית הבטן לצורך בידוד שומן אפידידימלי ומפשעתי (השתמש במכונת הגילוח הקטנה יותר עבור הפרווה באזור זה). יש לגלח את כל הגב כדי שהשומן התת עורי האחורי ימוקם בין השכמה (עדיף להשתמש במכונת גילוח גדולה יותר מכיוון שהפרווה עבה יותר בחלק האחורי של החולדה).
    5. הכינו את החולדה על ידי ריסוס שלה באתנול 70%. באופן כללי, מומלץ לנקות את האזור שעומד להיחתך פעמיים.
  2. בידוד מחסני שומן שונים
    1. מפשעתי (תת עורי)
      1. במצב שכיבה, להרים את העור מתחת לפין עם זוג מספריים. מתחילים את החתך עם מספריים, מתחילים במרכז וחותכים לרוחב, יוצרים צורת "V" ולולאה לחלק האחורי של החולדה כדי לגשת לכל מחסן השומן. זכרו לחתוך באופן שטחי כך שהשומן למטה יהיה שלם. במהלך שלב החיתוך, הקפידו על הפרדת העור מהשומן על-ידי חיתוך רקמת הפאשיה המחוברת (איור 2A).
      2. לאחר חיתוך הפאשיה כראוי, ודא ששני הצדדים של השומן המפשעתי נראים לעין (השומן המפשעתי משתרע מאזור המפשעה לכיוון הגב). לאחר מכן, הסירו את השומן משני הצדדים בשתי צינוריות חרוטיות נפרדות המכילות 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA (איור 2B).
    2. אפידידימל (קרביים)
      1. קצרו את השומן האפידידיסמלי על-ידי חיתוך דרך עור הבטן ובזהירות דרך השכבה הדקה שמקיפה את האשכים (איור 2C).
      2. בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את רקמת השומן החוצה וגזרו אותה באמצעות מספריים. הימנעו מלנתח כלי דם גדולים הנראים לעין (אם האשכים והאפידידימיס נקצרים, הסירו אותם במהלך שלב הניקוי בביו-הוד).
      3. מניחים בזהירות את השומן שהוסר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS.
        הערה: הסרת השומן האפידידימלי צריכה להיעשות לאחר הסרת השומן המפשעתי. השומן האפידידימלי הוא בדרך כלל קטן יותר בנפחו וממוקם מתחת לשומן המפשעה, מתחת לעור הבטן סביב האשכים והאפידידימיס.
    3. תת עורית אחורית
      1. סובבו את החולדה נוטה (הצד הגבי כלפי מעלה) ובעזרת מספריים גדולים חתכו את עור הגב (העור באזור הזה עבה) עד לקרקפת, תוך הקפדה לא לחתוך עמוק מדי, ממש מתחת לעור (איור 2D).
      2. חותכים את הפאשיה המחברת את העור לרקמה; השומן ממוקם באזור interscapular. שימו לב להבדיל/להפריד את השומן התת עורי מהשומן החום. השומן החום קרוב יותר לעמוד השדרה (איור 2E).
      3. בודדו והניחו את השומן בצינור(ות) החרוטיות המתאימות של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.

Figure 2
איור 2: בידוד של מחסני רקמת שומן שונים . (A) חתכים ראשוניים הדרושים לכריתה של רקמת השומן המפשעתית. (ב) מיקום מחסן השומן המפשעה. (C) מיקום מחסן השומן האפידידימלי, תוך ציון חתך העור החיצוני הדרוש לגישה. (D) חתכים נוספים הדרושים לאחר שהעכברים ממוקמים מועדים לגישה לשומן נוסף. (ה) מיקום מחסן השומן התת עורי האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. פרוטוקול בידוד שברים מיקרו-וסקולריים

  1. מניחים 50 מ"ל צינוריות חרוטיות המכילות שומן נכרת מהחולדה לתוך biohood.
  2. באמצעות מלקחיים, הניחו את השומן בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ (עם ~0.5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי לשמור על לחות הרקמה).
  3. נקו והוציאו את כל כלי הדם הנראים לעין ואת רקמת השריר/חוץ מהשומן.
  4. טוחנים את השומן עם מספריים במשך ~ 10 דקות (טחון מספיק כדי שניתן יהיה להעביר אותו עם פיפט 10 מ"ל).
  5. בדוק גושים על ידי הוספת ~ 0.5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS; ממשיכים לטחון במידת הצורך.
  6. מעבירים את השומן הטחון לבקבוק סטרילי של 250 מ"ל עם פיפט של 10 מ"ל.
    הערה: שים לב לעוצמת הקול באמצעות פיפט.
  7. הוסף מספיק BSA (1 מ"ג / מ"ל) כך נפח הסופי הוא 20 מ"ל.
  8. הוסף 4 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS ל- collagenase (ריכוז סופי של collagenase: 6 מ"ג / מ"ל) (כלומר, 12 מ"ל עבור 72 מ"ג של collagenase או 24 מ"ל עבור 144 מ"ג של collagenase).
    הערה: אין להוסיף עד לסיום הטחינה, שכן היא רגישה לזמן.
  9. נערו בעדינות את הצינור החרוטי כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן רשת ניילון 0.22 מיקרומטר.
  10. עבור שומן epididymal, לעכל במשך ~ 8-10 דקות; עבור השומן התת עורי המפשעה והאחורי, לעכל במשך ~ 15-20 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, לנער את הבקבוק בתנועה סיבובית לאורך כל הדרך (לעצור ברגע שהשומן מגיע למקום שבו נותרו רק כמה גושים).
  11. מעבירים את השומן המעוכל לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל (צריך להיות ~30 מ"ל / צינור), ותייגו את הצינור כ"שומן מעוכל".
  12. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 4 דקות; לאחר סיבוב, הגלולה חייבת להיות אדומה (איור 3A).
  13. במהלך הסיבוב, הניחו את המסך הסטרילי בגודל 37 מיקרומטר ומסכי 500 מיקרומטר בצלחת פטרי סטרילית עם 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי להשרות לפני השימוש.
  14. לאחר הסיבוב, דקנט את הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המסומן כ"פסולת". בצעו את הדקציה בעדינות כדי להסיר את השומן השטחי ולא להפריע לגלולה העשויה MVFs.
  15. הוסף 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS לצינור המכיל את הגלולה ("שומן מעוכל"). טריטוראט (פייפ למעלה ולמטה) את הגלולה 2x.
  16. הימנע להיות גס מדי על הגלולה כדי לא לשבש את השברים.
  17. הניחו את המסך בגודל 500 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק (איור 3B).
  18. פיפט 10 מ"ל מצינור "גלולה מעוכלת" מעל מסך של 500 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים (איור 3C).
  19. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יסתננו דרך צלחת הפטרי; לכן, השליכו את מסך 500 מיקרומטר אך שמרו את הנוזל המסונן בתוך צלחת הפטרי.
  20. הניחו את המסך בגודל 37 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק.
  21. החליפו את הצינור כדי לסלק גושים לפני השימוש במסך 37 מיקרומטר.
  22. פיפט את הנוזל המתקבל מהסינון הראשון על מסך 37 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים.
  23. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בפילטר, ולכן השליכו את הנוזל המסונן, אך שמרו את מסך 37 מיקרומטר.
  24. החלק את המסך בגודל 37 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.
  25. נערו את התבשיל על ידי הדבקתו על מחזיק חרוטי כדי לעקור את השברים. אין לנער במרץ רב מדי, שכן הנוזל/התאים עלולים להישפך מתוך צלחת הפטרי.
  26. יש לשטוף את המסנן ב-5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בתמיסה נוזלית בצלחת הפטרי. שמור את המסך בגודל 37 מיקרומטר ואת המקטע שנעקר ממקומו המכיל נוזל בתוך צלחת הפטרי לשלבים הבאים.
  27. מעבירים את BSA + קטע המכיל נוזל לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
  28. חזור על שטיפה של מסך 37 מיקרומטר מספר פעמים נוספות (בכל פעם עם ~ 5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS) והוסף לצינור החרוט. חזור על הפעולה עד שהנפח הכולל שנאסף הוא ~ 15-20 מ"ל. בסופו של דבר, התאים הרצויים ייאספו מהתמיסה הנוזלית בצלחת הפטרי ויונחו בצינור חרוט; בשלב זה, השליכו את מסך 37 מיקרומטר לאחר השטיפה הסופית, אך שמרו את השברים שנעקרו ממקומם המכילים נוזל בתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
  29. גזור את קצהו של קצה צינור 200 μL באמצעות מספריים. נערו בעדינות את צינור 50 מ"ל, הסירו שתי דגימות של 20 מיקרוליטר והניחו אותן בצלחת פטרי נקייה של 35 מ"מ.
  30. ספרו את מספר השברים בכל דגימה בצלחת הפטרי כדי לקבל את המספר הכולל של MVF שבודדו.
    סה"כ שברים = Equation 1
  31. סובב את החלק שנותר שנעקר המכיל נוזל בצינור חרוטי של 50 מ"ל ב 400 x גרם במשך 4 דקות כדי לאסוף את ה- MVF.

Figure 3
איור 3: בידוד של MVFs. (A) לאחר עיכול של רקמת השומן, תיאור ההפרדה של MVFs המכילים גלולה וסופרנאטנט לאחר ספין-דאון. (B) פריסת חומרים לסינון ולכידה של MVFs. (C) איור של שיטת המעגל הקונצנטרי לשלבי סינון/שטיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. היווצרות הידרוג'לים פיברין

  1. חישובים לדוגמה:
    הערה: להלן החישובים עבור MVFs שנזרעו ב~15,000-20,000 MVF/mL ויחס ג'ל פיברינוגן:טרומבין ב-2:5, כאשר פיברינוגן משמש בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל.
    1. לייצור חמישה ג'לים של 250 מיקרוליטר, נדרש נפח כולל של 1,250 מיקרוליטר. תמיד חשבון שגיאות pipetting, ולכן, לעשות מספיק עבור 1.5 מ"ל של ג'לים.
      1. חישוב נפח הפיברינוגן הנדרש כדלקמן:
        Equation 2, X1 = 428.57 μL של פיברינוגן,
      2. חשב את נפח התרומבין הנדרש כדלקמן:
        Equation 3, X2 = 1,071.43 מיקרוליטר של טרומבין
      3. עבור נפח נדרש של 428.57 μL, לעשות 500 μL של פיברינוגן כדלקמן:
        20 מ"ג / מ"ל * 0.5 מ"ל = 10 מ"ג פיברינוגן. להשעות את זה ב 500 μL של DMEM
      4. כדי להשיג כל ג'ל, לחשב את נפח פיברינוגן וטרומבין כדלקמן:
        1. פיברינוגן:
          Equation 4,X 1 = 71.43 מיקרוליטר של פיברינוגן (ב-DMEM) + MVF
        2. טרומבין:
          Equation 5, X2 = 178.57 מיקרוליטר של טרומבין
  2. יציקת ג'ל פיברין MVF
    1. דקנט את רוב הנוזל בשבר המסובב למטה בצינור החרוטי 50 מ"ל. השתמש פיפטה כדי להסיר את נפח קטן של נוזל שתופס על שפת הצינור החרוט.
    2. הוסיפו תרומבין לבארות שבהן ייוצרו ג'לים (איור 4A).
    3. יש לגזור את קצהו של קצה פיפט של 200 μL ולהשהות מחדש את ה-MVFs בעדינות באמצעות פיברינוגן כדי לקבל צפיפות סופית של ~15,000-20,000 MVF/mL פעם אחת בג'ל.
    4. יש לקצץ קצה של 200 מיקרוליטר פיפט ופיפט MVF+פיברינוגן לתמיסת הטרומבין בעדינות. מזלפים במהירות למעלה ולמטה כדי להבטיח תערובת הומוגנית. חזרו על הפעולה עד שכל הג'לים מיוצרים (איור 4B).
    5. הניחו את לוחות הבאר באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך ~15 דקות כדי לאפשר הצלבת ג'ל (איור 4C).
    6. הוסף 100-150 μL של מצע צמיחה לכל באר.

Figure 4
איור 4: היווצרות של ג'ל פיברין MVF . (A) תערובת תרומבין בת 5/7 חלקים מוחדרת לבאר המתאימה. (B) לאחר מכן, עם קצה פיפט חתוך (כדי לא להפריע ל-MVFs), תערובת פיברינוגן+MVF בת 2/7 חלקים מוחדרת לתוך הבאר ומעורבבת בעדינות. (C) לבסוף, כל הג'לים שהושלמו ממוקמים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, מה שמאפשר להידרוג'ל להתמצק באופן מלא לפני שהמדיה מונחת למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. תנאי טיפוח של MVFs

  1. לטיפוח רקמת שומן לבנה ובז' לא וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן19 המוצגים באיור 5.
  2. לתרבית של רקמת שומן לבנה ובז' וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן19 המוצגים באיור 6.
  3. הידרוג'לים צריכים להישמר באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך התרבית למחקר, כאשר התקשורת מתחלפת כל יומיים. לקיבוע וטיפול בדוגמאות לניתוח, עיין בעבודות שפורסמו בעבר16,19,20.

Figure 5
איור 5: תזמון להיווצרות רקמת שומן לא וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תזמון להיווצרות רקמת שומן וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ישנם מספר מאפיינים מורפולוגיים פנוטיפיים עיקריים של רקמת שומן בצבע בז'/חום: הוא רב-לוקולרי/מכיל טיפות שומנים קטנות, בעל מספר רב של מיטוכונדריה (הסיבה להופעתו ה"חומה" האופיינית in vivo), יש לו בהתאמה קצב צריכת חמצן גבוה/ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית, הוא מאוד וסקולרי, יש לו ספיגת גלוקוז מוגברת בליפוליזה/אינסולין, והכי ידוע לשמצה, מבטא רמות גבוהות של חלבון uncoupling protein 1 (UCP1), חלבון מיטוכונדריאלי המעורב בנשימה תרמוגנית19,30.

בהתאם לכך, כאשר אפיינו את היכולת של MVFs להתמיין לרקמת שומן בצבע בז', נערך ניתוח שיאפשר לנו לדמיין (איור 7, איור 8), לאשר גנטית (איור 9, איור 10) ולמדוד באופן פונקציונלי (איור 11) את הטרנספורמציה של MVF.

באיור 7 ובאיור 8, באמצעות שימוש ב-BODIPY, כתם שומנים, והדמיה של ההידרוג'לים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ההדמיה של גודל ומיקום השומנים באדיפוציטים המובחנים נראתה16,17,19. יש לציין כי בניתוח זה, במיוחד בהשוואה בין תנאים, קבוצות ה- BAM צריכות להציג גדלי שומנים קטנים יותר (המעידים על היווצרות רקמת שומן בז '), הניתנים לכימות באמצעות NIH ImageJ19,20.

באמצעות RT-qPCR 16,19,20, באיור 9 ובאיור 10, באופן המובהק ביותר, הביטוי של UCP1 גדל באופן משמעותי עם חשיפת MVF ל-BAM.

לבסוף, כשמסתכלים על ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית (איור 11), ברור שלקבוצות BAM יש רמות גבוהות יותר של צריכת חמצן (OCR), שנמדדו באמצעות מבחן מאמץ מיטו-סוסון ים19,20.

Figure 7
איור 7: הערכה היסטולוגית r-MVF. r-MVF שמקורם בסוכרת רזה או מסוג 2 נחשפו למדיה אדיפוגנית ישירה (פאנל עליון, ADIPO) או עקיפה (פאנל תחתון, ANGIO+ADIPO) WAM או BAM כדי להשיג רקמת שומן לבנה או בז' שאינה וסקולרית או וסקולרית, בהתאמה (פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר). נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: הערכה היסטולוגית h-MVF. h-MVF נחשפו ל-WAM או BAM ישירים (ADIPO) כדי להשיג רקמת שומן לבנה או בז' לא וסקולרית, בהתאמה (פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר). נתון זה שונה מ Gonzalez Porras et al.20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: הערכת r-MVF באמצעות RT-qPCR. סוכרתי רזה (L) או סוג 2 (Db) הנגזר מ-r-MVF שנחשף ל-WAM או BAM ישיר או עקיף (A-C) הוערך עבור (A,E) אדיפוגנזה (אדיפונקטין), (B,F) תרמוגנזה (UCP1) ו-(C,G) אנגיוגנזה (ANGPT1). התוצאות מדווחות כממוצע ± שגיאת תקן של שני שכפולים ניסיוניים (n = 4). * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 ו- **** = p < 0.0001. D0 = יום 0. ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) בודק עם ניתוחי השוואה מרובים של הולם-סידאק כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. נתון זה שונה מ Acosta et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: הערכת h-MVF באמצעות RT-qPCR. h-MVFs שנחשפו ל-WAM או BAM ישיר הוערכו עבור (A) אדיפוגנזה (Adiponectin) ו-(B) תרמוגנזה (UCP1). התוצאות מדווחות כממוצע ± שגיאת תקן של שני שכפולים ניסיוניים (n = 4). * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 ו- **** = p < 0.0001. ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) נבדק עם ניתוחי השוואה מרובים של הולם-סידאק כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. נתון זה שונה מ Gonzalez Porras et al.20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: הערכה תפקודית r-MVF ו-h-MVF. r-MVFs שמקורם בסוכרת רזה (L) או מסוג 2 (Db) שנחשפו ל-(A) WAM או BAM עקיפים או (C) h-MVFs שנחשפו ל-WAM או BAM ישירים הוערכו תפקודית באמצעות מדידת קצב צריכת החמצן (OCR). התוצאות מדווחות כממוצע ± שגיאת תקן של שני שכפולים ניסיוניים (n = 4). נתון זה שונה מ Acosta et al.19. וגונזלס פוראס ואח' 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תחום הנדסת רקמת השומן החומה/בז' אינו בשל ברובו 22,23,24,25,26,27,28, כאשר רוב דגמי השומן מפותחים עבור רקמת שומן לבנה 8,22,31. מיקרו-רקמות מהונדסות/בז' מורכבות בדרך כלל ממקורות תאים מרובים או שינויים גנטיים כדי לקבל תת-קבוצה של המאפיינים הפנוטיפיים של רקמת שומן חומה מקומית 8,11,32. הגישה המתוארת כאן מציגה דרך אחת, בעלת פוטנציאל אוטולוגישל 18,33 ליצירת שומן בז' פונקציונלי, רלוונטי מבחינה מבנית וכלי דם תוך שימוש במקטעים מיקרו-וסקולריים (MVFs). MVFs ידועים בעיקר כמקור להיווצרות רקמת שומן לבנה 14,16,17,1 8,34, אם כי לאחרונה הוכחנו את יכולתם להיווצרות שומן בז' הנובע ממכרסמים, בני אדם ומקורות חולים, כפי שמוצג כאן 19,20. בהתחשב בעניין הרב בשימוש בשומן בז '/ חום לפוטנציאל הטיפול או מידול המחלה שלו, לטכניקה זו יש יישומים מרחיקי לכת בתחומי חילוף חומרים, השמנת יתר והפרעות נלוות.

ישנן מספר נקודות מפתח המתוארות בפרוטוקול. ראשית, ישנם הבדלים בין השימוש בחולדות לעומת MVF אנושי. השימוש במכרסמים (בין אם מעכברים 29 או מחולדות) שלט עד כה במידה רבה במחקר עם MVFs, עם עבודה שבחנה אותם במגוון מצבים כגון השמנת יתר 35, סוכרת מסוג 1 36,37, סוכרת מסוג 2 19 והזדקנות38, ואפילו הבדלים בין מחסני שומן 39 או מין40. למרות שניתן לבודד MVFs, בהתחשב במקורם, באופן אוטולוגי ממחסני השומן התת עוריים של מבוגרים באמצעות הליכים זעיר פולשניים סטנדרטיים41, כלי דם מבוססי MVF לא בוצעו בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, מחקרים פרה-קליניים שבהם MVF אנושי נקצר מליפואספירט הוכיחו את האפשרות שלו18,33. עבור הקבוצה שלנו באופן ספציפי, כפי שמוצג בנתונים המייצגים, היווצרות רקמת שומן בז' וסקולרית מוגבלת כיום ל- MVFs שמקורם במכרסמים. כפי שהודגם בעבר על ידי הקבוצה שלנו ואחרים18, השגת האיזון של צמיחת כלי הדם והתמיינות אדיפוציט היא רגישה מאוד, הוכחה כתלויה בגורמים שהוכנסו42, והבחנה בנקודות זמן מעוררת16. מגבלה של הפרוטוקול המתואר היא שיש צורך בפיתוח נוסף כדי לייעל את התנאים התורמים להיווצרות רקמת שומן בצבע בז' h-MVF וסקולרית. בנוסף, נדרשת עבודה נוספת הבוחנת את התגובה של פיגומים אלה in vivo ונובעת ממצבים חולים אחרים, יחד עם צעדי אופטימיזציה נלווים.

יתר על כן, מתואר כאן פרוטוקול לבידוד של r-MVFs משלושה מחסני רקמת שומן שונים בחולדות זכרים. עבודה קודמת של Später et al.39 דנה בהבדלים בין יכולת כלי הדם של MVF ממחסן ויסצרלי לעומת MVF שמקורו במחסן תת-עורי, וציינו כי MVF של מחסן תת-עורי היה בעל יכולת מופחתת לכלי דם, תכונה שהם ייחסו לזיהום עודף ברקמת חיבור. יש לציין כי במחקרנו, כפי שהוצג כאן ב"נתונים המייצגים", נעשה שימוש רק במחסנים התת עוריים והתת עוריים האחוריים. הבחירה להשתמש אך ורק ב-MVF שמקורו בתת-עורית נעשתה כדי לחקות באופן הדוק יותר מחקרים תרגומיים שבהם ליפואספיראט, או הליכים דומים, אוספים רקמת שומן תת-עורית בלבד. בנוסף, העובדה שמחקרי in vivo מפותחים רקמת שומן בצבע בז' בתוך רקמת שומן תת-עורית, המכילה תת-קבוצה מובחנת של קדם-אדיפוציטים או אדיפוציטים לבנים המתמיינים, סיפקה רציונל נוסף להחלטתנו43. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו לא הראו הבדלים ניכרים בין MVFs שמקורם במחסנים ויסצרליים או תת עוריים של מכרסמים בריאים לעבור גם אנגיוגנזה וגם היווצרות רקמת שומן לבן16. יש לקחת בחשבון את כל המשתנים הללו בעת תכנון מחקרים עתידיים.

לבסוף, כאשר מנסים לשנות או לפתור את השיטה המתוארת, יש לדון בכמה נקודות חיוניות. ראשית, השלב של עיכול אנזימטי של רקמת השומן הוא חשוב ביותר; יש לנקוט בזהירות מיוחדת ולהבטיח אופטימיזציה כדי לשחזר באופן עקבי MVFs בגודל ובאיכות דומים. בהתחשב בשונות הגדולה בין סוגי השומן ונפחי השומן (תלוי מאוד בגיל בעלי החיים, גודלם, בריאותם והטיפול שננקט בזמן בידוד השומן [הימנעות ממזהמים ויעילות מיצוי]), זמן העיכול יכול להשתנות, ולכן טווחים, המתאימים ביותר לציוד/בעלי החיים שלנו מסופקים. עם זאת, יש לשקול התאמה אישית לקבלת תוצאות מיטביות. בנוסף, בעת טיפול MVF, במהלך עיכול פוסט-אנזימטי, יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי למנוע חספוס מיותר ושברים נוספים. לבסוף, יש להיות מודעים לכך שפורמולציות מדיה, הידרוג'ל הבחירה44 ותנאי תרבות ניתנים להתאמה אישית רבה בהתבסס על התוצאות המיועדות. כפי שניתן לראות כאן, MVFs הנגזרים ממקורות שונים (למשל, MVF רזים לעומת סוכרתיים) הם בעלי דרגות שונות של בידול, ולכן בעת תכנון ניסויים, יש לכלול בקרות מתאימות וקבוצות ניסוי.

לסיכום, ככל שתחום הנדסת רקמת השומן התרמוגנית גדל, חיוני לבנות מערכות ביולוגיות-רלוונטיות המחקות מבחינה מבנית, גנטית ותפקודית רקמת שומן מקומית בצבע בז'/חום. MVFs מציגים גישה מרגשת וייחודית לאתגר זה, שכן הם, כפי שמתואר כאן, מספקים שיטה פשוטה ממקור יחיד ליצירת חיקויים ביולוגיים של שומן בז'. לכן, הם טומנים בחובם פוטנציאל משמעותי לניצול הבנה או פיתוח של טיפולים להשמנת יתר ולמחלות מטבוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

ד"ר אקוסטה נתמך על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות CA148724 ו- TL1TR002647. ד"ר גונזלס פוראס נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס מספר F32-0DK122754. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5SC1DK122578) ואוניברסיטת טקסס במחלקה להנדסה ביו-רפואית בסן אנטוניו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114 (2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Tags

פסילה גיליון 192
תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M.… More

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter