Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Bu protokol, atık su bazlı epidemiyoloji çalışmaları için kullanılacak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının miktarını belirlemeyi ve iç ve dış aerosollerde SARS-CoV-2'ye maruz kalma riskini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda SARS-CoV-2 tüm genom karakterizasyonu için kiremitli amplikon uzun şablon dizileme yaklaşımını da açıklar.

Abstract

Atık su bazlı epidemiyoloji, birçok ülkede SARS-CoV-2 ve diğer bulaşıcı hastalıklar için umut verici ve etkili bir sürveyans sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Süreç tipik olarak atık su konsantrasyonunu, nükleik asit ekstraksiyonunu, seçilen genomik segmentlerin amplifikasyonunu ve amplifiye edilmiş genomik segmentin tespitini ve nicelleştirilmesini içerir. Bu metodoloji, hava örneklerinde SARS-CoV-2 gibi bulaşıcı ajanları tespit etmek ve ölçmek için benzer şekilde kullanılabilir. Başlangıçta, SARS-CoV-2'nin öncelikle enfekte bir kişi tarafından konuşurken, hapşırırken, öksürürken, şarkı söylerken veya nefes alırken üretilen damlacıklarla yakın kişisel temas yoluyla yayıldığı varsayılmıştır. Bununla birlikte, giderek artan sayıda çalışma, sağlık tesislerinin havasında SARS-CoV-2 RNA'nın varlığını bildirmiş ve hava yoluyla bulaşmayı virüs için uygun bir yol olarak belirlemiştir. Bu çalışma, hem atık su hem de hava örneklerinden virüslerin çevresel tespitini, miktarını belirlemesini ve dizilenmesini kolaylaştırmak için yerleşik protokollerin bir bileşimini sunmaktadır.

Introduction

Aralık 2019'da, daha önce bilinmeyen bir koronavirüs olan SARS-CoV-21'in neden olduğu COVID-19 adlı yeni bir hastalık ortaya çıktı. Ortaya çıkan küresel salgın, dünya çapında klinik ve halk sağlığı laboratuvarları için önemli bir zorluk teşkil etti, çünkü çok sayıda kişi toplumda virüs bulaşmasını ve yaygınlığını doğru bir şekilde değerlendirmek için teste ihtiyaç duyuyor. Bununla birlikte, birçok bölgede, zamanında ve mekansal olarak kapsamlı bir şekilde gerekli test seviyesine ulaşmak ekonomik olarak mümkün değildir 2,3. Bireysel klinik tanıya dayalı mevcut sürveyans sistemleri, büyük ölçüde semptom şiddetine ve bireysel raporlamaya ve ayrıca bu semptomların popülasyonda dolaşan mevcut hastalıklarla ne ölçüde örtüştüğünedayanmaktadır 4,5,6,7,8,9,10. Sonuç olarak, çok sayıda asemptomatik vaka, hastalık yükünün önemli ölçüde hafife alınmasına katkıda bulunur 7,11.

Bu zorluklar nedeniyle, tamamlayıcı bir sürveyans stratejisi olarak COVID-19 sürveyansı için atık su bazlı epidemiyoloji (WBE) önerilmiştir. WBE ilk olarak 2001'detanımlanmıştır 12 ve başlangıçta kokain ve diğer yasadışı uyuşturucuların izini sürmek için kullanılmıştır13. Bu yaklaşım, atık suda stabil olan ve insanlar tarafından atılan herhangi bir maddenin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamanın mümkün olduğu varsayımına dayanmaktadır 8,12. WBE, SARS-CoV-2 3,8,14,15,16 için tamamlayıcı ve etkili bir sürveyans sistemi olarak birçok ülkede başarıyla uygulanmıştır. Sucul ortamlarda insan virüslerini tespit etme yöntemlerinin çoğu şu adımları takip eder: konsantrasyon, nükleik asit ekstraksiyonu, seçilen genomik segmentin (veya segmentlerin) amplifikasyonu ve amplifiye edilmiş genomik segmentin tespiti/miktarının belirlenmesi3.

SARS-CoV-2'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir diğer önemli ortam da hava örnekleridir. Başlangıçta, SARS-CoV-2'nin esas olarak enfekte bir kişi tarafından konuşurken, hapşırırken, öksürürken, şarkı söylerken veya nefes alırken üretilen aerosollerden solunum damlacıkları ile yakın kişisel temas yoluyla bulaştığı düşünülüyordu17. Bununla birlikte, birkaç çalışma, özellikle sağlık tesislerinde ve diğer kapalı alanlarda havada SARS-CoV-2 RNA'nın varlığını bildirmeye başladı 18,19,20,21. Hastanelerde ve diğer kapalı alanlarda iç mekanlarda alınan hava örneklerinde SARS-CoV-2 canlılığına dair kanıt, virüs konsantrasyonu yeterince yüksek olduğundabulunmuştur 22,23,2 4. Açık hava çalışmaları, kalabalık dış mekanlar dışındagenellikle SARS-CoV-2 kanıtı bulamamıştır 21,25,26,27,28,29. Şu an itibariyle, SARS-CoV-2'nin hava yoluyla bulaşması bir bulaşma şekli olarak kabul edilmiştir30,31. Yakın tarihli bir gözden geçirme çalışması, kalabalık alanların dışında hava yoluyla bulaşma risklerinin minimum olduğu dış mekanlar ile güçlü kaynakların (yani enfekte insan sayısının) bulunabileceği yetersiz havalandırılan ortamlarda daha büyük risklerin bulunabileceği iç mekanlar arasındaki farkları göstermektedir. Yakın zamanda yapılan kapsamlı bir gözden geçirme çalışması, özellikle havalandırmanın yetersiz olduğu kalabalık alanlarda, dış ve kapalı ortamlarda hava yoluyla bulaşma riskleri arasındaki önemli farklılıkları vurgulamıştır. Çalışma, virüs partiküllerinin seyreltilmesi ve dağılması için daha büyük bir hava hacminin bulunduğu dış ortamlarda hava yoluyla bulaşma riskinin minimum olduğunu göstermektedir32. Bu bulguların COVID-19 ile ilgili halk sağlığı politikaları ve kılavuzları için önemli etkileri vardır. Politika yapıcılar, iç ve dış ortamlar arasındaki bulaşma risklerindeki önemli farklılıkları kabul ederek, virüsün yayılmasını azaltmak ve halk sağlığını korumak için daha etkili stratejiler geliştirebilirler.

Farklı çevresel örneklerden SARS-CoV-2'nin tespiti, miktarı ve dizilimi için çeşitli yöntemler ve protokoller vardır. Bu yöntem makalesi, farklı kapasite seviyelerine sahip laboratuvarların atık su ve hava örneklerinden virüslerin çevresel tespitini, miktarını belirlemesini ve dizilenmesini gerçekleştirmesine olanak tanıyan köklü protokollerin bir kombinasyonunu sunmayı amaçlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler başka bir yerde yayınlanmıştır ve orijinal yöntemlerden küçük değişiklikler içerir.

1. Atık su toplama ve numune ön işleme

NOT: Çevresel örneklerdeki düşük SARS-CoV-2 RNA konsantrasyonları nedeniyle, başarılı bir tespit için bir konsantrasyon adımının uygulanmasıçok önemlidir 33,34,35. Burada açıklanan, atık suda SARS-CoV-2'nin tespiti için bildirilen ilk yöntemdir36.

  1. Atık su numunelerinin toplanması ve konsantrasyonu
    1. 1 L 24 saatlik kompozit atık su numunesi toplayın. Numuneyi 4 °C'de saklayın ve 24 saat içinde protokole devam edin.
    2. Şişeyi hafifçe sallayarak numuneyi homojenize edin. 70 mL'yi 100 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın veya numuneyi 50 mL'lik iki santrifüj tüpe bölün.
    3. Konsantrasyon işleminin dahili kontrolü olarak her numuneden 20 μL mengovirüsü (3.2 x 103 kopya / μL) 70 mL'ye dökün. Alternatif olarak, her 50 mL santrifüj tüpüne 10 μL mengovirüs (3.2 x 103 kopya / μL) dökün.
    4. Numuneyi homojenize edin ve büyük partikülleri ve organizmaları (pelet) çıkarmak için 10 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin.
    5. Elde edilen süpernatanı, 4 ° C'de 40 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyerek 10 KDa'lık bir kesme ile santrifüj ile santrifüj ultrafiltrasyon cihazlarıyla konsantrasyon için kullanın. 40 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj ederek ve ultrafiltrasyon cihazının konumunu tersine çevirerek konsantreyi yükseltin.
    6. Elde edilen konsantrenin hacmini ölçün. Hacim, santrifüj filtreleri tıkayan numunedeki katı madde miktarına bağlı olarak değişecektir. Bu çalışmada elde edilen konsantre hacimler 200-1.200 μL arasındaydı.
    7. Elde edilen konsantreyi ticari bir kit veya şirket içi bir yöntem kullanarak RNA ekstraksiyonu için kullanın. Bu çalışmada kullanılan numuneler için, 50 μL'lik bir elüsyon hacmine sahip viral RNA ekstraksiyonu için özel bir ticari kit kullanılmıştır.
    8. Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir florometrik RNA miktar tayin kiti ile ölçün. Ekstrakte edilen RNA'yı alikotlara bölün ve daha fazla analize kadar -80 °C'de dondurun.
      NOT: Her RNA izolasyon prosedürü seti için, ekstraksiyon sırasında olası kontaminasyonu tespit etmek için yalnızca tamponları içeren bir negatif izolasyon kontrolü (NCI) dahil edilmelidir.
  2. Coriolis kompakt hava örnekleyici kullanılarak hava örneklerinin toplanması
    1. Örnekleme sıklığını ve örnekleme yerlerini tanımlayarak araştırma hedefine göre bir örnekleme stratejisi seçin.
    2. Hava örnekleyicide akış hızını ayarlayın (burada, 30 dakika boyunca 50 L/dak). Lütfen 200 L/dk'dan daha yüksek bir akış hızının viral RNA'yı bozabileceğini unutmayın, bu nedenle 200 L/dk'nın altında bir akış hızı kullanılması önerilir.
    3. Başlatmayı darbelendirerek toplamaya başlamadan önce hava örnekleyiciye steril bir koni yerleştirin. Numune alma bittiğinde, koniye 5-15 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Numuneyi 15 saniye boyunca elle hafifçe girdap yapın veya sallayın. Numuneleri kriyotüplerde 4 °C'de veya -80 °C'de 24 saate kadar saklayın.
    4. İsteğe bağlı bir konsantrasyon adımı gerçekleştirilebilir. Her deneyden sonra konileri çamaşır suyu kullanarak temizleyin ve dekontamine edin.
    5. Ticari bir kit veya şirket içi bir yöntem kullanarak RNA'yı çıkarın. Bu çalışmadaki numuneler için, 50 μL'lik bir elüsyon hacmine sahip viral RNA ekstraksiyonu için spesifik bir ticari kit kullanılmıştır.
    6. Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir florometrik RNA miktar tayin kiti ile ölçün. Ekstrakte edilen RNA'yı alikotlara bölün ve daha fazla analize kadar -80 °C'de dondurun.
      NOT: Her RNA izolasyon prosedürü seti için, ekstraksiyon sırasında olası kontaminasyonu tespit etmek için yalnızca tamponları içeren bir negatif izolasyon kontrolü (NCI) dahil edilmelidir.

2. SARS-CoV-2 RNA'sının gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile miktar tayini

NOT: Aşağıdaki protokol CDC 2019-Yeni Koronavirüs (2019-nCoV) RT-PCR tanı paneli37'ye göredir. Donma ve çözülme döngülerini önlemek için astar/prob karışımını birkaç alikota bölün.

  1. Her hedef için reaksiyon mastermix'ini hazırlayın (mengovirüs; SARS-CoV-2 [N1 ve N2 genleri]) Tablo 1'deki gibi, reaktif kurulum odasında temiz bir başlıkta. Primerleri/prob karışımını ve enzimi beş kez ters çevirerek karıştırın. Alternatif olarak, ışık darbesi, primerleri / prob karışımını ve enzimi beş kez girdaplar.
    NOT: Hazırlama ve kullanım sırasında tüm reaktifleri soğuk tutun. Donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için, alikotlarda dondurulması şiddetle tavsiye edilir.
  2. İçeriği altta toplamak için tüpleri aşağı doğru döndürün (15-30 s boyunca 1.000 x g ) ve tüpleri soğuk bir rafa veya buz üzerine yerleştirin.
  3. Her hedef için 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin. Her bir mikrosantrifüj tüpüne ihtiyaç duyulan her bir reaktifin miktarını ekleyin (reaksiyon başına hacim çarpımı, gerekli kontroller dahil olmak üzere reaksiyon sayısı). Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve alttaki içeriği toplamak için 5 saniye santrifüjleyin.
  4. Mikrosantrifüj tüplerini soğuk bir rafta tutun ve 15 μL'yi bir soğutma rafındaki şerit PCR tüplerine veya 96 oyuklu bir plakaya dağıtın. Plakayı örtün ve nükleik asit işleme alanına taşıyın (bir soğutma rafında saklayın).
  5. Ekstrakte edilen RNA'nın bir alikotunu çözün ve 5 saniye boyunca hafifçe girdap yapın. Her reaksiyon kuyusuna veya önceden hazırlanmış mastermix'i içeren tüpe 5 μL RNA pipetleyin (5 μL şablon olmayan kontrol [NTC], izolasyonun negatif kontrolü [NCI] ve pozitif kontrol [PC]). Çapraz kontaminasyonu önlemek için eldivenleri gerektiği kadar sık değiştirin.
  6. Tüm reaksiyon plakasını veya tüplerini kapatın ve hafifçe girdap yapın. Plaka veya PCR tüplerini santrifüjleyin (15-30 s için 1.000 x g ).
  7. 25 μL RT-qPCR'yi aşağıdaki döngü koşullarıyla başlatın: 10 dakika boyunca 45 ° C'de ters transkriptaz; polimeraz aktivasyonu 95 °C'de 10 dakika; 15 saniye boyunca 95 ° C'de 45 döngü denatürasyon; ve 45 saniye boyunca 60 ° C'de tavlama/uzatma.
  8. Conte ve ark.38 tarafından bildirildiği gibi mengovirüs kontrollerinin iyileşme verimliliğini hesaplayın:
    Equation 1 × 100

3. Atıksu ve veri analizinde sıralama varyantları

NOT: Açıklanan protokol, Quick ve ark.39,40 tarafından oluşturulmuş değiştirilmiş bir protokoldür. SARS-CoV-2 genom amplifikasyonu için PCR döşeme metodolojisi-ARTIC primerleri ve VarSkip primerleri ile iki set primer kullanır. En iyi genom kapsamını garanti etmek ve bir tipteki primerlerin başarısız olmasına neden olan yeni mutasyonların olasılığını en aza indirmek için primerlerin bir kombinasyonu kullanılır. Genel olarak, protokol üç bölüme ayrılmıştır: ters transkripsiyon (RT) ve amplikon üretimi, dizileme kütüphanesi hazırlama ve dizileme ve veri analizi.

  1. Ters transkripsiyon ve amplikon üretimi
    1. PCR dereceli suda doğru şekilde seyreltmek için giriş numunelerinin bilinen bir qPCR döngü eşiği (Ct) değerine sahip olduğundan emin olun. Ct değeri, qPCR ile miktar tayini sırasında elde edilir. Seyreltmeler aşağıdaki gibidir: Ct değeri 12-15 ise, numuneleri 1:100 seyreltin; Ct değeri 15-18 ise, numuneleri 1:10 oranında seyreltin; Ct değeri 18-35 ise numuneyi seyreltmeyin. Ct değeri 35'in üzerindeki numunelerin çalışmama olasılığı yüksektir.
    2. Bir PCR plakasında, her numuneden 16 μL'yi plaka üzerindeki konumuna pipetleyin. 4 μL ters transkripsiyon (RT) mastermix (5x) ekleyin. Plakayı kapatın ve aşağıdaki koşullarla PCR reaksiyonunu başlatın: 25 dakika 2 °C, 55 dakika 20 °C ve 95 dakika 1 °C.
    3. Her bir primer setinden 10 μM dilüsyon hazırlayın (ARTIC havuzu A ve havuz B ve VarSkip havuzu A ve havuz B). Mastermix'i her bir primer seti (ARTIC seti A ve B ve VarSkip seti A ve B) için Tablo 2'deki gibi hazırlayın. Bundan dört mastermix ortaya çıkacaktır.
    4. Yeni bir PCR plakasında, karşılık gelen her bir kuyucuğa 20 μL mastermix pipetleyin. Her karışıma 5 μL RT numunesi ekleyin.
      NOT: Her numune, ARTIC havuzu A ve B ve VarSkip havuzu A ve B olmak üzere dört reaksiyon karışımına sahip olacaktır.
    5. Plakayı kapatın ve PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi başlatın: 30 saniye boyunca 98 ° C'de polimeraz aktivasyonu; 15 saniye boyunca 98 ° C'de 35 döngü denatürasyon; ve 65 °C'de 4 dakika tavlama/uzatma. Plakayı aşağı doğru döndürün (15-30 s için 1.000 x g ). ARTIC reaksiyon havuzlarını birleştirin ve VarSkip reaksiyon havuzlarını ayrı ayrı birleştirin. Her numunenin iki adet 50 μL'lik amplikon reaksiyonu olacaktır.
    6. Her bir kuyucuğa PCR saflaştırması için 50 μL boncuk bazlı reaktif ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Her kullanımdan önce, boncukları yeniden süspanse etmek için PCR saflaştırma reaktifini kuvvetlice karıştırın.
    7. Plakayı manyetik bir ayırma standına yerleştirin ve boncukların bir pelet oluşturmasını ve sıvının berraklaşmasını bekleyin (~5 dk). Süpernatanı pipetleyin ve atın. PCR plakasını manyetik standın üzerinde tutun.
    8. PCR plakasını manyetik stand üzerinde tutarak, boncuk peletine dokunmadan her numuneye 200 μL %80 etanol ekleyin. Etanolü çıkarın.
    9. Önceki adımı yineleyin. Etanolün buharlaşmasını sağlamak için manyetik standdaki plakayı 30 saniye açıkta bırakın.
    10. Plakayı manyetik standdan çıkarın ve her numuneye 15 μL PCR sınıfı su ekleyin. Pipetleme ile peleti tekrar süspanse edin. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    11. Plakayı manyetik standa geri yerleştirin ve boncukların peletlenmesine izin verin (2 dk). Her numuneden 15 μL süpernatanı dikkatlice yeni bir PCR plakasına pipetleyin.
    12. Her numunenin konsantrasyonunu bir florometrik RNA miktar tayin kiti ile ölçün. Bir sonraki adıma kadar 12.5 μL'de her numuneden yaklaşık 50 ng alın. Gerekirse, numuneyi PCR dereceli suyla seyreltin.
  2. Kütüphane hazırlığı
    1. Her numuneye Illumina DNA kütüphanesi hazırlama kitinden 1.75 μL reaksiyon tamponu ve 0.75 μL enzim karışımı ekleyin. Plakayı örtün, kısaca döndürün ve döndürün (15-30 saniye boyunca 1.000 x g ). 21°C'de 5 dakika ve 65 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Yeni bir plakada, her numune için 3 μL PCR sınıfı suyu yeni bir PCR plakasına pipetleyin. Hazırlanan örneklerden 0.75 μL, dizileme kütüphanesi hazırlığı için 1.25 μL barkod ve 5 μL T4 DNA ligaz mastermix ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın, bir santrifüjde kısa bir süre döndürün (15-30 saniye boyunca 1.000 x g ) ve 21 °C'de 20 dakika ve 65 °C'de 10 dakika inkübe edin.
      NOT: 25'ten az örnek kullanıyorsanız, bu adımda tüm birimleri ikiye katlayın.
    3. Aynı düşük bağlayıcı tüpe her numuneden 10 μL ekleyerek tüm numuneleri bir araya getirin. Bir sonraki adıma 480 μL alın.
    4. Havuza PCR saflaştırması için 192 μL boncuk bazlı reaktif ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    5. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve süpernatantın temizlenmesini ve bir boncuk peletinin oluşmasını bekleyin. Süpernatanı çıkarın. Tüpü manyetik standdan çıkarın.
    6. 700 μL kısa parça tamponu (SFB) ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Manyetik standa geri yerleştirin ve peletin oluşmasını ve sıvının berraklaşmasını bekleyin (~5 dk). Süpernatanı pipetleyin ve atın.
    7. Önceki adımı yineleyin. Tüpü manyetik standın üzerinde bırakın. Boncuğa dokunmadan 100 μL %80 etanol ekleyin. Etanolü pipetleyin ve boncuğun 30 saniye kurumasını bekleyin.
      NOT: Boncuğun aşırı kurumasına izin vermeyin.
    8. Tüpü manyetik standdan çıkarın ve 35 μL PCR sınıfı su ekleyin. Pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve boncuğun topaklanmasına ve sıvının temizlenmesine izin verin. Süpernatanın 35 μL'sini yeni bir tüpe pipetleyin.
    9. Havuzlanmış kitaplığın RNA konsantrasyonunu ölçün. 30-50 ng RNA miktarına ulaşmak için gereken hacmi pipetleyin ve 30 μL'lik bir nihai hacme ulaşmak için PCR sınıfı suyla doldurun.
    10. Adaptör ligasyon reaksiyonu karışımını hazırlayın: 30 μL havuzlanmış kütüphane, 5 μL Adaptör Karışımı II, 10 μL ligasyon reaksiyon tamponu (5x) ve 5 μL T4 DNA ligaz. Pipetleme ve sıkma ile karıştırın (15-30 sn boyunca 1.000 x g ). Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    11. PCR saflaştırması için 20 μL boncuk bazlı reaktif ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    12. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve boncuk peletinin oluşmasını ve süpernatantın renksiz hale gelmesini bekleyin. Süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve atın.
    13. Manyetik standdan çıkarın ve 125 μL SFB ekleyin. Pipetleyerek karıştırın ve boncukları ayırmak için manyetik standa geri yerleştirin. Sıvı berrak olduğunda, süpernatanı pipetleyin ve atın.
    14. Önceki adımı yineleyin. Kalan sıvının bir kısmının buharlaşması için tüpü manyetik stand üzerinde 30 saniye açık bırakın.
    15. Tüpü manyetik standdan çıkarın ve 15 μL elüsyon tamponu ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve kısa bir süre döndürün (15-30 saniye boyunca 1.000 x g ). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Manyetik standa 2 dakika yerleştirin.
    16. Süpernatanın 15 μL'sini yeni bir düşük bağlayıcı tüpe pipetleyin. Bu son kütüphanedir. Konsantrasyonu bir florometrik DNA miktar tayin kiti ile ölçün.
      NOT: Bir sonraki adımda 12 μL'ye ihtiyaç vardır. Konsantrasyon çok yüksekse ve 12 μL'den daha az kütüphaneye ihtiyaç duyulursa, elüsyon tamponu reaktifi ile 12 μL'ye kadar doldurun.
  3. Akış hücresi yükleme ve sıralama
    1. Akış hücresini (R9.4.1) gerçek zamanlı DNA ve RNA dizileme cihazına yerleştirin.
    2. Bir yıkama tamponu (FB) reaktifi tüpüne 30 μL yıkama bağı (FLT) reaktifi ekleyerek hazırlama karışımını hazırlayın. Karıştırmak ve döndürmek için girdap (15-30 s için 1.000 x g ).
    3. Doldurma bağlantı noktası kapağını açın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 200 μL'ye ayarlayın ve ucu hazırlama portuna yerleştirin. Ses ayar çarkını çevirin ve uçtaki sıvı görünene kadar sesi artırın. Ucu atın.
      NOT: Tekerleği sadece uçta birkaç μL sıvı görünene kadar çevirin. Daha büyük miktarların çekilmesi akış hücresine zarar verebilir.
    4. Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek hazırlama portuna 800 μL hazırlama karışımını yavaşça ekleyin. 5 dakika bekleyin.
    5. Bu arada, kitaplıkları yükleme için hazırlayın. 37,5 μL sıralama tamponunu, 25,5 μL yükleme tamponunu ve 12 μL kitaplığı karıştırın.
      NOT: Pipetlemeden önce yükleme tamponunu karıştırın. Bu reaktifteki boncuklar çok hızlı bir şekilde yerleşir.
    6. Bağlantı noktası kapağını açın. 200 μL hazırlama karışımını hazırlama portuna pipetleyin.
      NOT: Kapak portu açıkken hazırlama portuna pipetleme yaparken, numune portundan küçük damlalar geldiği fark edilecektir. Pipetlemeyi yeterince yavaş yapın, böylece numune portu damlaları dökülmeden içeri çekebilir.
    7. Hazırlanan kitaplığı yüklemeden önce pipetleyerek iyice karıştırın. 75 μL'ye ayarlanmış 100 μL'lik bir pipet kullanarak, kitaplığı ve pipeti numune yuvasına damla damla alın. Sıvının taşmasını önlemek için bir sonraki damlayı yüklemeden önce porta dokunmayın ve her damlanın porta emilmesini bekleyin.
    8. Kapak portunu ve doldurma portunu kapatın. Yazılımı açın ve sıralama deneyini başlatın. Temel arama Açık'ı seçin. 96 çoğullanmış örneğe sahip bir kütüphane için, yeterli veri üretmek için genellikle 10-12 saatlik sıralama yeterlidir.
      NOT: Yazılımı kullanarak, örnek sayfa .csv formatında eklenebilir. Örnek sayfa şu verileri gerektirir: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code ve kit. Akış hücresi kimliği, kullanılan kit ile birlikte gereklidir (akış hücresinin yanında listelenmiştir). Önerilen protokol için LSK109 kiti seçilmelidir.
  4. Sıralama veri analizi
    1. Sıkıştırılmış fastq okumalarını wf-artic iş akışına41 ekleyin. İş akışını iki farklı astar şemasıyla (ARTIC/V4.1 ve NEB-VarSkip/v1a) ayrı ayrı çalıştırın. İki ". primertrimmed.rg.sorted.bam" dosyaları her örnek için oluşturulur.
    2. BAM dosyalarını "samtools merge" komutuyla tek bir dosyada birleştirin42. Birleştirilmiş BAM dosyasını, göreli soy bolluklarını kurtarmak için varsayılan ayarları bırakarak Freyja aracına ekleyin43.
    3. Bir FASTA dosyası oluşturmak için, birleştirilmiş BAM dosyasını varsayılan ayarları44,45 olan "samtools mpileup" ve "ivar" araçlarına ekleyin. Mutasyon çağrısı için FASTA dosyasını Nextclade aracına46,47 yükleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tablo 3'te özetlenen sonuçlar, bu makalede açıklanan yöntem kullanılarak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesine ilişkin örnekleri göstermektedir. Atık su numuneleri İspanya ve Slovenya'daki atık su arıtma tesislerinden toplandı ve üç kopyadan en az ikisinde Ct 40'tan azsa pozitif olarak kabul edildi ve Ct'nin %5'ten daha az bir varyasyona sahip olması durumunda miktar belirleme geçerli kabul edildi. İspanya ve Portekiz'de iç ve dış hava örnekleri toplandı ve aynı kurallar uygulandı. Çalışmanın amacı SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek ve ölçmek olmadığından, atık su örneklerinde olduğu gibi üçlü değil, hava örnekleri için kopyalar kullanılmıştır. Ayrıca, bir RT-qPCR çalışması, yalnızca kullanılan tüm kontroller (bu protokolde açıklandığı gibi) beklendiği gibi davrandıysa ve mengovirüs RNA kontrolünde önemli bir sapma gözlenmediyse geçerli kabul edildi. Bu örnekler için mengovirüs iyileşme etkinliği %13.7 ile %19.7 arasında değişmiştir. İnhibisyon, on kat ve 100 kat ekstrakte edilmiş RNA'nın seyreltilmesi ve elde edilen RT-qPCR sonuçlarının karşılaştırılması ve ayrıca ticari bir kit kullanılarak değerlendirildi. Her bir inhibisyon kontrol kiti için talimatlar, üreticiler tarafından açıklandığı şekilde izlenmelidir.

Atık su örneklerinin standart sapması üç kopyalar arasında %1.91 ile %13.98 arasındaydı ve 3.05 x 10 3 ile 2.83 x 108 gen kopyası/L arasında değişiyordu. Hava numuneleri 6.17 x 103 ile 5.48 x 109 arasında değişmekte olup, kopyalar arasında standart sapma %0.54 ile %10.95 arasında değişmektedir. Bu, önceki çalışmalarauygundur 6,48,49,50.

Bu protokolde açıklandığı gibi, numuneler sıralandı ve üç sıralı numune sonucunun bir örneği Tablo 4 ve Şekil 1'de özetlendi. Her üç örnekte de, BA.5.x soyu, Freyja aracı tarafından en yaygın olarak belirlenmiştir (%95.3, %95.4 ve %99.8).

Figure 1
Şekil 1: Seçilmiş atık su örneklerinde SARS-CoV-2 soy prevalansı. Soylar Freyja aracı kullanılarak atandı. Bazı veriler yeterli kalitede olmadığı için yaygınlık sayılarının özeti mutlaka %100'e ulaşmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: RT-qPCR ile SARS-CoV2 miktar tayini için mastermix'i hazırlamak için her birinden eklenecek reaktifler ve hacimler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Örneklerdeki tüm SARS-CoV-2 genomlarını çoğaltmak üzere mastermix'i hazırlamak için her birinden eklenecek reaktifler ve hacimler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Atık su ve hava örneklerinden SARS-CoV-2 RNA'sının RT-qPCR miktar tayin sonuçlarının özeti. N1 geni miktar tayini için kullanıldı ve N2 doğrulama için kullanıldı (pozitif veya negatif). Sonuçlar kopya/L olarak ifade edilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Tespit edilen mutasyonlar ve soy prevalansı. Soylar, Freyja aracı kullanılarak ve Nextclade kullanılarak bulunan ilgilenilen mutasyonlara göre atandı. Her örnek için genom kapsamı gösterilir. Bazı veriler yeterli kalitede olmadığı için yaygınlık sayılarının özeti mutlaka %100'e ulaşmaz. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

(RT-)qPCR yöntemleri kullanılarak mikrobiyal ve viral tespit ve miktar tayini, dikkate değer duyarlılıkları nedeniyle yaygın olarak kabul görmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler çevresel örnekleri analiz ederken çok sayıda zorlukla karşı karşıyadır. Atık su numuneleri, ölçümleri çarpıtabilecek ve yanıltıcı sonuçlar üretebilecek çok sayıda inhibitör madde içerir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve hassasiyeti artırmak için karmaşık bir protokol tasarlandı, tasarlandı ve uygulandı. Bu protokol, bilimsel literatürdeki protokollerin birleştirilmesiyle ve sürecin her aşamasında bir dizi sıkı kontrol dahil edilerek qPCR yöntemlerinin doğasında bulunan kısıtlamaları özel olarak ele alarak uyarlanmıştır. Bu protokol, bu titiz kalite kontrol önlemlerini entegre ederek, karmaşık çevresel numunelerde qPCR tabanlı tespit ve miktar tayini yöntemlerinin karşılaştığı zorluklara sağlam bir çözüm sunar51,52. İzolasyonun negatif kontrolü (NCI) ve şablon olmayan kontrol (NTC), RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR reaksiyonu sırasında kontaminasyon olasılığını değerlendirmek için gerekli araçlardır. Ayrıca, mengovirüs kontrol RNA'sının entegrasyonu, numuneler arası değişkenliğin yanı sıra konsantrasyon adımının etkinliğini ve karmaşık çevresel numunelerde bulunan ajanların inhibitör etkilerini değerlendirmek için çok önemli bir araç sağlar. Her RT-qPCR reaksiyonunda, amplifikasyon işleminin etkinliğini doğrulamak için pozitif kontroller dahil edilmelidir. Numunelerin saklanması ve işlenmesi de dahil olmak üzere protokolün her adımını dikkatle izlemek çok önemlidir. Numunelerin bozunması, sıcaklıktan ve atık suyun karmaşık bileşiminden etkilenebilir, bu da numunelerin 4 °C sıcaklıkta saklanmasını ve 24 saat içinde işlenmesini gerekli kılar. Araştırmacılar ve halk sağlığı çalışanları, bu sıkı kalite kontrol önlemlerine bağlı kalarak, mikrobiyal ve viral popülasyonlara ilişkin hayati bilgileri ortaya çıkarmak ve çevresel faktörlerin insan sağlığı üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için çevresel örnekleri güvenle ve doğru bir şekilde analiz edebilir48.

SARS-CoV-2 tespiti için RNA hedeflerinin seçimi, RT-qPCR testlerinin duyarlılığını etkileyebilecek kritik bir faktördür. Bu çalışmada, yazarlar RdRp, E, N1 ve N2 hedeflerini değerlendirdiler ve RdRp ve E testlerinin, önceki araştırmalarla tutarlı olarak N1 ve N2 testlerinden daha düşük duyarlılığa sahip olduğunu buldular53. N1 ve N2 tahlilleri, (RT-)qPCR tahlillerinde duyarlılıklarını arttırdığı gösterilen çift söndürücü probları kullanır54. Bu nedenler, çok düşük konsantrasyonlar bulunduğunda şüpheleri ortadan kaldırmak için N1'i niceleme için ve N2'yi RNA varlığının bir teyidi olarak kullanma kararına yol açar. RT-qPCR hedefleri arasında gözlenen tutarsızlıklar daha önce bildirilmişti36.

Birkaç çalışma benzer protokoller kullanmış ve devam eden COVID-19 salgını sırasında atık sudaki SARS-CoV-2 RNA'nın başarılı bir şekilde tespit edildiğini ve miktarının belirlendiğini bildirmiştir 6,48,49,55,56. Bildirilen SARS-CoV-2 RNA konsantrasyonları, bu çalışmada veprotokol 48,50,55'te bildirilenlere uygundur. Bu çalışmalardan bazıları, aktif vakalar ile RT-qPCR hedef genlerinin, özellikle N1 ve N2konsantrasyonları arasındaki ilişkiyi araştırmıştır 6,36,49,50,55,57,58,59. Elde edilen gen konsantrasyonlarındaki değişkenliği azaltmak için, ilk viral yükü elde etmek için deneysel konsantrasyonların örnekleme sırasındaki akış hızı ile çarpılması önerilmiştir36. Bu yaklaşım, atık sularda COVID-19 için ulusal bir izleme sistemi olan İspanya'daki VATar COVID-19 projesine dahil edilmiştir60.

COVID-19 atık su bazlı epidemiyoloji (WBE) çalışmalarının bir sonraki aşaması olarak araştırmacılar, topluluklar içinde endişe verici varyantların dolaşımını tahmin etmek için atık sudaki SARS-CoV-2 mutasyonlarını tespit etmeye çalıştılar. Önceki çalışmalar, atık suda tanımlanan varyantlar ile aynı anda popülasyonda bulunanlar arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, atık su bazlı izlemenin SARS-CoV-2 varyantlarının yayılmasını izlemede değerli bir araç olarak hizmet edebileceğini düşündürmektedir61,62. WBE, SARS-CoV-2'nin izlenmesinde büyük umut vaat etmiştir ve pandemiler için gelecekteki sürveyans stratejilerinin geliştirilmesinde kullanılabilir. Bu yaklaşım, sınırlı bireysel testlerin olduğu ve birçok vakanın asemptomatik olabileceği bir pandeminin erken aşamalarında özellikle yararlıdır ve klinik sürveyansı tamamlayıcı bir stratejiye sahiptir. Bu nedenle, WBE, diğer daha pahalı gözetim stratejilerini karşılayamayan düşük ekonomik kapasiteye sahip yerlerde özellikle yararlı olabilir. Açıklanan yöntem, gelecekte izlenmesi uygun olabilecek diğer virüslere kolayca uyarlanabilir.

İç ve dış ortamlarda hava örneklemesinin sonuçları, SARS-CoV-2 RNA'nın dış ortamlarda daha düşük konsantrasyonlarda olmasına rağmen her iki ortamda da mevcut olduğunu ortaya koymuştur 38,63,64. Bu bulgular, yeme, içme veya müzik festivallerine katılma gibi maske takmanın ve sosyal mesafenin korunmasının zor olduğu faaliyetlerin ve maruziyetlerin COVID-19 bulaşması için daha yüksek risk oluşturabileceğini düşündürmektedir. Bu tür riskleri azaltmak için, özellikle Delta (B.1.617.2) ve Omicron (B.1.1.529) varyantları gibi daha bulaşıcı olan yeni endişe verici varyantların ortaya çıkmasıyla birlikte, uygun havalandırma önlemlerini ve maske kullanımını dikkate almak çok önemlidir. Birçok alanda COVID-19 kısıtlamalarının kaldırılması ışığında, SARS-CoV-2'nin topluma bulaşmasını minimumda tutmak ve hastalığın gelecekteki salgınlarını önlemek için maske kullanımının sürdürülmesi önerilmektedir 5,21,26,65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların birbiriyle çelişen ekonomik çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Castilla y Leon Bölgesel Hükümeti ve FEDER programının mali desteğiyle gerçekleştirilmiştir (CLU 2017-09, UIC315 ve VA266P20 projeleri).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 196 SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR dizileme endişe verici varyantlar
Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter