Summary
여기에서 우리는 기능적 혈관화된 베이지색 지방 조직을 엔지니어링하기 위한 간단한 접근 방식으로 설치류 또는 인간 지방 조직에서 분리된 미세혈관 조각의 사용을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
공학적 열 발생 지방 조직(예: 베이지색 또는 갈색 지방 조직)은 대사 질환에 대한 잠재적 치료법 또는 건강 검진 및 약물 검사를 위한 개인화된 미세 조직의 설계를 위한 것으로 조사되었습니다. 현재의 전략은 종종 매우 복잡하며 열 발생 지방 조직의 다세포 및 기능적 특성을 정확하게 완전히 묘사하지 못합니다. 지방 조직에서 분리된 세동맥, 세정맥 및 모세혈관으로 구성된 작고 손상되지 않은 미세혈관인 미세혈관 단편은 혈관화 및 지방 조직 형성을 가능하게 하는 단일 자가 세포 공급원 역할을 합니다. 이 기사에서는 지방 조직 및 배양 조건에서 미세혈관 단편을 분리하기 위한 프로토콜을 포함하여 미세혈관 조각에서 3차원, 혈관화 및 기능적 열발생 지방 조직을 생성할 수 있도록 배양 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 또한 조작된 조직을 특성화하는 기술과 마찬가지로 모범 사례에 대해 논의하고 설치류 및 인간 미세혈관 단편의 샘플 결과를 제공합니다. 이 접근법은 비만 및 대사 질환 치료법의 이해와 개발에 활용될 가능성이 있습니다.
Introduction
이 프로토콜의 목표는 잠재적으로 자가 소스인 단일 미세혈관 단편(MVF)에서 혈관화된 베이지색 지방 조직을 개발하기 위한 접근 방식을 설명하는 것입니다. 갈색 및 베이지색 지방 조직은 대사 조절과 관련된 유익한 특성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 그러나, 성인의 이러한 지방 조직 저장소의 소량은 특히 비만이나 제2형 당뇨병과 같은 질병 상태에서 전신 대사에 대한 잠재적 영향을 제한한다 1,2,3,4,5,6,7. 비만 및 그 동반 질환과 관련된 유해한 대사 효과를 예방하기 위한 치료 표적으로서 갈색/베이지색 지방에 상당한 관심이 있습니다 8,9,10,11,12.
MVF는 지방 조직으로부터 직접 분리되고, 배양되고, 연장된 기간 동안 3차원 구성으로 유지될 수 있는 혈관 구조이다(13,14,15). 우리 그룹과 다른 사람들의 이전 연구는 특히 지방 조직 형성과 관련하여 MVF의 다세포 및 다능성 능력을 활용하기 시작했습니다16,17,18. 이 연구의 축적으로, 우리는 최근 건강한 제2형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 설치류 모델(19)과 인간 피험자(50세 이상의 성인)20에서 파생된 MVF가 열발생 또는 베이지색 지방 조직을 형성하도록 유도될 수 있는 세포를 함유하고 있음을 입증했습니다.
본원은 베이지색 지방 조직뿐만 아니라 그의 관련되고 중요한 혈관 성분(21)을 생성할 수 있는 단일 공급원 MVF가 활용되는 혁신적인 접근법이다. 이 기술의 사용은 열 발생 지방 조직 형성을 위한 간단한 조직 공학적 접근 방식을 찾는 연구에 큰 가치가 있을 수 있습니다. 베이지색 지방 조직 22,23,24,25,26,27,28을 조작하려는 다른 방법과 달리 이 연구에 설명된 프로세스는 여러 세포 유형이나 복잡한 유도 요법을 사용할 필요가 없습니다. 혈관화된 베이지색 및 백색 지방 모델은 설치류 및 인간 소스에서 유래한 MVF로 생성할 수 있어 뛰어난 번역 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 제품은 갈색 지방 조직에 필적하는 구조와 대사 기능을 가진 엔지니어링된 베이지색 열 발생 지방 조직입니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 쉽게 접근할 수 있고 자가 소스 MVF가 대사 장애를 연구하기 위한 가치 있는 치료 개입 및 도구가 될 수 있다는 아이디어를 제시합니다.
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Protocol
본 연구는 동물복지법 및 동물복지 시행규정에 따라 실험동물 관리 및 사용 가이드의 원칙에 따라 수행되었다. 모든 동물 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 아래에 설명된 단계에서는 수컷 Lewis Rats가 사용됩니다. 암컷과 생쥐 미세혈관 조각(MVF) 수집에 대해 약간의 프로토콜 조정이 이루어져야 한다29. 인간 MVF(h-MVF)를 사용하는 프로토콜의 경우 필요한 유일한 단계는 제조업체의 프로토콜에 따른 h-MVF의 재현탁, 성장 배지 준비(1.3), 피브린 하이드로겔 형성(5) 및 배양(6)입니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오.
그림 1: 실험 개요. MVF를 사용한 열발생 지방 조직 형성을 위한 분석 전 6가지 주요 단계 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 시약 준비
참고: 아래 시약은 쥐 한 마리에 해당하며, 무게를 측정하고 바이오후드 내부에서 만듭니다.
- PBS에서 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다.
- 세척 단계(1mg/mL, 1.0%) 및 소화(1mg/mL, 0.1%)를 위해 희석할 PBS에 4mg/mL(0.4%) BSA를 준비합니다.
- 1.1.3-1.1.5 단계에 따라 1.1.1 단계에서 언급 한대로 다른 농도의 BSA를 준비하십시오.
- PBS의 10mg/mL BSA(PBS의 1% BSA)
- 500mg의 BSA와 500mL의 PBS를 50mL의 원뿔형 튜브에 넣고 용액을 와동시켜 BSA를 용해시킵니다.
- 과도한 기포가 형성되면 용액을 350 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 필터는 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 멸균합니다.
- PBS의 1mg/mL BSA(PBS의 0.1% BSA)
- 15mL 멸균 병에 PBS 10mL에 PBS 10mL를 첨가하여 PBS 10:15에 10mg/mL BSA 500mL를 희석하고 병을 부드럽게 흔들어 균질한 혼합물이 되도록 합니다.
- PBS의 4mg/mL BSA(PBS의 경우 0.4% BSA)
- PBS에 10mg/mL BSA 35mL + PBS 100mL 멸균 병에 PBS 57.5mL를 추가하여 PBS 10:2.5에 10mg/mL BSA 35mL를 희석하고 병을 부드럽게 흔들어 균질한 혼합물이 되도록 합니다.
- 다진 지방 패드의 소화를 위해 BSA에서 콜라게나아제를 준비하십시오.
- 6mg/mL 콜라게나제를 준비합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에서 72mg의 콜라게나제("에피용" 라벨)의 무게를 잰다.
- 3개의 50mL 원뿔형 튜브에서 각각 144mg의 콜라게나제(라벨 "for Ing 1", "for Ing 2" 및 "for SubQ")를 잰다.
- 칭량된 콜라게나아제를 사용할 때까지 4°C에서 보관한다.
알림: 소화 직전까지 BSA/PBS를 첨가하지 마십시오. - PBS에 4mg/mL BSA 12mL를 콜라게나제 72mg이 들어 있는 튜브에 추가합니다.
- PBS에 24mg의 4mg/mL BSA 144mL를 콜라게나제가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
- 튜브를 흔들어 균질한 용액을 확인하고 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 여과하여 멸균합니다.
- 6mg/mL 콜라게나제를 준비합니다.
- 분리된 MVF를 공급/분화하기 위해 아미노카프로산(ACA)이 보충된 성장 배지를 준비합니다.
- 성장 배지(GM): DMEM에 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙), 0.2% 마이코플라스마 예방 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
- 백색 지방 생성 배지(WAM)를 준비합니다.
- WAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
참고: h-MVF의 경우 125μM의 인도메타신을 추가합니다. - WAM 유지: 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 5μg/mL 인슐린 및 1mg/mL ACA로 DMEM/F12를 보충합니다.
참고: h-MVF의 경우 인슐린 농도를 10μg/mL로 변경합니다.
- WAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
- 베이지색 지방 생성 배지(BAM)를 준비합니다.
- BAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 스트렙, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손, 1μm의 로시글리타존, 20nM 3,3′,5-트리요오도-L-티로닌(T3) 및 1mg/mL ACA.
알림: h-MVF의 경우 T3의 농도를 120nM으로 변경합니다. - BAM 유지: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 연쇄상 구균, 0.2% 마이코플라스마 예방, 5μg/ml 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 로시글리타존, 20nM T3 및 1mg/mL ACA를 보충합니다.
참고: h-MVF의 경우 인슐린 농도를 10μg/mL로, T3 농도를 120nM으로 변경합니다.
- BAM 유도: DMEM/F12에 20% FBS, 1% 펜 스트렙, 0.2% 마이코플라스마 예방, 10μg/mL 인슐린, 10μm의 포스콜린, 1μm의 덱사메타손, 1μm의 로시글리타존, 20nM 3,3′,5-트리요오도-L-티로닌(T3) 및 1mg/mL ACA.
- 피브린 겔에 사용할 응고제를 만들기 위해 트롬빈을 준비합니다(스톡 분취 용액을 사용할 수 없는 경우에만 만들어야 함).
- ddH2O의 10U/mL 트롬빈:
- 제조자로부터의 바이알에 1-5 mL의ddH2O를 사용하여 트롬빈 분말을 재현탁시키고, 재현탁액을 250 mL 비커로 옮긴다.
- 용액을 100mL로 올리고 균질한 혼합물이 되도록 용액을 위아래로 여러 번 피펫합니다. 용액을 15mL 원뿔형 튜브(~10mL/튜브)에 분취하고 분취량을 -20°C 냉동고에 보관합니다.
알림: 사용하려면 실온(RT)에서 트롬빈을 해동하십시오.
- ddH2O의 10U/mL 트롬빈:
2. 공구/재료 준비
알림: 모든 기기는 사용하기 전에 고압 증기멸균/멸균해야 합니다.
- 부고환/사타구니/피하 지방 분리(정의된 수술 부위에서 시행하는 수술)
- PBS에서 10-15mL의 1mg/mL BSA(0.1%)가 있는 일회용 언더패드, 가위 2개, 지혈제 1개(옵션), 겸자 2개, 50mL 원뿔형 튜브 4개의 가용성을 보장합니다.
- 미세혈관 단편 분리
- 다진 것(바이오후드에서 수행)의 경우 코팅되지 않은 멸균 100mm 페트리 접시 3개, 집게 1쌍, 곡선 가위 1쌍을 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 소화 및 분리(바이오후드에서 수행)를 위해 가위 1쌍, 집게 1쌍, 코팅되지 않은 멸균 100mm 페트리 접시 8개, 코팅되지 않은 멸균 35mm 페트리 접시 3개, 콜라게나제 칭량 및 4°C, 250mL 플라스크 4개, 중앙에 구멍이 있는 플라스틱 홀더 1개, 500μM 스크린 4개(둥근 사각형으로 3개로 절단), 4개의 37μM 스크린(둥근 정사각형으로 3개로 절단) 및 11개의 50mL 원뿔형 튜브.
- 피브린 재현탁
- 피브린 하이드로겔(바이오후드에서 수행)의 경우 피브리노겐, 트롬빈 및 성장 배지(시약 준비 중에 생성됨)를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
3. 뚱뚱한 고립 의정서
- 예비 단계
- 비커에 에탄올을 채워 수술 기구를 사용하기 전에 세척하고 소독하십시오. 다음으로, 쥐를 다루기 위해 테이블을 준비하고 면도 단계에서 생성된 털을 흡인할 수 있도록 진공 청소기를 준비합니다.
- 각각 50mg/mL BSA 10mL가 들어 있는 미리 준비된 1mL 원뿔형 튜브를 놓을 얼음이 담긴 양동이를 준비합니다. 그에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.
참고: 사타구니 지방에 대해 두 개의 분리된 원추형 튜브가 필요할 수 있습니다., 양면을 추출해야 하고 이 부위에서 수집된 지방의 양이 부고환 및 후방 피하에 비해 가장 큰 경향이 있기 때문입니다. - 필요한 수술 도구를 사용하여 정의된 수술 영역에서 안락사된 쥐로 시작합니다. 일반적으로,CO2 는 IACUC 프로토콜에 따라 래트를 안락사시키는데 사용된다.
- 머리 깎기를 사용하여 관심 부위 주변의 쥐를 면도하십시오. 특히, 부고환 및 사타구니 지방 분리를 위해 사타구니와 복부의 절반 사이를 면도합니다(이 부위의 모피에는 더 작은 면도기 사용). 견갑골 사이에 위치한 후방 피하 지방을 얻기 위해 등 전체를 면도하십시오 (쥐의 뒷면에서 털이 더 두껍기 때문에 더 큰 면도기를 사용하는 것이 가장 좋습니다).
- 쥐를 70% 에탄올로 분사하여 무균적으로 준비합니다. 일반적으로 절단할 부분을 두 번 청소하는 것이 좋습니다.
- 다른 지방 저장소의 격리
- 사타구니 (피하)
- 앙와위 자세에서 가위로 음경 아래의 피부를 들어 올립니다. 가위로 절개를 시작하여 중앙에서 시작하여 측면으로 절단하여 "V"자 모양을 형성하고 쥐의 뒤쪽으로 고리를 만들어 전체 지방 저장소에 접근합니다. 아래의 지방이 손상되지 않도록 표면을 자르는 것을 잊지 마십시오. 절단 단계 동안, 상호연결된 근막 조직을 절단하여 지방으로부터 피부의 분리를 보장한다(도 2A).
- 근막이 적절하게 절단되면 사타구니 지방의 양면이 보이는지 확인합니다(사타구니 지방은 사타구니 부위에서 뒤쪽으로 확장됨). 다음으로, 10mg/mL BSA 1mL가 들어 있는 두 개의 별도 원뿔형 튜브에서 양면의 지방을 제거합니다(그림 2B).
- 부고환 (내장)
- 복부 피부를 절단하고 고환을 둘러싼 얇은 층을 조심스럽게 통해 부고환 지방을 수확합니다(그림 2C).
- 집게로 지방 조직을 부드럽게 잡아 당기고 가위를 사용하여 잘라냅니다. 눈에 보이는 주요 혈관을 해부하지 마십시오(고환과 부고환을 채취해야 하는 경우 생체 후드의 세척 단계에서 제거하십시오).
- 제거된 지방을 PBS에 10mL의 1mg/mL BSA가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 조심스럽게 넣습니다.
참고: 부고환 지방 제거는 사타구니 지방이 제거된 후에 이루어져야 합니다. 부고환 지방은 일반적으로 부피가 작고 사타구니 지방 아래, 고환과 부고환을 둘러싼 복부 피부 아래에 위치합니다.
- 후방 피하
- 쥐를 엎드린 채 (등쪽이 위로 향하게) 돌리고 큰 가위를 사용하여 피부 바로 아래에서 너무 깊게 자르지 않도록주의하면서 등 (이 부위의 피부가 두껍습니다)의 피부를 두피까지 자릅니다 (그림 2D).
- 피부와 조직을 연결하는 근막을 잘라냅니다. 지방은 interscapular 영역에 있습니다. 갈색 지방과 피하 지방을 구별/분리하기 위해 메모해 두십시오. 갈색 지방은 척추에 더 가깝습니다 (그림 2E).
- PBS에서 10mL의 1mg/mL BSA와 함께 해당 50mL 원뿔형 튜브에 지방을 분리하고 넣습니다.
- 사타구니 (피하)
그림 2: 다양한 지방 조직 저장소의 분리 . (A) 사타구니 지방 조직의 절제에 필요한 초기 절개. (B) 사타구니 지방 저장소의 위치. (C) 부고환 지방 저장소의 위치, 접근에 필요한 외피의 절개에 주목. (D) 마우스가 추가 지방에 접근하기 쉬운 상태로 배치되면 추가 절개가 필요합니다. (E) 후방 피하 지방 저장소의 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 미세혈관 단편 격리 프로토콜
- 쥐에서 절제된 지방이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 바이오후드에 넣습니다.
- 집게를 사용하여 지방을 표준 100mm 페트리 접시에 넣습니다(조직을 수분을 유지하기 위해 PBS에 ~0.5mL의 1mg/mL BSA 포함).
- 지방에서 눈에 보이는 혈관과 근육/외부 조직을 청소하고 제거합니다.
- ~10분 동안 가위로 지방을 다집니다(10mL 피펫으로 옮길 수 있을 만큼 충분히 다집니다).
- PBS에 ~0.5mL의 1mg/mL BSA를 추가하여 덩어리를 확인합니다. 필요한 경우 계속 다지십시오.
- 다진 지방을 10mL 피펫이 있는 멸균 250mL 플라스크에 옮깁니다.
알림: 피펫을 사용하여 볼륨을 기록하십시오. - 최종 부피가 20mL가 되도록 충분한 BSA(1mg/mL)를 추가합니다.
- PBS에 4mg/mL BSA를 콜라게나제(콜라게나제 최종 농도: 6mg/mL)에 추가합니다(즉, 콜라게나제 72mg의 경우 12mL, 콜라게나제 144mg의 경우 24mL).
알림: 시간에 민감하므로 다지기가 완료될 때까지 추가하지 마십시오. - 원뿔형 튜브를 부드럽게 흔들어 균질한 용액을 확인하고 0.22μm 나일론 네트 필터로 용액을 여과하여 멸균합니다.
- 부고환 지방의 경우 ~8-10분 동안 소화합니다. 사타구니 및 후방 피하 지방의 경우 37°C 수조에서 ~15-20분 동안 소화하고 플라스크를 전체적으로 원을 그리며 흔듭니다(지방이 몇 덩어리만 남아 있는 곳에 도달하는 순간 멈춥니다).
- 소화된 지방을 50mL 원추형 튜브(~30mL/튜브가 있어야 함)에 옮기고 튜브에 "소화된 지방"이라고 표시합니다.
- 튜브를 400 x g 에서 4분 동안 돌립니다. 방사 후 펠릿은 빨간색이어야 합니다(그림 3A).
- 스핀하는 동안 멸균 37μM 스크린과 500μM 스크린을 PBS에 5mL의 1mg/mL BSA가 포함된 멸균 페트리 접시에 넣어 사용하기 전에 미리 담급니다.
- 스핀 후 상층액을 "폐기물"이라고 표시된 50mL 원추형 튜브에 디캔팅합니다. 표면 지방을 제거하고 MVF로 만든 펠릿을 방해하지 않도록 부드럽게 디캔테이션을 수행합니다.
- PBS에 1mg/mL BSA 10mL를 펠릿("소화된 지방")이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 펠릿을 2x (위아래로 피펫) 분쇄합니다.
- 파편을 방해하지 않도록 펠릿을 너무 거칠게 만들지 마십시오.
- 플라스틱 스크린 홀더 위의 새 페트리 접시에 500μM 스크린을 놓습니다(그림 3B).
- 동심원을 사용하여 500μM 스크린을 통해 "소화된 펠릿" 튜브에서 피펫 10mL를 추출합니다(그림 3C).
- PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 세척합니다. 원하는 세포는 페트리 접시로 걸러집니다. 따라서 500μM 스크린을 버리고 여과된 액체는 페트리 접시 내부에 저장합니다.
- 37μM 스크린을 플라스틱 스크린 홀더 위의 새 페트리 접시에 넣습니다.
- 37μM 스크린을 사용하기 전에 피펫을 교체하여 덩어리를 제거하십시오.
- 1차 여과로부터 얻어진 액체를 동심원을 이용하여 37 μM 스크린을 통해 피펫화하였다.
- PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 세척합니다. 원하는 세포는 필터에 남아 있으므로 여과된 액체는 버리지만 37μM 스크린은 저장합니다.
- 37μM 스크린을 PBS에 5mg/mL BSA 1mL가 들어 있는 새 페트리 접시에 밀어 넣습니다.
- 접시를 원뿔형 홀더에 대고 두드려 흔들어 조각을 제거합니다. 액체/세포가 페트리 접시에서 쏟아질 수 있으므로 너무 세게 흔들지 마십시오.
- PBS에서 5mg/mL BSA의 1mL를 추가로 사용하여 필터를 헹굽니다. 원하는 세포는 페트리 접시의 액체 용액에 남아 있습니다. 37 μM 스크린과 액체를 함유한 제거된 단편을 다음 단계를 위해 페트리 접시 내부에 저장한다.
- 액체를 함유하는 BSA+ 단편을 멸균된 50 mL 코니컬 튜브로 옮긴다.
- 37μM 스크린의 헹굼을 여러 번 더 반복하고(PBS에서 ~5mL의 1mg/mL BSA를 사용할 때마다) 원뿔형 튜브에 추가합니다. 수집된 총 부피가 ~15-20mL가 될 때까지 반복합니다. 궁극적으로, 원하는 세포는 페트리 접시의 액체 용액에서 수집되어 원추형 튜브에 배치됩니다. 이 시점에서, 최종 헹굼 후 37 μM 스크린을 버리고 50 mL 코니컬 튜브 내부에 액체가 포함된 제거된 단편을 저장한다.
- 가위를 사용하여 200μL 피펫 팁의 끝을 잘라냅니다. 50mL 튜브를 부드럽게 흔들고 20μL의 샘플 2개를 제거한 다음 깨끗한 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
- 페트리 접시의 각 샘플에서 절편 수를 계산하여 분리된 MVF의 총 수를 구합니다.
총 조각 수 =
- 액체가 포함된 나머지 분리된 단편을 400 x g 의 50mL 원뿔형 튜브에 4분 동안 회전시켜 MVF를 수집합니다.
그림 3: MVF의 분리. (A) 지방 조직의 소화 후, 스핀다운 후 펠릿과 상청액을 포함하는 MVF의 분리 묘사. (B) MVF의 여과 및 포획을 위한 공급품의 배치. (C) 여과/세척 단계를 위한 동심원 방법의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 피브린 하이드로겔의 형성
- 계산 예:
참고: 아래는 ~15,000-20,000 MVF/mL로 시딩된 MVF와 2:5에서 피브리노겐:트롬빈 겔 비율에 대한 계산이며, 피브리노겐은 20mg/mL 농도로 사용됩니다.- 5개의 250 μL 젤을 만들기 위해서는 총 1,250 μL의 부피가 필요합니다. 따라서 항상 피펫팅 오류를 고려하여 1.5mL의 젤을 충분히 만드십시오.
- 다음과 같이 필요한 피브리노겐의 양을 계산하십시오.
, X1 = 428.57 μL의 피브리노겐 - 다음과 같이 필요한 트롬빈의 양을 계산하십시오.
, X2 = 트롬빈 1,071.43μL - 필요한 부피 428.57 μL의 경우 다음과 같이 500 μL의 피브리노겐을 만듭니다.
20mg/mL * 0.5mL = 피브리노겐 10mg. 500μL의 DMEM에서 이를 재현탁합니다. - 각 젤을 얻으려면 다음과 같이 피브리노겐과 트롬빈의 부피를 계산하십시오.
- 피브리노겐 :
, X1 = 71.43 μL의 피브리노겐 (DMEM에서) + MVF - 트롬빈:
, X2 = 트롬빈 178.57μL
- 피브리노겐 :
- 다음과 같이 필요한 피브리노겐의 양을 계산하십시오.
- 5개의 250 μL 젤을 만들기 위해서는 총 1,250 μL의 부피가 필요합니다. 따라서 항상 피펫팅 오류를 고려하여 1.5mL의 젤을 충분히 만드십시오.
- MVF 피브린 겔 주조
- 50mL 원뿔형 튜브에서 스펀다운 조각에 있는 대부분의 액체를 디캔팅합니다. 피펫을 사용하여 원뿔형 튜브의 가장자리에 걸린 소량의 액체를 제거합니다.
- 젤이 만들어질 웰에 트롬빈을 추가합니다(그림 4A).
- 200 μL 피펫 팁의 끝을 클립하고 피브리노겐을 사용하여 MVF를 부드럽게 재현탁하여 겔에서 ~15,000-20,000 MVF/mL의 최종 밀도를 얻습니다.
- 200μL 피펫 팁의 끝을 클립하고 MVF+피브리노겐을 트롬빈 용액에 부드럽게 넣습니다. 균질한 혼합물을 보장하기 위해 빠르게 위아래로 피펫합니다. 모든 젤이 만들어질 때까지 반복합니다(그림 4B).
- 웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 ~15분 동안 놓아 겔 가교를 허용합니다(그림 4C).
- 각 웰에 100-150 μL의 성장 배지를 추가합니다.
, X1 = 428.57 μL의 피브리노겐
, X2 = 트롬빈 1,071.43μL
, X1 = 71.43 μL의 피브리노겐 (DMEM에서) + MVF
, X2 = 트롬빈 178.57μL
그림 4 : MVF 피브린 겔의 형성. (A) 5/7 부분 트롬빈 혼합물이 해당 웰에 피펫팅됩니다. (B) 다음으로, 잘린 피펫 팁(MVF를 방해하지 않기 위해)을 사용하여 2/7 부분 피브리노겐+MVF 혼합물을 웰에 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. (C) 마지막으로, 완성된 모든 겔을 37°C의 인큐베이터에 넣어 배지를 위에 놓기 전에 하이드로겔이 완전히 고형화되도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. MVF의 배양 조건
- 혈관화되지 않은 백색 및 베이지색 지방 조직(+ GM 대조군)을 배양하기 위해, 도 5에 도시된 타임라인19를 사용한다.
- 혈관화된 백색 및 베이지색 지방 조직 (+ GM 대조군)의 배양을 위해, 도 6에 도시된 타임라인19를 사용한다.
- 하이드로겔은 연구를 위한 배양 기간 동안 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 유지되어야 하며, 배지는 격일로 교체되어야 합니다. 분석을 위한 샘플의 고정 및 취급에 대해서는 이전에 발표된 저작물16,19,20을 참조하십시오.
그림 5: 비혈관화 지방 조직 형성 시기. 이 수치는 Acosta et al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 혈관화된 지방 조직 형성 시기. 이 수치는 Acosta et al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
베이지색/갈색 지방 조직의 몇 가지 주요 표현형 형태학적 특징이 있습니다: 다안성/작은 지질 방울을 포함하고, 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고(생체 내에서 특징적으로 "갈색"으로 보이는 이유), 이에 따라 높은 산소 소비율/미토콘드리아 생물 에너지를 가지며, 혈관이 많이 형성되고, 지방 분해/인슐린 자극 포도당 흡수가 증가하고, 가장 악명 높게, 열 발생 호흡에 관여하는 미토콘드리아 단백질인 uncoupling protein 1 (UCP1)을 높은 수준으로 발현한다19,30.
따라서 MVF가 베이지색 지방 조직으로 분화하는 능력을 특성화할 때 MVF의 변형을 시각화하고(그림 7, 그림 8), 유전적으로 확인하고(그림 9, 그림 10) 기능적으로 측정(그림 11)할 수 있는 분석이 수행되었습니다.
도 7 및 도 8에서, BODIPY의 이용, 지질 염색 및 공초점 현미경을 이용한 하이드로젤의 이미징을 통해, 분화된 지방세포에서 지질의 크기 및 위치를 가시화한 것을 알 수 있었다16,17,19. 특히, 이 분석에서, 특히 조건 간의 비교에서 BAM 그룹은 NIH ImageJ19,20을 통해 정량화할 수 있는 더 작은 지질 크기(베이지색 지방 조직 형성을 나타냄)를 표시해야 합니다.
RT-qPCR 16,19,20을 사용하여, 도 9 및 도 10에서, 가장 뚜렷하게, UCP1의 발현은, 전반적으로 BAM에 대한 MVF 노출시 유의하게 증가하였다.
마지막으로, 미토콘드리아 생물 에너지학(그림 11)을 살펴보면, BAM 그룹은 해마 미토 스트레스 테스트19,20을 사용하여 측정한 산소 소비율(OCR) 수준이 특징적으로 더 높다는 것이 분명합니다.
그림 7: r-MVF 조직학적 평가. 제2형 또는 제2형 당뇨병 유래 r-MVF를 직접(상부 패널, ADIPO) 또는 간접(하부 패널, ANGIO+ADIPO) WAM 또는 BAM 지방 생성 배지에 노출시켜 각각 비혈관화 또는 혈관화된 흰색 또는 베이지색 지방 조직을 얻었습니다(스케일 바 = 200μm). 이 수치는 Acosta et al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: h-MVF 조직학적 평가. h-MVF를 직접(ADIPO) WAM 또는 BAM에 노출시켜 각각 혈관화되지 않은 백색 또는 베이지색 지방 조직을 얻었다(스케일 바 = 200 μm). 이 수치는 Gonzalez Porras et al.20에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: RT-qPCR을 통한 r-MVF 평가. (A-C) 직접 또는 (E-G) 간접 WAM 또는 BAM에 노출된 린(L) 또는 제2형 당뇨병(Db) 유래 r-MVF는 (A,E) 지방 생성(Adiponectin), (B,F) 열 생성(UCP1) 및 (C,G) 혈관신생(ANGPT1). 결과는 두 번의 실험 반복실험의 평균 ± 표준 오차(n = 4)로 보고됩니다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 및 **** = p < 0.0001. D0 = 0일. 그룹 간의 차이를 확인하기 위해 Holm-Sidak의 다중 비교 분석을 사용한 이원 분산 분석(ANOVA) 테스트. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였다. 이 수치는 Acosta et al.19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: RT-qPCR을 통한 h-MVF 평가. 직접 WAM 또는 BAM에 노출된 h-MVF는 (A) 지방생성(아디포넥틴) 및 (B) 열생성(UCP1)에 대해 평가되었습니다. 결과는 두 번의 실험 반복실험의 평균 ± 표준 오차(n = 4)로 보고됩니다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 및 **** = p < 0.0001. 그룹 간의 차이를 확인하기 위한 Holm-Sidak의 다중 비교 분석을 사용한 일원 분산 분석(ANOVA) 검정. 통계학적 유의성은 p < 0.05로 정의하였다. 이 수치는 Gonzalez Porras et al.20에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: r-MVF 및 h-MVF 기능 평가. (A) 직접 또는 (B) 간접 WAM 또는 BAM 또는 (C) 직접 WAM 또는 BAM에 노출된 제2형 당뇨병(L) 또는 제2형 당뇨병(Db) 유래 r-MVF 또는 직접 WAM 또는 BAM에 노출된 h-MVF는 산소 소비율(OCR) 측정을 통해 기능적으로 평가되었습니다. 결과는 두 번의 실험 반복실험의 평균 ± 표준 오차(n = 4)로 보고됩니다. 이 수치는 Acosta et al.19에서 수정되었습니다. 및 Gonzalez Porras et al.20. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
갈색 / 베이지 색 지방 조직 공학 분야는 대체로 미성숙 22,23,24,25,26,27,28이며, 대부분의 지방 모델은 백색 지방 조직 8,22,31을 위해 개발되고 있습니다 . 조작된 갈색/베이지색 미세조직은 전형적으로 천연 갈색 지방 조직의 표현형 특성의 하위집합을 얻기 위한 다중 세포 공급원 또는 유전적 변형으로 구성된다 8,11,32. 본원에 기술된 접근법은 미세혈관 단편(MVF)을 활용하여 기능적이고, 구조적으로 관련된, 혈관화된 베이지색 지방을 생성하는 단일 소스의, 잠재적으로 자가18,33 방법을 제시한다. MVF는 백색 지방 조직 형성의 원인으로 가장 잘 알려져 있다 14,16,17,1 8,34, 비록 우리가 최근에 설치류, 인간 및 병에 걸린 근원으로부터 유래한 베이지색 지방 형성에 대한 능력을 입증했지만, 여기에 표시된 바와 같이19,20. 치료 또는 질병 모델링 가능성을 위해 베이지색/갈색 지방을 활용하는 데 상당한 관심을 감안할 때 이 기술은 신진대사, 비만 및 관련 장애 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.
프로토콜에 설명된 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫째, 쥐와 인간 MVF의 활용 사이에는 차이가 있습니다. 설치류 유래(생쥐 29 또는 쥐에서 유래)의 사용은 지금까지 MVF에 대한 연구를 주로 지배해 왔으며, 비만 35, 제1형 당뇨병 36,37, 제2형 당뇨병19, 노화 38, 심지어 지방 저장소(adipose depot)39 또는 성별40의 차이와 같은 다양한 조건에서 MVF를 조사했습니다. MVF는 그 기원을 감안할 때 표준 최소 침습 절차41를 사용하여 성인의 피하 지방 저장소에서 자가 분리할 수 있지만 MVF 기반 혈관 형성은 임상 실습에서 수행되지 않았습니다. 그러나 인간 MVF가 리포아스피레이트에서 채취된 전임상 연구에서는 그 가능성을 입증했습니다 18,33. 구체적으로 우리 그룹의 경우, 대표 데이터에서 볼 수 있듯이 혈관화된 베이지색 지방 조직의 형성은 현재 설치류에서 유래한 MVF로 제한됩니다. 앞서 우리 그룹과 다른 사람들에 의해 입증된 바와 같이18, 혈관 성장과 지방세포 분화의 균형을 얻는 것은 매우 민감하고, 도입된 인자에 의존하는 것으로 입증되었으며42, 시점 분화가 유발된다16. 설명된 프로토콜의 한계는 혈관화된 h-MVF 베이지색 지방 조직 형성에 도움이 되는 조건을 최적화하기 위해 추가 개발이 필요하다는 것입니다. 또한, 생체 내에서 이러한 스캐폴드의 반응을 살펴보고 관련 최적화 단계와 함께 다른 질병 상태에서 파생되는 추가 작업이 필요합니다.
또한, 여기에 설명된 것은 수컷 래트의 3개의 상이한 지방 조직 저장소로부터 r-MVF를 분리하기 위한 프로토콜이다. Später et al.39 의 이전 연구에서는 내장 및 피하 저장소 유래 MVF의 혈관화 능력 간의 차이점에 대해 논의했으며, 피하 저장소 MVF는 과도한 결합 조직 오염에 기인하는 혈관화 능력이 감소했다는 점에 주목했습니다. 우리의 연구에서는 여기 "대표 데이터"에 제시된 바와 같이 사타구니 피하 및 후방 피하 저장소만 사용되었다는 점에 유의해야 합니다. 피하 유래 MVF만 사용하기로 한 선택은 지방 흡인 또는 유사한 절차가 독점적으로 피하 지방 조직을 수집하는 번역 연구를 보다 밀접하게 모방하기 위해 이루어졌습니다. 또한, 생체 내 연구에서 베이지색 지방 조직을 정확히 가리키는 것이 전지방세포 또는 형질전환되는 백색 지방세포의 뚜렷한 하위 집합을 포함하는 피하 지방 조직 내에서 개발되고 있다는 사실은 우리의 결정43에 대한 추가 근거를 제공했습니다. 우리 그룹의 이전 연구에서는 혈관신생과 백색 지방 조직 형성을 모두 겪는 건강한 설치류의 내장 또는 피하 저장소에서 유래한 MVF 간에 눈에 띄는 차이가 없음을 보여주었습니다16. 이러한 모든 변수는 향후 연구를 설계할 때 고려되어야 합니다.
마지막으로, 설명된 방법을 수정하거나 문제를 해결하려고 할 때 몇 가지 필수 사항을 숙고해야 합니다. 첫째, 지방 조직을 효소적으로 소화하는 단계는 매우 중요합니다. 유사한 크기와 품질의 MVF를 일관되게 재현할 수 있도록 특별한 주의를 기울이고 최적화를 보장해야 합니다. 지방 유형과 지방 부피 사이의 큰 차이를 감안할 때 (동물의 나이, 크기, 건강 및 지방 분리 시 취한 관리[오염 물질 방지 및 추출 효율]에 따라 크게 달라짐), 소화 시간은 다양할 수 있으므로 당사 장비/동물에 가장 적합한 범위가 제공됩니다. 그러나 최적의 결과를 얻으려면 사용자 지정을 고려해야 합니다. 또한 MVF를 취급할 때 효소 후 분해 중에 불필요한 거칠기와 파편 분해를 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 마지막으로, 배지 제형, 선택된 하이드로겔(44) 및 배양 조건은 의도된 결과에 따라 고도로 맞춤화될 수 있다는 것을 알아야 한다. 여기에서 볼 수 있듯이 다양한 출처에서 파생된 MVF(예: 순수 MVF 대 당뇨병 MVF)는 차별화 정도가 다르므로 실험을 설계할 때 적절한 대조군과 실험 그룹이 포함되어야 합니다.
결론적으로, 열 발생 지방 조직 공학 분야가 성장함에 따라 구조적, 유전적, 기능적으로 천연 베이지/갈색 지방 조직을 모방하는 생물학적 관련 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. MVF는 여기에 설명된 대로 베이지색 지방의 생물학적 모조품을 만드는 간단한 단독 소스 방법을 제공하기 때문에 이 문제에 대한 흥미롭고 독특한 접근 방식을 제시합니다. 따라서 비만 및 대사 질환 치료제에 대한 이해 또는 개발을 활용할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
Acosta 박사는 국립 보건원 보조금 CA148724 및 TL1TR002647의 지원을 받습니다. 곤잘레스 포라스 박사는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)의 지원을 받고 있습니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health, 5SC1DK122578)과 텍사스 대학교 샌 안토니오 생물 의학 공학과 (University of Texas at San Antonio Department of Biomedical Engineering)의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림은 부분적으로 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
| Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
| Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
| Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
| Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
| Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
| Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
| Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
| Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
| Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
| MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
| Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
| Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
| Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
| Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
| Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
| Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
| Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
| Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
| Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
| Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |
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