Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantifisering og helgenomkarakterisering av SARS-CoV-2 RNA i avløpsvann og luftprøver

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Denne protokollen tar sikte på å kvantifisere SARS-CoV-2 RNA i avløpsvann og luftprøver som skal brukes til avløpsvannbaserte epidemiologiske studier og å vurdere eksponeringsrisikoen for SARS-CoV-2 i innendørs og utendørs aerosoler. Denne protokollen beskriver også en flislagt amplikon langmalsekvenseringstilnærming for SARS-CoV-2 helgenomkarakterisering.

Abstract

Avløpsvannbasert epidemiologi har dukket opp som et lovende og effektivt overvåkingssystem for SARS-CoV-2 og andre smittsomme sykdommer i mange nasjoner. Prosessen involverer vanligvis avløpsvannkonsentrasjon, nukleinsyreekstraksjon, amplifisering av utvalgte genomiske segmenter og deteksjon og kvantifisering av det amplifiserte genomiske segmentet. Denne metoden kan på samme måte utnyttes for å oppdage og kvantifisere smittsomme stoffer, som SARS-CoV-2, i luftprøver. I utgangspunktet ble SARS-CoV-2 antatt å spre seg primært gjennom nær personlig kontakt med dråper generert av en infisert person mens han snakket, nyset, hostet, sang eller pustet. Et økende antall studier har imidlertid rapportert tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 RNA i luften av helseinstitusjoner, og etablert luftbåren overføring som en levedyktig rute for viruset. Denne studien presenterer en sammensetning av etablerte protokoller for å lette miljødeteksjon, kvantifisering og sekvensering av virus fra både avløpsvann og luftprøver.

Introduction

I desember 2019 dukket det opp en ny sykdom kalt COVID-19, forårsaket av et tidligere ukjent koronavirus, SARS-CoV-21. Den resulterende globale pandemien har presentert en betydelig utfordring for kliniske og folkehelselaboratorier over hele verden, ettersom et stort antall individer krever testing for nøyaktig å vurdere virusoverføring og utbredelse i samfunnet. I mange regioner er det imidlertid økonomisk umulig å oppnå det nødvendige testnivået på en rettidig og romlig omfattende måte 2,3. Dagens overvåkingssystemer basert på individuell klinisk diagnostikk er avhengig av symptombelastning og individuell rapportering, samt i hvilken grad disse symptomene overlapper med eksisterende sykdommer som sirkulerer i befolkningen 4,5,6,7,8,9,10. Følgelig bidrar et høyt antall asymptomatiske tilfeller til en betydelig underestimering av sykdomsbyrde 7,11.

På grunn av disse utfordringene ble avløpsvannbasert epidemiologi (WBE) for COVID-19-overvåking foreslått som en komplementær overvåkingsstrategi. WBE ble første gang beskrevet i 200112, og ble opprinnelig brukt til å spore kokain og andre ulovlige rusmidler13. Denne tilnærmingen er avhengig av antagelsen om at det er mulig å beregne den opprinnelige konsentrasjonen av ethvert stoff som er stabilt i avløpsvann og utskilt av mennesker 8,12. WBE har blitt implementert med suksess i mange land som et komplementært og effektivt overvåkingssystem for SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. De fleste metoder for å oppdage humane virus i vannmiljøer følger disse trinnene: konsentrasjon, nukleinsyreekstraksjon, amplifisering av det valgte genomiske segmentet (eller segmentene) og deteksjon / kvantifisering av det forsterkede genomiske segmentet3.

Et annet viktig miljø for påvisning og kvantifisering av SARS-CoV-2 er i luftprøver. I utgangspunktet ble SARS-CoV-2 antatt å overføres hovedsakelig gjennom nær personlig kontakt med luftveisdråper fra aerosoler generert av en infisert person mens du snakker, nyser, hoster, synger eller puster17. Imidlertid begynte flere studier å rapportere tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 RNA i luften, spesielt i helseinstitusjoner og andre lukkede rom 18,19,20,21. Det er funnet bevis for SARS-CoV-2-levedyktighet i luftprøver tatt innendørs på sykehus og andre lukkede rom når viruskonsentrasjonen var tilstrekkelig høy22,23,2 4. Utendørsstudier har generelt ikke funnet holdepunkter for SARS-CoV-2, bortsett fra i overfylte uteområder 21,25,26,27,28,29. Per nå har luftbåren overføring av SARS-CoV-2 blitt anerkjent som en overføringsmåte30,31. En nylig gjennomgangsstudie viser forskjellene mellom utendørs, hvor risikoen for luftbåren overføring er minimal utenfor overfylte områder, og innendørs, hvor større risiko kan være tilstede i dårlig ventilerte miljøer der sterke kilder (dvs. antall smittede personer) kan være til stede. En nylig omfattende gjennomgangsstudie har fremhevet de betydelige forskjellene mellom risikoen for luftbåren overføring i utendørs versus innendørs miljøer, spesielt i overfylte områder med dårlig ventilasjon. Studien indikerer at risikoen for luftbåren overføring er minimal i utendørsmiljøer, hvor det er et større volum luft tilgjengelig for fortynning og spredning av viruspartikler32. Disse funnene har viktige implikasjoner for folkehelsepolitikk og retningslinjer knyttet til COVID-19. Ved å anerkjenne de betydelige forskjellene i overføringsrisiko mellom innendørs og utendørs miljøer, kan beslutningstakere utvikle mer effektive strategier for å redusere spredningen av viruset og beskytte folkehelsen.

Det finnes en rekke metoder og protokoller for påvisning, kvantifisering og sekvensering av SARS-CoV-2 fra forskjellige miljøprøver. Denne metodeartikkelen tar sikte på å presentere en kombinasjon av veletablerte protokoller som tillater laboratorier med ulike kapasitetsnivåer å utføre miljødeteksjon, kvantifisering og sekvensering av virus fra avløpsvann og luftprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene beskrevet her er publisert andre steder og inneholder små modifikasjoner fra de opprinnelige metodene.

1. Innsamling av avløpsvann og forbehandling av prøver

MERK: På grunn av de lave konsentrasjonene av SARS-CoV-2 RNA i miljøprøver, er implementeringen av et konsentrasjonstrinn avgjørende for en vellykket deteksjon33,34,35. Beskrevet her er den første rapporterte metoden for påvisning av SARS-CoV-2 i avløpsvann36.

  1. Innsamling og konsentrasjon av avløpsvannsprøve(r)
    1. Samle 1 l av 24 timers sammensatt avløpsvannprøve. Oppbevar prøven ved 4 °C og fortsett med protokollen innen 24 timer.
    2. Homogeniser prøven ved å riste flasken forsiktig. Samle 70 ml i et 100 ml sentrifugalrør eller del prøven i to sentrifugalrør på 50 ml.
    3. Spike 20 μL mengovirus (3,2 x 103 kopier/μL) til 70 ml av hver prøve som en internkontroll av konsentrasjonsprosessen. Alternativt kan du pigge 10 μL mengovirus (3,2 x 103 kopier/μL) i hvert 50 ml sentrifugerør.
    4. Homogeniser prøven og sentrifugen ved 700 x g i 10 min for å fjerne store partikler og organismer (pellet).
    5. Bruk den resulterende supernatanten for konsentrasjon med sentrifugale ultrafiltreringsanordninger med en grenseverdi på 10 KDa ved sentrifugering ved 4000 x g i 40 minutter ved 4 °C. Elute konsentratet ved å sentrifugere ved 700 x g i 40 minutter og snu posisjonen til ultrafiltreringsenheten.
    6. Mål volumet av det resulterende konsentratet. Volumet vil endres avhengig av mengden faste stoffer i prøven som tetter sentrifugalfiltrene. I denne studien var de oppnådde konsentratvolumene mellom 200-1,200 μL.
    7. Bruk det resulterende konsentratet for RNA-ekstraksjon ved hjelp av et kommersielt sett eller en intern metode. For prøvene som brukes i denne studien, brukes et spesifikt kommersielt sett for viral RNA-ekstraksjon med et elueringsvolum på 50 μL.
    8. Mål konsentrasjonen av det ekstraherte RNA med et fluorometrisk RNA-kvantifiseringssett. Del det ekstraherte RNA i alikoter og frys ved -80 °C inntil videre analyse.
      MERK: For hvert prosedyresett for RNA-isolering skal en negativ kontroll av isolasjon (NCI) inkluderes, som bare inneholder buffere for å oppdage mulig kontaminering under ekstraksjonen.
  2. Innsamling av luftprøver ved hjelp av en Coriolis kompaktluftprøvetaker
    1. Velg en prøvetakingsstrategi i henhold til forskningsmålet ved å definere prøvetakingsfrekvens og prøvetakingssteder.
    2. Still inn strømningshastigheten på luftprøvetakeren (her 50 l/min i 30 min). Vær oppmerksom på at en strømningshastighet på mer enn 200 l / min kan nedbryte viralt RNA, så det anbefales å bruke en strømningshastighet under 200 l / min.
    3. Plasser en steril kjegle i luftprøvetakeren før du starter samlingen ved å pulsere starten. Når prøvetakingen er ferdig, tilsett 5-15 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) i kjeglen. Virv forsiktig eller rist prøven for hånd i 15 s. Oppbevar prøvene i opptil 24 timer ved 4 °C eller ved -80 °C i kryorør.
    4. Et valgfritt konsentrasjonstrinn kan utføres. Rengjør og dekontaminer kjeglene etter hvert eksperiment ved hjelp av blekemiddel.
    5. Pakk ut RNA ved hjelp av et kommersielt sett eller en intern metode. For prøvene i denne studien brukes et spesifikt kommersielt sett for viral RNA-ekstraksjon med et elueringsvolum på 50 μL.
    6. Mål konsentrasjonen av det ekstraherte RNA med et fluorometrisk RNA-kvantifiseringssett. Del det ekstraherte RNA i alikoter og frys ved -80 °C inntil videre analyse.
      MERK: For hvert prosedyresett for RNA-isolering skal en negativ kontroll av isolasjon (NCI) inkluderes, som bare inneholder buffere for å oppdage mulig kontaminering under ekstraksjonen.

2. Kvantifisering av SARS-CoV-2 RNA ved sanntidskvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)

MERK: Protokollen nedenfor er i henhold til CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR diagnostisk panel37. Del primer-/sondeblandingen i flere alikoter for å unngå fryse- og tinesykluser.

  1. Forbered reaksjonen mastermix for hvert mål (mengovirus; SARS-CoV-2 [N1- og N2-gener]) som i tabell 1, i en ren hette i reagensoppsettrommet. Bland primere/sondeblanding og enzym ved inversjon fem ganger. Alternativt lyspuls-vortex primerne/sonden blandes og enzym fem ganger.
    NOTAT: Hold alle reagenser kalde under tilberedning og bruk. For å minimere fryse-tine sykluser, anbefales det sterkt å fryse i alikoter.
  2. Spinn ned (1000 x g i 15-30 s) rørene for å samle innholdet i bunnen og legg rørene i et kaldt stativ eller på is.
  3. Merk 1,5 ml mikrosentrifugerør for hvert mål. Legg til hvert mikrosentrifugerør mengden av hvert reagens som trengs (volum per reaksjon ganger antall reaksjoner inkludert nødvendige kontroller). Bland ved å pipettere opp og ned og sentrifugere i 5 s for å samle innholdet i bunnen.
  4. Oppbevar mikrosentrifugerørene i et kaldt stativ og dispenser 15 μL i PCR-striper eller en 96-brønnsplate i et kjølestativ. Dekk platen og flytt den til nukleinsyrehåndteringsområdet (oppbevar den i et kjølestativ).
  5. Tine en aliquot av ekstrahert RNA og forsiktig vortex i 5 s. Pipette 5 μL RNA (i tillegg til 5 μL ikke-malkontroll [NTC], negativ kontroll av isolasjon [NCI] og positiv kontroll [PC]) til hver reaksjonsbrønn eller rør som inneholder den tidligere preparerte mastermixen. Bytt hansker ofte etter behov for å unngå krysskontaminering.
  6. Dekk hele reaksjonsplaten eller rørene og forsiktig virvel. Sentrifuge (1000 x g i 15-30 s) platen eller PCR-rørene.
  7. Start 25 μL RT-qPCR med følgende sykkelforhold: revers transkriptase ved 45 °C i 10 minutter; polymeraseaktivering ved 95 °C i 10 minutter; 45 sykluser med denaturering ved 95 °C i 15 s; og glødning/forlengelse ved 60 °C i 45 s.
  8. Beregn utvinningseffektiviteten av mengoviruskontroller som rapportert av Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Sekvenseringsvarianter i avløpsvann og dataanalyse

MERK: Den beskrevne protokollen er en modifisert protokoll opprettet av Quick et al.39,40. Den bruker to sett med primere for SARS-CoV-2 genomamplifisering ved PCR-flisemetodikk-ARTIC primere og VarSkip-primere. En kombinasjon av primere brukes til å garantere den beste genomdekningen og for å minimere muligheten for at nye mutasjoner forårsaker at primere av en type mislykkes. Generelt er protokollen delt inn i tre deler: revers transkripsjon (RT) og amplikongenerering, sekvensering av bibliotekforberedelse og sekvensering og dataanalyse.

  1. Revers transkripsjon og amplikongenerering
    1. Forsikre deg om at inngangsprøvene har en kjent qPCR-syklingsterskel (Ct) for å fortynne dem riktig i vann av PCR-kvalitet. T-verdien oppnås under kvantifiseringen med qPCR. Fortynningene er som følger: hvis Ct-verdien er 12-15, fortynn prøvene 1:100; hvis Ct-verdien er 15-18, fortynn prøvene 1:10; hvis Ct-verdien er 18-35, må du ikke fortynne prøven. Prøver over en Ct-verdi på 35 har stor sjanse for ikke å fungere.
    2. I en PCR-plate, pipett 16 μL av hver prøve til sin posisjon på platen. Legg til 4 μL revers transkripsjon (RT) mastermix (5x). Dekk platen og start PCR-reaksjonen med følgende betingelser: 25 °C i 2 minutter, 55 °C i 20 minutter og 95 °C i 1 min.
    3. Forbered 10 μM fortynninger av hvert primersett (ARTIC pool A og basseng B, og VarSkip pool A og basseng B). Forbered mastermix for hvert sett med primere (ARTIC sett A og B, og VarSkip sett A og B) som i tabell 2. Fire mastermixer vil resultere fra dette.
    4. På en ny PCR-plate, pipett 20 μL av mastermix til hver tilsvarende brønn. Tilsett 5 μL av RT-prøven til hver blanding.
      MERK: Hver prøve vil ha fire reaksjonsblandinger-ARTIC pool A og B, og VarSkip pool A og B.
    5. Dekk platen og start PCR-reaksjonen som følger: polymeraseaktivering ved 98 °C i 30 s; 35 sykluser med denaturering ved 98 °C i 15 s; og glødning/forlengelse ved 65 °C i 4 min. Spinn ned (1000 x g i 15-30 s) platen. Kombiner ARTIC-reaksjonsbassengene og kombiner VarSkip-reaksjonsbassengene separat. Hver prøve vil ha to 50 μL amplikonreaksjoner.
    6. Tilsett 50 μL perlebasert reagens for PCR-rensing til hver brønn og bland godt ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
      NOTAT: Før hver bruk, bland PCR-rensingsreagenset kraftig for å resuspendere perlene.
    7. Plasser platen på et magnetisk separasjonsstativ og vent til perlene danner en pellet og væsken er klar (~ 5 min). Pipette og kast supernatanten. Hold PCR-platen på magnetstativet.
    8. Vedlikehold av PCR-platen på magnetstativet, tilsett 200 μL 80% etanol til hver prøve uten å berøre perlepelleten. Fjern etanol.
    9. Gjenta forrige trinn. La platen på magnetstativet stå utildekket i 30 sekunder for å la etanolen fordampe.
    10. Fjern platen fra magnetstativet og tilsett 15 μL PCR-vann til hver prøve. Bryt pelleten på nytt ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
    11. Sett platen tilbake på magnetstativet og la perlene pelletere (2 min). Pipetter forsiktig 15 μl av supernatanten fra hver prøve til en ny PCR-plate.
    12. Mål konsentrasjonen av hver prøve med et fluorometrisk RNA-kvantifiseringssett . Ta omtrent 50 ng av hver prøve i 12,5 μL til neste trinn. Hvis nødvendig, fortynn prøven i PCR-grade vann.
  2. Forberedelse av bibliotek
    1. Legg til 1,75 μL reaksjonsbuffer fra Illumina DNA-bibliotekets forberedelsessett og 0,75 μL enzymblanding til hver prøve. Dekk platen, virvel kort, og spinn ned (1000 x g i 15-30 s). Inkuber ved 21 °C i 5 minutter og ved 65 °C i 5 minutter.
    2. I en ny plate, pipett 3 μL PCR-grade vann for hver prøve til en ny PCR-plate. Tilsett 0,75 μL av de preparerte prøvene, 1,25 μL strekkoder for sekvensering av bibliotekforberedelse og 5 μL T4 DNA-ligase mastermix. Bland godt ved pipettering, sentrifugering kort (1000 x g i 15-30 s) i en sentrifuge og inkuber ved 21 °C i 20 minutter og ved 65 °C i 10 minutter.
      MERK: Hvis du bruker mindre enn 25 prøver, dobler du alle volumene i dette trinnet.
    3. Samle alle prøvene sammen ved å legge til 10 μL av hver prøve til det samme lavbindingsrøret. Ta 480 μL til neste trinn.
    4. Tilsett 192 μL perlebasert reagens for PCR-rensing til bassenget og bland godt ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
    5. Plasser røret på et magnetisk stativ og vent til supernatanten er klar og en perlepellet skal dannes. Fjern supernatanten. Fjern røret fra magnetstativet.
    6. Tilsett 700 μL av den korte fragmentbufferen (SFB) og bland ved pipettering. Plasser tilbake på magnetstativet og vent til pelleten dannes og væsken er klar (~ 5 min). Pipett ut supernatanten og kast den.
    7. Gjenta forrige trinn. La røret stå på magnetstativet. Tilsett 100 μL 80% etanol uten å berøre perlen. Pipett ut etanolen og la perlen tørke i 30 s.
      NOTAT: Ikke la perlen tørke for mye.
    8. Fjern røret fra magnetstativet og tilsett 35 μL PCR-vann av PCR-kvalitet. Bland ved pipettering og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter. Plasser røret på magnetstativet og la perlen pelleten og væsken klare. Pipette 35 μL av supernatanten til et nytt rør.
    9. Mål RNA-konsentrasjonen til det samlede biblioteket. Pipett volumet som trengs for å nå en mengde på 30-50 ng RNA og fyll det med PCR-vann for å nå et endelig volum på 30 μL.
    10. Forbered adapterligeringsreaksjonsblandingen: 30 μL av det samlede biblioteket, 5 μL Adapter Mix II, 10 μL av ligeringsreaksjonsbufferen (5x) og 5 μL T4 DNA-ligase. Bland med pipettering og spin-down (1000 x g i 15-30 s). Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.
    11. Tilsett 20 μL av det perlebaserte reagenset for PCR-rensing og bland ved pipettering. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
    12. Plasser røret på magnetstativet og vent til perlepelleten dannes og supernatanten blir fargeløs. Pipetter forsiktig ut og kast supernatanten.
    13. Fjern fra magnetstativet og tilsett 125 μL SFB. Bland ved pipettering og plasser tilbake på magnetstativet for å skille perlene. Når væsken er klar, pipett og kast supernatanten.
    14. Gjenta forrige trinn. La røret stå åpent på magnetstativet i 30 s for at noe av den gjenværende væsken skal fordampe.
    15. Fjern røret fra magnetstativet og tilsett 15 μL av elueringsbufferen. Bland godt ved pipettering og kort spin-down (1000 x g i 15-30 s). Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Plasser på magnetstativet i 2 min.
    16. Pipette 15 μL av supernatanten inn i et nytt lavbindingsrør. Dette er det endelige biblioteket. Mål konsentrasjonen med et fluorometrisk DNA-kvantifiseringssett.
      MERK: I neste trinn er 12 μL nødvendig. Hvis konsentrasjonen er svært høy og mindre enn 12 μL av biblioteket er nødvendig, fyll opptil 12 μL med elueringsbufferreagenset.
  3. Flytcellelasting og sekvensering
    1. Sett inn flytcellen (R9.4.1) i sanntids DNA- og RNA-sekvenseringsenheten.
    2. Forbered primingblandingen ved å tilsette 30 μL flush tether (FLT) reagens til et rør med flush buffer (FB) reagens. Vortex å blande og spinne ned (1000 x g i 15-30 s).
    3. Åpne primingportdekselet. Bruk en 1000 μL pipette, sett den på 200 μL og sett spissen inn i primingporten. Vri voluminnstillingshjulet og øk volumet til væsken i spissen sees. Kast spissen.
      MERK: Snu bare hjulet til noen få μL væske i spissen er sett. Å trekke større mengder kan skade flytcellen.
    4. Tilsett sakte 800 μL av grunningsblandingen til primingporten, og pass på at du ikke introduserer bobler. Vent i 5 min.
    5. I mellomtiden forbereder du bibliotekene for lasting. Bland 37,5 μL av sekvenseringsbufferen, 25,5 μL av lastbufferen og 12 μL av biblioteket.
      NOTAT: Bland lastebufferen før pipettering. Perlene i dette reagenset avgjøres veldig raskt.
    6. Åpne portdekselet. Pipette 200 μL av primingblandingen inn i primingporten.
      MERK: Når man pipetterer inn i primingporten med dekselporten åpen, vil man legge merke til små dråper som kommer fra prøveporten. Pipetten er langsom nok til at prøveporten kan trekke dråpene inn uten å renne over.
    7. Før du legger i det forberedte biblioteket, bland godt ved pipettering. Bruk en 100 μL pipette satt til 75 μL til å ta biblioteket og pipetten dråpe for dråpe inn i prøveporten. Ikke berør porten og vent til hver dråpe absorberes i porten før du legger i neste dråpe for å unngå overfylling av væsken.
    8. Lukk dekselporten og grunningsporten. Åpne programvaren og start sekvenseringseksperimentet. Velg basecalling On. For et bibliotek med 96 multipleksede prøver er 10-12 timers sekvensering vanligvis nok til å generere tilstrekkelige data.
      MERK: Ved hjelp av programvaren kan man sette inn prøvearket i .csv format. Eksempelarket krever følgende data: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code og sett. Flytcelle-ID-en er nødvendig (oppført på siden av flytcellen) sammen med settet som brukes. For den foreslåtte protokollen bør LSK109-settet velges.
  4. Analyse av sekvensielle data
    1. Sett inn den komprimerte fastq-avlesningen i wf-artic workflow41. Kjør arbeidsflyten separat med to forskjellige primerskjemaer (ARTIC/V4.1 og NEB-VarSkip/v1a). To ". primertrimmed.rg.sorted.bam" -filer opprettes for hver prøve.
    2. Slå sammen BAM-filene til en enkelt fil med kommandoen "samtools merge"42. Sett inn den sammenslåtte BAM-filen i Freyja-verktøyet, og la standardinnstillinger, for å gjenopprette relative avstamningsmengder43.
    3. For å opprette en FASTA-fil, sett inn den sammenslåtte BAM-filen i verktøyene "samtools mpileup" og "ivar" med standardinnstillinger44,45. For mutasjonskall, last inn FASTA-filen i Nextclade-verktøyet46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene oppsummert i tabell 3 viser eksempler på påvisning og kvantifisering av SARS-CoV-2 RNA i avløpsvann og luftprøver ved hjelp av metoden beskrevet i denne artikkelen. Avløpsvannprøver ble samlet inn fra renseanlegg i Spania og Slovenia og ble ansett som positive hvis Ct var mindre enn 40 i minst to av de tre replikatene, med kvantifisering ansett som gyldig hvis Ct hadde en variasjon på mindre enn 5%. I Spania og Portugal ble det samlet inn innendørs og utendørs luftprøver, og de samme reglene ble brukt. Duplikater ble brukt for luftprøvene, ikke triplikater som for avløpsvannprøvene, da målet med studien var å oppdage SARS-CoV-2 RNA og ikke å kvantifisere det. Videre ble en RT-qPCR-kjøring bare ansett som gyldig hvis alle kontrollene som ble brukt (som beskrevet i denne protokollen) oppførte seg som forventet, og hvis ingen signifikante avvik ble observert i mengovirus RNA-kontrollen. For disse prøvene varierte effektiviteten av gjenoppretting av mengovirus mellom 13,7% og 19,7%. Inhiberingen ble vurdert ved å fortynne ti ganger og 100 ganger ekstrahert RNA og ved å sammenligne de resulterende RT-qPCR-resultatene, samt ved bruk av et kommersielt sett. Instruksjonene for hvert kontrollsett for hemming bør følges som beskrevet av produsentene.

Avløpsvannprøvene hadde et standardavvik fra 1,91 % til 13,98 % blant triplikatene og varierte fra 3,05 x 10 3 til 2,83 x 108 genkopier/L. Luftprøvene varierte fra 6,17 x 103 til 5,48 x 10 9 med et standardavvik mellom duplikatene mellom 0,54 % og 10,95 %. Dette er i samsvar med tidligere studier 6,48,49,50.

Som beskrevet i denne protokollen ble prøvene sekvensert, og et eksempel på tre sekvenserte prøveresultater er oppsummert i tabell 4 og figur 1. I alle tre prøvene ble linjen BA.5.x tildelt som den mest utbredte av Freyja-verktøyet (95,3%, 95,4% og 99,8%).

Figure 1
Figur 1: SARS-CoV-2-avstamningsprevalens i utvalgte avløpsvannprøver. Linjer ble tildelt ved hjelp av Freyja-verktøyet. Sammendraget av prevalenstall når ikke nødvendigvis 100%, da noen av dataene ikke er av tilstrekkelig kvalitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Reagenser og volumer som skal tilsettes av hver for å forberede mastermix for SARS-CoV2-kvantifisering ved RT-qPCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Reagenser og volumer som skal tilsettes av hver for å forberede mastermixen for å forsterke de komplette SARS-CoV-2-genomene i prøvene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Sammendrag av RT-qPCR-kvantifiseringsresultater av SARS-CoV-2 RNA fra avløpsvann og luftprøver. N1-genet ble brukt til kvantifisering og N2 ble brukt til bekreftelse (positiv eller negativ). Resultatene uttrykkes som kopier/L. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Påviste mutasjoner og avstamningsprevalens. Linjer ble tildelt ved hjelp av Freyja-verktøyet og i henhold til mutasjonene av interesse funnet ved hjelp av Nextclade. Genomdekning for hver prøve vises. Sammendraget av prevalenstall når ikke nødvendigvis 100%, da noen av dataene ikke er av tilstrekkelig kvalitet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrobiell og viral deteksjon og kvantifisering ved hjelp av (RT-) qPCR-metoder har fått utbredt aksept på grunn av deres bemerkelsesverdige følsomhet. Imidlertid står disse teknikkene overfor mange utfordringer når man analyserer miljøprøver. Avløpsvannprøver inneholder en overflod av hemmende stoffer som kan forskyve målinger og gi misvisende resultater. For å takle disse begrensningene og forbedre presisjonen, ble en kompleks protokoll unnfanget, designet og implementert. Denne protokollen ble skreddersydd ved å kombinere protokoller fra den vitenskapelige litteraturen og for å spesifikt adressere begrensningene som ligger i qPCR-metoder ved å innlemme en rekke strenge kontroller på hvert trinn i prosessen. Ved å integrere disse strenge kvalitetskontrolltiltakene tilbyr denne protokollen en robust løsning på utfordringene qPCR-baserte deteksjons- og kvantifiseringsmetoder står overfor i komplekse miljøprøver51,52. Den negative kontrollen av isolasjon (NCI) og ikke-malkontroll (NTC) er viktige verktøy for å vurdere sannsynligheten for forurensning under RNA-ekstraksjonen og RT-qPCR-reaksjonen. Videre gir integrasjonen av mengoviruskontroll-RNA et avgjørende middel for å evaluere variabilitet mellom prøver, samt effektiviteten av konsentrasjonstrinnet og de hemmende effektene av midler som er tilstede i komplekse miljøprøver. I hver RT-qPCR-reaksjon må positive kontroller inkluderes for å bekrefte effektiviteten av amplifikasjonsprosessen. Det er viktig å nøye overvåke hvert trinn i protokollen, inkludert lagring og behandlingstid for prøvene. Nedbrytningen av prøvene kan påvirkes av temperatur og den komplekse sammensetningen av avløpsvann, noe som gjør det viktig å lagre prøvene ved en temperatur på 4 °C og behandle dem innen 24 timer. Ved å overholde disse strenge kvalitetskontrolltiltakene kan forskere og folkehelsearbeidere trygt og nøyaktig analysere miljøprøver for å avdekke viktig innsikt i mikrobielle og virale populasjoner og bedre forstå virkningen av miljøfaktorer på menneskers helse48.

Valget av RNA-mål for SARS-CoV-2-deteksjon er en kritisk faktor som kan påvirke følsomheten til RT-qPCR-analyser. I denne studien evaluerte forfatterne RdRp-, E-, N1- og N2-målene og fant at RdRp- og E-analysene hadde lavere følsomhet enn N1- og N2-analysene, i samsvar med tidligere forskning53. N1- og N2-analysene bruker dobbeltslukkerprober, som har vist seg å forbedre sensitiviteten i (RT-) qPCR-analyser54. Disse årsakene fører til beslutningen om å bruke N1 for kvantifisering og N2 som en bekreftelse på RNA-tilstedeværelsen, for å eliminere tvil når svært lave konsentrasjoner er funnet. De observerte avvikene blant RT-qPCR-målene ble tidligere rapportert36.

Flere studier har brukt lignende protokoller og har rapportert vellykket påvisning og kvantifisering av SARS-CoV-2 RNA i avløpsvann under den pågående COVID-19-pandemien 6,48,49,55,56. De rapporterte SARS-CoV-2 RNA-konsentrasjonene er i samsvar med de som er rapportert i denne studien og protokoll 48,50,55. Noen av disse studiene har undersøkt forholdet mellom aktive tilfeller og konsentrasjoner av RT-qPCR-målgener, spesielt N1 og N2 6,36,49,50,55,57,58,59. For å redusere variabiliteten i de oppnådde genkonsentrasjonene, har det blitt foreslått å multiplisere de eksperimentelle konsentrasjonene med strømningshastigheten på prøvetakingstidspunktet for å oppnå den opprinnelige virusbelastningen36. Denne tilnærmingen er innarbeidet i VATar COVID-19-prosjektet i Spania, et nasjonalt overvåkingssystem for COVID-19 i avløpsvann60.

Som den neste fasen av COVID-19 avløpsvannbasert epidemiologi (WBE) studier, har forskere forsøkt å oppdage SARS-CoV-2-mutasjoner i avløpsvann for å estimere sirkulasjonen av varianter av bekymring i lokalsamfunn. Tidligere studier har vist en sterk sammenheng mellom variantene som er identifisert i avløpsvann og de som finnes i befolkningen samtidig. Disse funnene antyder at avløpsvannbasert overvåking kan tjene som et verdifullt verktøy for å spore spredningen av SARS-CoV-2-varianter61,62. WBE har vist store løfter i overvåking av SARS-CoV-2 og kan brukes til å utvikle fremtidige overvåkingsstrategier for pandemier. Denne tilnærmingen er spesielt nyttig i de tidlige stadiene av en pandemi, når det er begrensede individuelle tester og mange tilfeller kan være asymptomatiske, og har en komplementær strategi til klinisk overvåking. Derfor kan WBE være spesielt nyttig på steder med lav økonomisk kapasitet som ikke har råd til andre dyrere overvåkingsstrategier. Den beskrevne metoden kan enkelt tilpasses andre virus som kan være aktuelle å overvåke i fremtiden.

Resultatene av luftprøvetaking i innendørs og utendørs miljøer viste at SARS-CoV-2 RNA er tilstede i begge miljøer, men i lavere konsentrasjoner i utendørsmiljøer 38,63,64. Disse funnene antyder at aktiviteter og eksponeringer der maskebruk og sosial distansering er vanskelig å opprettholde, for eksempel å spise, drikke eller delta på musikkfestivaler, kan utgjøre en høyere risiko for COVID-19-overføring. For å redusere slike risikoer er det kritisk å vurdere passende ventilasjonstiltak og bruken av munnbind, spesielt med fremveksten av nye bekymringsvarianter som er mer overførbare, som variantene Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529). I lys av opphevingen av Covid-19-restriksjoner i mange områder anbefales det å opprettholde bruken av munnbind for å holde samfunnsoverføring av SARS-CoV-2 på et minimum og forhindre fremtidige utbrudd av sykdommen 5,21,26,65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble utført med økonomisk støtte fra den regionale regjeringen i Castilla y Leon og FEDER-programmet (prosjektene CLU 2017-09, UIC315 og VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Miljøvitenskap utgave 196 SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR sekvensering varianter av bekymring
Kvantifisering og helgenomkarakterisering av SARS-CoV-2 RNA i avløpsvann og luftprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter