Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantifiering och helgenomkarakterisering av SARS-CoV-2 RNA i avloppsvatten- och luftprover

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Detta protokoll syftar till att kvantifiera SARS-CoV-2-RNA i avloppsvatten- och luftprover som ska användas för avloppsvattenbaserade epidemiologiska studier och för att bedöma exponeringsrisken för SARS-CoV-2 i aerosoler inomhus och utomhus. Detta protokoll beskriver också en sekvenseringsmetod med lång mall för SARS-CoV-2 helgenomkarakterisering.

Abstract

Avloppsvattenbaserad epidemiologi har visat sig vara ett lovande och effektivt övervakningssystem för SARS-CoV-2 och andra infektionssjukdomar i många länder. Processen involverar vanligtvis koncentration av avloppsvatten, nukleinsyraextraktion, amplifiering av utvalda genomiska segment samt detektion och kvantifiering av det amplifierade genomiska segmentet. Denna metod kan på samma sätt användas för att upptäcka och kvantifiera smittämnen, såsom SARS-CoV-2, i luftprover. Ursprungligen antogs SARS-CoV-2 spridas främst genom nära personlig kontakt med droppar som genereras av en infekterad individ när han talar, nyser, hostar, sjunger eller andas. Ett växande antal studier har dock rapporterat förekomsten av SARS-CoV-2-RNA i luften på vårdinrättningar, vilket visar att luftburen överföring är en gångbar väg för viruset. Denna studie presenterar en sammansättning av etablerade protokoll för att underlätta miljödetektering, kvantifiering och sekvensering av virus från både avloppsvatten och luftprover.

Introduction

I december 2019 dök en ny sjukdom som kallas covid-19 upp, orsakad av ett tidigare okänt coronavirus, SARS-CoV-21. Den resulterande globala pandemin har utgjort en betydande utmaning för kliniska laboratorier och folkhälsolaboratorier över hela världen, eftersom ett stort antal individer behöver testning för att korrekt bedöma virusöverföring och prevalens i samhället. I många regioner är det dock ekonomiskt omöjligt att uppnå den nödvändiga testnivån i tid och på ett rumsligt heltäckande sätt 2,3. Nuvarande övervakningssystem som bygger på individuell klinisk diagnostik är starkt beroende av symtomens svårighetsgrad och individuell rapportering, samt i vilken utsträckning dessa symtom överlappar med befintliga sjukdomar som cirkulerar i befolkningen 4,5,6,7,8,9,10. Följaktligen bidrar ett stort antal asymtomatiska fall till en betydande underskattning av sjukdomsbördan 7,11.

På grund av dessa utmaningar föreslogs avloppsvattenbaserad epidemiologi (WBE) för övervakning av covid-19 som en kompletterande övervakningsstrategi. WBE beskrevs första gången 200112 och användes ursprungligen för att spåra kokain och andra illegala droger13. Detta tillvägagångssätt bygger på antagandet att det är möjligt att beräkna den initiala koncentrationen av alla ämnen som är stabila i avloppsvatten och utsöndras av människor 8,12. WBE har framgångsrikt implementerats i många länder som ett kompletterande och effektivt övervakningssystem för SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. De flesta metoder för att detektera humana virus i vattenmiljöer följer dessa steg: koncentration, nukleinsyraextraktion, amplifiering av det valda genomiska segmentet (eller segmenten) och detektion/kvantifiering av det amplifierade genomiska segmentet3.

En annan viktig miljö för detektion och kvantifiering av SARS-CoV-2 är i luftprover. Ursprungligen trodde man att SARS-CoV-2 huvudsakligen överfördes genom nära personlig kontakt med andningsdroppar från aerosoler som genereras av en infekterad person när han eller hon talar, nyser, hostar, sjunger eller andas17. Flera studier började dock rapportera förekomsten av SARS-CoV-2 RNA i luften, särskilt i vårdinrättningar och andra slutna utrymmen 18,19,20,21. Bevis på SARS-CoV-2-livsduglighet i luftprover som tagits inomhus på sjukhus och andra slutna utrymmen har hittats när viruskoncentrationen var tillräckligt hög22,23,2 4. Utomhusstudier har i allmänhet inte funnit några tecken på SARS-CoV-2, förutom i trånga utomhusutrymmen 21,25,26,27,28,29. Från och med nu har luftburen överföring av SARS-CoV-2 erkänts som ett överföringssätt30,31. En nyligen genomförd översiktsstudie visar skillnaderna mellan utomhus, där riskerna för luftburen överföring är minimala utanför trånga områden, och inomhus, där större risker kan finnas i dåligt ventilerade miljöer där starka källor (dvs. antal smittade personer) kan vara närvarande. En nyligen genomförd omfattande översiktsstudie har belyst de stora skillnaderna mellan riskerna för luftburen överföring i utomhus- och inomhusmiljöer, särskilt i trånga utrymmen med dålig ventilation. Studien indikerar att risken för luftburen överföring är minimal i utomhusmiljöer, där det finns en större volym luft tillgänglig för utspädning och spridning av viruspartiklar32. Dessa resultat har viktiga implikationer för folkhälsopolitik och riktlinjer relaterade till covid-19. Genom att erkänna de betydande skillnaderna i överföringsrisker mellan inomhus- och utomhusmiljöer kan beslutsfattare utveckla effektivare strategier för att mildra spridningen av viruset och skydda folkhälsan.

Det finns en mängd olika metoder och protokoll för detektion, kvantifiering och sekvensering av SARS-CoV-2 från olika miljöprover. Denna metodartikel syftar till att presentera en kombination av väletablerade protokoll som gör det möjligt för laboratorier med olika kapacitetsnivåer att utföra miljödetektering, kvantifiering och sekvensering av virus från avloppsvatten- och luftprover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har publicerats på andra ställen och innehåller små ändringar från de ursprungliga metoderna.

1. Uppsamling av avloppsvatten och förbehandling av prover

OBS: På grund av de låga koncentrationerna av SARS-CoV-2 RNA i miljöprover är implementeringen av ett koncentrationssteg avgörande för en framgångsrik detektion33,34,35. Här beskrivs den första rapporterade metoden för detektion av SARS-CoV-2 i avloppsvatten36.

  1. Insamling och koncentrering av avloppsvattenprover
    1. Samla in 1 l 24 timmars sammansatt avloppsvattenprov. Förvara provet vid 4 °C och fortsätt med protokollet inom 24 timmar.
    2. Homogenisera provet genom att försiktigt skaka flaskan. Samla upp 70 ml i ett 100 ml centrifugalrör eller dela provet i två centrifugalrör på 50 ml.
    3. Spika 20 μL mengovirus (3,2 x 103 kopior/μL) till 70 ml av varje sample som en intern kontroll av koncentrationsprocessen. Alternativt kan du sticka in 10 μL mengovirus (3,2 x 103 kopior/μL) i varje 50 ml centrifugrör.
    4. Homogenisera provet och centrifugera vid 700 x g i 10 minuter för att avlägsna stora partiklar och organismer (pellet).
    5. Använd den resulterande supernatanten för koncentrering med centrifugalultrafiltreringsanordningar med en cutoff på 10 KDa genom centrifugering vid 4 000 x g i 40 minuter vid 4 °C. Eluera koncentratet genom centrifugering vid 700 x g i 40 minuter och invertera ultrafiltreringsanordningens läge.
    6. Mät volymen av det resulterande koncentratet. Volymen kommer att ändras beroende på mängden fasta ämnen i provet som täpper till centrifugalfiltren. I denna studie var de erhållna koncentratvolymerna mellan 200-1 200 μL.
    7. Använd det resulterande koncentratet för RNA-extraktion med hjälp av ett kommersiellt kit eller en intern metod. För de prover som används i denna studie används ett specifikt kommersiellt kit för viral RNA-extraktion med en elueringsvolym på 50 μL.
    8. Mät koncentrationen av det extraherade RNA:t med ett fluorometriskt RNA-kvantifieringskit. Dela upp det extraherade RNA:t i alikvoter och frys vid -80 °C tills vidare analys.
      OBS: För varje uppsättning RNA-isoleringsprocedurer bör en negativ kontroll av isolering (NCI) inkluderas, som endast innehåller buffertar för att upptäcka eventuell kontaminering under extraktionen.
  2. Insamling av luftprover med hjälp av en Coriolis kompakt luftprovtagare
    1. Välj en provtagningsstrategi enligt forskningsmålet genom att definiera provtagningsfrekvens och provtagningsplatser.
    2. Ställ in flödet på luftprovtagaren (här 50 L/min i 30 min). Observera att en flödeshastighet på mer än 200 l/min kan bryta ned viralt RNA, så det rekommenderas att använda en flödeshastighet under 200 l/min.
    3. Placera en steril kon i luftprovtagaren innan du startar uppsamlingen genom att pulsera starten. När provtagningen är klar, tillsätt 5-15 ml steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i konen. Snurra försiktigt eller skaka sample för hand i 15 s. Förvara proverna i upp till 24 timmar vid 4 °C eller vid -80 °C i kryorör.
    4. Ett valfritt koncentrationssteg kan utföras. Rengör och dekontaminera kottarna efter varje experiment med blekmedel.
    5. Extrahera RNA med hjälp av ett kommersiellt kit eller en intern metod. För proverna i denna studie används ett specifikt kommersiellt kit för viral RNA-extraktion med en elueringsvolym på 50 μL.
    6. Mät koncentrationen av det extraherade RNA:t med ett fluorometriskt RNA-kvantifieringskit. Dela upp det extraherade RNA:t i alikvoter och frys vid -80 °C tills vidare analys.
      OBS: För varje uppsättning RNA-isoleringsprocedurer bör en negativ kontroll av isolering (NCI) inkluderas, som endast innehåller buffertar för att upptäcka eventuell kontaminering under extraktionen.

2. Kvantifiering av SARS-CoV-2-RNA genom kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR)

OBS: Nedanstående protokoll är enligt CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR diagnostisk panel37. Dela upp primer/sondblandningen i flera delmängder för att undvika frysning och upptining.

  1. Förbered reaktionsmastermixen för varje mål (mengovirus; SARS-CoV-2 [N1- och N2-gener]) som i tabell 1, i en ren huv i reagensinställningsrummet. Blanda primers/sondblandningen och enzymet genom inversion fem gånger. Alternativt, ljuspulsvirvla primers/sondblandningen och enzymet fem gånger.
    OBS: Håll alla reagenser kalla under beredning och användning. För att minimera frys-upptiningscykler rekommenderas det starkt att frysa in alikvoter.
  2. Snurra ner (1 000 x g i 15-30 s) rören för att samla upp innehållet i botten och placera rören i ett kallt ställ eller på is.
  3. Märk 1.5 ml mikrocentrifugrör för varje mål. Tillsätt till varje mikrocentrifugrör den mängd av varje reagens som behövs (volym per reaktion gånger antalet reaktioner inklusive de nödvändiga kontrollerna). Blanda genom att pipettera upp och ner och centrifugera i 5 s för att samla upp innehållet i botten.
  4. Förvara mikrocentrifugrören i ett kylställ och dispensera 15 μL i remsor PCR-rör eller en 96-hålsplatta i ett kylställ. Täck över plattan och flytta den till nukleinsyrahanteringsområdet (förvara den i ett kylställ).
  5. Tina en alikvot av extraherat RNA och virvla försiktigt i 5 s. Pipettera 5 μL RNA (utöver 5 μL icke-mallkontroll [NTC], negativ kontroll av isolering [NCI] och positiv kontroll [PC]) till varje reaktionsbrunn eller rör som innehåller den tidigare beredda mastermixen. Byt handskar ofta vid behov för att undvika korskontaminering.
  6. Täck hela reaktionsplattan eller rören och virvla försiktigt. Centrifugera (1 000 x g i 15-30 s) plattan eller PCR-rören.
  7. Starta 25 μL RT-qPCR med följande cykelförhållanden: omvänt transkriptas vid 45 °C i 10 min; polymerasaktivering vid 95 °C i 10 minuter. 45 cykler av denaturering vid 95 °C i 15 s. och glödgning/förlängning vid 60 °C i 45 sekunder.
  8. Beräkna återhämtningseffektiviteten för mengoviruskontroller enligt Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Sekvenseringsvarianter i avloppsvatten och dataanalys

OBS: Det beskrivna protokollet är ett modifierat protokoll skapat av Quick et al.39,40. Den använder två uppsättningar primers för SARS-CoV-2-genomamplifiering med PCR-plattsättningsmetodik - ARTIC-primers och VarSkip-primers. En kombination av primers används för att garantera bästa genomtäckning och för att minimera risken för nya mutationer som gör att primers av en typ misslyckas. I allmänhet är protokollet uppdelat i tre delar: omvänd transkription (RT) och amplikongenerering, förberedelse av sekvenseringsbibliotek samt sekvensering och dataanalys.

  1. Omvänd transkription och generering av amplikon
    1. Se till att indataamples har ett känt qPCR-cykeltröskelvärde (Ct) för att korrekt späda ut dem i PCR-klassat vatten. Ct-värdet erhålls under kvantifieringen med qPCR. Utspädningarna är följande: om Ct-värdet är 12-15, späd proverna 1:100; om Ct-värdet är 15-18, späd proverna 1:10; om Ct-värdet är 18-35, späd inte ut sample. Prover över ett Ct-värde på 35 har en stor chans att inte fungera.
    2. Pipettera 16 μL av varje prov på en PCR-platta till dess position på plattan. Tillsätt 4 μl mastermix för omvänd transkription (RT) (5x). Täck över plattan och starta PCR-reaktionen under följande förhållanden: 25 °C i 2 minuter, 55 °C i 20 minuter och 95 °C i 1 minut.
    3. Bered 10 μM utspädningar av varje primeruppsättning (ARTIC pool A och pool B samt VarSkip pool A och pool B). Förbered mastermixen för varje uppsättning primers (ARTIC set A och B och VarSkip set A och B) enligt tabell 2. Fyra mastermixar kommer att bli resultatet av detta.
    4. På en ny PCR-platta pipetterar du 20 μL av mastermixen till varje motsvarande brunn. Tillsätt 5 μl av RT-provet till varje blandning.
      OBS: Varje sample kommer att ha fyra reaktionsblandningar - ARTIC pool A och B och VarSkip pool A och B.
    5. Täck över plattan och starta PCR-reaktionen enligt följande: polymerasaktivering vid 98 °C i 30 s; 35 cykler av denaturering vid 98 °C i 15 s. och glödgning/förlängning vid 65 °C i 4 min. Snurra ner (1 000 x g i 15-30 s) plattan. Kombinera ARTIC-reaktionspoolerna och kombinera VarSkip-reaktionspoolerna separat. Varje prov kommer att ha två 50 μL amplikonreaktioner.
    6. Tillsätt 50 μl pärlbaserat reagens för PCR-rening till varje brunn och blanda väl genom pipettering. Inkubera i rumstemperatur i 5 min.
      OBS: Före varje användning, blanda PCR-reagenset kraftigt för att återsuspendera pärlorna.
    7. Placera plattan på ett magnetiskt separationsstativ och vänta tills kulorna bildar en pellet och vätskan klarnar (~5 min). Pipettera och kassera supernatanten. Håll PCR-plattan på det magnetiska stativet.
    8. Behåll PCR-plattan på det magnetiska stativet, tillsätt 200 μL 80 % etanol till varje sample utan att vidröra pärlpelleten. Ta bort etanolen.
    9. Upprepa föregående steg. Låt plattan på magnetstativet vara otäckt i 30 s så att etanolen kan avdunsta.
    10. Ta bort plattan från magnetstativet och tillsätt 15 μL PCR-vatten till varje sample. Återsuspendera pelleten genom pipettering. Inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    11. Sätt tillbaka plattan på magnetstativet och låt pärlorna pelletera (2 min). Pipettera försiktigt 15 μL av supernatanten från varje prov till en ny PCR-platta.
    12. Mät koncentrationen av varje sample med ett fluorometrisk RNA-kvantifieringskit . Ta ca 50 ng av varje prov i 12,5 μL till nästa steg. Späd vid behov provet i vatten av PCR-kvalitet.
  2. Förberedelse av bibliotek
    1. Tillsätt 1,75 μL reaktionsbuffert från Illumina DNA-bibliotekets beredningssats och 0,75 μL enzymblandning till varje prov. Täck plattan, virvla kort och snurra ner (1 000 x g i 15-30 s). Inkubera vid 21 °C i 5 min och vid 65 °C i 5 min.
    2. Pipettera 3 μL PCR-vatten för varje prov till en ny PCR-platta på en ny platta. Tillsätt 0,75 μL av de förberedda proverna, 1,25 μL streckkoder för sekvenseringsbiblioteksberedning och 5 μL T4 DNA-ligasmastermix. Blanda väl genom att pipettera, centrifugera kort (1 000 x g i 15–30 s) och inkubera vid 21 °C i 20 minuter och vid 65 °C i 10 minuter.
      OBS: Om du använder mindre än 25 samples, dubbla alla volymer i detta steg.
    3. Slå samman alla prover genom att tillsätta 10 μl av varje prov till samma lågbindande rör. Ta 480 μL till nästa steg.
    4. Tillsätt 192 μl pärlbaserat reagens för PCR-rening till poolen och blanda väl genom pipettering. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
    5. Placera röret på ett magnetiskt stativ och vänta tills supernatanten klarnar och en pärlkula bildas. Ta bort supernatanten. Ta bort röret från magnetstativet.
    6. Tillsätt 700 μL av den korta fragmentbufferten (SFB) och blanda med pipettering. Sätt tillbaka på magnetstativet och vänta tills pelleten har bildats och vätskan klarnat (~5 min). Pipettera ut supernatanten och kassera den.
    7. Upprepa föregående steg. Lämna röret på magnetstativet. Tillsätt 100 μL 80 % etanol utan att röra vid vulsten. Pipettera ut etanolen och låt pärlan torka i 30 s.
      OBS: Låt inte pärlan torka för mycket.
    8. Ta bort röret från magnetstativet och tillsätt 35 μL PCR-klassat vatten. Blanda med pipettering och inkubera i rumstemperatur i 2 min. Placera röret på magnetstativet och låt kulan pelleta och vätskan klarna. Pipettera 35 μL av supernatanten till ett nytt rör.
    9. Mät RNA-koncentrationen i det poolade biblioteket. Pipettera den volym som behövs för att nå en mängd på 30-50 ng RNA och fyll den med PCR-klassat vatten för att nå en slutlig volym på 30 μL.
    10. Förbered adapterligeringsreaktionsblandningen: 30 μL av det poolade biblioteket, 5 μL av Adapter Mix II, 10 μL av ligeringsreaktionsbufferten (5x) och 5 μL av T4 DNA-ligas. Blanda genom pipettering och centrifugering (1 000 x g i 15-30 s). Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
    11. Tillsätt 20 μl av det pärlbaserade reagenset för PCR-rening och blanda med pipettering. Inkubera i 10 min i rumstemperatur.
    12. Placera röret på det magnetiska stativet och vänta tills pärlkulan bildas och supernatanten blir färglös. Pipettera försiktigt ut och kassera supernatanten.
    13. Ta bort från magnetstativet och tillsätt 125 μL SFB. Blanda genom att pipettera och lägg tillbaka på det magnetiska stativet för att separera pärlorna. När vätskan är klar, pipettera och kassera supernatanten.
    14. Upprepa föregående steg. Låt röret vara öppet på magnetstativet i 30 s så att en del av den överblivna vätskan kan avdunsta.
    15. Ta bort slangen från magnetstativet och tillsätt 15 μL av elueringsbufferten. Blanda väl genom att pipettera och centrifugera kort (1 000 x g i 15-30 s). Inkubera i rumstemperatur i 5 min. Ställ på magnetstativet i 2 min.
    16. Pipettera över 15 μL av supernatanten till ett nytt lågbindande rör. Det här är det sista biblioteket. Mät koncentrationen med ett fluorometriskt DNA-kvantifieringskit.
      OBS: I nästa steg behövs 12 μL. Om koncentrationen är mycket hög och mindre än 12 μL av biblioteket behövs, fyll upp till 12 μL med elueringsbuffertreagenset.
  3. Inläsning och sekvensering av flödesceller
    1. Sätt in flödescellen (R9.4.1) i DNA- och RNA-sekvenseringsenheten i realtid.
    2. Bered grundblandningen genom att tillsätta 30 μl FLT-reagens (flush tjuder) till ett rör med spolbuffertreagens (FB). Virvel för att blanda och snurra ner (1 000 x g i 15-30 s).
    3. Öppna locket till luftningsporten. Använd en 1 000 μL pipett, ställ in på 200 μL och sätt in spetsen i primingporten. Vrid volyminställningshjulet och öka volymen tills vätskan i spetsen syns. Kassera spetsen.
      OBS: Vrid bara hjulet tills några μL vätska i spetsen syns. Att dra större mängder kan skada flödescellen.
    4. Tillsätt långsamt 800 μL av primingblandningen till primingporten, var noga med att inte introducera bubblor. Vänta i 5 minuter.
    5. Under tiden förbereder du biblioteken för inläsning. Blanda 37,5 μL av sekvenseringsbufferten, 25,5 μL av laddningsbufferten och 12 μL av biblioteket.
      OBS: Blanda laddningsbufferten före pipettering. Pärlorna i detta reagens sätter sig mycket snabbt.
    6. Öppna portluckan. Pipettera 200 μL av primingblandningen i primingporten.
      OBS: När man pipetterar in i primingporten med lockporten öppen, kommer man att märka små droppar som kommer från sample port. Pipettera tillräckligt långsamt så att provporten kan dra in dropparna utan att spilla över.
    7. Innan du laddar det förberedda biblioteket, blanda väl genom att pipettera. Använd en 100 μL-pipett inställd på 75 μL, ta biblioteket och pipetten droppe för droppe in i sample porten. Rör inte porten och vänta tills varje droppe har absorberats i porten innan du laddar nästa droppe för att undvika att vätskan rinner över.
    8. Stäng lockporten och primingporten. Öppna programvaran och starta sekvenseringsexperimentet. Välj basecalling På. För ett bibliotek med 96 multiplexade prover räcker det vanligtvis med 10-12 timmars sekvensering för att generera tillräckligt med data.
      OBS: Med hjälp av programvaran kan man infoga provarket i .csv format. Exempelbladet kräver följande data: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code och kit. Flödescellens ID behövs (visas på sidan av flödescellen) tillsammans med det kit som används. För det föreslagna protokollet bör LSK109-satsen väljas.
  4. Analys av sekvenseringsdata
    1. Infoga de komprimerade fastq-läsningarna i wf-artic-arbetsflödet41. Kör arbetsflödet separat med två olika primerscheman (ARTIC/V4.1 och NEB-VarSkip/v1a). Två ". primertrimmed.rg.sorted.bam" skapas för varje exempel.
    2. Slå samman BAM-filerna till en enda fil med kommandot "samtools merge"42. Infoga den sammanslagna BAM-filen i Freyja-verktyget, lämna standardinställningarna, för att återställa relativa härstamningsöverflöd43.
    3. För att skapa en FASTA-fil, infoga den sammanslagna BAM-filen i verktygen "samtools mpileup" och "ivar" med standardinställningarna44,45. För mutationsanrop, ladda fasta-filen i Nextclade-verktyget46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten som sammanfattas i tabell 3 visar exempel på detektion och kvantifiering av SARS-CoV-2 RNA i avloppsvatten- och luftprover med hjälp av den metod som beskrivs i denna artikel. Avloppsvattenprover samlades in från avloppsreningsverk i Spanien och Slovenien och ansågs vara positiva om Ct var mindre än 40 i minst två av de tre replikaten, och kvantifieringen ansågs giltig om Ct hade en variation på mindre än 5 %. I Spanien och Portugal samlades prover av inomhus- och utomhusluft in, och samma regler tillämpades. Dubbletter användes för luftproverna, inte tre stycken som för avloppsvattenproverna, eftersom syftet med studien var att detektera SARS-CoV-2-RNA och inte att kvantifiera det. Dessutom ansågs en RT-qPCR-körning endast vara giltig om alla kontroller som användes (enligt beskrivningen i detta protokoll) uppförde sig som förväntat och om inga signifikanta avvikelser observerades i mengovirusets RNA-kontroll. För dessa prover varierade mengovirusets återhämtningseffektivitet mellan 13,7 % och 19,7 %. Hämningen utvärderades genom att späda ut tiofaldigt och 100-faldigt extraherat RNA och genom att jämföra de resulterande RT-qPCR-resultaten, samt genom att använda ett kommersiellt kit. Instruktionerna för varje inhibitionskontrollsats ska följas enligt tillverkarens beskrivning.

Avloppsvattenproverna hade en standardavvikelse från 1,91 % till 13,98 % bland triplikaterna och varierade från 3,05 x 10 3 till 2,83 x 108 genkopior/L. Luftproverna varierade från 6,17 x 103 till 5,48 x 109 med en standardavvikelse mellan dubbletterna mellan 0,54 % och 10,95 %. Detta är i enlighet med tidigare studier 6,48,49,50.

Som beskrivs i detta protokoll sekvenserades proverna och ett exempel på tre sekvenserade provresultat sammanfattas i tabell 4 och figur 1. I alla tre urvalen tilldelades härstamningen BA.5.x som den mest utbredda av Freyja-verktyget (95,3 %, 95,4 % och 99,8 %).

Figure 1
Figur 1: Prevalens av SARS-CoV-2-härstamning i utvalda avloppsvattenprover. Släktlinjer tilldelades med hjälp av Freja-verktyget. Sammanställningen av prevalenstalen når inte nödvändigtvis 100 %, eftersom en del av uppgifterna inte är av tillräcklig kvalitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Reagenser och volymer som ska tillsättas av var och en för att bereda mastermixen för SARS-CoV2-kvantifiering med RT-qPCR. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Reagenser och volymer som ska tillsättas av var och en för att bereda mastermixen för att amplifiera det fullständiga SARS-CoV-2-genomet i proverna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Sammanfattning av RT-qPCR-kvantifieringsresultat av SARS-CoV-2-RNA från avloppsvatten- och luftprover. N1-genen användes för kvantifiering och N2 användes för bekräftelse (positiv eller negativ). Resultaten uttrycks i kopior/L. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Upptäckta mutationer och härstamningsprevalens. Släktlinjer tilldelades med hjälp av Freyja-verktyget och enligt de mutationer av intresse som hittades med Nextclade. Genomtäckningen för varje prov visas. Sammanställningen av prevalenstalen når inte nödvändigtvis 100 %, eftersom en del av uppgifterna inte är av tillräcklig kvalitet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrobiell och viral detektion och kvantifiering med hjälp av (RT-)qPCR-metoder har fått stor acceptans på grund av deras anmärkningsvärda känslighet. Dessa tekniker står dock inför många utmaningar vid analys av miljöprover. Avloppsvattenprover innehåller ett överflöd av hämmande ämnen som kan snedvrida mätningarna och generera missvisande resultat. För att ta itu med dessa begränsningar och förbättra precisionen utformades, designades och implementerades ett komplext protokoll. Detta protokoll skräddarsyddes genom att kombinera protokoll från den vetenskapliga litteraturen och för att specifikt ta itu med de begränsningar som är inneboende i qPCR-metoder genom att införliva en rad stränga kontroller i varje steg av processen. Genom att integrera dessa rigorösa kvalitetskontrollåtgärder erbjuder detta protokoll en robust lösning på de utmaningar som qPCR-baserade detektions- och kvantifieringsmetoder i komplexa miljöproverstår inför 51,52. Den negativa kontrollen av isolering (NCI) och icke-mallkontroll (NTC) är viktiga verktyg för att bedöma sannolikheten för kontaminering under RNA-extraktion och RT-qPCR-reaktionen. Dessutom ger integrationen av mengoviruskontroll-RNA ett avgörande sätt att utvärdera variabilitet mellan prover, liksom effektiviteten av koncentrationssteget och de hämmande effekterna av ämnen som finns i komplexa miljöprover. I varje RT-qPCR-reaktion måste positiva kontroller inkluderas för att bekräfta amplifieringsprocessens effektivitet. Det är viktigt att noggrant övervaka varje steg i protokollet, inklusive lagrings- och bearbetningstiden för proverna. Nedbrytningen av proverna kan påverkas av temperaturen och avloppsvattnets komplexa sammansättning, vilket gör det viktigt att förvara proverna vid en temperatur på 4 °C och bearbeta dem inom 24 timmar. Genom att följa dessa stränga kvalitetskontrollåtgärder kan forskare och folkhälsoarbetare på ett säkert och korrekt sätt analysera miljöprover för att avslöja viktiga insikter om mikrobiella och virala populationer och bättre förstå miljöfaktorernas inverkan på människors hälsa48.

Valet av RNA-mål för SARS-CoV-2-detektion är en kritisk faktor som kan påverka känsligheten hos RT-qPCR-analyser. I denna studie utvärderade författarna RdRp-, E-, N1- och N2-målen och fann att RdRp- och E-analyserna hade lägre känslighet än N1- och N2-analyserna, i överensstämmelse med tidigare forskning53. N1- och N2-analyserna använder dubbla släckningsprober, som har visat sig öka deras känslighet i (RT-)qPCR-analyser54. Dessa skäl leder till beslutet att använda N1 för kvantifiering och N2 som en bekräftelse av RNA-närvaron, för att undanröja tvivel när mycket låga koncentrationer upptäcks. De observerade avvikelserna mellan RT-qPCR-mål har tidigare rapporterats36.

Flera studier har använt liknande protokoll och har rapporterat framgångsrik detektion och kvantifiering av SARS-CoV-2 RNA i avloppsvatten under den pågående COVID-19-pandemin 6,48,49,55,56. De rapporterade SARS-CoV-2 RNA-koncentrationerna överensstämmer med de som rapporterats i denna studie och protokoll 48,50,55. Några av dessa studier har undersökt förhållandet mellan aktiva fall och koncentrationer av RT-qPCR-målgener, särskilt N1 och N2 6,36,49,50,55,57,58,59. För att minska variabiliteten i de erhållna genkoncentrationerna har det föreslagits att de experimentella koncentrationerna multipliceras med flödeshastigheten vid provtagningstillfället för att erhålla den initiala virusmängden36. Detta tillvägagångssätt har införlivats i VATar COVID-19-projektet i Spanien, ett nationellt övervakningssystem för COVID-19 i avloppsvatten60.

Som nästa fas av COVID-19-avloppsvattenbaserade epidemiologiska (WBE) studier har forskare försökt upptäcka SARS-CoV-2-mutationer i avloppsvatten för att uppskatta cirkulationen av oroande varianter inom samhällen. Tidigare studier har visat på ett starkt samband mellan de varianter som identifierats i avloppsvattnet och de som finns i befolkningen samtidigt. Dessa resultat tyder på att avloppsvattenbaserad övervakning kan fungera som ett värdefullt verktyg för att spåra spridningen av SARS-CoV-2-varianterna61,62. WBE har visat sig mycket lovande när det gäller övervakning av SARS-CoV-2 och kan användas för att utveckla framtida övervakningsstrategier för pandemier. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart i de tidiga stadierna av en pandemi, när det finns ett begränsat antal individuella tester och många fall kan vara asymtomatiska, och har en kompletterande strategi till klinisk övervakning. Därför kan WBE vara särskilt användbart på platser med låg ekonomisk kapacitet som inte har råd med andra dyrare övervakningsstrategier. Den beskrivna metoden kan enkelt anpassas till andra virus som kan vara aktuella att övervaka i framtiden.

Resultaten av luftprovtagning i inomhus- och utomhusmiljöer visade att SARS-CoV-2 RNA finns i båda miljöerna, men i lägre koncentrationer i utomhusmiljöer 38,63,64. Dessa resultat tyder på att aktiviteter och exponeringar där det är svårt att bära mask och hålla avstånd, t.ex. att äta, dricka eller delta i musikfestivaler, kan utgöra en högre risk för överföring av covid-19. För att minska sådana risker är det viktigt att överväga lämpliga ventilationsåtgärder och användning av munskydd, särskilt med uppkomsten av nya oroande varianter som är mer smittsamma, såsom deltavarianterna (B.1.617.2) och omikron (B.1.1.529). Mot bakgrund av upphävandet av covid-19-restriktionerna i många områden rekommenderas att användningen av masker bibehålls för att hålla samhällsspridningen av SARS-CoV-2 på ett minimum och förhindra framtida utbrott av sjukdomen 5,21,26,65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete utfördes med ekonomiskt stöd från den regionala regeringen i Castilla y León och FEDER-programmet (projekten CLU 2017-09, UIC315 och VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Miljövetenskap utgåva 196 SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR sekvensering varianter av särskild betydelse
Kvantifiering och helgenomkarakterisering av SARS-CoV-2 RNA i avloppsvatten- och luftprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter