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Bioengineering

माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से संवहनी थर्मोजेनिक वसा ऊतक की त्रि-आयामी संस्कृति

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64650
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Summary

यहां, हम कृंतक या मानव वसा ऊतक से अलग माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों के उपयोग को रेखांकित करते हुए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कार्यात्मक, संवहनी बेज वसा ऊतक को इंजीनियर करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण है।

Abstract

इंजीनियरिंग थर्मोजेनिक वसा ऊतक (जैसे, बेज या भूरे रंग के वसा ऊतक) की जांच चयापचय रोगों के लिए संभावित चिकित्सा के रूप में या स्वास्थ्य स्क्रीनिंग और दवा परीक्षण के लिए व्यक्तिगत सूक्ष्म ऊतकों के डिजाइन के लिए की गई है। वर्तमान रणनीतियाँ अक्सर काफी जटिल होती हैं और थर्मोजेनिक वसा ऊतक के बहुकोशिकीय और कार्यात्मक गुणों को पूरी तरह से चित्रित करने में विफल रहती हैं। माइक्रोवैस्कुलर टुकड़े, छोटे बरकरार माइक्रोवाइल जिनमें धमनशी, शिराएं और वसा ऊतक से अलग केशिकाएं शामिल हैं, कोशिकाओं के एकल ऑटोलॉगस स्रोत के रूप में काम करते हैं जो वैस्कुलराइजेशन और वसा ऊतक गठन को सक्षम करते हैं। यह लेख माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से त्रि-आयामी, संवहनी और कार्यात्मक थर्मोजेनिक वसा ऊतकों की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए संस्कृति की स्थितियों को अनुकूलित करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिसमें वसा ऊतक और संस्कृति स्थितियों से माइक्रोवस्कुलर टुकड़ों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सर्वोत्तम प्रथाओं पर चर्चा की जाती है, जैसा कि इंजीनियर ऊतकों को चिह्नित करने के लिए तकनीकें हैं, और कृंतक और मानव माइक्रोवैस्कुलर टुकड़े दोनों से नमूना परिणाम प्रदान किए जाते हैं। इस दृष्टिकोण में मोटापे और चयापचय रोग के लिए उपचार की समझ और विकास के लिए उपयोग किए जाने की क्षमता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक एकल, संभावित ऑटोलॉगस स्रोत, माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ा (एमवीएफ) से संवहनी बेज वसा ऊतक विकसित करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करना है। ब्राउन और बेज वसा ऊतकों को चयापचय विनियमन से संबंधित लाभकारी गुणों को प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है; हालांकि, वयस्कों में इन वसा ऊतक डिपो की छोटी मात्रा प्रणालीगत चयापचय पर संभावित प्रभाव को सीमित करती है, विशेष रूप से मोटापे या टाइप 2 मधुमेह 1,2,3,4,5,6,7 जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में। मोटापे और इसकी कोमोर्बिडिटी 8,9,10,11,12 से जुड़े हानिकारक चयापचय प्रभावों को रोकने के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में भूरे / बेज वसा में महत्वपूर्ण रुचि है।

एमवीएफ पोत संरचनाएं हैं जिन्हें वसा ऊतक से सीधे अलग किया जा सकता है, सुसंस्कृत किया जा सकता है, और 13,14,15 की विस्तारित अवधि के लिए त्रि-आयामी विन्यास में बनाए रखा जा सकता है। हमारे समूह और अन्य लोगों के पिछले काम ने एमवीएफ की बहुकोशिकीय और मल्टीपोटेंट क्षमता का फायदा उठाना शुरू कर दिया है, विशेष रूप से क्योंकि यह वसा ऊतक गठन16,17,18 से संबंधित है। इस काम के निर्माण के रूप में, हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि स्वस्थ और टाइप 2 मधुमेह19 के कृंतक मॉडल और मानव विषयों (50 वर्ष से अधिक आयु के वयस्कों) 20 से प्राप्त एमवीएफ में थर्मोजेनिक, या बेज, वसा ऊतक बनाने के लिए प्रेरित होने में सक्षम कोशिकाएं थीं।

इसमें एक अभिनव दृष्टिकोण है जिसमें से एक एकल स्रोत एमवीएफ का उपयोग किया जाता है, न केवल बेज वसा ऊतक बनाने में सक्षम है, बल्कि इसके संबंधित और महत्वपूर्ण संवहनी घटक21 भी हैं। थर्मोजेनिक वसा ऊतक गठन के लिए एक सरल ऊतक-इंजीनियर दृष्टिकोण की तलाश में अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। बेज वसा ऊतक 22,23,24,25,26,27,28 को इंजीनियर करने के इच्छुक अन्य तरीकों के विपरीत, इस अध्ययन में वर्णित प्रक्रिया को कई सेल प्रकारों या जटिल प्रेरण आहार का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है। संवहनी बेज और सफेद वसा मॉडल कृंतक और मानव स्रोतों से उत्पन्न एमवीएफ के साथ बनाए जा सकते हैं, जो महान अनुवाद क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का अंतिम उत्पाद भूरे रंग के वसा ऊतक की तुलना में संरचना और चयापचय समारोह के साथ एक इंजीनियर बेज थर्मोजेनिक वसा ऊतक है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल इस विचार को प्रस्तुत करता है कि एक आसानी से सुलभ और संभवतः ऑटोलॉगस स्रोत एमवीएफ चयापचय संबंधी विकारों का अध्ययन करने के लिए एक सार्थक चिकित्सीय हस्तक्षेप और उपकरण हो सकता है।

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Protocol

यह अध्ययन प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के सिद्धांतों के अनुसार पशु कल्याण अधिनियम और कार्यान्वयन पशु कल्याण विनियमों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। सैन एंटोनियो में टेक्सास विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

नोट: नीचे वर्णित चरणों के लिए, नर लुईस चूहों का उपयोग किया जाता है। एक महिला के लिए मामूली प्रोटोकॉल समायोजन किया जाना चाहिए, साथ ही माउस माइक्रोवस्कुलर टुकड़ा (एमवीएफ) संग्रह29। मानव एमवीएफ (एच-एमवीएफ) का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक एकमात्र कदम निर्माता के प्रोटोकॉल, विकास मीडिया तैयारी (1.3), फाइब्रिन हाइड्रोगेल (5) के गठन और संवर्धन (6) के बाद एच-एमवीएफ का पुन: निलंबन है। प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए, कृपया चित्र 1 देखें।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक रूपरेखा। एमवीएफ का उपयोग करके थर्मोजेनिक वसा ऊतक के गठन के लिए विश्लेषण से पहले छह प्रमुख चरणों का टूटना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. अभिकर्मक तैयारी

नोट: नीचे दिए गए अभिकर्मक एक चूहे के अनुरूप होते हैं, वजन किए जाते हैं और बायोहुड के अंदर बनाए जाते हैं।

  1. पीबीएस में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें।
    1. पीबीएस में 10 मिलीग्राम / एमएल (1.0%) बीएसए को धोने के चरणों (1 मिलीग्राम / एमएल, 0.1%) और पाचन (4 मिलीग्राम / एमएल, 0.4%) के लिए पतला करने के लिए तैयार करें।
    2. चरण 1.1.3-1.1.5 का पालन करते हुए, चरण 1.1.1 में उल्लिखित बीएसए की विभिन्न सांद्रता तैयार करें।
    3. पीबीएस में 10 मिलीग्राम / एमएल बीएसए (पीबीएस में 1% बीएसए)
      1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 500 मिलीग्राम बीएसए और 500 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और बीएसए को भंग करने के लिए घोल को भंवर करें।
      2. यदि अत्यधिक बुलबुले बनते हैं, तो 2 मिनट के लिए 350 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें। 0.22 μm नायलॉन नेट फ़िल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर करें।
    4. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए (पीबीएस में 0.1% बीएसए)
      1. पीबीएस 1:10 में 10 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 15 मिलीलीटर को पीबीएस के साथ 500 मिलीलीटर बाँझ बोतल में 135 मिलीलीटर पीबीएस में जोड़कर पतला करें और एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए बोतल को धीरे से हिलाएं।
    5. पीबीएस में 4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए (पीबीएस में 0.4% बीएसए)
      1. पीबीएस में 10 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 35 मिलीलीटर को पीबीएस के साथ 10 मिलीग्राम/एमएल बीएसए + 100 मिलीलीटर बाँझ बोतल में 57.5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़कर पतला करें और एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए बोतल को धीरे से हिलाएं।
  2. कीमा वसा पैड के पाचन के लिए बीएसए में कोलेजनेस तैयार करें।
    1. 6 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस तैयार करें।
      1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 72 मिलीग्राम कोलेजनेस (लेबल "एपि के लिए") वजन करें।
      2. तीन 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में, 144 मिलीग्राम कोलेजनेस (लेबल "इंग 1 के लिए", "इंग 2 के लिए", और "सबक्यू के लिए") प्रत्येक का वजन होता है।
      3. उपयोग तक वजन किए गए कोलेजनेस को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: पाचन से ठीक पहले तक बीएसए / पीबीएस न जोड़ें।
      4. पीबीएस में 4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 12 एमएल को 72 मिलीग्राम कोलेजनेस युक्त ट्यूब में जोड़ें।
      5. 144 मिलीग्राम कोलेजनेस युक्त ट्यूबों में पीबीएस में 4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 24 एमएल जोड़ें।
      6. एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों को हिलाएं और 0.22 μm नायलॉन नेट फ़िल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर करें।
  3. पृथक एमवीएफ को खिलाने / अलग करने के लिए एमिनोकैप्रोइक एसिड (एसीए) के साथ पूरक विकास मीडिया तैयार करें।
    1. ग्रोथ मीडिया (जीएम): 20% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन स्ट्रेप), 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी और 1 मिलीग्राम / एमएल एसीए के साथ डीएमईएम को पूरक करें।
    2. सफेद एडिपोजेनिक मीडिया (डब्ल्यूएएम) तैयार करें।
      1. डब्ल्यूएएम प्रेरण: 20% एफबीएस, 1% पेन स्ट्रेप, 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी, 10 μg / mL इंसुलिन, 10 μm forskolin, 1 μm डेक्सामेथासोन, और 1 मिलीग्राम / एमएल एसीए के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12।
        नोट: एच-एमवीएफ के लिए, इसके अलावा, इंडोमेथासिन के 125 μM जोड़ें।
      2. डब्ल्यूएएम रखरखाव: 20% एफबीएस, 1% पेन स्ट्रेप, 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी, 5 μg / mL इंसुलिन, और 1 मिलीग्राम / एमएल एसीए के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12।
        नोट: एच-एमवीएफ के लिए, इंसुलिन एकाग्रता को 10 μg / mL में बदलें।
    3. बेज एडिपोजेनिक मीडिया (बीएएम) तैयार करें।
      1. बीएएम प्रेरण: 20% एफबीएस, 1% पेन स्ट्रेप, 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी, 10 μg / mL इंसुलिन, 10 μm forskolin, 1 μm डेक्सामेथासोन, 1 μm रोज़िग्लिटाज़ोन, 20 nM 3,3', 5-Triiodo-L-thyronine (T3), और 1 मिलीग्राम /
        नोट: एच-एमवीएफ के लिए, टी 3 की एकाग्रता को 120 एनएम में बदलें।
      2. बीएएम रखरखाव: 20% एफबीएस, 1% पेन स्ट्रेप, 0.2% माइकोप्लाज्मा रोगनिरोधी, 5 μg / ml इंसुलिन, 10 μm forskolin, 1 μm रोज़िग्लिटाज़ोन, 20 nM T3, और 1 मिलीग्राम / mL ACA के साथ पूरक DMEM / F12।
        नोट: एच-एमवीएफ के लिए, इंसुलिन एकाग्रता को 10 μg / mL और T3 एकाग्रता को 120 nM में बदलें।
  4. फाइब्रिन जैल में उपयोग किए जाने वाले थक्के एजेंट बनाने के लिए थ्रोम्बिन तैयार करें (केवल स्टॉक एलिकोट समाधान उपलब्ध नहीं होने पर बनाया जाना चाहिए)।
    1. डीडीएच2ओ में 10 यू / एमएल थ्रोम्बिन:
      1. निर्माता से शीशी में डीडीएच2ओ के 1-5 एमएल का उपयोग करके थ्रोम्बिन पाउडर को पुन: निलंबित करें और 250 एमएल बीकर में रीसस्पेंशन स्थानांतरित करें।
      2. घोल को 100 एमएल तक लाएं और एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए घोल को कई बार ऊपर और नीचे करें। समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (~ 10 एमएल / ट्यूब) में मिलाएं और एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
        नोट: उपयोग करने के लिए, कमरे के तापमान (आरटी) पर थ्रोम्बिन को पिघलाएं।

2. उपकरण / सामग्री की तैयारी

नोट: उपयोग से पहले सभी इंस्ट्रूमेंटेशन को आटोक्लेव / स्टरलाइज़ किया जाना चाहिए।

  1. चमड़े के नीचे वसा अलगाव (एक परिभाषित शल्य चिकित्सा क्षेत्र में की जाने वाली सर्जरी)
    1. पीबीएस में 10-15 एमएल बीएसए (0.1%) के साथ डिस्पोजेबल अंडरपैड, दो कैंची, एक हेमोस्टैट (वैकल्पिक), दो फोर्सप्स और चार 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
  2. माइक्रोवस्कुलर टुकड़ा अलगाव
    1. मिंकिंग (बायोहुड में किया जाना) के लिए, तीन अनकोटेड बाँझ 100 मिमी पेट्री व्यंजन, एक जोड़ी फोर्सप्स और एक जोड़ी घुमावदार कैंची की उपलब्धता सुनिश्चित करें।
    2. पाचन और अलगाव के लिए (बायोहुड में किया जाना है), कैंची की एक जोड़ी, एक जोड़ी फोर्स, आठ बिना लेपित बाँझ 100 मिमी पेट्री व्यंजन, तीन अनकोटेड बाँझ 35 मिमी पेट्री व्यंजन, कोलेजनेस वजन और 4 डिग्री सेल्सियस पर, चार 250 एमएल फ्लास्क, केंद्र में एक छेद के साथ एक प्लास्टिक धारक, चार 500 μM स्क्रीन (गोल वर्गों में 3 में काटे गए) की उपलब्धता सुनिश्चित करें। चार 37 μM स्क्रीन (गोल वर्गों में 3 में काटे गए), और 11 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब।
  3. फाइब्रिन रिसस्पेंशन
    1. फाइब्रिन हाइड्रोगेल (बायोहुड में किया जाना है) के लिए, सुनिश्चित करें कि फाइब्रिनोजेन, थ्रोम्बिन और विकास मीडिया (अभिकर्मक तैयारी के दौरान बनाया गया) उपलब्ध हैं।

3. वसा अलगाव प्रोटोकॉल

  1. प्रारंभिक कदम
    1. उपयोग करने से पहले सर्जिकल उपकरणों को धोने और साफ करने के लिए इथेनॉल के साथ एक बीकर भरें। इसके बाद, चूहे को संभालने के लिए टेबल तैयार करें और शेविंग चरण के दौरान उत्पन्न फर को एस्पिरेट करने के लिए एक वैक्यूम तैयार करें।
    2. बर्फ के साथ एक बाल्टी तैयार करें जहां पहले से तैयार 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, प्रत्येक में 10 एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए होगा, रखा जाएगा। तदनुसार ट्यूबों को लेबल करें।
      नोट: इंगुइनल वसा के लिए दो अलग-अलग शंक्वाकार ट्यूब होना आवश्यक हो सकता है, क्योंकि दो पक्षों को निकालने की आवश्यकता होती है और इस क्षेत्र से एकत्र वसा की मात्रा एपिडीडिमल और पश्चवर्ती चमड़े के नीचे की तुलना में सबसे बड़ी होती है।
    3. आवश्यक सर्जिकल उपकरणों के साथ परिभाषित सर्जिकल क्षेत्र में एक इच्छामृत्यु चूहे के साथ शुरू करें। आम तौर पर, सीओ2 का उपयोग आईएसीयूसी प्रोटोकॉल का पालन करते हुए चूहों को इच्छामृत्यु करने के लिए किया जाता है।
    4. हेयर क्लिपर का उपयोग करके, रुचि के क्षेत्र के आसपास चूहे को शेव करें। विशेष रूप से, एपिडीडिमल और इंगुइनल वसा अलगाव के लिए कमर और पेट के आधे हिस्से के बीच शेविंग करें (इस क्षेत्र में फर के लिए छोटे शेवर का उपयोग करें)। स्कैपुला के बीच स्थित पीछे के चमड़े के नीचे की वसा प्राप्त करने के लिए पूरी पीठ को शेव करें (एक बड़े शेवर का उपयोग करना सबसे अच्छा है क्योंकि फर चूहे के पीछे की ओर मोटा होता है)।
    5. चूहे को 70% इथेनॉल के साथ छिड़ककर सड़न रोकनेवाला तैयार करें। आम तौर पर, उस क्षेत्र को साफ करने की सिफारिश की जाती है जिसे दो बार काटा जाने वाला है।
  2. विभिन्न वसा डिपो का अलगाव
    1. इंगुइनल (चमड़े के नीचे)
      1. लापरवाह स्थिति में, कैंची की एक जोड़ी के साथ लिंग के नीचे की त्वचा को उठाएं। कैंची से चीरा शुरू करें, केंद्र में शुरू करें और पार्श्व में काटते हुए, "वी" आकार बनाएं और पूरे वसा डिपो तक पहुंचने के लिए चूहे की पीठ पर लूप करें। सतही रूप से कटौती करना याद रखें ताकि नीचे की वसा बरकरार रहे। काटने के चरण के दौरान, परस्पर जुड़े प्रावरणी ऊतक (चित्रा 2 ए) को काटकर वसा से त्वचा के पृथक्करण को सुनिश्चित करें।
      2. एक बार प्रावरणी को उचित रूप से काटने के बाद, सुनिश्चित करें कि इंगुइनल वसा के दो पक्ष दिखाई दे रहे हैं (इंगुइनल वसा कमर क्षेत्र से पीठ की ओर फैली हुई है)। इसके बाद, दो अलग-अलग शंक्वाकार ट्यूबों में दो तरफ से वसा को हटा दें जिसमें 10 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए (चित्रा 2 बी) होता है।
    2. एपिडीडिमल (आंत)
      1. पेट की त्वचा के माध्यम से काटकर और अंडकोष के आसपास की पतली परत के माध्यम से सावधानी पूर्वक एपिडीडिमल वसा की कटाई करें (चित्रा 2 सी)।
      2. बल के साथ, धीरे से वसा ऊतक को बाहर खींचें और कैंची का उपयोग करके इसे काट लें। किसी भी प्रमुख दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं को विच्छेदित करने से बचें (क्या वृषण और एपिडीडिमिस को काटा जाना चाहिए, बायोहुड में सफाई चरण के दौरान उन्हें हटा दें)।
      3. पीबीएस में 10 मिलीलीटर / एमएल बीएसए के साथ हटाए गए वसा को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सावधानी पूर्वक रखें।
        नोट: एपिडीडिमल वसा को हटाने के बाद इंगुइनल वसा को हटा दिया जाना चाहिए। एपिडीडिमल वसा आम तौर पर मात्रा में छोटा होता है और वृषण और एपिडीडिमिस के आसपास की पेट की त्वचा के नीचे स्थित होता है।
    3. पश्चवर्ती चमड़े के नीचे।
      1. चूहे को प्रवण (पृष्ठीय पक्ष ऊपर) घुमाएं और, बड़ी कैंची का उपयोग करके, पीठ की त्वचा (इस क्षेत्र में त्वचा मोटी है) को खोपड़ी तक सभी तरह से काट दें, त्वचा के ठीक नीचे बहुत गहरा न काटने का ध्यान रखें (चित्रा 2 डी)।
      2. त्वचा को ऊतक से जोड़ने वाली प्रावरणी को काटें; वसा इंटरस्कैपुलर क्षेत्र में स्थित है। चमड़े के नीचे की वसा को भूरे रंग की वसा से अलग करने के लिए एक नोट बनाएं। भूरे रंग की वसा रीढ़ की हड्डी के करीब है (चित्रा 2 ई)।
      3. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 10 एमएल के साथ संबंधित 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (ओं) में वसा को अलग करें और रखें।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न वसा ऊतक डिपो का अलगाव । (ए) इंगुइनल एडीपोज ऊतक के छांटने के लिए आवश्यक प्रारंभिक चीरे। (बी) इंगुइनल वसा डिपो का स्थान। (सी) एपिडीडिमल वसा डिपो का स्थान, पहुंच के लिए आवश्यक बाहरी त्वचा के चीरा को ध्यान में रखते हुए। (डी) चूहों को अतिरिक्त वसा तक पहुंचने के लिए प्रवण होने के बाद अतिरिक्त चीरों की आवश्यकता होती है। (ई) पीछे के चमड़े के नीचे वसा डिपो का स्थान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ा अलगाव प्रोटोकॉल

  1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (ट्यूब) जिसमें चूहे से उत्पादित वसा होती है, को बायोहुड में रखें।
  2. फोर्सप्स का उपयोग करके, वसा को एक मानक 100 मिमी पेट्री डिश में रखें (ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए पीबीएस में ~ 0.5 एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के साथ)।
  3. वसा से किसी भी दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं और मांसपेशियों / बाहरी ऊतक को साफ करें और हटा दें।
  4. वसा को कैंची के साथ ~ 10 मिनट के लिए कीमा करें (पर्याप्त कीमा ताकि इसे 10 एमएल पिपेट के साथ स्थानांतरित किया जा सके)।
  5. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के ~ 0.5 एमएल जोड़कर गांठ की जांच करें; यदि आवश्यक हो तो जांच जारी रखें।
  6. कीमा वसा को 10 एमएल पाइप के साथ बाँझ 250 एमएल फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक पाइप का उपयोग कर वॉल्यूम नोट करें।
  7. पर्याप्त बीएसए (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा 20 एमएल हो।
  8. पीबीएस में 4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए को कोलेजनेस में जोड़ें (कोलेजनेस अंतिम एकाग्रता: 6 मिलीग्राम / एमएल) (यानी, 72 मिलीग्राम कोलेजनेस के लिए 12 एमएल या 144 मिलीग्राम कोलेजनेस के लिए 24 एमएल)।
    नोट: जब तक मिंसिंग पूरी न हो जाए तब तक न जोड़ें क्योंकि यह समय के प्रति संवेदनशील है।
  9. एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब को धीरे से हिलाएं और 0.22 μm नायलॉन नेट फ़िल्टर के साथ घोल को फ़िल्टर करें।
  10. एपिडीडिमल वसा के लिए, ~ 8-10 मिनट के लिए पचाएं; इंगुइनल और पश्चवर्ती चमड़े के नीचे की वसा के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ~ 15-20 मिनट के लिए पचाएं, फ्लास्क को पूरे गोलाकार गति में हिलाएं (उस समय रुक जाएं जहां वसा केवल कुछ झुरमुट शेष हैं)।
  11. पचने वाले वसा को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें (~ 30 एमएल / ट्यूब होना चाहिए), और ट्यूब को "पचने वाले वसा" के रूप में लेबल करें।
  12. 4 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब स्पिन करें; घूमने के बाद, गोली लाल होनी चाहिए (चित्रा 3 ए)।
  13. स्पिन के दौरान, बाँझ 37 μM स्क्रीन और 500 μM स्क्रीन को एक बाँझ पेट्री डिश में पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 5 मिलीलीटर के साथ उपयोग से पहले भिगोने के लिए रखें।
  14. स्पिन के बाद, सतह पर तैरनेवाले को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में "अपशिष्ट" के रूप में लेबल किया जाता है। सतही वसा को हटाने और एमवीएफ से बने छर्रों को परेशान नहीं करने के लिए धीरे से डिकेंटेशन करें।
  15. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 10 एमएल को गोली ("पचा वसा") युक्त ट्यूब में जोड़ें। गोली को 2x पर ट्राइट्यूरेट (ऊपर और नीचे की ओर घुमाएं)।
  16. टुकड़ों को बाधित न करने के लिए गोली पर बहुत कठोर होने से बचें।
  17. प्लास्टिक स्क्रीन धारक (चित्रा 3 बी) के ऊपर एक नए पेट्री डिश में 500 μM स्क्रीन रखें।
  18. संकेंद्रित वृत्तों का उपयोग करके 500 μM स्क्रीन पर "पचा हुआ पेलेट" ट्यूब से पिपेट 10 एमएल (चित्रा 3 सी)।
  19. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के अतिरिक्त 5 एमएल के साथ फिल्टर धो लें। वांछित कोशिकाएं पेट्री डिश में फ़िल्टर होंगी; इसलिए, 500 μM स्क्रीन को छोड़ दें लेकिन पेट्री डिश के अंदर फ़िल्टर किए गए तरल को सहेजें।
  20. प्लास्टिक स्क्रीन धारक के ऊपर एक नए पेट्री डिश में 37 μM स्क्रीन रखें।
  21. 37 μM स्क्रीन का उपयोग करने से पहले किसी भी झुरमुट को खत्म करने के लिए पिपेट को बदलें।
  22. संकेंद्रित वृत्तों का उपयोग करके 37 μM स्क्रीन पर पहले निस्पंदन से प्राप्त तरल को पिपेट।
  23. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के अतिरिक्त 5 एमएल के साथ फिल्टर धो लें। वांछित कोशिकाएं फ़िल्टर में रहेंगी, इसलिए फ़िल्टर किए गए तरल को छोड़ दें, लेकिन 37 μM स्क्रीन को सहेजें।
  24. 37 μM स्क्रीन को एक नए पेट्री डिश में स्लाइड करें जिसमें पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 5 मिलीलीटर शामिल हैं।
  25. टुकड़ों को हटाने के लिए शंक्वाकार धारक के खिलाफ टैप करके पकवान को हिलाएं। बहुत जोर से न हिलाएं, क्योंकि तरल / कोशिकाएं पेट्री डिश से बाहर फैल सकती हैं।
  26. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के अतिरिक्त 5 एमएल के साथ फिल्टर को धो लें। पेट्री डिश में वांछित कोशिकाएं तरल घोल में रहेंगी। 37 μM स्क्रीन और पेट्री डिश के अंदर तरल युक्त हटाए गए टुकड़े को निम्नलिखित चरणों के लिए सहेजें।
  27. तरल युक्त बीएसए + टुकड़े को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  28. 37 μM स्क्रीन को कई बार दोहराएं (हर बार पीबीएस में ~ 5 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के साथ) और शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। तब तक दोहराएं जब तक कि एकत्र की गई कुल मात्रा ~ 15-20 एमएल न हो। अंततः, वांछित कोशिकाओं को पेट्री डिश में तरल समाधान से एकत्र किया जाएगा और शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाएगा; इस बिंदु पर, अंतिम कुल्ला करने के बाद 37 μM स्क्रीन को छोड़ दें लेकिन 50 mL शंक्वाकार ट्यूब के अंदर तरल युक्त बिखरे हुए टुकड़ों को बचाएं।
  29. कैंची का उपयोग करके 200 μL पिपेट टिप के अंत को क्लिप करें। धीरे से 50 एमएल ट्यूब को हिलाएं, 20 μL के दो नमूने निकालें, और उन्हें एक साफ 35 मिमी पेट्री डिश में डालें।
  30. पृथक किए गए एमवीएफ की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए पेट्री डिश में प्रत्येक नमूने में टुकड़ों की संख्या की गणना करें।
    कुल टुकड़े = Equation 1
  31. एमवीएफ को इकट्ठा करने के लिए 4 मिनट के लिए 400 x g पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तरल युक्त शेष बिखरे हुए टुकड़े को घुमाएं।

Figure 3
(ए) वसा ऊतक के पाचन के बाद, स्पिन-डाउन के बाद पेलेट और सुपरनैटेंट युक्त एमवीएफ के पृथक्करण का चित्रण। (बी) एमवीएफ के निस्पंदन और फंसाने के लिए आपूर्ति का लेआउट (सी) निस्पंदन / धोने के चरणों के लिए संकेंद्रित सर्कल विधि का चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. फाइब्रिन हाइड्रोजेल का निर्माण

  1. उदाहरण गणना:
    नोट: नीचे ~ 15,000-20,000 एमवीएफ / एमएल और फाइब्रिनोजेन: थ्रोम्बिन जेल अनुपात 2: 5 पर बीज ति एमवीएफ के लिए गणना है, जिसमें फाइब्रिनोजेन का उपयोग 20 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर किया जाता है।
    1. पांच 250 μL जैल बनाने के लिए, 1,250 μL की कुल मात्रा की आवश्यकता होती है। हमेशा पाइपिंग त्रुटियों के लिए जिम्मेदार हैं, इसलिए, 1.5 एमएल जैल के लिए पर्याप्त बनाएं।
      1. आवश्यक फाइब्रिनोजेन की मात्रा की गणना निम्नानुसार करें:
        Equation 2, X1 = 428.57 μL फाइब्रिनोजेन
      2. आवश्यक थ्रोम्बिन की मात्रा की गणना निम्नानुसार करें:
        Equation 3, X2 = 1,071.43 μL थ्रोम्बिन
      3. 428.57 μL की आवश्यक मात्रा के लिए, 500 μL फाइब्रिनोजेन निम्नानुसार बनाएं:
        20 मिलीग्राम / एमएल * 0.5 एमएल = 10 मिलीग्राम फाइब्रिनोजेन। इसे DMEM के 500 μL में पुन: निलंबित करें
      4. प्रत्येक जेल प्राप्त करने के लिए, फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन की मात्रा की गणना निम्नानुसार करें:
        1. फाइब्रिनोजेन:
          Equation 4, एक्स1 = 71.43 μL फाइब्रिनोजेन (डीएमईएम में) + एमवीएफ
        2. थ्रोम्बिन:
          Equation 5, X2 = 178.57 μL थ्रोम्बिन
  2. एमवीएफ फाइब्रिन जेल कास्टिंग
    1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में काता-फिरता हुआ टुकड़ा में अधिकांश तरल को हटा दें। शंक्वाकार ट्यूब के रिम पर पकड़ने वाले तरल की छोटी मात्रा को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    2. थ्रोम्बिन को कुओं में जोड़ें जहां जैल बनाए जाएंगे (चित्रा 4 ए)।
    3. 200 μL पिपेट टिप के अंत को क्लिप करें और जेल में एक बार ~ 15,000-20,000 MVF / mL का अंतिम घनत्व प्राप्त करने के लिए फाइब्रिनोजेन का उपयोग करके एमवीएफ को धीरे से फिर से निलंबित करें।
    4. 200 μL पिपेट टिप के अंत को क्लिप करें और पिपेट एमवीएफ + फाइब्रिनोजेन को थ्रोम्बिन समाधान में धीरे से क्लिप करें। एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से ऊपर और नीचे पाइप करें। सभी जैल बनने तक दोहराएं (चित्रा 4 बी)।
    5. जेल क्रॉसलिंकिंग (चित्रा 4 सी) की अनुमति देने के लिए ~ 15 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में अच्छी प्लेट (ओं) रखें।
    6. प्रत्येक कुएं में 100-150 μL विकास मीडिया जोड़ें।

Figure 4
चित्र 4: एमवीएफ फाइब्रिन जैल का गठन । (ए) 5/7-भाग थ्रोम्बिन मिश्रण संबंधित कुएं में पाइप हो जाता है। (बी) इसके बाद, एक कटी हुई पाइप टिप (एमवीएफ को परेशान न करने के लिए) के साथ, एक 2/7-भाग फाइब्रिनोजेन + एमवीएफ मिश्रण को कुएं में पाइप किया जाता है और धीरे से मिलाया जाता है। (सी) अंत में, सभी पूर्ण जैल को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखा जाता है, जिससे हाइड्रोगेल को मीडिया को शीर्ष पर रखने से पहले पूरी तरह से ठोस होने की अनुमति मिलती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. एमवीएफ की खेती की शर्तें

  1. गैर-संवहनी सफेद और बेज वसा ऊतक (+ जीएम नियंत्रण) की खेती के लिए, चित्र 5 में दिखाए गए टाइमलाइन19 का उपयोग करें।
  2. संवहनी सफेद और बेज वसा ऊतक (+ जीएम नियंत्रण) के संवर्धन के लिए, चित्र 6 में दिखाए गए टाइमलाइन19 का उपयोग करें।
  3. हाइड्रोगेल को अध्ययन के लिए संस्कृति की अवधि के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में बनाए रखा जाना चाहिए, जिसमें मीडिया को हर दूसरे दिन बदला जाना चाहिए। विश्लेषण के लिए नमूने के निर्धारण और हैंडलिंग के लिए, पहले प्रकाशित कार्यों 16,19,20 को देखें।

Figure 5
चित्रा 5: गैर-संवहनी वसा ऊतक गठन के लिए समय। यह आंकड़ा Acosta et al.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: संवहनी वसा ऊतक गठन के लिए समय। यह आंकड़ा Acosta et al.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

भूरे रंग के वसा ऊतक की कुछ प्रमुख फेनोटाइपिक रूपात्मक विशेषताएं हैं: यह बहुकोणीय / इसमें छोटे लिपिड बूंदें होती हैं, बड़ी संख्या में माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं (विवो में इसकी विशिष्ट रूप से "भूरा" उपस्थिति का कारण), तदनुसार उच्च ऑक्सीजन खपत दर / माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक है, अत्यधिक संवहनी है, लिपोलिसिस / इंसुलिन-उत्तेजित ग्लूकोज अपटेक में वृद्धि हुई है, और, सबसे कुख्यात, अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) के उच्च स्तर को व्यक्त करता है, एक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन जो थर्मोजेनिक श्वसन19,30 में शामिल है।

तदनुसार, बेज वसा ऊतक में अंतर करने के लिए एमवीएफ की क्षमता को चिह्नित करते समय, एक विश्लेषण आयोजित किया गया था जो हमें कल्पना करने (चित्रा 7, चित्रा 8), आनुवंशिक रूप से पुष्टि (चित्रा 9, चित्रा 10), और कार्यात्मक रूप से मापने (चित्रा 11) एमवीएफ के परिवर्तन की अनुमति देगा।

चित्रा 7 और चित्रा 8 में, बीओडीआईपीवाई, एक लिपिड दाग के उपयोग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हाइड्रोगेल की इमेजिंग के माध्यम से, विभेदित एडिपोसाइट्स में लिपिड के आकार और स्थान का दृश्य 16,17,19 देखा गया था। विशेष रूप से, इस विश्लेषण में, विशेष रूप से स्थितियों के बीच तुलना में, बीएएम समूहों को छोटे लिपिड आकार (बेज वसा ऊतक गठन का संकेत) प्रदर्शित करना चाहिए, जो एनआईएच इमेजजे 19,20 के माध्यम से मात्रात्मक है।

आरटी-क्यूपीसीआर 16,19,20 का उपयोग करते हुए, चित्रा 9 और चित्रा 10 में, सबसे विशिष्ट रूप से, बीएएम के एमवीएफ एक्सपोजर पर यूसीपी 1 की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई है।

अंत में, माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक (चित्रा 11) को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि बीएएम समूहों में विशिष्ट रूप से उच्च ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) स्तर हैं, जिसे सीहॉर्स माइटो तनाव परीक्षण19,20 का उपयोग करके मापा जाता है।

Figure 7
चित्रा 7: आर-एमवीएफ हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। दुबला या टाइप 2 मधुमेह व्युत्पन्न आर-एमवीएफ को क्रमशः गैर-संवहनी या संवहनी सफेद या बेज वसा ऊतक प्राप्त करने के लिए प्रत्यक्ष (ऊपरी पैनल, एडीआईपीओ) या अप्रत्यक्ष (निचला पैनल, एंजियो + एडीआईपीओ) डब्ल्यूएएम या बीएएम एडिपोजेनिक मीडिया के संपर्क में लाया गया था (स्केल बार = 200 μm)। यह आंकड़ा Acosta et al.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एच-एमवीएफ हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। एच-एमवीएफ को क्रमशः गैर-संवहनी सफेद या बेज वसा ऊतक प्राप्त करने के लिए प्रत्यक्ष (एडीआईपीओ) डब्ल्यूएएम या बीएएम के संपर्क में लाया गया था (स्केल बार = 200 μm)। इस आंकड़े को गोंजालेज पोरस एट अल.20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से आर-एमवीएफ मूल्यांकन। लीन (एल) या टाइप 2 डायबिटिक (डीबी) व्युत्पन्न आर-एमवीएफ या तो (ए-सी) प्रत्यक्ष या (ई-जी) अप्रत्यक्ष डब्ल्यूएएम या बीएएम के संपर्क में आने पर (ए, ई) एडिपोजेनेसिस (एडिपोनेक्टिन), (बी, एफ) थर्मोजेनेसिस (यूसीपी 1), और (सी, जी) एंजियोजेनेसिस (एएनजीपीटी 1) के लिए मूल्यांकन किया गया था। परिणामों को दो प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों (एन = 4) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, और **** = p < 0.0001. D0 = दिन 0 समूहों के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए होल्म-सिदक के कई तुलना विश्लेषणों के साथ विचरण (एनोवा) परीक्षणों का दो-तरफा विश्लेषण। सांख्यिकीय महत्व को पी < 0.05 के रूप में परिभाषित किया गया था। यह आंकड़ा Acosta et al.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
प्रत्यक्ष डब्ल्यूएएम या बीएएम के संपर्क में आने वाले एच-एमवीएफ का मूल्यांकन (ए) एडिपोजेनेसिस (एडिपोनेक्टिन) और (बी) थर्मोजेनेसिस (यूसीपी 1) के लिए किया गया था। परिणामों को दो प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों (एन = 4) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, और **** = p < 0.0001. समूहों के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए होल्म-सिदक के कई तुलना विश्लेषणों के साथ विचरण (एनोवा) परीक्षणों का एक-तरफा विश्लेषण। सांख्यिकीय महत्व को पी < 0.05 के रूप में परिभाषित किया गया था। इस आंकड़े को गोंजालेज पोरस एट अल.20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: आर-एमवीएफ और एच-एमवीएफ कार्यात्मक मूल्यांकन। लीन (एल) या टाइप 2 डायबिटिक (डीबी) व्युत्पन्न आर-एमवीएफ या तो (ए) प्रत्यक्ष या (बी) अप्रत्यक्ष डब्ल्यूएएम या बीएएम या (सी) एच-एमवीएफ के संपर्क में आने से ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के माप के माध्यम से कार्यात्मक रूप से मूल्यांकन किया गया था। परिणामों को दो प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों (एन = 4) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। यह आंकड़ा Acosta et al.19 से संशोधित किया गया है। और गोंजालेज पोरस एट अल.20. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बेज वसा ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र काफी हद तक अपरिपक्व है 22,23,24,25,26,27,28, जिसमें सफेद वसा ऊतक 8,22,31 के लिए वसा मॉडल का बड़ा हिस्सा विकसित किया जा रहा है।. बेज माइक्रोटिश्यूज में आमतौर पर देशी भूरे रंग के वसा ऊतक 8,11,32 के फेनोटाइपिक विशेषताओं का उप-समूह प्राप्त करने के लिए कई सेल स्रोत या आनुवंशिक परिवर्तन होते हैं। यहां वर्णित दृष्टिकोण माइक्रोवस्कुलर टुकड़ों (एमवीएफ) का उपयोग करके कार्यात्मक, संरचनात्मक रूप से प्रासंगिक और संवहनी बेज वसा बनाने का एक एकल-स्रोत, संभावित ऑटोलॉगस18,33 तरीका प्रस्तुत करता है। एमवीएफ को विशेष रूप से सफेद वसा ऊतक गठन 14,16,17,18,34 के स्रोत के रूप में जाना जाता है, हालांकि हमने हाल ही में कृंतक, मानव और रोगग्रस्त स्रोतों से उत्पन्न बेज वसा गठन के लिए उनकी क्षमता का प्रदर्शन किया है, जैसा कि यहां दिखाया गया है 19,20. ब्राउन वसा को इसकी चिकित्सीय या रोग मॉडलिंग क्षमता के लिए उपयोग करने में काफी रुचि को देखते हुए, इस तकनीक में चयापचय, मोटापा और संबंधित विकारों के क्षेत्र में दूरगामी अनुप्रयोग हैं।

प्रोटोकॉल में वर्णित कई प्रमुख बिंदु हैं। सबसे पहले, चूहे बनाम मानव एमवीएफ के उपयोग के बीच अंतर हैं। कृंतक-व्युत्पन्न (या तो चूहों 29 या चूहों से) का उपयोग, अब तक, एमवीएफ के साथ अनुसंधान पर काफी हद तक हावी रहा है, जिसमें उन्हें मोटापा 35, टाइप 1 मधुमेह36,37, टाइप 2 मधुमेह 19, और उम्र बढ़ने38 जैसी स्थितियों की भीड़ में देखा गया है, और यहां तक कि वसा डिपो 39 या लिंग40 के बीच अंतर भी।. हालांकि एमवीएफ, उनकी उत्पत्ति को देखते हुए, मानक न्यूनतम-इनवेसिव प्रक्रियाओं41 का उपयोग करके वयस्कों के चमड़े के नीचे के वसा डिपो से ऑटोलॉगरूप से अलग किया जा सकता है, नैदानिक अभ्यास में एमवीएफ-आधारित वैस्कुलराइजेशन नहीं किया गया है। हालांकि, प्रीक्लिनिकल अध्ययन जहां लिपोएस्पिरेट से मानव एमवीएफ की कटाई की गई थी, ने इसकी संभावना18,33 प्रदर्शित की है। हमारे समूह के लिए विशेष रूप से, जैसा कि प्रतिनिधि डेटा में दिखाया गया है, संवहनी बेज वसा ऊतक का गठन वर्तमान में कृन्तकों से प्राप्त एमवीएफ तक सीमित है। जैसा कि पहले हमारे समूह और अन्य18 द्वारा प्रदर्शित किया गया था, पोत विकास और एडिपोसाइट्स भेदभाव का संतुलन प्राप्त करना अत्यधिक संवेदनशील है,जो पेश किए गए कारकों पर निर्भर साबित होता है, और टाइमपॉइंट भेदभाव को उकसायाजाता है। वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि संवहनी एच-एमवीएफ बेज वसा ऊतक गठन के लिए अनुकूल परिस्थितियों को अनुकूलित करने के लिए आगे के विकास की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, विवो में इन मचानों की प्रतिक्रिया को देखते हुए और अन्य रोगग्रस्त राज्यों से प्राप्त करने के साथ-साथ संबंधित अनुकूलन कदमों के लिए आगे के काम की आवश्यकता है।

इसके अलावा, यहां वर्णित नर चूहों में तीन अलग-अलग वसा ऊतक डिपो से आर-एमवीएफ के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। Spéter et al.39 के पिछले काम ने आंत बनाम चमड़े के नीचे के डिपो-व्युत्पन्न एमवीएफ की वैस्कुलराइजेशन क्षमता के बीच अंतर पर चर्चा की, यह देखते हुए कि चमड़े के नीचे के डिपो एमवीएफ में संवहनी करने की क्षमता कम हो गई थी, एक विशेषता जो उन्होंने अतिरिक्त संयोजी ऊतक संदूषण के लिए जिम्मेदार ठहराया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, हमारे अध्ययनों के लिए, जैसा कि "प्रतिनिधि डेटा" में यहां प्रस्तुत किया गया है, केवल इंगुइनल चमड़े के नीचे और पीछे के चमड़े के नीचे के डिपो का उपयोग किया गया था। चमड़े के नीचे-व्युत्पन्न एमवीएफ का पूरी तरह से उपयोग करने का विकल्प ट्रांसलेशनल अध्ययनों की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए किया गया था जहां लिपोएस्पिरेट, या इसी तरह की प्रक्रियाएं, विशेष रूप से चमड़े के नीचे वसा ऊतक एकत्र करती हैं। इसके अतिरिक्त, तथ्य यह है कि विवो अध्ययनों में पिन-पॉइंटिंग बेज वसा ऊतक को चमड़े के नीचे वसा ऊतक के भीतर विकसित किया जा रहा है, जिसमें प्रीडिपोसाइट्स या सफेद एडिपोसाइट्स का एक अलग उप-समूह होता है जो अंतर करता है, हमारे निर्णयके लिए एक और तर्क प्रदान करता है। हमारे समूह के पिछले काम ने एंजियोजेनेसिस और सफेद वसाऊतक गठन दोनों से गुजरने के लिए स्वस्थ कृन्तकों के आंत या चमड़े के नीचे के डिपो से उत्पन्न एमवीएफ के बीच कोई समझदार अंतर नहीं दिखाया। भविष्य के अध्ययनों को डिजाइन करते समय इन सभी चर पर विचार किया जाना चाहिए।

अंत में, वर्णित विधि को संशोधित या समस्या निवारण करने का प्रयास करते समय, कुछ आवश्यक बिंदुओं पर विचार-विमर्श किया जाना चाहिए। सबसे पहले, वसा ऊतक को एंजाइमेटिक रूप से पचाने का चरण बेहद महत्वपूर्ण है; समान आकार और गुणवत्ता के एमवीएफ को लगातार पुन: पेश करने के लिए विशेष देखभाल की जानी चाहिए और अनुकूलन सुनिश्चित किया जाना चाहिए। वसा के प्रकार और वसा की मात्रा के बीच बड़ी भिन्नता को देखते हुए (पशु की उम्र, आकार, स्वास्थ्य और वसा अलगाव के समय की गई देखभाल [दूषित पदार्थों और निष्कर्षण दक्षता से बचाव] पर अत्यधिक निर्भर), पाचन का समय भिन्न हो सकता है, इस प्रकार सीमाएं, जो हमारे उपकरण / जानवरों के साथ सबसे अच्छी तरह से फिट होती हैं। हालांकि, इष्टतम परिणामों के लिए अनुकूलन पर विचार किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एमवीएफ को संभालते समय, पोस्ट-एंजाइमेटिक पाचन के दौरान, अनावश्यक खुरदरापन और आगे टूटने वाले टुकड़ों से बचने के लिए विशेष देखभाल की जानी चाहिए। अंत में, किसी को पता होना चाहिए कि मीडिया फॉर्मूलेशन, पसंद के हाइड्रोगेलऔर संस्कृति की स्थिति इच्छित परिणामों के आधार पर अत्यधिक अनुकूलन योग्य हैं। जैसा कि यहां दिखाया गया है, विभिन्न स्रोतों (जैसे, दुबला बनाम मधुमेह एमवीएफ) से प्राप्त एमवीएफ में भेदभाव की अलग-अलग डिग्री होती है, इसलिए प्रयोगों को डिजाइन करते समय, उचित नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों को शामिल किया जाना चाहिए।

अंत में, जैसे-जैसे इंजीनियरिंग थर्मोजेनिक वसा ऊतक का क्षेत्र बढ़ता है, जैविक-प्रासंगिक प्रणालियों का निर्माण करना महत्वपूर्ण है जो संरचनात्मक, आनुवंशिक रूप से और कार्यात्मक रूप से देशी बेज / भूरे रंग के वसा ऊतक की नकल करते हैं। एमवीएफ इस चुनौती के लिए एक रोमांचक और अनूठा दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, क्योंकि वे, जैसा कि यहां वर्णित है, बेज वसा की जैविक नकल बनाने के लिए एक सरल एकमात्र-स्रोत विधि प्रदान करते हैं। इसलिए, वे मोटापे और चयापचय रोग के लिए उपचार की समझ या विकास के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण क्षमता रखते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

अकोस्टा को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स सीए 148724 और टीएल 1टीआर 002647 द्वारा समर्थित किया गया है। गोंजालेज पोरस को पुरस्कार संख्या एफ 32-0डीके 122754 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज द्वारा समर्थित किया गया है। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (5SC1DK122578) और सैन एंटोनियो डिपार्टमेंट ऑफ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग में टेक्सास विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो। आंकड़े आंशिक रूप से Biorender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

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माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से संवहनी थर्मोजेनिक वसा ऊतक की त्रि-आयामी संस्कृति
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